CN110257491B

CN110257491B - 一种小鼠卵巢干细胞移植及追踪的方法

Info

Publication number: CN110257491B
Application number: CN201910516753.0A
Authority: CN
Inventors: 赵世斗; 焦文林; 秦莹莹; 陈子江; 颜磊; 刘冉; 燕涛
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2019-06-14
Filing date: 2019-06-14
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2039-06-14
Also published as: CN110257491A

Abstract

本发明提供一种小鼠卵巢干细胞移植及追踪的方法，本发明通过运用透明质酸钠凝胶延长移植后细胞存活时间，同时针对现有追踪细胞方法的局限性，根据人和小鼠GAPDH基因非同源序列设计引物，应用PCR技术进行移植细胞体内追踪，从而提供一种简单、方便、敏感的追踪卵巢局部干细胞存留的方法，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种小鼠卵巢干细胞移植及追踪的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小鼠卵巢干细胞移植及追踪的方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

干细胞在疾病治疗、组织修复等领域具有极大的发展潜力和临床应用价值，近年来已成为生命科学领域的重要方向之一，受到广泛关注。当组织细胞发生炎症或者受损伤时，干细胞可以作为种子细胞分化为所需细胞，或者通过旁分泌的方式改善局部微环境，从而应用于多种病变引起的器官组织修复。目前干细胞正在应用于多种疾病动物模型的治疗中，其有效性和安全性都有证实，而且干细胞发挥功能的不同机制也不断被发现。在临床研究当中，许多疾病如黄斑退化、脊髓损伤、骨关节炎、心肌梗塞、早衰症、帕金森病等，各国研究人员应用不同干细胞进行了临床治疗相关的探索，显示出良好的安全性和有效性。

早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)是指女性40岁以前出现卵巢功能减退，表现为月经异常(闭经、月经稀发或频发)、促性腺激素水平升高和雌激素降低，并伴有不同程度的围绝经期症状，是女性不孕不育的重要原因之一。POI病因复杂且缺乏有效的治疗手段，严重威胁家庭稳定和社会和谐。干细胞移植为POI的治疗提供了一种新的方法，其中间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是应用最为广泛的一种。动物实验表明，间充质干细胞移植到POI模型小鼠卵巢后定位于卵巢间质，分泌细胞因子如肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和胰岛素生长因子1(IGF-1)等改善卵巢局部微环境，增加化疗药物或者免疫损伤后的卵巢体积，恢复小鼠动情周期，升高雌激素水平，增加各级卵泡数，最终提高生育能力。并且，国内外均开展了干细胞治疗POI的临床研究，取得了一定的治疗效果。干细胞移植有望成为一种安全有效的治疗POI的方法，具有良好的临床应用前景。虽然干细胞有良好的应用潜能，但是干细胞在体内存活时间短，极大地影响了干细胞移植后疗效的发挥。因此，在临床上亟需寻找提高卵巢干细胞移植后存活的方法。

另外，现在常用的移植后干细胞追踪方法包括动物活体成像或组织切片免疫组化染色分析移植细胞的存活情况。这些方法或需要精密的仪器，或只能反映某个切面不能整体反映移植细胞的存活情况，具有一定的局限性。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种小鼠卵巢干细胞移植及追踪的方法，本发明通过运用透明质酸钠凝胶延长移植后细胞存活时间，同时针对现有追踪细胞方法的局限性，根据人和小鼠GAPDH基因非同源序列设计引物，应用PCR技术进行移植细胞体内追踪，从而提供一种简单、方便、敏感的追踪卵巢局部干细胞存留的方法，因此具有良好的实际应用之价值。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的第一个方面，提供透明质酸钠凝胶在小鼠卵巢干细胞移植及追踪中的应用。本发明研究发现，透明质酸钠对于延长干细胞在卵巢局部存留有良好效果。

进一步的，所述透明质酸钠凝胶浓度为0.1～0.3mg/ml(优选为0.3mg/ml)。

进一步的，所述干细胞为人脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymalstem cells，UCMSCs)。

本发明的第二个方面，提供一种小鼠卵巢干细胞移植及追踪的方法，所述方法包括：

将人脐带间充质干细胞重悬于透明质酸钠凝胶溶液中，移植至小鼠卵巢中；

通过比对人和小鼠GAPDH基因DNA序列不同之处，在非同源的位置设计人GAPDH(hGAPDH)引物以及小鼠Gapdh(mGapdh)引物，检测基因扩增产物，追踪干细胞移植后不同时间点小鼠卵巢内人脐带间充质干细胞的存留。

