CN104531711A - 一种具有抗肿瘤及放化疗增敏效应的基于竞争性内源rna机制的lna寡核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有抗肿瘤及放化疗增敏效应的基于竞争性内源RNA机制的LNA寡核苷酸。本发明基于lncRNA GAS5与miR-21之间存在的竞争性内源RNA调节机制，设计了靶向miR-21的修饰性LNA寡核苷酸，其特异性强、稳定性好，经体外实验和动物实验证实该LNA寡核苷酸能降低miR-21的表达，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，效果十分显著，且具有放化疗增敏效应，因此可用于治疗miR-21增高的相关疾病，如靶向阻断miR-21增高相关肿瘤的增殖、复发和转移，抑制血管发生等，还可用于提高临床的放化疗效果以及临床miR-21相关疾病的诊断和预防等。

Description

一种具有抗肿瘤及放化疗增敏效应的基于竞争性内源RNA机制的LNA寡核苷酸

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种具有抗肿瘤及放化疗增敏效应的基于竞争性内源RNA机制的LNA寡核苷酸。

背景技术

癌症占人类死亡病因的近1/4。在过去的几十年里肿瘤复发和转移仍是改善整体存活率的主要障碍，这可能主要归因于人们对于癌症生物学仍然缺乏全面的了解。例如，功能基因组学研究的最新进展表明，参与人类基因转录的绝大多数是非编码RNA，然而，对于长非编码RNA(lncRNA)在调控癌症基因表达及机制等方面人类仍然所知甚少(Xie C,Yuan J,Li H,Li M,Zhao G,Bu D,et al.NONCODEv4:exploring the world of long non-coding RNA genes.Nucleicacids research.2013.)。

除了蛋白质编码基因，人类基因组制造了大量的非编码RNA，包括microRNA和lncRNAs。microRNA和lncRNA在调节细胞过程方面都有着至关重要的作用，如细胞的生长和凋亡，以及癌症的进展和转移。虽然众所周知microRNA可以靶向大量的蛋白质编码基因，但少有人知道lncRNA可以靶向大量的蛋白质编码基因，更少有人知道lncRNA是否也可以靶向microRNA。

期刊文献(Zhang Z,Zhu Z,Watabe K,Zhang X,Bai C,Xu M,Wu F,Mo YY.(2013)Negative regulation of lncRNA GAS5 by miR-21.Cell Death Differ.2013.)通过基因筛选方法，使用lncRNA RT-PCR(反转录-聚合酶链反应)Array方法，表明miR-21能够抑制lncRNA生长抑制特异性因子5(GAS5)。miR-21和GAS5的负相关关系也见于乳腺肿瘤标本。有趣的是，GAS5也能够抑制miR-21的表达。过表达GAS5抑制miR-21表达，GAS5-siRNA增加miR-21的表达。更重要的是，有一个假定的miR-21的结合位点位于GAS5外显子4；miR-21结合位点缺失能够删除活性。体外细胞培养和异种移植小鼠模型的实验表明GAS5是作为肿瘤抑制子发挥作用。结果还表明，生物素标记的GAS5-RNA探针能够Pull Down RNA诱导的沉默复合物(RISC)的关键蛋白(AGO2)，并且miR-21包含在GAS5-RISC复合物中，这意味着miR-21和GAS5以相互调节方式，通过靶向microRNA介导基因沉默。所以，lncRNA GAS5可以靶向抑制肿瘤蛋白编码基因，而且可以通过靶向miR-21发挥抗肿瘤作用。重要的是，miR-21是目前被证明的重要的肿瘤促生长因子，已经被证明在多种肿瘤中表达显著上调，并促进肿瘤增殖、侵袭及转移(文献1：Zhang Z,Zhu Z,Watabe K,Zhang X,Bai C,Xu M,Wu F,Mo YY.(2013)Negative regulation of lncRNAGAS5 by miR-21.Cell Death Differ.2013.文献2：Schetter AJ,Leung SY,Sohn JJ,Zanetti KA,Bowman ED,Yanaihara N et al.MicroRNA expression profilesassociated with prognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma.JAMA 2008；299:425–436.文献3：Jiang J,Gusev Y,Aderca I,Mettler TA,Nagorney DM,Brackett DJ et al.Association of MicroRNA expression inhepatocellular carcinomas with hepatitis infection,cirrhosis,and patient survival.Clin Cancer Res 2008；14:419–427.)，GAS5则相反，GAS5为肿瘤抑制因子，且在促进肿瘤细胞凋亡等方面发挥作用。GAS5与miR-21之间通过竞争性内源RNA调节机制发挥作用，这对于进一步研究lncRNA与microRNA参与的基因表达调控网络在肿瘤发病及进展中具有重要的意义，同时为肿瘤的治疗提供了一条重要途径，而目前还未见基于GAS5与miR-21的竞争性内源RNA调节机制治疗肿瘤的报道。

