WO2005012908A1 - Procede d’obtention d’un systeme d’etalonnage unique applique au dosage multiparametrique d’anticorps, preferentiellement d’au moins des anticorps anti-gliadine et anticorps anti-transglutaminase - Google Patents

Procede d’obtention d’un systeme d’etalonnage unique applique au dosage multiparametrique d’anticorps, preferentiellement d’au moins des anticorps anti-gliadine et anticorps anti-transglutaminase Download PDF

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WO2005012908A1
WO2005012908A1 PCT/FR2004/001712 FR2004001712W WO2005012908A1 WO 2005012908 A1 WO2005012908 A1 WO 2005012908A1 FR 2004001712 W FR2004001712 W FR 2004001712W WO 2005012908 A1 WO2005012908 A1 WO 2005012908A1
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glia
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antibodies
antigen
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Pascale Laroche
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Biomedical Diagnostics Sa
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form

Definitions

  • Method for obtaining a single calibration system applied to the multi-parameter assay of antibodies preferably at least anti-Gliadin and anti-Transglutaminase antibodies.
  • the present invention relates, in general, to the field of antibody assays from biological samples and, more particularly to the calibration of such assay methods. Specifically, the present invention relates to a new method for obtaining a single calibration system, making it possible to simultaneously quantify several antibodies, in particular anti-Gliadin antibodies (hereinafter referred to as anti-GLIA) and anti-Transglutaminase antibodies (hereinafter referred to as anti-tTG), in the same reaction medium containing at least said two categories of particles.
  • anti-GLIA anti-Gliadin antibodies
  • anti-tTG anti-Transglutaminase antibodies
  • the process which is the subject of the invention is of particular interest for the diagnosis and the therapeutic monitoring of celiac disease.
  • unique calibration system is meant a singular system consisting of a single entity regardless of the number of antibodies sought simultaneously.
  • Celiac disease is associated with malabsorption syndrome, weight loss and frequent abdominal pain. It constitutes, at the same time an intolerance to gluten against which anti-GLIA antibodies (protein fraction of gluten) are directed, and an autoimmune disease by the presence of autoantibodies against the endomysium of muscle fibers, reticulin and, more recently discovered as the main antigen recognized by anti-endomysium, tissue transglutaminase (tTG). The search for these antibodies is necessary for screening for the disease and monitoring its treatment: the gluten-free diet.
  • Anti-GLIA antibodies of the IgG and IgA type have less specificity compared to the anti-endomysium or anti-tTG but they nevertheless seem interesting, on the one hand in children under two years of age in whom anti-GLIA IgA could appear before anti-endomysium IgA and, on the other hand, in the event of selective IgA deficiency.
  • Anti-reticulin antibodies are considered to be less sensitive than the previous ones.
  • the titer of anti-GLIA and anti-endomysium or anti-tTG decreases in a few months during a gluten-free diet well followed, and increases again in case of deviation from diet.
  • the combined assay of anti-GLIA and anti-tTG antibodies and, optionally anti-reticulin, in adults and / or in children represents a simple, rapid, sensitive and specific serological technique for screening and monitoring treatment.
  • the simultaneous presence of anti-GLIA and anti-tTG IgA antibodies with or without anti-GLIA and / or anti-tTG IgG allows an almost certain diagnosis of CD and an indication for performing a duodenojejunal biopsy.
  • the presence of anti-GLIA IgA and IgG constitutes a possible diagnosis, referring to the clinic.
  • the presence of antibodies only IgG is not in favor of a celiac disease, it is however necessary to take into account a possible deficit in IgA.
  • This method therefore leads not only to an additional handling cost, but also to a practical management problem, due to the size of the wells of the micro-titration plates, (the tests being generally carried out on ELISA micro-titration plates of 96 wells), as well as an increase in handling time.
  • this system involves the constitution of 10 different calibration systems, i.e. for 100 samples tested, an additional consumption of reagents ranging from 10 to 40% depending on the number of calibration points, and an obvious congestion problem.
  • the present invention aims to remedy the drawbacks of the prior art by proposing a new unique, rapid, simple and reproducible calibration method making it possible to reduce the consumption of reagents devoted to calibration, while also reducing the size of the plates.
  • the present invention relates to a calibration method, requiring only one calibration system, making it possible to quantify several antibodies simultaneously in the same biological sample, a method which is based on the preparation and the use of a specific immunological reagent.
  • a first aspect of the present invention relates to a process for the preparation of an immunological reagent used in the composition of a calibration system applied to the assay of anti-GLIA and anti-tTG antibodies, in the same biological sample, said method using at least two categories of particles, said at least two categories of particles being respectively sensitized by association with one of the antigens GLIA and tTG, said method comprising the steps which consist in: a) determining, for each category of particles sensitized and for each of n given quantities of antigens, in particular GLIA and tTG, associated with said particles, the response curve as a function of the concentration of homologous compound over a range of concentrations corresponding to the known measurement range of the antibodies to be assayed; b) select, for each category of sensitized particles, the curve corresponding to the smallest amount of antigen which gives a significant response signal and which is compatible with the use of a sample dilution and a reagent common marking antibodies, in particular anti-GLIA
  • Another aspect of the present invention relates to a method for preparing an immunological reagent used in the composition of a calibration system applied to the assay of anti-GLIA and anti-tTG antibodies in the same biological sample, said method using works two categories of particles, each category of particles being respectively sensitized by association with the corresponding antigens, namely GLIA and tTG, characterized in that it comprises the stages which consist in: a) determining, for each category of particles sensitized and for each of n given quantities of GLIA and tTG associated with said particles, the response curve as a function of the concentration of homologous compound over a range of concentrations corresponding to the known measurement range of the antibodies to be assayed; b) select, for each category of sensitized particles, the curve corresponding to the smallest amount of antigen which gives a significant response signal and which is compatible with the use of a dilution of sample and of a labeling reagent common to the anti-GLIA and anti-tTG antibodies simultaneously assayed
  • the method which is the subject of the present invention therefore applies to assay methods using different categories of sensitized particles. More particularly, such methods consist mainly of immunoassays of the type: - direct assay, by an immunometric or "sandwich” method, for example, of an antibody which has reacted with the specific antigen fixed beforehand on the particles, - direct assay , by an immunometric or “sandwich” method, for example, of an antigen having reacted with the specific antibody fixed beforehand on the particles, or - indirect assay, by a method called "by competition", of an antigen entering compete with a similar labeled antigen for its reaction with the antibody previously attached to the particles, or vice versa.
  • the reaction developed by bringing into contact the different categories of particles, sensitized respectively by an antigen, in particular GLIA and tTG, with the antibodies, in particular anti-GLIA and anti-tTG, to be assayed is measured by flow cytometry according to different modes. particle identification.
  • Mention may be made, for example, of particles of different colors and of uniform size (identified according to their specific color, with quantification of the antibody-antigen reactions by the addition of an external compound with excitation and emission lengths different from those of particles), particles of different sizes and identical color (identified according to their size, with quantification of the antibody-antigen reactions by measuring the size of the resulting aggregates) or particles of different sizes and of identical color (classified according to their size , with quantification of the antibody-antigen reactions by adding an external compound with excitation and emission wavelengths different from those of the particles).
  • These particles generally consist of polystyrene.
  • antigen means any substance from which the production of antibodies can be generated. Among these substances, mention may be made of proteins, haptens, allergens, peptides, medicaments or even drugs. In the present invention, the preferred antigens are GLIA and tTG. Other antigens can also be added to the two antigens mentioned above.
  • homologous compound an antibody, or any molecule capable of binding to a given antigen, in particular GLIA and / or tTG, and whose site of interaction with said antigen, in particular GLIA and / or tTG, is similar to the site of interaction between the given antibody, in particular anti- GLIA and / or anti-tTG, to be assayed and said antigen, in particular GLIA and / or tTG.
  • the homologous compound can be the antibody, or any molecule capable of binding to a given antigen, in particular GLIA and / or tTG, and whose site of interaction with said antigen, in particular GLIA and / or tTG, is similar to the site of interaction between the given antibody, in particular anti- GLIA and / or anti-tTG, to be assayed and said antigen, in particular GLIA and / or tTG.
  • the homologous compound can be the antibody
  • the first step of the process therefore consists in determining for each category of sensitized particles, as described above, the correlation which exists, for a given quantity of antigen, in particular of GLIA and of tTG, fixed to the particles, between the quantity of homologous compound and the magnitude of the emitted signal, representative of antigen / antibody interactions.
  • several tests are carried out by fixing a given quantity, different for each test, of antigen, in particular GLIA and tTG, to said particles, then bringing the particles thus sensitized into contact with different quantities. of homologous compound, identical for all the tests, and by measuring the signal resulting from their interaction.
  • the quantities of antigen, in particular of GLIA and of tTG, used vary in steps from 2 to 4.
  • the different quantities of homologous compound are selected so as to be included in the measurement range of the antibodies, in particular anti-GLIA and anti-tTG, which we seek to dose.
  • an antibody whose concentration can vary between 0 and 100 biological units
  • one will choose, for example, six given quantities of homologous compound corresponding to 0, 20, 40, 60, 80 and 100 biological units .
  • a population of samples characterized and certified on clinical-biological criteria is used, that is to say the presence or absence of a given antibody is validated by a clinical diagnosis and / or by the estimation of the antibody by one or more other assay method (s).
  • the result of this operation results in obtaining a dose / response curve between the quantity of homologous compound and the signals obtained for each of the n given quantities of antigen, in particular of GLIA and of tTG.
  • the concept of expression of the concentration in biological units is based on the assignment, for example, of a range 0-150 to the measurement range of each of the antibodies to be assayed. It is understood that these measurement ranges differ, in absolute terms, from one antibody to another and that, consequently, the same concentration of different antibodies expressed in biological units, for example 95 biological units (in short 95 UB) does not correspond to the same concentration, in absolute terms, in these same antibodies.
  • the concentration of homologous compounds is expressed, in the same way, in biological units over an identical range for all the antibodies.
  • the sensitization of the particles can be carried out in various ways, namely by covalence, by means of an intermediate molecular layer biologically and / or chemically reactive, or by the use of a system. of affinity interaction.
  • the sensitized particles insofar as they contain a reactive functionality, can be sensitized by covalence.