进一步的，所述透明质酸钠凝胶溶液中采用PBS作为溶剂；

进一步的，所述透明质酸钠凝胶溶液中透明质酸钠凝胶浓度为0.1～0.3mg/ml(优选为0.3mg/ml)；透明质酸钠凝胶浓度过低，则对干细胞在卵巢局部存留时间提升效果不明显；透明质酸钠凝胶浓度过高，则透明质酸钠凝胶过于粘稠，不利于注射操作，且可能对干细胞的生物学性质产生影响。

进一步的，所述人脐带间充质干细胞移植细胞量为0.1～5x10⁵(优选为1x10⁵)；

进一步的，所述移植采用微量注射器卵巢局部注射的方式进行。

进一步的，所述人GAPDH(hGAPDH)引物为：

F:5'-GCACCCTATGGACACGCTC-3'(SEQ ID NO.1)；

R:5'-CCCACATCACCCCTCTACCTC-3'(SEQ ID NO.2)；

进一步的，所述小鼠Gapdh(mGapdh)引物为：

F:5'-GTCACTACCGAAGAACAACGAG-3'(SEQ ID NO.3)；

R：5'-TGTGGGCTCCGAACTGAT-3'(SEQ ID NO.4)。

本发明有益效果：本发明提供一种小鼠卵巢干细胞移植及追踪的方法，本发明经过研究发现，通过添加适宜浓度的透明质酸钠凝胶能够显著延长移植后细胞存活时间，而且适宜浓度的透明质酸钠对体外培养干细胞的生物学性质等不产生显著影响；同时针对现有追踪细胞方法的局限性，本发明根据人和小鼠GAPDH基因非同源序列设计引物，扩增基因产物，从而利用PCR技术对移植的人脐带间充质干细胞进行体内追踪，该方法简单、方便、灵敏度高，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。图1为实施例一中用于干细胞追踪的PCR引物验证图。不同数量干细胞与卵巢混合后提取总DNA，PCR扩增人源GAPDH和鼠源Gapdh基因片段，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。hGAPDH代表人GAPDH，mGapdh代表小鼠Gapdh。结果表明随着干细胞数量的增加，hGAPDH条带逐渐变深变亮，mGapdh随着细胞数量增加有减少的趋势。阳性及阴性对照分别显示hGAPDH引物不能扩增小鼠卵巢DNA序列，同时mGapdh引物不能扩增人UCMSCs DNA序列，证明这两对引物可以用于干细胞移植后的追踪。

图2为实施例四中探索合适的细胞移植数量图。不同数量的干细胞对小鼠进行卵巢原位移植，1天后取卵巢，检测存活在卵巢中的干细胞。图为提取卵巢DNA，PCR后琼脂糖凝胶电泳检测hGAPDH基因。结果显示，1x10⁵/5μl效果较好，加大移植细胞量并没有明显改善。

图3为实施例五中探索合适的透明质酸钠凝胶浓度图。0～0.3mg/ml透明质酸钠凝胶与1x10⁵细胞混合后进行卵巢局部移植，1天后取卵巢提DNA，检测hGAPDH基因。结果显示，与其它浓度相比，0.3mg/ml透明质酸钠凝胶(HA)对于细胞移植效果最好，更高浓度的透明质酸钠凝胶由于堵塞注射器针头而无法移植。

图4为实施例六中应用透明质酸钠凝胶移植延长干细胞在小鼠卵巢内的存留时间图。1x10⁵/5μl干细胞移植后第1，3，7，14天取卵巢提DNA，进行PCR。图为PCR后琼脂糖凝胶电泳检测不同时间点小鼠卵巢中存留的人GAPDH基因。结果显示，与MSC组相比，MSC+0.3mg/mlHA组每个时间点都有更多的存留细胞，而且在7天也检测到了存活的细胞，证明HA可以明显延长干细胞在卵巢内的存活时间。

图5为实施例七中不同浓度的透明质酸钠凝胶对体外培养人脐带间充质干细胞活力的影响图。CCK8法检测UCMSCs在不同浓度透明质酸钠凝胶处理下第0-5天细胞活力情况。结果显示，0.3mg/ml透明质酸钠对干细胞活力无明显影响。