锁核酸(locked nucleic acid，LNA)作为一种新颖的核苷酸衍生物在药学研究领域引起了人们的广泛关注，有希望成为分子水平治疗各种疾病的新突破口。它是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，结构中含有2′-O，4′-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2′-O位和4′-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种LNA寡核苷酸。

本发明的再一的目的是，提供所述的LNA寡核苷酸的用途。

本发明的另一的目的是，提供一种缀合物。

本发明的第四个目的是，提供一种药物组合物。

本发明的第五个目的是，提供所述的缀合物或药物组合物的用途。

本发明的第六个目的是，提供一种试剂盒。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

LNA寡核苷酸，所述的LNA寡核苷酸由下述序列组成：A+T+T+ACAGGCATTAGACAGA+AAGCTG+G+T+C，其中+选自β-D-氧-LNA核苷酸类似物中的任一种。

优选地，所述的LNA寡核苷酸选自下述序列的一种：

a)AGTCTAACAGGCATTAGACAGATAAGCTGAGCTCC；

b)AGTCTAACAGGCATTAGACAGAGAAGCTGAGCTCC；

c)AGTATCACAGGCATTAGACAGATAAGCTGAGCTAC；

d)AGTATCACAGGCATTAGACAGAGAAGCTGAGCTAC，

其中，G为G-β-D-氧-LNA核苷酸类似物，C为C-β-D-氧-LNA核苷酸类似物，A为A-β-D-氧-LNA核苷酸类似物，T为T-β-D-氧-LNA核苷酸类似物。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

所述的LNA寡核苷酸在制备药物中的应用，所述的药物用于治疗或诊断miR-21表达显著上调的疾病。

所述的miR-21表达显著上调的疾病选自miR-21表达显著上调的肿瘤和血管发生。

所述的miR-21表达显著上调的肿瘤选自前列腺癌、肺癌、乳腺癌、睾丸癌、子宫颈癌和结肠癌。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种缀合物，所述的缀合物包含如上所述的LNA寡核苷酸，和至少一个共价结合到所述LNA寡核苷酸上的非核苷酸或非多核苷酸部分。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

一种药物组合物，所述的药物组合物含有如上所述的LNA寡核苷酸，以及可药用的稀释剂、载体或辅剂。

所述的药物组合物包含水性载体，所述的水性载体包含用于将pH维持在7.35-7.45范围内的缓冲剂。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：

所述的缀合物或所述的药物组合物在制备药物中的应用，所述的药物用于治疗或诊断miR-21表达显著上调的疾病。

所述的miR-21表达显著上调的疾病选自miR-21表达显著上调的肿瘤和血管发生。

所述的miR-21表达显著上调的肿瘤选自前列腺癌、肺癌、乳腺癌、睾丸癌、子宫颈癌和结肠癌。

为实现上述第六个目的，本发明采取的技术方案是：

一种试剂盒，所述的试剂盒含有如上所述的LNA寡核苷酸，以及适合重配所述LNA寡核苷酸的盐水或缓冲溶液。

给药途径

LNA寡核苷酸可以以多种可药用盐使用。所述的“可药用盐”是指会保持LNA寡核苷酸的期望生物活性并显示最小的不期望的毒理作用的盐。这类盐的非限定性实例可与有机氨基酸形成，可与碱加成盐和金属阳离子例如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉、钠、钾等形成，可与由氨、N，N-二苄基乙二胺、D-葡糖胺、四乙铵或乙二胺形成的阳离子形成；或其组合，例如单宁酸锌盐等。

优选地，LNA寡核苷酸可以注射或输注施用在病灶位置或附近。例如，本发明的药物组合物可用多种方式施用，这取决于期望的是局部还是系统性治疗。包括静脉内、动脉内、组织内注射或输注。更优选地，有活性的LNA寡核苷酸通过静脉内、局部地或作为推注注射施用或直接施用到靶器官。目前认为，最合适的给药形式是通过静脉输注或局部应用。