  • numerous immobilization protocols have been described as involving, without limitation, the following functional groups between the particles and the antigen:
  • the activation can be carried out by water-soluble carbodiimides, and be carried out in a single stage or, according to a particularly preferred embodiment, in two stages, with the carbodiimide alone or in the presence of N-hydroxy. It is followed by the elimination of the excess activator before fixing the antigen.
  • a homo- or hetero-bifunctional spacer arm having reactive chemical functions at each end, respectively identical or different, can be attached to the previously activated particles. These arms of variable length and functionality can be activated and covalently coupled, firstly, to the particles by one end, and secondly, to the compound to be fixed, by the other end. Chemically or biologically active intermediates can also be used for sensitization.
  • microparticles consisting of a protein (such as albumin), a mixture of proteins or a polymer (such as polylysine). This process is particularly used in the case of small particles which can then be coupled via bonding agents on the functions of this intermediate layer.
  • a protein such as albumin
  • polymer such as polylysine
  • Another way of raising awareness, this time non-covalent consists in using, without limitation, systems of interaction by affinity: - the biotin-avidin system, using particles coupled to avidin which are put in the presence of compounds which have been previously biotinylated, - protein A or protein G, having a receptor for the Fc fragment of the immunoglobulins, allowing the immobilization of an antibody and the outward orientation of its Fab fragments, responsible for antigenic recognition, or else - the indirect immobilization via an antibody specific for the compound to be fixed.
  • affinity - the biotin-avidin system, using particles coupled to avidin which are put in the presence of compounds which have been previously biotinylated, - protein A or protein G, having a receptor for the Fc fragment of the immunoglobulins, allowing the immobilization of an antibody and the outward orientation of its Fab fragments, responsible for antigenic recognition, or else - the indirect immobilization via an antibody specific for the compound to be fixed.
  • the selection of one of the aforementioned systems is carried out initially during the initial development phase.
  • the operating conditions are then fixed and subsequently applied systematically.
  • the sensitization medium consists of buffered water having a pH between 5 and 9 and an ionic strength between 0.01 and 0.1.
  • the antigen can be suspended in the same medium before carrying out said sensitization.
  • reaction produced by each category of sensitized particles is standardized and reproducible, that the signal provided by this reaction is representative of all of the antigen-antibody reactions developing simultaneously and that all of these reactions is controlled at the level of the sensitization process of each category of particles so that they all produce a similar signal in the presence of samples of the same degree of positivity, that is to say comprising substantially the same amount of the antibody assayed as expressed on its particular range of biological units.
  • “Significant response signal” means a signal that is high enough to ensure readability over the entire measurement range.
  • the curve selected must be substantially linear and have a sufficiently high measurement amplitude. Each type of particle is therefore sensitized by one of the techniques described above using the quantity of antigen determined above.
  • the next step c) then consists in determining the mean signal (SM) associated with a concentration in biological units, identical for the antibodies.
  • SM mean signal
  • a point characteristic of the dose / response curve selected in step b) is selected and the signal corresponding graphically to said point is taken as the mean signal SM.
  • the characteristic point otherwise called a positive point or a point of strong positivity, is chosen arbitrarily in the upper quarter of the linear part of the curve.
  • the mean signals SM obtained for the different categories of sensitized particles are then compared with one another and, if necessary, readjusted so that they are all included in a ratio of 1 to 5.
  • the reactivity is then readjusted by selecting in the dose / response curve another quantity of antigen and by recommencing the operation of sensitization of said particles with this new quantity of antigen until obtaining the resulting SM between in the aforementioned ratio of 1 to 5.
  • the fact that the SM of the various sensitized particles constituting the immunological reagent are all included in a ratio of 1 to 5 is decisive for ensuring a relatively equivalent immunological reactivity for each type of sensitized particles used and therefore for obtaining, in a range of measurements compatible with biological reality, values close enough to allow the use of a single calibration system common to all the antibodies.
  • the immunological reagent is then constituted by mixing, in a solvent, the different types of sensitized particles thus obtained. Mention may be made, as possible solvents, of mixtures of proteins and amino acids or else a mixture of proteins inert with respect to the antibodies to be assayed and allowing particle stabilization. In any event, the solvents used are selected so as to allow the conservation of all the sensitized particles, and their choice is therefore dictated by the nature of the antigens, in particular GLIA and tTG. Therefore, said solvent can be defined so that it is suitable and common to all of these two antigens.
  • the solvent used is buffered at a pH between 7 and 9 and has an ionic strength between 0.01 and 0.1.
  • an immunological reagent intended for the assay of multiple antibodies, in particular anti-GLIA and anti-tTG, in biological samples, said reagent comprising a solvent and, mixed within said solvent, different categories of particles, each of which is sensitized by association respectively with a given amount of specific antigen of one of the antibodies to be assayed, in particular GLIA and tTG, with, for each of the categories of particles, and for a given concentration of homologous compound of the antigen, as expressed in biological units, said given quantity of antigen resulting in a signal called "average signal", which is included in a ratio of 1 to 5 with the average signals obtained for the other categories of particles.
  • the present invention relates to a kit for assaying multiple antibodies, in particular anti-GLIA and anti-tTG, in biological samples using different categories of particles, each category of particles being sensitized by a specific antigen of one of the analytes to be assayed, in particular GLIA and tTG, which comprises: i) an immunological reagent resulting from the method as described above, ii) at least one calibration standard consisting of a single homologous compound reacting with one of the categories of particles entering into the composition of the immunological reagent, iii) a table of correspondence between the concentration, expressed in biological units, of the homologous compound constituting the calibration standard and that of each of the compounds homologous to the others antigens attached to the other categories of particles entering into the composition of the immunological reagent, and iv) a brand reagent ge.
  • said calibration standard comprises a homologous compound reacting directly or indirectly with the antigen attached to the sensitized particle.
  • Indirect fixation can be done, for example, via a protein used to saturate the binding sites of the particle not occupied by the antigen. This protein must be chosen so as not to interfere with the specific system and be present on a single particle category.
  • the quantification medium must contain a labeling reagent specific for the antibodies to be assayed (consisting of one or more compounds) and a labeling reagent specific for the inert protein.
  • said homologous compound is of the same origin as the antibodies, in particular anti-GLIA and / or anti-tTG, to be assayed, for example, of human origin.
  • said homologous compound and the antibodies, in particular anti-GLIA and anti-tTG, to be assayed are of different origins.
  • the antibody to be assayed is of human origin, such as autoantibodies present in human blood samples
  • the homologous compound may be, for example, of animal origin as long as it is capable of reacting specifically with the antigen, namely, in particular GLIA or tTG.
  • the quantification medium must, in this case, contain both a specific labeling reagent for samples of human origin and a specific labeling reagent for the standard of animal origin.
  • the preparation of the calibration standard implies a prior optimization of its concentration so as to produce an SM included in a ratio of 1 to 5 compared to the SM obtained for each category of sensitized particles during the preparation of the immunological reagent.
  • the "correspondence table” consists of a frame of reference, which can be in the form of a table, a graph, etc., which gives the different concentrations, expressed in units biological, of the homologous compound constituting the calibration standard and that of each of the compounds homologous to the antigens, in particular GLIA and tTG fixed on the other categories of particles entering into the composition of the immunological reagent.
  • the correspondence table is produced empirically, prior to the preparation of the kits, in the following manner.
  • labeling reagent this consists of an immunological compound capable of quantifying the reaction between the antibodies, in particular anti-GLIA and anti-tTG and the immunological reagent, said immunological compound being coupled to a marker which is preferably a fluorochrome.
  • immunological compound is meant any compound, natural or synthetic, capable of complexing specifically with a complementary compound, such as antibodies and antigens.
  • said labeling reagent reacts with the homologous compound complex or the antibody, in particular anti-GLIA and / or anti-tTG, to be assayed / antigen, in particular GLIA and / or tTG, in which case the assay is direct, or with the antigen, in particular GLIA and / or tTG, not complexed, in which case the assay is indirect.
  • the labeling reagent can be prepared from a single compound, reacting with, for example, an antigen specificity common to all of the homologous compounds, or result from the mixture of different compounds reacting specifically with different homologous compounds.
  • the present invention relates to a method for assaying antibodies, in particular anti-GLIA and anti-tTG present in a biological sample and, more particularly, a method for implementing the kit such as described above which consists in measuring the signals resulting from the interaction between the immunological reagent and, on the one hand, the biological sample, on the other hand, the calibration standard, and to determine and apply, to the various resulting signals, a correction factor so as to obtain the titration, expressed in biological units, of the antibodies, in particular anti-GLIA and anti-tTG, of the sample, said correction factor being the ratio between the signal obtained for the calibration standard and the concentrations obtained from the correspondence table .
  • the method of implementing the kit according to the present invention therefore rests on three steps, namely a first step of determining the different signals emitted by flow cytometry, a second step of calculation to determine the different correction factors from the signal emitted by the calibration standard and a third calculation step for the titration of the antibodies, in particular anti-GLIA and anti-tTG, of the sample from the correction factor previously obtained and the signals emitted by the different samples tested.
  • the method which is the subject of the present invention comprises the following steps: a) incubating, on the one hand, the biological sample and, on the other hand, the calibration standard, with a predetermined quantity of immunological reagent; b) add the labeling reagent; c) measure, by flow cytometry, the signals emitted, on the one hand, by the calibration standard, on the other hand by the sample; d) determine, for each category of sensitized particles, a correction factor which corresponds to the ratio between the concentration in biological units of each of the antibodies, in particular anti-GLIA and anti-tTG, to be assayed as given by the correspondence table and the signal corresponding to the calibration standard and measured in step c); e) multiply by said correction factor, calculated for each antibody, the signal emitted by each category of particles and measured in step c) to deduce therefrom the concentration in biological units of each antibody in the sample tested.
  • the method which is the subject of the present invention can be applied to direct dosages.
  • the labeling reagent is specific for the antibodies, in particular anti-GLIA and anti-tTG, which it is desired to assay and, therefore, the quantity of antibodies included in a sample is directly proportional to the signal. emitted by said labeling reagent.
  • the immunological reagent consists of different categories of particles each sensitized by antigens, in particular GLIA and tTG.
  • the antibodies, in particular anti-GLIA and anti-tTG, which one seeks to assay will complex with the said antigen (s) attached to the particles.
  • the labeling reagent which consists of one or more second antibodies labeled with a fluorochrome and specific of the antibodies, in particular anti-GLIA and anti-tTG, which one seeks to assay, will bind to said antibodies previously complexed with antigens, in particular GLIA and tTG, forming the sensitization layer of particles.