图6为实施例八中0.3mg/ml透明质酸钠凝胶对体外培养人脐带间充质干细胞干性基因及细胞因子表达的影响图；实时定量RT-PCR方法检测UCMSCs在0.3mg/ml透明质酸处理5天后干性基因以及细胞因子的表达情况，结果显示，0.3mg/ml透明质酸钠对干细胞的干性基因以及细胞因子的表达无明显影响。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。

如前所述，现有卵巢干细胞移植后存活率普遍不高，同时，现在常用的移植后干细胞追踪方法包括动物活体成像或组织切片免疫组化染色分析移植细胞的存活情况，然而这些方法或需要精密的仪器，或只能反映某个切面不能整体反映移植细胞的存活情况，具有一定的局限性。

有鉴于此，本发明研究发现，通过运用适宜浓度的透明质酸钠凝胶能够显著延长移植后的干细胞存活时间，同时针对现有追踪细胞方法的局限性，本发明提出根据人和小鼠GAPDH基因非同源序列设计引物，扩增基因产物，从而利用PCR技术对移植的人脐带间充质干细胞进行体内追踪，该方法简单、方便、灵敏度高。

本发明一个具体实施方式中，提供一种小鼠卵巢干细胞移植及追踪的方法，包括以下步骤：

S1.通过比对人和小鼠GAPDH基因DNA序列不同之处，在非同源的位置设计人GAPDH(hGAPDH)引物以及小鼠Gapdh(mGapdh)引物，用来追踪干细胞移植后不同时间点小鼠卵巢内UCMSCs的存留。

S2.通过细胞计数，将不同数量(10⁴,5x10⁴,1x10⁵,5x10⁵)UCMSCs与小鼠卵巢混合，提取总DNA，以总DNA为模板，利用S1中的两对引物，采用PCR的方法进行扩增，扩增后通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，验证引物扩增效率与方法的可行性。

S3.将不同数量(10⁴,5x10⁴,1x10⁵,5x10⁵)UCMSCs通过小鼠卵巢原位注射的方法移植到小鼠卵巢内，移植后1天取卵巢提取总DNA，利用S1中两对引物进行PCR扩增，电泳检测人GAPDH基因扩增产物，选择合适的细胞数量。

S4.将S3确定的合适数量的细胞重悬于不同浓度透明质酸钠凝胶(0,0.1,0.2,0.3mg/ml)中，通过局部注射移植到小鼠卵巢内，移植1天后取卵巢提总DNA，利用S1中两对引物进行PCR扩增，电泳检测人GAPDH基因扩增产物，选择合适的透明质酸钠浓度。

S5.在合适的细胞数量下，将小鼠分为单独干细胞移植组与干细胞添加0.3mg/ml透明质酸钠凝胶移植组，两组小鼠进行卵巢原位注射，分别在移植后1，3，7，14天取卵巢提取总DNA，利用S1中两对引物进行PCR扩增，电泳检测人GAPDH基因扩增产物，追踪移植后不同时间点卵巢内存留的干细胞。

S6.体外细胞实验将UCMSCs在不同浓度透明质酸钠处理下培养5天，利用CCK-8实验证实0.3mg/ml透明质酸钠对于干细胞活力没有明显影响。

S7.体外细胞实验将UCMSCs用0.3mg/ml透明质酸钠处理5天后，采用实时定量RT-PCR方法证实0.3mg/ml透明质酸钠对于UCMSCs干性基因以及细胞因子的表达没有明显影响。

本发明描述的小鼠卵巢干细胞移植采用Hamilton微量注射器卵巢局部注射；应用的透明质酸钠浓度没有影响体外培养干细胞的生物学性质，但应用透明质酸钠对于延长干细胞在卵巢局部存留有良好效果，为提高干细胞移植后存留时间提供了新方法；本发明提供的干细胞追踪方法，可以运用常规的PCR技术对存留于小鼠体内卵巢局部的干细胞进行追踪，方法简单、实用、可行。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。另外，实施例中未详细说明的分子生物学方法均为本领域常规的方法，具体操作可参看分子生物指南或产品说明书。

各实施例所用材料如下：

1.宫安康(宫腔用交联透明质酸钠凝胶，规格：5mg/ml，厂家：常州百瑞吉生物医药有限公司)；2.2 x Goldstar Taq MasterMix(康为世纪，CW0690M)；3.血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，DP304)；4.琼脂糖(BIOWEST)；5.Hamilton微量注射器(100μl)；6.反转录试剂盒(TAKARA，RR047A)；7.增强型CCK-8试剂盒(碧云天，C0043)；8.TB greenpremix Ex Taq(TAKARA，RR420)；9.MEM-alpha培养基(GIBCO，12571-063)；10.引物由铂尚生物技术有限公司合成。