药物组合物

包含所述的LNA寡核苷酸的药物组合物优选地适于注射、局部施用。组合物和制剂包括但不限于粉末或颗粒、微颗粒、纳米粒、在水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、小药囊、片剂或小片剂。组合物和制剂可包括无菌水溶液，其还可以包含缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂，例如但不限于渗透增强剂、载体化合物和其他药学可接受的载体或赋形剂。

本发明的药物组合物还可以包含至少一种化疗剂，如组合物中可采用紫杉烷化合物。本发明的LNA寡核苷酸可以用于本文所述的多种治疗应用。总体而言，本发明的治疗方法包括，施用治疗有效量的LNA寡核苷酸给哺乳动物，尤其是人。当与本发明的LNA寡核苷酸一起使用时，这样的化疗剂应当序贯使用，开始用LNA寡核苷酸治疗一段时间，通过降低肿瘤细胞和肿瘤血管系统的增殖内皮细胞中的miR-21水平，使靶细胞对随后的化疗剂共同治疗敏化。

用途

本发明的LNA寡核苷酸也可以用作研究试剂，用于诊断、治疗和预防。在研究中，本发明的LNA寡核苷酸可用于特异性抑制细胞和试验动物中miR-21基因的合成，由此方便对靶核酸的功能性分析，或评价其作为药物治疗干预目标的有效性。在诊断中，本发明的LNA寡核苷酸可用于检测和定量细胞和组织中的miR-21表达，这通过RNA印迹、原位杂交或类似的技术来实现。在治疗中，有可能通过调节miR-21表达进行治疗的疾病或病症的动物或人，可通过施用本发明的LNA寡核苷酸来治疗。

试剂盒

如果液体形式的药物组合物较难维持活性物质的稳定性，可优选地制备固体形式的含有LNA寡核苷酸的成品，例如作为冻干产品，并以这样的固体形式保藏产品。在施用前，可以在盐水或立即可以使用的缓冲盐水中重配(例如溶解或悬浮)该产品。因此，本发明的试剂盒其包含：a.第一种组分，其含有固体形式的本发明的LNA寡核苷酸或缀合物，和b.第二种组分，其含有适合重配(例如溶解或悬浮)所述LNA寡核苷酸的盐水或缓冲溶液(例如缓冲盐水)。

本发明优点在于：本发明基于lncRNA GAS5与miR-21之间存在的竞争性内源RNA调节机制，设计了靶向miR-21的修饰性LNA寡核苷酸，其特异性强、稳定性好，经体外实验和动物实验证实该LNA寡核苷酸能降低miR-21的表达，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，效果十分显著，优于一般的寡核苷酸，且具有放化疗增敏效应。因此可用于治疗miR-21增高的相关疾病，如靶向阻断miR-21增高相关肿瘤的增殖、复发和转移，抑制血管发生等，还可用于提高临床的放化疗效果以及临床miR-21相关疾病的诊断和预防等。

附图说明

图1.GAS5和miR-21通过竞争性内源RNA调节机制相互作用，下调GAS5表达可以引起miR-21的表达上调。siRNA-control为NC组，siRNA-GAS5为转染siRNA-GAS5的实验组。

图2.通过构建针对GAS5和miR-21互补序列的异构体，进一步证明了GAS5和miR-21之间的竞争性内源RNA调节作用。MSCV为空白载体对照组，GAS5为lncRNA GAS5高表达组，GAS5-mut/miR21为GAS5/miR21互补序列异构体组。

图3.核酸原位杂交检测证实人组织标本中GAS5和miR-21的竞争性内源RNA调节作用。

图4.体外转染GAS5-LNA寡核苷酸，核酸原位杂交检测GAS5和miR-21的表达。与对照组比较，GAS5-LNA寡核苷酸可以显著下调miR-21的表达水平。Con.为阴性对照组，GAS5-LNA为转染GAS5-LNA寡核苷酸组。

图5.体外验证GAS5-LNA寡核苷酸的功能：应用MCF-7细胞，体外转染GAS5-LNA寡核苷酸(不同浓度10、30、50、70μg/ml)，与对照组比较，肿瘤细胞的miR-21显著被下调。

图6.放疗增敏效应实验：应用紫外线照射诱导肿瘤细胞MDA-MB-231凋亡，与对照组比较，体外转染GAS5-LNA寡核苷酸的肿瘤细胞表现出显著增高的细胞凋亡现象。Control为未转染GAS5-LNA寡核苷酸的阴性对照组；GAS5-LNA为转染GAS5-LNA寡核苷酸组。