  • the signal emitted by the fluorochrome associated with each category of particles is proportional to the quantity of antibodies, in particular anti-GLIA and anti-tTG, present in the sample.
  • second antibodies it is necessary to understand any substance capable of complexing with the antibodies which it is sought to assay, that is to say capable of reacting with an epitope of said antibodies different from that used to ensure their binding to the antigen.
  • the method which is the subject of the present invention can be applied to so-called indirect dosages.
  • Such assays are no longer based solely on the complementarity between two immunological species, but on the competition between two close immunological species to complex with a third immunological species.
  • the simultaneous and indirect quantification of different antigens with said antibodies to be assayed which consist of antigens, said antigens in antibodies and said labeling reagent in a mixture of antigens labeled with an incoming fluorochrome in competition with the antibodies to be assayed to complex with the antigens.
  • the immunological reagent consists of different categories of particles each sensitized by a specific antibody.
  • the antigens that one seeks to assay will then enter into competition with the said antigen (s), labeled with a fluorochrome, constituting the labeling reagent.
  • the increase in the concentration of antigen which one seeks to assay results in the increase in the concentration of antigen complexes which one seeks to assay / fixed antibody, to the detriment of the formation of labeled antigen / fixed antibody complexes. , with a corresponding decrease in signal.
  • the signal emitted by the fluorochrome associated with each category of particles is inversely proportional to the amount of antigens present in the sample.
  • the process which is the subject of the present invention is based on the use of uniformly sized microspheres differently colored and a flow cytometer interfaced with a computerized digitalization and signal processing system.
  • a red diode of the flow cytometer classifying each category of microspheres on the basis of its unique fluorescence (from red to orange), allows the identification of the parameter analyzed.
  • a laser excites the fluorescence of a secondary compound to quantify the specific reaction associated with it.
  • Each antigen (gliadin and tissue transglutaminase) necessary for carrying out the test is covalently coupled to a category of colored microspheres, which support specific immunological reactions.
  • the mixture of sensitized particles obtained can be used for the detection of autoantibodies of isotype IgA anti-gliadin and anti-transglutaminase IgA or IgG.
  • the test is carried out in a 96-well microplate with a filter membrane at their base. First, the diluted sample is distributed in a well where one of the two mixtures of microspheres has been previously deposited. If it contains one or more sought-after autoantibodies, these will bind to the corresponding antigen (s) on the different categories of microspheres. After incubation, washing by filtration makes it possible to remove the unbound elements.
  • a specific conjugate of the desired isotype (which may consist of anti-human IgA or anti-IgG antibodies coupled to phycoerythrin) is added. It attaches to previously captured autoantibodies. The reaction developed is then directly analyzed by the flow cytometer, which classifies each category of colored particles according to its fluorescence by simultaneously measuring there the fluorescence emitted by the conjugate.
  • a calibration system allows, by interpolation, to define the title of the sample for each antigenic and isotype specificity (IgA or / and IgG) sought.
  • each category of particles Prior to sensitization, each category of particles is activated by a process which consists of: adding 1 ml of a carbodiimide solution, dosed between 10 and 40 mg / ml, to 1 ml of particles (i.e. approximately 10 7 particles ), - incubation for 20 to 60 minutes at room temperature, - three washes of the particles in distilled water by centrifuging at lOOOxg for 2 minutes to remove the excess carbodiimide.
  • the three curves in FIG. 1 correspond to 3 concentrations of antigen.
  • the curve used is that corresponding to an antigen concentration of 25 ⁇ g / ml of particles.
  • the higher concentrations result in a saturation of the antigen-antibody reaction for the high values, leading to a loss of linearity.
  • the curve retained is that obtained with 100 ⁇ g / ml of particles which combines reactivity and linearity. The lower concentrations give insufficient reactivity.
  • Verification of the reactivity ratio between the 2 types of particles The average signal associated with an identical concentration in biological units for the 2 types of autoantibody is determined by choosing a concentration located in the upper quarter of each curve selected and by comparing the signal fluorescence emitted. For example, a concentration of 100U corresponds respectively to a signal of 675 for tTG and 498 for GLIA. The ratio between these two signals is 1.35. The value of this ratio (between 1 and 5) is decisive in ensuring an equivalent immunological reactivity for each type of sensitized particles and therefore obtaining values close enough to allow a unique calibration system, while guaranteeing measurement ranges compatible with biological reality.
  • Sensitization of the activated particles The particles activated previously are then sensitized according to the conditions defined above, by suspension of each type of particle in a volume of lml containing respectively 25 ⁇ g of tTg and lOO ⁇ g of GLIA followed by an incubation 4 to 6 H at ambient temperature.
  • the sensitized particles are then washed as above and suspended in a pH8 buffer containing a mixture of protein substances intended to saturate the free sites and to reduce the particles to a concentration of the order of 10. to 5.10 6 particles per ml.
  • the immunological reagent is then constituted by mixing volume to volume of each category of sensitized particles and stored at + 5 ° C. until use.
  • the single calibration standard is constituted by an anti-gliadin human serum of isotype IgA, diluted in a phosphate buffer pH 7.4 which will react specifically with the particles sensitized by the GLIA antigen.
  • the correspondence table for this calibration standard is as follows. GLIA: 130UA tTG: 90UA
  • the AU concentrations in the correspondence table are divided by the value of the signal measured above for the calibration standard reacting with particles sensitized by the GLIA antigen. For a signal of 650 for example, the following correction factors are obtained:
  • BINDAZYME The Binding Site (TBS): Human Anti Gliadin IgA EIA and Human Anti Tissue Transglutaminase EIA.
  • Simultaneous assay protocol This protocol consists in taking 50 ⁇ l of previously prepared immunological reagent and mixing it, on the one hand with lOO ⁇ l of calibration standard (deposited in duplicate) and, on the other hand, with lOO ⁇ l of samples prediluted with 1/200 in a phosphate buffer (type PBS pH 7.4). The deposits and mixing are carried out in a 96-well microplate having at their base a 1.2 ⁇ m filter membrane. One well is reserved for mixing the immunological reagent with the buffer alone in order to constitute the “reagent blank”, making it possible to evaluate the signal associated with each category of particles which will then be systematically subtracted from the signal obtained for the other wells.
  • the following steps consist of: -incubate for 30 minutes at room temperature, -wash twice by filtration through the microplate filtering membrane -remit the medium in suspension in lOO ⁇ l of labeling reagent, consisting of a goat antibody reacting specifically with human immunoglobulins A and conjugated to phycoerythrine. Its concentration is adapted to the antigen-antibody reactions to be detected simultaneously, - incubate for 30 minutes at room temperature, and - analyze by flow cytometry.
  • At least 200 particles from each category are analyzed for about fifteen seconds.
  • the computer system classifies each of the particles according to its color and then determines the average fluorescence emitted by the conjugate for each antibody specificity.
  • Glia IgA negative weakly negative tTG IgA positive Glia IgG Glia IgA negative weakly negative IgG positive monoclonal Glia IgA negative weakly negative complement positive tTG IgA negative weakly weak no positive positive tTG IgA negative weakly negative donor of blood tTG IgA weakly negative weak factor positive positive rheumat.
  • the positivity threshold (20UA) corresponds to the 99.5 th percentile of the distribution of values for the two specificities
  • the negativity threshold (15UA) corresponds to the 96 th percentile for the 2 specificities. Between these 2 thresholds, the results are considered borderline.

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Abstract

L'invention utilise différentes catégories de particules sensibilisées, chacune par un antigène spécifique de l'un des anticorps à doser notamment des anticorps anti-Gliadine et des anticorps anti-Transglutaminase. On prépare un réactif immunologique constitué par un mélange de chacune desdites catégories de particules respectivement sensibilisées par une quantité sélectionnée d'antigènes donnés, notamment GLIA et tTG, mesure les signaux résultants de l'interaction entre ledit réactif immunologique et, d'une part, l'échantillon biologique, d'autre part, un standard d' étalonnage, détermine un facteur de correction à appliquer aux différents signaux résultants de manière à obtenir la titration, en unités biologiques, de chaque anticorps de l'échantillon.

Description

Procédé d'obtention d'un système d'étalonnage unique appliqué au dosage multiparamétrique d'anticorps, préférentiellement d'au moins des anticorps anti-Gliadine et anti-Transglutaminase .