野生型C57BL/6小鼠购买于山东大学实验动物中心，饲养于山东省立医院动物房。

实施例一：小鼠卵巢内人UCMSCs追踪引物设计

从NCBI网站分别下载人和小鼠GAPDH基因DNA序列，运用Clustalw网站对两个序列进行比对，选出两个序列中不相同的位置进行引物设计。引物设计运用primer 5软件完成。

设计的引物序列为：

此对引物经过附图1检测，hGAPDH引物只能对人UCMSCs的GAPDH基因序列进行扩增而不能扩增小鼠基因的序列，同样mGapdh引物只能扩增小鼠组织的DNA序列而不能扩增人UCMSCs中的基因序列，这两对引物可用于人鼠非同源移植后的细胞追踪。

实施例二：利用Hamilton微量注射器进行UCMSCs小鼠卵巢原位注射，具体包括以下步骤：

S1.准备细胞：弃培养基，PBS冲洗三遍后，用0.25％胰酶消化细胞，完全培养基终止消化。吹打成单细胞悬液，1000rpm离心5min，弃上清，5ml培养基重悬细胞，取10μl细胞进行计数，利用PBS溶液调整细胞到合适密度，准备好后将细胞置于冰上。

S2.小鼠用4％水合氯醛进行麻醉，剪去背部毛发，消毒后在脊柱两侧做1cm纵行切口，逐层剪开皮肤、筋膜、肌肉，用弯镊轻轻夹住脂肪垫，暴露双侧卵巢。

S3.用Hamilton微量注射器缓慢吸取10μl细胞悬液沿卵巢长轴注射于双侧卵巢，每侧卵巢注射5μl。

S4.将卵巢归位，逐层缝合。

实施例三：利用TIANGEN试剂盒提取小鼠卵巢总DNA，主要包括以下步骤：

S1.各时间点收取卵巢于液氮中，立刻进行DNA的提取。将卵巢加入50μl PBS后用电动研磨棒进行研磨直到看不到大块组织。

S2.按照试剂盒说明书进行总DNA的提取，用TE溶液溶解。混匀后用Nanogdrop超微量分光光度计进行DNA浓度与纯度检测，并用TE溶液调整到终浓度为8-10ng/μl，提取后的DNA-20℃保存。

实施例四：应用PCR方法进行GAPDH片段扩增及琼脂糖凝胶电泳检测不同细胞浓度下卵巢移植后细胞的存活情况。

1.用实施例二的方法，将不同数量的细胞(10⁴，5x10⁴，1x10⁵，5x10⁵)进行卵巢原位注射，一天后按照实施例三的方法提取卵巢DNA(包括小鼠卵巢DNA以及移植后存留于卵巢的人UCMSCs细胞DNA)，用实施例一中的两对引物进行PCR。

2.PCR上机程序：第一步预变性95℃10min，第二步变性后扩增95℃30s，60℃30s，72℃30s，第三步终延伸72℃7min，16℃保存。hGAPDH PCR程序34个循环，mGapdh PCR程序29个循环，PCR后产物进行琼脂糖凝胶(2％)电泳。结果如图2所示。

结果表明：在不加透明质酸钠凝胶移植一天后，每侧卵巢10⁴细胞量少，卵巢局部留下的细胞少。经比较每侧卵巢5x10⁵虽然细胞量多，但是效果并不比10⁵更好，而且用1x10⁵可以更节约细胞，所以经过细胞数量梯度的检测，1x10⁵每侧卵巢是一个较为合理的移植细胞量。

实施例五：应用PCR方法进行GAPDH片段扩增及琼脂糖凝胶电泳检测不同浓度透明质酸钠凝胶应用后卵巢移植细胞的存活情况。

将不同浓度的(0mg/ml，0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.3mg/ml)透明质酸钠凝胶与1x10⁵细胞混合后用实施例二的方法进行小鼠卵巢原位移植，一天后按照实施例三的方法提取卵巢DNA，用实施例一中的两对引物进行PCR。按照实施例四中PCR程序，PCR后产物进行琼脂糖凝胶(2％)电泳(因为透明质酸钠凝胶比较粘稠，而微量注射器针头比较细，更高浓度的透明质酸钠凝胶与细胞混合后微量注射器将不能工作，所以0.3mg/ml是我们选择的上限)。结果如图3所示。