图7.放疗增敏效应实验：应用紫外线照射诱导肿瘤细胞MCF-7凋亡，与对照组比较，体外转染GAS5-LNA寡核苷酸的肿瘤细胞表现出显著降低的增殖能力。MSCV为空白载体对照组，GAS5为转染GAS5-LNA寡核苷酸组。

图8.通过裸鼠动物实验建立肿瘤模型，应用GAS5-LNA寡核苷酸处理组，与对照组比较，肿瘤细胞的增殖能力显著降低(肿瘤重量)。CON.为对照组；GAS5-LNA为GAS5-LNA寡核苷酸处理组。

图9.通过裸鼠动物实验建立肿瘤模型，应用GAS5-LNA寡核苷酸处理组，与对照组比较，肿瘤细胞的增殖能力显著降低(肿瘤体积)。CON.为对照组；GAS5-LNA为GAS5-LNA寡核苷酸处理组。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1 合成GAS5-LNA寡核苷酸

LNA寡核苷酸对靶核酸表达的影响可在多种细胞类型中进行检测，条件是目标核酸以可测量的水平存在，靶物可内源性表达，或通过编码所述核酸的核酸的瞬时或稳定转染表达。合成一系列GAS5-LNA寡核苷酸，所述的GAS5-LNA寡核苷酸序列为：A+T+T+ACAGGCATTAGACAGA+AAGCTG+G+T+C，其中+选自β-D-氧-LNA核苷酸类似物中的任一种。其中4种GAS5-LNA寡核苷酸序列如下：

a)AGTCTAACAGGCATTAGACAGATAAGCTGAGCTCC(SEQ ID NO.1)；

b)AGTCTAACAGGCATTAGACAGAGAAGCTGAGCTCC(SEQ ID NO.2)；

c)AGTATCACAGGCATTAGACAGATAAGCTGAGCTAC(SEQ ID NO.3)；

d)AGTATCACAGGCATTAGACAGAGAAGCTGAGCTAC(SEQ ID NO.4)，

其中，G为G-β-D-氧-LNA核苷酸类似物，C为C-β-D-氧-LNA核苷酸类似物，A为A-β-D-氧-LNA核苷酸类似物，T为T-β-D-氧-LNA核苷酸类似物。

以上序列均由Exiqon合成，具体可参考：http://www.biomart.cn/infosupply/11085229.htm；http://www.biomart.cn/infosupply/19919667.htm。

实施例2 lncRNA GAS5与miR-21的相互作用验证(附图1、2、3、4)

1、细胞培养及转染

(1)肿瘤细胞MCF-7或MDA-MB-231，用1640培养基加10％FBS培养至细胞密度达50％。

(2)用RNA转染试剂按照说明书的常规操作方式转染siRNA-GAS5、GAS5 LNA寡核苷酸、lncRNA GAS5或miR-21(具体操作参见文献：Zhang Z,Zhu Z,WatabeK,Zhang X,Bai C,Xu M,Wu F,Mo YY.(2013)Negative regulation of lncRNAGAS5 by miR-21.Cell Death Differ.2013.)，终浓度达50nM。

(3)转染6小时之后，换上新鲜的培养基，继续培养24小时。

(4)吸去培养基，收集细胞后提取总RNA，检测目标基因的表达量(U6作为内参)。

2、实时荧光定量PCR检测GAS5或miR-21的表达量

(1)收集细胞。

(2)提取细胞中的总RNA。采用Ambion公司的RNA提取试剂盒(AM1560)，按照试剂盒说明书方法进行操作。

(3)取100ng的总RNA，进行逆转录。

(4)取逆转录得到的产物，根据Ambion公司的试剂盒说明书进行后续的real-time实验。U6、GAS5、miR-21引物序列如下：

结果：在肿瘤细胞MCF-7的实验结果见图1；在肿瘤细胞MDA-MB-231的实验结果与MCF-7结果一致，即下调GAS5表达可以引起miR-21表达上调。3、构建针对GAS5和miR-21互补序列的异构体(具体异构体构建参见文献：Zhang Z,Zhu Z,Watabe K,Zhang X,Bai C,Xu M,Wu F,Mo YY.(2013)Negativeregulation of lncRNA GAS5 by miR-21.Cell Death Differ.2013.)，通过改变二者间相互作用的序列，并经过基因克隆，进一步通过MCF-7细胞转染观察效果，进一步明确GAS5和miR-21之间的竞争性内源RNA调节作用。