La présente invention concerne, d'une manière générale, le domaine des dosages d'anticorps à partir d'échantillons biologiques et, plus particulièrement l'étalonnage de tels procédés de dosage. De manière spécifique, la présente invention a pour objet un nouveau procédé d'obtention d'un système d'étalonnage unique, permettant de quantifier simultanément plusieurs anticorps, notamment des anticorps anti-Gliadine (désignés ci-après par anti-GLIA) et des anticorps anti-Transglutaminase (désignés ci-après par anti-tTG) , dans un même milieu réactionnel contenant au moins lesdites deux catégories de particules. Le procédé objet de l'invention trouve un intérêt particulier pour le diagnostic et le suivi thérapeutique de la maladie coeliaque. Par système d'étalonnage "unique", on entend un système singulier constitué en une seule entité quel que soit le nombre d'anticorps recherchés simultanément. La maladie coeliaque (MC) est associée à un syndrome de malabsorption, une perte de poids et de fréquentes douleurs abdominales. Elle constitue, à la fois une intolérance au gluten contre lequel sont dirigées des anticorps anti-GLIA (fraction protéique du gluten), et une maladie auto-immune par la présence d'auto-anticorps contre l'endomysium des fibres musculaires, la réticuline et, plus récemment découverte comme étant le principal antigène reconnu par les anti-endomysium, la transglutaminase tissulaire (tTG) . La recherche de ces anticorps est nécessaire au dépistage de la maladie et au suivi de son traitement : le régime sans gluten. Les anticorps anti-GLIA de type IgG et IgA ont une spécificité moindre par rapport aux anti- endomysium ou anti-tTG mais ils semblent cependant intéressants, d'une part chez les enfants de moins de deux ans chez lesquels les IgA anti-GLIA pourraient apparaître avant les IgA anti-endomysium et, d'autre part, en cas de déficit sélectif en IgA. Les anticorps anti-réticuline sont considérés comme moins sensibles que les précédents. Enfin le titre des anti-GLIA et des anti-endomysium ou anti-tTG diminue en quelques mois au cours d'un régime sans gluten bien suivi, et augmente à nouveau en cas d'écart de régime. Le dosage combiné des anticorps anti-GLIA et anti-tTG et, optionnellement anti-réticuline, chez l'adulte et/ou chez l'enfant représente une technique sérologique simple, rapide, sensible et spécifique de dépistage et de suivi de traitement . La présence simultanée d'anticorps IgA anti-GLIA et anti-tTG accompagnée ou non d' IgG anti-GLIA et/ou anti-tTG permet un diagnostic quasi certain d'une MC et une indication à pratiquer une biopsie duodénojéjunale . La présence d' IgA et d' IgG anti-GLIA constitue un diagnostic possible, en se référant à la clinique. La présence d'anticorps uniquement IgG n'est pas en faveur d'une maladie coeliaque, il faut cependant tenir compte d'un éventuel déficit en IgA. Les techniques classiques de dosage consistent à doser chaque anticorps séparément et, pour ce faire, à réaliser pour chacun desdits anticorps un étalonnage propre du système utilisé. Il en résulte un grand nombre de manipulations et une consommation importante en réactifs, ce qui a pour conséquence un prix relativement élevé. Si une telle manière d'opérer reste envisageable dans le contexte de la recherche où la quantité de paramètres à doser est limitée et ciblée, elle pose un sérieux problème de coût dans le contexte de la médecine, où, en laboratoires d'analyse, l'on cherche à doser rapidement un grand nombre d'anticorps et ce à moindre coût. II a récemment été décrit, notamment dans les demandes de brevet internationales WO 99/36564 et WO 97/14028, une technique permettant de quantifier, de façon précise et reproductible, plusieurs analytes en un seul et même dosage à partir du même échantillon. Cette technique repose sur l'utilisation de différentes catégories de particules fluorescentes, chaque catégorie de particules étant sensibilisée par des ligands ayant des propriétés différentes, lesdits ligands étant adaptés à se lier de façon directe ou indirecte aux analytes et consistant généralement en des anticorps ou des antigènes. La quantification de la réaction entre ligand et analyte est réalisée par l'intermédiaire d'un composé fluorescent de longueurs d'onde d'excitation et d'émission différentes de celles des particules fluorescentes. Ainsi, une simple lecture par cytométrie en flux permet de quantifier la réaction associée à chaque catégorie de particules et donc de déduire de ladite quantification les quantités des différents analytes présents dans un même échantillon. Cependant, cette quantification nécessite au préalable la construction d'autant de systèmes d'étalonnage que d' analytes à doser, c'est-à-dire de réaliser X*Y dosages réservés à l'étalonnage, X étant le nombre d' analytes à doser simultanément (ou le nombre de particules sensibilisées par des ligands ayant des propriétés différentes) et Y le nombre de points d'étalonnage. Cette méthode entraîne donc non seulement un surcoût de la manipulation, mais également un problème de gestion pratique, du fait de l'encombrement des puits des micro-plaques de titration, (les tests étant généralement réalisés sur des plaques de micro-titration ELISA de 96 puits), ainsi qu'une augmentation de la durée de la manipulation. Par exemple, pour le dosage simultané de 10 analytes , ce système implique la constitution de 10 systèmes d'étalonnage différents, soit pour 100 échantillons testés, une consommation supplémentaire en réactifs allant de 10 à 40% selon le nombre de points d'étalonnage, et un problème évident d'encombrement. La présente invention vise à remédier aux inconvénients de l'art antérieur en proposant un nouveau procédé d'étalonnage unique, rapide, simple et reproductible permettant de diminuer la consommation de réactifs consacrée à l'étalonnage, tout en diminuant également l'encombrement des plaques de titration. Ce but est atteint en ce sens que la présente invention concerne un procédé d'étalonnage, ne nécessitant qu'un seul système d'étalonnage, permettant de quantifier simultanément plusieurs anticorps dans un même échantillon biologique, procédé qui repose sur la préparation et l'utilisation d'un réactif immunologique spécifique. Plus particulièrement, un premier aspect de la présente invention concerne un procédé de préparation d'un réactif immunologique entrant dans la composition d'un système d'étalonnage appliqué au dosage des anticorps anti- GLIA et anti-tTG, dans un même échantillon biologique, ledit procédé mettant en oeuvre au moins deux catégories de particules, lesdites au moins deux catégories de particules étant respectivement sensibilisées par association avec un des antigènes GLIA et tTG, ledit procédé comprenant les étapes qui consistent à : a) déterminer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées et pour chacune de n quantités données d'antigènes, notamment GLIA et tTG, associées auxdites particules, la courbe de réponse en fonction de la concentration en composé homologue sur une gamme de concentrations correspondant à la plage de mesure connue des anticorps à doser; b) sélectionner, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, la courbe correspondant à la plus petite quantité d'antigène qui donne un signal de réponse significatif et qui est compatible avec l'utilisation d'une dilution d'échantillon et d'un réactif de marquage communs aux anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, simultanément dosés ; c) évaluer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, d'après la courbe retenue à l'étape b) , le signal moyen correspondant au signal associé à un point caractéristique de chacune desdites courbes, obtenant ainsi autant de signaux moyens que de catégories de particules ; d) ajuster, le cas échéant, les quantités d'antigène, notamment GLIA et/ou tTG, associé à chaque catégorie de particules de sorte que l'ensemble des signaux moyens évalués à l'étape c) soit compris dans un rapport de 1 à 5, et e) mélanger, dans un solvant approprié, les différentes catégories de particules sensibilisées qui répondent au critère de l'étape d) .
Un autre aspect de la présente invention concerne un procédé de préparation d'un réactif immunologique entrant dans la composition d'un système d'étalonnage appliqué au dosage des anticorps anti-GLIA et anti-tTG dans un même échantillon biologique, ledit procédé mettant en oeuvre deux catégories de particules, chaque catégorie de particules étant respectivement sensibilisée par association avec les antigènes correspondants, à savoir la GLIA et la tTG, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent à : a) déterminer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées et pour chacune de n quantités données de GLIA et tTG associées auxdites particules, la courbe de réponse en fonction de la concentration en composé homologue sur une gamme de concentrations correspondant à la plage de mesure connue des anticorps à doser; b) sélectionner, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, la courbe correspondant à la plus petite quantité d'antigène qui donne un signal de réponse significatif et qui est compatible avec l'utilisation d'une dilution d'échantillon et d'un réactif de marquage communs aux anticorps anti-GLIA et anti-tTG simultanément dosés ; c) évaluer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, d'après la courbe retenue à l'étape b) , le signal moyen correspondant au signal associé à un point caractéristique de chacune desdites courbes, obtenant ainsi autant de signaux moyens que de catégories de particules ; d) ajuster, le cas échéant, les quantités de GLIA et/ou tTG associée à chaque catégorie de particules de sorte que l'ensemble des signaux moyens évalués à l'étape c) soit compris dans un rapport de 1 à 5, et e) mélanger, dans un solvant approprié, les différentes catégories de particules sensibilisées qui répondent au critère de l'étape d) .
Le procédé objet de la présente invention s'applique donc à des procédés de dosage mettant en oeuvre différentes catégories de particules sensibilisées. Plus particulièrement, de tels procédés consistent principalement en des immunodosages du type : - dosage direct, par une méthode immunométrique ou "sandwich", par exemple, d'un anticorps ayant réagi avec l'antigène spécifique fixé préalablement sur les particules, - dosage direct, par une méthode immunométrique ou "sandwich", par exemple, d'un antigène ayant réagi avec l'anticorps spécifique fixé préalablement sur les particules, ou - dosage indirect, par une méthode dite "par compétition", d'un antigène entrant en compétition avec un antigène similaire marqué, pour sa réaction avec l'anticorps préalablement fixé sur les particules, ou vice- versa . Ces différents dosages seront décrits plus en détail par la suite. La réaction développée par mise en contact des différentes catégories de particules, sensibilisées respectivement par un antigène, notamment la GLIA et la tTG, avec les anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, à doser est mesurée par cytométrie en flux selon différents modes d'identification des particules. On peut citer, par exemple, des particules de couleurs différentes et de taille uniforme (identifiées selon leur couleur spécifique, avec quantification des réactions anticorps-antigène par adjonction d'un composé externe de longueurs d'excitation et d'émission différentes de celles des particules), des particules de tailles différentes et de couleur identique (identifiées selon leur taille, avec quantification des réactions anticorps- antigène par mesure de la taille des agrégats résultants) ou encore des particules de tailles différentes et de couleur identique (classées selon leur taille, avec quantification des réactions anticorps-antigène par adjonction d'un composé externe de longueurs d'onde d'excitation et d'émission différentes de celles des particules). Ces particules sont constituées généralement de polystyrène. Toutefois, elles peuvent être également constituées de tout polymère leur conférant des propriétés physico-chimiques spécifiques (fonctionnalité, densité ou encore solubilité) comme du styrène-acide maléique, du styrène-acide méthacrylique, du styrène-acrylamide ou du poly (méthacrylate de méthyle) . On entend par "antigène" toute substance à partir de laquelle peut être générée la production d'anticorps. Parmi ces substances, on peut citer les protéines, les haptènes, les allergènes, les peptides, les médicaments ou encore les drogues. Dans la présente invention, les antigènes préférés sont la GLIA et la tTG. D'autres antigènes peuvent également être additionnés aux deux antigènes précédemment cités. Par "composé homologue", il faut comprendre un anticorps, ou toute molécule capable de se fixer à un antigène donné, notamment la GLIA et/ou la tTG, et dont le site d'interaction avec ledit antigène, notamment la GLIA et/ou la tTG, est similaire au site d'interaction entre l'anticorps donné, notamment les anticorps anti-GLIA et/ou anti-tTG, à doser et ledit antigène, notamment la GLIA et/ou la tTG. Le composé homologue peut être l'anticorps