结果表明：随着透明质酸钠凝胶浓度增加有更多细胞保留下来，0.3mg/ml效果最佳。

实施例六：移植时加入透明质酸钠凝胶后，细胞在小鼠卵巢内存留增多，时间延长。

将1x10⁵细胞与0.3mg/ml透明质酸钠凝胶相混合，用实施例二的方法进行细胞移植。移植后分别于第1,3,7,14天按照实施例三的方法提取卵巢DNA，用实施例一中的两对引物进行PCR。按照实施例四中PCR程序，PCR后产物进行琼脂糖凝胶(2％)电泳。结果如图4所示。

结果表明：加入透明质酸钠凝胶移植后1天和3天都有更多的细胞存留在卵巢而且时间延长，在第7天还能检测到细胞，所以透明质酸钠凝胶的应用可以延长UCMSCs在卵巢局部的存留时间。

实施例七：应用CCK-8细胞活性检测试剂检测不同浓度透明质酸钠对UCMSCs细胞活力的影响。

S1.制备不同浓度透明质酸钠凝胶包括以下步骤：将3ml透明质酸钠凝胶原液(5mg/ml)加入到12ml MEM-alpha培养基中，涡旋混匀即1mg/ml；取1mg/ml透明质酸钠混合液5ml加入5ml MEM-alpha培养基中涡旋混匀即0.5mg/ml；取1mg/ml透明质酸钠混合液2ml加入4ml MEM-alpha培养基混合均匀即0.3mg/ml；取1mg/ml透明质酸钠混合液1ml加入9mlMEM-alpha培养基混合均匀即0.1mg/ml。

S2.将UCMSCs接种于5个96孔板内，过夜后细胞贴壁。第二天换液为含有不同浓度透明质酸凝胶的培养基，每过24小时取出其中一板每孔加入10μl CCK-8试剂，2小时后于酶标仪上检测450nm处的吸光度数值，结果如图5所示。

结果表明：与对照组相比，0.3mg/ml透明质酸钠未对细胞活力产生明显影响。更高浓度的透明质酸虽然在性状上可以提供更好的黏性，但是却能影响干细胞的活力，所以在应用时最高选用0.3mg/ml的浓度，既保证微量注射器可以正常工作，同时也保证脐带间充质干细胞不受外源性透明质酸钠对其活力的影响。

实施例八：应用实时定量RT-PCR方法检测0.3mg/ml透明质酸钠对UCMSCs细胞干性基因及细胞因子表达的影响。

S1.将UCMSCs接种于6孔板，贴壁后换成0.3mg/ml透明质酸钠与MEM-alpha培养基预混液(对照组为MEM-alpha+10％FBS培养基正常培养)，在37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养5天后，用0.25％胰酶消化，收集细胞。

S2.TRIzol法提取细胞总RNA。提取RNA之前用75％酒精擦拭台面，准备冰。对照组与透明质酸钠处理组均加1ml TRIzol，静置5min，加入200μl氯仿后静置5min，4℃离心12000g；取上清200μl转移到另一个1.5ml无RNA酶EP管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置，4℃12000g离心后弃上清；加入100％乙醇1ml洗涤RNA沉淀，4℃7500g离心，弃乙醇。晾干。加入DEPC水溶解RNA，NANO drop超微量分光光度计检测RNA浓度与纯度。

S3.按试剂盒说明书将1ug RNA反转录成cDNA。

S4.实时定量PCR。体系：TB GREEN 5μl，上下游引物各1μl，cDNA模板1μl，ddH₂O 3μl。

实时定量程序：预变性95℃10min；PCR扩增反应95℃5s，60℃30s循环数为45。以β-ACTIN作为内参照，结果分析采用2^-ΔΔCT法。

所用引物：

结果表明：在加入0.3mg/ml透明质酸钠5天后，与对照组相比，无论是干性相关基因还是细胞因子相关基因的表达都没有明显改变，所以0.3mg/ml透明质酸钠对脐带间充质干细胞没有明显的负面影响，应用安全。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种小鼠卵巢干细胞移植及追踪的方法

<130>

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

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<213> 人工合成

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<212> DNA

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<212> DNA

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cggcagacat aaccacctt 19

Claims

1.透明质酸钠凝胶在制备小鼠卵巢干细胞移植及追踪试剂中的应用，所述透明质酸钠凝胶浓度为0.1～0.3mg/ml。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述透明质酸钠凝胶浓度为0.3mg/ml。

3.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述干细胞为人脐带间充质干细胞。