结果：见图2。

4、核酸原位杂交检测

通过核酸原位杂交的方法检测人组织标本(正常组织和乳腺癌组织)中GAS5和miR-21的表达。结果：见图3。

将MCF-7细胞以0.3×10⁶细胞接种，37℃，5％CO₂条件下培养。接种的次日，使用RNA转染试剂(2.5μg/ml)，使用GAS5 LNA寡核苷酸(70μg/ml)，用GAS5 LNA寡核苷酸一式两份或一式三份地转染细胞。简而言之，用在OptiMEM中的Lipofectamine温育细胞10min，随后加入GAS5 LNA寡核苷酸，12小时后，去除转染混合物，洗涤细胞，在适当的生长培养基中，在常氧或低氧下，在37℃生长约20小时，收集标本，通过核酸原位杂交的方法检测细胞中GAS5和miR-21的表达。结果：见图4。

核酸原位杂交的具体步骤如下：

(1)脱蜡：

1)二甲苯脱蜡3次，每次5min；

2)100％酒精两次，每次2min；

3)移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。

(2)蛋白酶处理：

1)每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解；

2)37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min；

3)2×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min；

4)梯度酒精脱水(-20℃预冷)。

(3)变性：

1)每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；

2)78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；

3)78℃孵育8min；

4)即移入-20℃预冷70％酒精的染色缸内2min，再依次移入80％、90％和100％的-20℃预冷酒精内，每缸2min；

5)空气干燥。

(4)杂交：

1)准备探针；

2)取一个较大的湿盒，交叉放置切片；

3)滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；

4)盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。

5)镊子小心去除盖玻片；

6)43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；

7)2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；

8)切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥；

9)从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片；

10)每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；

11)去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min；

12)从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；

13)每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；

14)去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min；

15)从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；

16)每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；

17)1×PBS室温下洗3次，每次2min。

(5)细胞核染色：

1)张切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；

2)尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。

实施例3 体外分析：GAS5 LNA寡核苷酸对人miR-21表达的反义抑制(附图5)

将MCF-7细胞以0.3×10⁶细胞接种，37℃，5％CO2条件下培养。接种的次日，使用RNA转染试剂(2.5μg/ml)，使用不同浓度的GAS5 LNA寡核苷酸(10、30、50、70ug/ml)，用GAS5 LNA寡核苷酸一式两份或一式三份地转染细胞。简而言之，用在OptiMEM中的Lipofectamine温育细胞10min，随后加入GAS5 LNA寡核苷酸，12小时后，去除转染混合物，洗涤细胞，在适当的生长培养基中，在常氧或低氧下，在37℃生长约20小时，收集标本检测，进行mRNA分析。对照组未转染GAS5-LNA寡核苷酸。

结果：见图5。

实施例4 GAS5 LNA寡核苷酸诱导细胞凋亡(附图6、7)

细胞培养：在37℃、95％湿度和5％CO2，在添加了10％胎牛血清、GlutamaxI、NEAA、丙酮酸钠和庆大霉素的MEM(Sigma)中，培养肿瘤细胞MDA-MB-231，当细胞达到60-70％汇合度时，使用RNA转染试剂(2.5μg/ml)转染细胞。

在37℃、95％湿度和5％CO2，在含有10％胎牛血清、庆大霉素的MEM(Sigma)中，培养肿瘤细胞MCF-7，当细胞达到60-70％汇合度时转染细胞。

转染细胞换液48小时后给予UV照射，进行细胞凋亡检测。

结果：肿瘤细胞MDA-MB-231凋亡检测结果见图6；肿瘤细胞MCF-7凋亡检测结果见图7。

实施例5 动物实验检测GAS5 LNA寡核苷酸的体内抑瘤效果(附图8、9)

错配研究：将50只裸鼠(约25g)分组，利用肿瘤细胞MCF-7肿瘤细胞制作裸鼠皮下成瘤模型，并随机分为GAS5-LNA寡核苷酸处理组及对照组(未经GAS5-LNA寡核苷酸处理)。具体为：

(1)肿瘤细胞用1640培养基加10％FBS培养至细胞密度达40％；

(2)用RNA转染试剂Lipofectamine(Invitrogen)按照说明书的常规操作方式转染，终浓度达50nM；

(3)首先体外检验转染效率：细胞转染6小时之后，换上新鲜的培养基，继续培养；收集24h的细胞，提取细胞总RNA，按照实施例2的方法检测细胞内的目标基因的表达情况(U6作为内参)；