La première étape du procédé consiste donc à déterminer pour chaque catégorie de particules sensibilisées, telles que décrites plus haut, la corrélation qui existe, pour une quantité donnée d'antigène, notamment de GLIA et de tTG, fixée aux particules, entre la quantité de composé homologue et la grandeur du signal ém s, représentatif des interactions antigène/anticorps. En pratique, pour chaque catégorie de particules, plusieurs essais sont effectués en fixant une quantité donnée, différente pour chaque essai, d'antigène, notamment de GLIA et de tTG, auxdites particules, en mettant ensuite en contact les particules ainsi sensibilisées avec différentes quantités de composé homologue, identiques pour l'ensemble des essais, et en mesurant le signal résultant de leur interaction. Plus particulièrement, les quantités d' antigène notamment de GLIA et de tTG, utilisées varient par pas de 2 à 4. Les différentes quantités de composé homologue sont sélectionnées de manière à être comprises dans la plage de mesure des anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, que l'on cherche à doser. Ainsi, si l'on cherche à doser un anticorps dont la concentration peut varier entre 0 et 100 unités biologiques, on choisira, par exemple, six quantités données de composé homologue correspondant a 0, 20, 40, 60, 80 et 100 unités biologiques. Dans la pratique, on utilise une population d'échantillons caractérisés et certifiés sur des critères clinico-biologiques, c'est-à-dire dont la présence ou l'absence en un anticorps donné est validée par un diagnostic clinique et/ou par l'estimation de l'anticorps par une ou plusieurs autre (s) méthode (s) de dosage . Le résultat de cette opération se traduit par l'obtention d'une courbe dose/réponse entre la quantité de composé homologue et les signaux obtenus pour chacune des n quantités données d'antigène, notamment de GLIA et de tTG. Le concept d'expression de la concentration en unités biologiques repose sur l'affectation, par exemple, d'une gamme 0-150 à la plage de mesure de chacun des anticorps à doser. On comprend que ces plages de mesure diffèrent, dans l'absolu, d'un anticorps à l'autre et que, par suite, une même concentration en différents anticorps exprimée en unités biologiques, par exemple 95 unités biologiques (en abrégé 95 UB) ne correspond pas à la même concentration, dans l'absolu, en ces mêmes anticorps. La concentration en composés homologues est exprimée, de même façon, en unités biologiques sur une gamme identique pour tous les anticorps . A ce niveau, il faut noter que la sensibilisation des particules peut être effectuée de différentes manières, à savoir par covalence, par le biais d'une couche moléculaire intermédiaire biologiquement et/ou chimiquement réactive, ou encore par l'utilisation d'un système d'interaction par affinité. Les particules sensibilisées, dans la mesure où elles comportent une fonctionnalité réactive, peuvent être sensibilisées par covalence. Ainsi, de nombreux protocoles d' immobilisation ont été décrits comme faisant intervenir de façon non limitative les groupements fonctionnels suivants entre les particules et l'antigène :
- COOH/R-NH2 ou R-OH , - CO-NH2 /NH2-NH2 , - C ( =0 ) -0-CH3/NH2-NH2 , - NH2CHO/RCOOH , ou encore - R-NH2 ou NH2-NH2 . Il est à noter que, lors de l'utilisation de la plupart des couples cités plus haut, il est nécessaire d'activer préalablement certaines fonctions, comme par exemple les fonctions COOH, afin qu'elles puissent réagir, par exemple, avec les groupements fonctionnels de l'antigène, tels que des groupements aminés - aliphatiques ou aromatiques. Selon une autre forme d'exécution préférée, l'activation peut être réalisée par des carbodiimides hydrosolubles, et être effectuée en une seule étape ou, selon une forme d'exécution particulièrement préférée, en deux étapes, avec le carbodiimide seul ou en présence de N-hydroxysuccinimide. Elle est suivie de l'élimination de l'excès d' activateur avant fixation de l'antigène. Selon encore une autre forme d'exécution, un bras espaceur homo- ou hétéro-bifonctionnel, présentant des fonctions chimiques réactives à chaque extrémité, respectivement identiques ou différentes, peut être fixé aux particules préalablement activées. Ces bras de longueur et de fonctionnalité variables peuvent être activés et couplés par covalence, dans un premier temps, aux particules par l'une des extrémités, et dans un deuxième temps, au composé à fixer, par l'autre extrémité. Des intermédiaires chimiquement ou biologiquement actifs peuvent également être utilisés pour la sensibilisation. Ils créent à la surface des microparticules une couche moléculaire intermédiaire constituée par une protéine (telle que l'albumine), un mélange de protéines ou un polymère (tel que la polylysine) . Ce procédé est particulièrement utilisé dans le cas de particules de petite taille qui peuvent ensuite être couplées par l'intermédiaire d'agents de liaison sur les fonctions de cette couche intermédiaire. Une autre voie de sensibilisation, cette fois non covalente, consiste à utiliser, de façon non limitative, des systèmes d' interaction par affinité : - le système biotine-avidine, en utilisant des particules couplées à l'avidine qui sont mises en présence de composés ayant été préalablement biotinylés, - la protéine A ou la protéine G, disposant d'un récepteur pour le fragment Fc des immunoglobulines, permettant l'immobilisation d'un anticorps et l'orientation vers l'extérieur de ses fragments Fab, responsables de la reconnaissance antigénique, ou encore - l'immobilisation indirecte par l'intermédiaire d'un anticorps spécifique du composé à fixer. Cette énumération n'est aucunement limitative et il est évident que tout procédé de sensibilisation similaire connu de l'homme du métier peut également être utilisé. Pour chaque antigène à fixer, la sélection d'un des systèmes précités est réalisée initialement pendant la phase initiale de mise au point. Les conditions opératoires sont ensuite fixées et appliquées ultérieurement de façon systématique. Dans une forme d'exécution préférée, le milieu de sensibilisation est constitué d'eau tamponnée ayant un pH compris entre 5 et 9 et une force ionique comprise entre 0,01 et 0,1. Afin de maintenir constant le milieu, l'antigène peut être mis en suspension dans le même milieu avant d'effectuer ladite sensibilisation. L'intérêt d'un tel système réside dans sa simplicité d'utilisation, son faible coût et son indépendance réactionnelle par rapport aux autres réactions simultanées. Cela est rendu possible par le fait que la réaction produite par chaque catégorie de particules sensibilisées est standardisée et reproductible, que le signal fourni par cette réaction est représentatif de l'ensemble des réactions antigène-anticorps se développant simultanément et que l'ensemble de ces réactions est maîtrisé au niveau du procédé de sensibilisation de chaque catégorie de particules de façon à ce qu'elles produisent toutes un signal similaire en présence d'échantillons de même degré de positivite, c'est-à-dire comprenant sensiblement la même quantité en l'anticorps dosé telle qu'exprimée sur sa gamme d'unités biologiques particulière. Une fois les courbes dose/réponse obtenues, il est déterminé, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, comme décrit à l'étape b) , la courbe correspondant à la plus petite quantité d'antigène, notamment de GLIA et de tTG, donnant, graphiquement, un signal de lecture significatif et compatible avec l'utilisation d'une dilution d'échantillon ainsi que d'un réactif de marquage communs pour les anticorps simultanément détectés. Par "signal de réponse significatif", il faut comprendre un signal suffisamment élevé pour assurer une précision de lecture sur l'ensemble de la plage de mesure. En pratique, la courbe sélectionnée doit être sensiblement linéaire et avoir une amplitude de mesure suffisamment élevée. Chaque type de particule est donc sensibilisé par l'une des techniques décrites plus haut en employant la quantité d'antigène déterminée ci-dessus. L'étape suivante c) consiste alors à déterminer le signal moyen (SM) associé à une concentration en unités biologiques, identique pour les anticorps. Pour ce faire, un point caractéristique de la courbe dose/réponse retenue à l'étape b) est sélectionné et le signal correspondant graphiquement audit point est pris comme signal moyen SM. Le point caractéristique, autrement appelé point positif ou de forte positivite, est choisi arbitrairement dans le quart supérieur de la partie linéaire de la courbe. Les signaux moyens SM obtenus pour les différentes catégories de particules sensibilisées sont ensuite comparés entre eux et, si nécessaire, réajustés de sorte qu'ils soient tous compris dans un rapport de 1 à 5. En pratique, pour les catégories de particules ayant un SM non compris dans ledit rapport, la réactivité est alors réajustée en sélectionnant dans la courbe dose/réponse une autre quantité d'antigène et en recommençant l'opération de sensibilisation desdites particules par cette nouvelle quantité d'antigène jusqu'à obtenir que le SM résultant entre dans le rapport de 1 à 5 précité. Le fait que les SM des différentes particules sensibilisées constituant le réactif immunologique soient tous compris dans un rapport de 1 à 5 est déterminant pour assurer une réactivité immunologique relativement équivalente pour chaque type de particules sensibilisées utilisées et donc d'obtenir, dans une gamme de mesures compatible avec la réalité biologique, des valeurs suffisamment proches pour permettre l'utilisation d'un système d'étalonnage unique et commun à l'ensemble des anticorps . Le réactif immunologique est alors constitué par mélange, dans un solvant, des différents types de particules sensibilisées ainsi obtenues. On peut citer comme solvants possibles : des mélanges de protéines et d'acides aminés ou encore un mélange de protéines inertes vis-à-vis des anticorps à doser et permettant une stabilisation de particules. En tout état de cause, les solvants utilisés sont sélectionnés de manière à permettre la conservation de l'ensemble des particules sensibilisées, et leur choix se trouve donc dicté par la nature des antigènes, notamment de la GLIA et de la tTG. De ce fait, ledit solvant peut être défini de sorte qu'il est adapté et commun à l'ensemble de ces deux antigènes . Le solvant utilisé est tamponné à un pH compris entre 7 et 9 et a une force ionique comprise entre 0,01 et 0,1. Selon un second aspect de la présente invention, celle-ci porte sur un réactif immunologique destiné au dosage d' anticorps multiples, notamment anti-GLIA et anti- tTG, dans des échantillons biologiques, ledit réactif comprenant un solvant et, mélangées au sein dudit solvant, différentes catégories de particules, dont chacune est sensibilisée par association avec respectivement une quantité donnée en antigène spécifique de l'un des anticorps à doser, notamment GLIA et tTG, avec, pour chacune des catégories de particules, et pour une concentration donnée en composé homologue de l'antigène, telle qu'exprimée en unités biologiques, ladite quantité donnée d'antigène débouchant sur un signal dit "signal moyen", qui est compris dans un rapport de 1 à 5 avec les signaux moyens obtenus pour les autres catégories de particules . Selon un troisième aspect, la présente invention concerne un kit de dosage d'anticorps multiples, notamment anti-GLIA et anti-tTG, dans des échantillons biologiques mettant en oeuvre différentes catégories de particules, chaque catégorie de particules étant sensibilisée par un antigène spécifique de l'un des analytes à doser, notamment de la GLIA et de la tTG, qui comprend : i) un réactif immunologique issu du procédé tel que décrit plus haut, ii) au moins un standard d'étalonnage constitué d'un unique composé homologue réagissant avec l'une des catégories de particules entrant dans la composition du réactif immunologique, iii) une table de correspondance entre la concentration, exprimée en unités biologiques, du composé homologue constituant le standard d'étalonnage et celle de chacun des composés homologues aux autres antigènes fixés sur les autres catégories de particules entrant dans la composition du réactif immunologique, et iv) un réactif de marquage. Plus particulièrement, ledit standard d'étalonnage comprend un composé homologue réagissant directement ou indirectement avec l'antigène fixé à la particule sensibilisée . La fixation indirecte peut se faire, par exemple, par l'intermédiaire d'une protéine utilisée pour saturer les sites de fixation de la particule non occupés par l'antigène. Cette protéine doit être choisie de façon à ne pas interférer avec le système spécifique et être présente sur une seule catégorie de particule. Dans ce cas, le milieu de quantification devra contenir un réactif de marquage spécifique des anticorps à doser (constitué d'un ou de plusieurs composés) et un réactif de marquage spécifique de la protéine inerte. Dans une première forme d'exécution, ledit composé homologue est de même origine que les anticorps, notamment anti-GLIA et/ou anti-tTG, à doser, par exemple, d'origine humaine . Dans une seconde forme d'exécution, ledit composé homologue et les anticorps, notamment anti-GLIA et anti- tTG, à doser sont d'origines différentes. Alors que, par exemple, l'anticorps à doser est d'origine humaine, tel que des autoanticorps présents dans des échantillons sanguins humains, le composé homologue peut être, par exemple, d'origine animale pour autant qu'il soit capable de réagir spécifiquement avec l'antigène, à savoir, notamment la GLIA ou la tTG. Le milieu de quantification devra, dans ce cas, contenir, à la fois un réactif de marquage spécifique des échantillons d'origine humaine et un réactif de marquage spécifique du standard d'origine animale. La préparation du standard d'étalonnage implique une optimisation préalable de sa concentration de façon à produire un SM compris dans un rapport de 1 à 5 par rapport aux SM obtenus pour chaque catégorie de particules sensibilisées lors de la préparation du réactif immunologique . Pour ce qui est de la "table de correspondance", celle-ci consiste en un référentiel, pouvant se présenter sous la forme d'un tableau, d'un graphique, etc., qui donne les différentes concentrations, exprimées en unités biologiques, du composé homologue constituant le standard d'étalonnage et celle de chacun des composés homologues aux antigènes, notamment GLIA et tTG fixés sur les autres catégories de particules entrant dans la composition du réactif immunologique. La table de correspondance est réalisée empiriquement, préalablement à la préparation des kits, de la manière suivante. On fait réagir plusieurs échantillons, comprenant des quantités différentes et connues d'antigène, notamment de GLIA et de tTG, à doser avec le réactif immunologique qui fera partie du kit. On mesure les signaux résultants et l'on trace, pour chaque anticorps, notamment anti-GHLIA et anti-tTG, la droite de régression linéaire liant les signaux émis aux quantités connues, exprimées en unités biologiques, des anticorps dosés, selon une équation de type y=ax, avec y=signal et x=concentration en unités biologiques . On mesure, de même, le signal obtenu lors de la réaction entre le standard d'étalonnage et le réactif immunologique et l'on relève, sur chaque courbe précédemment obtenue, la concentration, exprimée en unités biologiques, correspondant à cette même valeur de signal. C'est l'ensemble de ces concentrations en anticorps, exprimées en unités biologiques, qui constitue la table de correspondance . La concentration du standard peut être ensuite vérifiée à partir de la table de correspondance et ajustée si nécessaire. Dans une variante, il peut être souhaité de réaliser une gamme d'étalonnage, c'est-à-dire de partir de plusieurs standards d'étalonnage constitué chacun du même composé homologue, mais selon différentes concentrations. Dans ce cas, le principe de réalisation de la table de correspondance reste le même, mis à part que l'on trace pour chaque anticorps, à partir des différents signaux obtenus, la droite de régression liant les signaux émis aux quantités connues, en unités biologiques, des anticorps à doser selon une équation de type log y=a(log x) , avec y=signal et x=concentration en unités biologiques. Cette équation est ensuite appliquée aux signaux correspondant aux différentes concentrations connues de standard d'étalonnage de façon à déduire la correspondance entre chacune desdites concentrations et la concentration de chaque anticorps, exprimée en unités biologiques. Pour ce qui est du "réactif de marquage", celui-ci consiste en un composé immunologique susceptible de quantifier la réaction entre les anticorps, notamment anti- GLIA et anti-tTG et le réactif immunologique, ledit composé immunologique étant couplé à un marqueur qui est, de préférence un fluorochrome . Par "composé immunologique", il faut comprendre tout composé, naturel ou de synthèse, susceptible de se complexer spécifiquement avec un composé complémentaire, tels que les anticorps et les antigènes. Selon une forme d'exécution préférée, ledit réactif de marquage réagit avec le complexe composé homologue ou l'anticorps, notamment anti-GLIA et/ou anti-tTG, à doser / antigène, notamment GLIA et/ou tTG, auquel cas le dosage est direct, ou avec l'antigène, notamment la GLIA et/ou la tTG, non complexé, auquel cas le dosage est indirect. En outre, le réactif de marquage peut être préparé à partir d'un composé unique, réagissant avec, par exemple, une spécificité antigénique commune à l'ensemble des composés homologues, ou résulter du mélange de différents composés réagissant spécifiquement avec différents composés homologues . Selon un dernier aspect de la présente invention, celle-ci porte sur un procédé de dosage d'anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG présents dans un échantillon biologique et, plus particulièrement, un procédé de mise en oeuvre du kit tel que décrit plus haut qui consiste à mesurer les signaux résultants de l'interaction entre le réactif immunologique et, d'une part, l'échantillon biologique, d'autre part, le standard d'étalonnage, et à déterminer et appliquer, aux différents signaux résultants, un facteur de correction de manière à obtenir la titration, exprimée en unités biologiques, des anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, de l'échantillon, ledit facteur de correction étant le rapport entre le signal obtenu pour le standard d'étalonnage et les concentrations issues de la table de correspondance. Le procédé de mise en oeuvre du kit selon la présente invention repose donc sur trois étapes, à savoir une première étape de détermination des différents signaux émis par cytométrie en flux, une seconde étape de calcul pour déterminer les différents facteurs de correction à partir du signal émis par le standard d'étalonnage et une troisième étape de calcul pour la titration des anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, de l'échantillon à partir du facteur de correction précédemment obtenu et les signaux émis par les différents échantillons testés. Plus particulièrement, le procédé objet de la présente invention comprend les étapes suivantes : a) incuber, d'une part, l'échantillon biologique et, d'autre part, le standard d'étalonnage, avec une quantité prédéterminée de réactif immunologique ; b) ajouter le réactif de marquage ; c) mesurer, par cytométrie en flux, les signaux émis, d'une part, par le standard d'étalonnage, d'autre part par l'échantillon ; d) déterminer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, un facteur de correction qui correspond au rapport entre la concentration en unités biologiques de chacun des anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, à doser telle que donnée par la table de correspondance et le signal correspondant au standard d'étalonnage et mesuré à l'étape c) ; e) multiplier par ledit facteur de correction, calculé pour chaque anticorps, le signal émis par chaque catégorie de particules et mesuré à l'étape c) pour en déduire la concentration en unités biologiques de chaque anticorps dans l'échantillon testé. Ainsi de la concentration en unités biologique pour chaque anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, testé on pourra déduire le diagnostic de la maladie coeliaque. La présence simultanée d'anticorps IgA anti-GLIA et anti-tTG accompagnée ou non d' IgG anti-GLIA et/ou anti-tTG permettant un diagnostic quasi certain d'une MC et une indication à pratiquer une biopsie duodénojéjunale . La présence d' IgA et d' IgG anti- GLIA constituant un diagnostic possible, en se référant à la clinique. La présence d'anticorps uniquement IgG n'étant pas en faveur d'une maladie coeliaque, il faudra cependant tenir compte d'un éventuel déficit en IgA.
Dans une première variante, le procédé objet de la présente invention peut être appliqué à des dosages directs. Dans de tels dosages, le réactif de marquage est spécifique des anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, que l'on cherche à doser et, de ce fait, la quantité d'anticorps compris dans un échantillon est directement proportionnelle au signal émis par ledit réactif de marquage. Dans ce cas, le réactif immunologique est constitué de différentes catégories de particules sensibilisées chacune par les antigènes, notamment de la GLIA et de la tTG. Les anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, que l'on cherche à doser vont se complexer avec le ou lesdits antigène (s) fixé (s) aux particules. Le réactif de marquage, qui est constitué par un ou plusieurs second (s) anticorps marqué (s) par un fluorochrome et spécifique (s) des anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, que l'on cherche à doser, va se fixer auxdits anticorps préalablement complexés avec les antigènes, notamment GLIA et tTG, formant la couche de sensibilisation des particules. Ainsi, le signal émis par le fluorochrome associé à chaque catégorie de particules est proportionnel à la quantité d'anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, présents dans l'échantillon. Par "seconds anticorps", il faut comprendre toute substance capable de se complexer avec les anticorps que l'on cherche à doser, c'est-à-dire capable de réagir avec un épitope desdits anticorps différent de celui mis en oeuvre pour assurer leur fixation à l'antigène. Dans une seconde variante, le procédé objet de la présente invention peut être appliqué à des dosages dits indirects. De tels dosages sont non plus basés uniquement sur la complémentarité entre deux espèces immunologiques, mais sur la compétition entre deux espèces immunologiques proches à se complexer avec une troisième espèce immunologique . Ainsi, selon une première possibilité, il est envisagé la quantification simultanée et indirecte de différents antigènes avec lesdits anticorps à doser qui consistent en des antigènes, lesdits antigènes en des anticorps et ledit réactif de marquage en un mélange d'antigènes marqués par un fluorochrome entrant en compétition avec les anticorps à doser pour se complexer avec les antigènes. Dans ce cas, le réactif immunologique est constitué de différentes catégories de particules sensibilisées chacune par un anticorps spécifique. Les antigènes que l'on cherche à doser vont alors entrer en compétition avec le ou lesdits antigènes, marqués par un fluorochrome, constituant le réactif de marquage. Ainsi, l'augmentation de la concentration en antigène que l'on cherche à doser entraîne l'augmentation de la concentration en complexes antigène que l'on cherche à doser / anticorps fixé, au détriment de la formation de complexes antigène marqué / anticorps fixé, avec corrélativement une diminution du signal. Il en résulte que le signal émis par le fluorochrome associé à chaque catégorie de particules est inversement proportionnel à la quantité d'antigènes présente dans 1 ' échantillon.