(4)上述MCF-7细胞用于小鼠动物模型的制作及后继体内干预实验；

(5)动态监测裸鼠皮下成瘤模型，成瘤四周后将动物处死。取肿瘤组织样品，测定肿瘤重量和体积。

结果：肿瘤重量和体积的测定结果分别见图8和图9。

需要说明的是，以上实施例2-实施例5使用的均是SEQ ID NO.1所示的LNA寡核苷酸。

实施例6 动物实验检测GAS5 LNA寡核苷酸的治疗效果

将裸鼠(24～26g)采用肿瘤细胞MCF-7制作裸鼠皮下成瘤模型，模型建立成功后抽取体重基本一致(最高-最低<2g)的裸鼠模型50只，随机分为5组，饲养条件相同。各组裸鼠模型在分组后的第1、2、3、4天注射药物，实验组1注射SEQ ID NO.1的GAS5 LNA寡核苷酸，实验组2注射SEQ ID NO.2的GAS5 LNA寡核苷酸，实验组3注射SEQ ID NO.3的GAS5 LNA寡核苷酸，实验组4注射SEQ ID NO.4的GAS5 LNA寡核苷酸，对照组注射等量溶剂Lipofectamine。GAS5 LNA寡核苷酸采用Lipofectamine(Invitrogen)配制成50nM/ml的溶液，直接注射入裸鼠模型的瘤体中，注射剂量为0.2ml。在最后一次注射后2周将动物处死，取出肿瘤组织，测定肿瘤重量和体积，计算各实验组肿瘤组织的重量降低率和体积降低率，重量降低率＝(实验组肿瘤组织总重量－对照组肿瘤组织总重量)×100％/对照组肿瘤组织总重量，体积降低率＝(实验组肿瘤组织总体积－对照组肿瘤组织总体积)×100％/对照组肿瘤组织总体积。结果见表1。

表1各实验组裸鼠模型肿瘤组织的重量降低率和体积降低率

实验组	肿瘤组织的重量降低率(％)	肿瘤组织的重量降低率(％)
			实验组1	85.3	84.6
实验组2	81.5	82.0
			实验组3	79.5	78.3
实验组4	82.9	83.3

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.LNA寡核苷酸，其特征在于，所述的LNA寡核苷酸由下述序列组成：A+T+T+ACAGGCATTAGACAGA+AAGCTG+G+T+C，其中+选自β-D-氧-LNA核苷酸类似物中的任一种。

2.根据权利要求1所述的LNA寡核苷酸，其特征在于，所述的LNA寡核苷酸选自下述序列的一种：

a)AGTCTAACAGGCATTAGACAGATAAGCTGAGCTCC；

b)AGTCTAACAGGCATTAGACAGAGAAGCTGAGCTCC；

c)AGTATCACAGGCATTAGACAGATAAGCTGAGCTAC；

d)AGTATCACAGGCATTAGACAGAGAAGCTGAGCTAC，

其中，G为G-β-D-氧-LNA核苷酸类似物，C为C-β-D-氧-LNA核苷酸类似物，A为A-β-D-氧-LNA核苷酸类似物，T为T-β-D-氧-LNA核苷酸类似物。

3.权利要求1或2所述的LNA寡核苷酸在制备药物中的应用，其特征在于，所述的药物用于治疗或诊断miR-21表达显著上调的疾病。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的miR-21表达显著上调的疾病选自miR-21表达显著上调的肿瘤和血管发生。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的miR-21表达显著上调的肿瘤选自前列腺癌、肺癌、乳腺癌、睾丸癌、子宫颈癌和结肠癌。

6.一种缀合物，其特征在于，所述的缀合物包含权利要求1或2所述的LNA寡核苷酸，和至少一个共价结合到所述LNA寡核苷酸上的非核苷酸或非多核苷酸部分。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有权利要求1或2所述的LNA寡核苷酸，以及可药用的稀释剂、载体或辅剂。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含水性载体，所述的水性载体包含用于将pH维持在7.35-7.45范围内的缓冲剂。

9.权利要求6所述的缀合物或权利要求7所述的药物组合物在制备药物中的应用，其特征在于，所述的药物用于治疗或诊断miR-21表达显著上调的疾病。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有权利要求1或2所述的LNA寡核苷酸，以及适合重配所述LNA寡核苷酸的盐水或缓冲溶液。