MATERIEL ET METHODE
Le procédé objet de la présente invention repose sur l'utilisation de microsphères de taille uniforme différemment colorées et d'un cytometre de flux interface avec un système informatique de digitalisation et de traitement du signal. Une diode rouge du cytometre de flux, en classant chaque catégorie de microsphères sur la base de sa fluorescence unique (du rouge à l'orange), permet l'identification du paramètre analysé. Parallèlement un laser excite la fluorescence d'un composé secondaire pour quantifier la réaction spécifique qui y est associée. Chaque antigène (la gliadine et la transglutaminase tissulaire) nécessaire à la réalisation du test est couplé de façon covalente à une catégorie de microsphères colorées, support des réactions immunologiques spécifiques. Le mélange de particules sensibilisées obtenu peut être utilisé pour la détection des autoanticorps d' isotype IgA anti-gliadine et anti-transglutaminase IgA ou IgG. Le test est réalisé dans une microplaque de 96 puits vierges disposant à leur base d'une membrane filtrante. Dans un premier temps, l'échantillon dilué est distribué dans un puits où a été préalablement déposé l'un des deux mélanges de microsphères. S'il contient un ou plusieurs autoanticorps recherchés, ceux-ci vont se fixer au(x) antigène (s) correspondant (s) sur les différentes catégories de microsphères. Après incubation, un lavage par filtration permet d'éliminer les éléments non fixés. Un conjugué spécifique de l' isotype recherché (qui peut être constitué d'anticorps anti-IgA ou anti-IgG humaines couplés à la phycoérythrine) est rajouté. Il se fixe aux autoanticorps précédemment capturés. La réaction développée est ensuite directement analysée par le cytometre de flux, qui classe chaque catégorie de particules colorées selon sa fluorescence en y mesurant simultanément la fluorescence émise par le conjugué. Un système de calibration permet, par interpolation, de définir le titre de l'échantillon pour chaque spécificité antigénique et isotype (IgA ou/et IgG) recherché. Exemple de la détection des anticorps IgA
1- Préparation du réactif immunologique
Activation des particules 2 catégories de particules de polystryrène colorées et fonctionnalisées par des groupements COOH sont sélectionnées. Préalablement à la sensibilisation, chaque catégorie de particules est activée par un procédé qui consiste en : -l'ajout de 1ml d'une solution de carbodiimide, dosée entre 10 et 40 mg/ml, à 1ml de particules (soit environ 107 particules) , -l'incubation pendant 20 à 60 minutes à température ambiante, -trois lavages des particules à l'au distillée en centrifugeant à lOOOxg pendant 2 minutes pour éliminer l'excès de carbodiimide.
Détermination de la quantité d'antigène optimale La quantité de chaque antigène a été déterminée dans le but d'utiliser un système d'étalonnage unique mais également de répondre à la réactivité nécessaire et représentative des dosages biologiques impliqués.
Le dosage simultanées des 2 types d'anticorps est réalisé dans un seul puits et utilise la même dilution d'échantillon et le même milieu de marquage (conjugué anti- IgA) . Par conséquent la réaction produite par chaque catégorie de particules sensibilisées doit être standardisée, reproductible et représentative des 2 réactions antigène-anticorps. De plus, si l'on souhaite utiliser un étalonnage unique, le procédé de sensibilisation de chaque antigène doit conduire à l'obtention de signaux similaires pour les deux spécificités en présence d'échantillons de degrés de positivite équivalents en termes d'unités biologiques.
Les courbes doses/réponses ont donc été réalisées avec les deux antigènes GLIA et tTG. Les figures 1 et 2 présentent chacune 3 courbes doses-réponses exprimant le signal de fluorescence émis (axe des Y) en fonction du titre en anticorps spécifiques en unités biologiques (UA) (axe des X) ; respectivement figure 1 pour l'antigène tTG et figure 2 pour l'antigène GLIA. Ces courbes permettent de sélectionner la courbe correspondant à la plus petite quantité d'antigène sur une plage de mesure représentative de la zone de mesure (en termes de linéarité et d' amplitude) .
Pour chaque antigène, quatre échantillons ont été sélectionnés en fonction de leur titre exprimé en UA et déterminé par technique ELISA (bmd) . La dilution en échantillon, la concentration en réactif de marquage et les prises d'essais sont communes. Pour l'antigène tTG, les trois courbes de la figure 1 correspondent à 3 concentrations en antigène. La courbe retenue est celle correspondant à une concentration en antigène de 25μg/ml de particules. Les concentrations supérieures se traduisent par une saturation de la réaction antigène-anticorps pour les valeurs élevées, conduisant à une perte de linéarité. Pour l'antigène GLIA (figure 2), la courbe retenue est celle obtenue avec lOOμg/ml de particules qui allie réactivité et linéarité. Les concentrations inférieures donnent une réactivité insuffisante.
Vérification du rapport de réactivité entre les 2 types de particules Le signal moyen associé à une concentration en unités biologiques identique pour les 2 types d' auto anticorps est déterminé en choisissant une concentration située dans le quart supérieur de chaque courbe retenue est en comparant le signal de fluorescence émis. Par exemple, une concentration de 100U correspond respectivement à un signal de 675 pour tTG et de 498 pour GLIA. Le rapport entre ces deux signaux est égal à 1.35. La valeur de ce rapport (ente 1 et 5) est déterminante pour assurer une réactivité immunologique équivalente pour chaque type de particules sensibilisées et donc obtenir des valeurs suffisamment proches pour permettre un système d'étalonnage unique, tout en garantissant des gammes de mesure compatibles avec la réalité biologique.
Sensibilisation des particules activées Les particules activées précédemment sont ensuite sensibilisées selon les conditions définies ci-dessus, par suspension de chaque type de particules dans un volume de lml contenant respectivement 25μg de tTg et lOOμg de GLIA suivie d'une incubation 4 à 6 H à température ambiante. Les particules sensibilisées sont ensuite lavées comme précédemment et mises en suspension dans un tampon pH8 contant un mélange de substances protéiques destinées à saturer les sites libres et à ramener les particules à une concentration de l'ordre de 10. à 5.106 particules par ml. Le réactif immunologique est ensuite constitué par mélange volume à volume de chaque catégorie de particules sensibilisées et conservé à +5°C jusqu'à utilisation
2- Etalonnage
Le standard d'étalonnage unique est constitué par un sérum humain anti-gliadine d' isotype IgA, dilué dans un tampon phosphate pH 7.4 qui va réagir spécifiquement avec les particules sensibilisées par l'antigène GLIA. La table de correspondance pour ce standard d' étalonnage est la suivante . GLIA : 130UA tTG : 90UA
Cette table a été obtenue comme suit :
On fait réagir plusieurs échantillons, comprenant des concentrations différentes et connues d'auto anticorps anti-GLIA ou anti-tTG, avec le réactif immunologique dans des conditions identiques (conjugué, prises d'essais et dilution échantillons) . On mesure les signaux résultants et on trace, pour chaque spécificité, la droite de régression linéaire liant les signaux émis aux quantités connues, exprimées en UA, selon une équation de type y=ax, avec y=signal et x= concentration en UA. Est également mesuré dans le même essai (au moins deux fois) le signal résultant de la réaction entre le standard d'étalonnage et l'on en déduit, à partir de chaque droite de régression précédente, la concentration en UA du standard d'étalonnage pour spécificité.
-Détermination des facteurs de correction Afin de déterminer les facteurs de correction à attribuer à chaque spécificité, les concentrations en UA de la table de correspondance sont divisées par la valeur du signal mesuré ci-dessus pour le standard d'étalonnage réagissant avec les particules sensibilisées par l'antigène GLIA. Pour un signal de 650 par exemple, les facteurs de correction suivants sont obtenus :
Gliadine : 0.20 tTG : 0.14 Ces facteurs de correction seront utilisés lors du dosage d'anticorps anti-tTG et anti-GLIA dans les échantillons biologiques. Ainsi si l'on dose, au moyen du réactif immunologique ayant précédemment donné un signal de 650 avec le standard d'étalonnage, les anticorps anti-tTG dans un échantillon, et que l'on obtient un signal correspondant à 420, on pourra déterminer le titre en multipliant la valeur de ce signal par le facteur de correction associé à tTG. Le titre en anticorps anti-tTG de l'échantillon sera donc, dans cet exemple, égal à 0.14x 420 = 59UA
Evaluation du réactif immunologique par comparaison avec des méthodes de références .
Méthodes comparatives Afin d'évaluer les performances du réactif immunologique, associé à l'étalonnage ci-dessus, et permettant le dosage simultané des anticorps anti-GLIA et anti-tTG d' isotype IgA, la sensibilité et la spécificité ont été comparées par rapport aux méthodes suivantes : -coffret GLIA-LISA (bmd) basé sur une méthode ELISA pour la détection des anticorps anti-gliadine IgA -coffret de recherche TGA-LISA (bmd) basé sur une méthode ELISA pour la détection des anticorps anti-tTG IgA.
Méthodes de confirmation en cas de résultats discordants : BINDAZYME (The Binding Site (TBS)) : Human Anti Gliadin IgA EIA et Human Anti Tissue Transglutaminase EIA .
Echantillons testés L'étude a porté sur 205 échantillons : -60 échantillons associés à la présence d'une maladie coeliaque -50 échantillons provenant d'individus sains -95 échantillons présentant des marqueurs biologiques susceptibles de provoquer des interférences
(cryoglobulinémie, hypergammaglobulinémie, immunoglobulines monoclonales IgG et IgM, complément, complexes immuns, facteur rhumatoïde) .
Protocole de dosage simultané Ce protocole consiste à prélever 50μl de réactif immunologique précédemment préparé et à le mélanger, d'une part à lOOμl de standard d'étalonnage (déposé en double) et, d'autre part, à lOOμl d'échantillons prédilués au 1/200 dans un tampon phosphate (type PBS pH 7.4) . Les dépôts et mélange se font dans une microplaque de 96 puits disposant à leur base d'une membrane filtrante de 1.2μm. Un puits est réservé au mélange du réactif immunologique avec le tampon seul afin de constituer le « blanc réactif », permettant d'évaluer le signal associé à chaque catégorie de particules qui sera ensuite soustrait systématiquement du signal obtenu pour les autres puits. Les étapes suivantes consistent à : -incuber 30 minutes à température ambiante, -laver deux fois par filtration à travers la membrane filtrante de la microplaque -remettre le milieu en suspension dans lOOμl de réactif de marquage, constitué d'un anticorps de chèvre réagissant spécifiquement avec les immunoglobulines A humaines et conjugué à la phycoerythrine. Sa concentration est adaptée aux réactions antigène-anticorps à détecter simultanément, -incuber 30 minutes à température ambiante, et -analyser par cytométrie de flux.
Ce faisant, au moins 200 particules de chaque catégorie sont analysées pendant une quinzaine de secondes. Pendant ce temps, le système informatique classe chacune des particules selon sa couleur et détermine ensuite la fluorescence moyenne émise par le conjugué pour chaque spécificité anticorps.
Résultats
tTG IgA ELISA Positi Negati fs fs dosaSe Positi f 59 simultané
Négati f 143
Figure imgf000030_0001
s
Figure imgf000030_0002
Analyse des résultats discordants (6/205)
Spécificité Résultat ELISA bmd ELISA Spécificités antigénique dosage TBS associées simultané
Glia IgA négatif faiblement négatif tTG IgA, positif Glia IgG Glia IgA négatif faiblement négatif IgG positif monoclonale Glia IgA négatif faiblement négatif complément positif tTG IgA négatif faiblement faiblement aucune positif positif tTG IgA négatif faiblement négatif donneur de positif sang tTG IgA faiblement négatif faiblement facteur positif positif rheumat .
<=> Résultats discordants pour Glia IgA : les résultats négatifs sont confirmés par TBS (2 correspondent à des interférences biologiques <=> Résultats discordants pour tTG IgA : 2/3 sont confirmés par TBS
Mode de détermination du seuil de positivite
Estimé à partir des 145 échantillons issus des populations « individus sains » et « interférences biologiques ». Le seuil de positivite (20UA) correspond au 99.5eme percentile de la distribution des valeurs pour les deux spécificités Le seuil de négativité (15UA) correspond au 96eme percentile pour les 2 spécificités. Entre ces 2 seuils, les résultats sont considérés limites .
Fidélité du test Estimée sur 3 échantillons pour chaque spécificité faiblement positif, positif et fortement positif
Figure imgf000032_0001

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'un réactif immunologique entrant dans la composition d'un système d'étalonnage appliqué au dosage d'anticorps multiples, notamment des anticorps anti-GLIA et anti-tTG, dans un même échantillon biologique, ledit procédé mettant en oeuvre différentes catégories de particules, chaque catégorie de particules étant respectivement sensibilisée par association avec un antigène spécifique des anti-corps à doser, notamment la GLIA et la tTG, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent à : a) déterminer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées et pour chacune de n quantités données d'antigènes, notamment de GLIA et tTG, associées auxdites particules, la courbe de réponse en fonction de la concentration en composé homologue sur une gamme de concentrations correspondant à la plage de mesure connue des anticorps à doser; b) sélectionner, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, la courbe correspondant à la plus petite quantité d'antigène, notamment de GLIA et tTG, qui donne un signal de réponse significatif et qui est compatible avec l'utilisation d'une dilution d'échantillon et d'un réactif de marquage communs à tous les anticorps simultanément dosés, notamment anti-GLIA et anti-tTG; c) évaluer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, d'après la courbe retenue à l'étape b) , le signal moyen correspondant au signal associé à un point caractéristique de chacune desdites courbes, obtenant ainsi autant de signaux moyens que de catégories de particules ; d) ajuster, le cas échéant, les quantités d'antigène, notamment GLIA et/ou tTG, associé à chaque catégorie de particules de sorte que l'ensemble des signaux moyens évalués à l'étape c) soit compris dans un rapport de 1 à 5, et e) mélanger, dans un solvant approprié, les différentes catégories de particules sensibilisées qui répondent au critère de l'étape d) .
2. Procédé de préparation d'un réactif immunologique entrant dans la composition d'un système d'étalonnage appliqué au dosage des anticorps anti-GLIA et anti-tTG dans un même échantillon biologique, ledit procédé mettant en oeuvre deux catégories de particules, chaque catégorie de particules étant respectivement sensibilisée par association avec les antigènes correspondants, à savoir la GLIA et la tTG, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent à : a) déterminer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées et pour chacune de n quantités données de GLIA et tTG associées auxdites particules, la courbe de réponse en fonction de la concentration en composé homologue sur une gamme de concentrations correspondant à la plage de mesure connue des anticorps à doser; b) sélectionner, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, la courbe correspondant à la plus petite quantité d' antigène qui donne un signal de réponse significatif et qui est compatible avec l'utilisation d'une dilution d'échantillon et d'un réactif de marquage communs aux anticorps anti-GLIA et anti-tTG simultanément dosés ; c) évaluer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, d'après la courbe retenue à l'étape b) , le signal moyen correspondant au signal associé à un point caractéristique de chacune desdites courbes, obtenant ainsi autant de signaux moyens que de catégories de particules ; d) ajuster, le cas échéant, les quantités de GLIA et/ou tTG associée à chaque catégorie de particules de sorte que l'ensemble des signaux moyens évalués à l'étape c) soit compris dans un rapport de 1 à 5, et e) mélanger, dans un solvant approprié, les différentes catégories de particules sensibilisées qui répondent au critère de l'étape d) .
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que, 'dans l'étape a), les quantités d'antigène, notamment de GLIA et/ou de tTG, utilisées varient par pas de 2 à 4.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la sensibilisation desdites particules par lesdits antigènes, notamment la GLIA et/ou la tTG, est effectuée par covalence, par le biais d'une couche moléculaire intermédiaire biologiquement et/ou chimiquement réactive, ou encore par l'utilisation d'un système d'interaction par affinité.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration en composé homologue est exprimée en unités biologiques sur une gamme qui est identique pour tous les anti-corps, notamment, anti- GLIA et anti-tTG.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le solvant utilisé à l'étape e) est adapté et commun à l'ensemble des antigènes, notamment la GLIA et la tTG.
7. Réactif immunologique destiné au dosage d' anticorps multiples, notamment anti-GLIA et anti-tTG, dans des échantillons biologiques, ledit réactif comprenant un solvant et, mélangées au sein dudit solvant, différentes catégories de particules, dont chacune est sensibilisée par association avec respectivement une quantité donnée en un antigène spécifique de l'un des anticorps à doser, notamment la GLIA et tTG, caractérisé en ce que, pour chacune des catégories de particules, et pour une concentration donnée en composé homologue de l'antigène, telle qu'exprimée en unités biologiques, ladite quantité donnée d'antigène débouche sur un signal dit "signal moyen", qui est compris dans un rapport de 1 à 5 avec les signaux moyens obtenus pour les autres catégories de particules .
8. Kit de dosage d'anticorps multiples, notamment des anticorps anti-GLIA et anti-tTG, dans des échantillons biologiques mettant en oeuvre différentes catégories de particules, chaque catégorie de particules étant respectivement sensibilisée par un antigène spécifique de l' anti-corps à doser, notamment de la GLIA et de la tTG, caractérisé en ce qu'il comprend : i) un réactif immunologique issu du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ii) au moins un standard d'étalonnage constitué d'un unique composé homologue réagissant avec l'une des catégories de particules entrant dans la composition du réactif immunologique, iii) une table de correspondance entre la concentration, exprimée en unités biologiques, du composé homologue constituant le standard d'étalonnage et celle de chacun des composés homologues aux antigènes fixés sur les autres catégories de particules entrant dans la composition du réactif immunologique, et iv) un réactif de marquage.
9. Kit selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit standard d'étalonnage comprend un composé homologue réagissant directement ou indirectement avec l'antigène fixé à la particule sensibilisée.
10. Kit selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que ledit composé homologue est de même origine que l'anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, à doser.
11. Kit selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que ledit composé homologue et les anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, à doser sont d'origines différentes.
12. Kit selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisé en ce que ledit réactif de marquage consiste en un composé immunologique susceptible de quantifier la réaction entre les anticorps, notamment anti- GLIA et anti-tTG, et le réactif immunologique, ledit composé immunologique étant couplé à un marqueur qui est, de préférence un fluorochrome.
13. Kit selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit réactif de marquage réagit avec le complexe composé homologue ou anticorps, notamment anti-GLIA et/ou anti-tTG, à doser / antigène notamment, GLIA et/ou tTG, auquel cas le dosage est direct, ou avec l'antigène, notamment la GLIA et/ou la tTG, non complexé, auquel cas le dosage est indirect.
14. Procédé de mise en oeuvre du kit selon l'une quelconque des revendications 8 à 13, caractérisé en ce qu'il consiste à mesurer les signaux résultants de l'interaction entre le réactif immunologique et, d'une part, l'échantillon biologique, d'autre part, le standard d'étalonnage, et à déterminer et appliquer, aux différents signaux résultants, un facteur de correction de manière à obtenir la titration, exprimée en unités biologiques, des anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, de l'échantillon, ledit facteur de correction étant le rapport entre le signal obtenu pour le standard d'étalonnage et les concentrations issues de la table de correspondance.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent à : a) incuber, d'une part, l'échantillon biologique et, d'autre part, le standard d'étalonnage, avec une quantité prédéterminée de réactif immunologique ; b) ajouter le réactif de marquage ; c) mesurer, par cytométrie en flux, les signaux émis, d'une part, par le standard d'étalonnage, d'autre part par l'échantillon ; d) déterminer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, un facteur de correction qui correspond au rapport entre la concentration en unités biologiques de chacun des anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, à doser telle que donnée par la table de correspondance et le signal mesuré à l'étape c) pour le standard d'étalonnage ; e) multiplier par ledit facteur de correction, calculé pour chaque anticorps, le signal émis par chaque catégorie de particules et mesuré à l'étape c) pour en déduire la concentration en unités biologiques de chaque anticorps dans l'échantillon testé.
16. Procédé de mise en oeuvre du kit selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'il consiste à déduire le diagnostic de la maladie coeliaque de la concentration en unités biologique pour chaque anticorps, notamment anti- GLIA et anti-tTG, testé.
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