WO2003058244A2 - Procede d'obtention d'un systeme d'etalonnage - Google Patents

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WO2003058244A2
WO2003058244A2 PCT/FR2003/000069 FR0300069W WO03058244A2 WO 2003058244 A2 WO2003058244 A2 WO 2003058244A2 FR 0300069 W FR0300069 W FR 0300069W WO 03058244 A2 WO03058244 A2 WO 03058244A2
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analytes
ligand
sensitized
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Pascale Laroche
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Biomedical Diagnostic Sa
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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles

Definitions

  • the present invention relates, in general, to the field of assays of analytes from biological samples and, more particularly to the calibration of such assay methods. Specifically, the present invention relates to a new process for obtaining a single calibration system, making it possible to simultaneously quantify several analytes, whatever their number and in the same reaction medium.
  • single calibration system is meant a single system regardless of the number of analytes sought simultaneously.
  • the conventional techniques consist in assaying each analyte separately and, to do this, in carrying out for each of said analytes a proper calibration of the system used. This results in a large number of manipulations and a significant consumption of reagents, which results in a relatively high price.
  • This technique is based on the use of different categories of fluorescent particles, each category of particles being sensitized by ligands having different properties, said ligands being adapted to bind directly or indirectly to the analytes and generally consisting of antibodies or antigens.
  • the reaction between ligand and analytes is quantified by means of a fluorescent compound with excitation and emission wavelengths different from those of the fluorescent particles.
  • this quantification requires beforehand the construction of as many calibration systems as analytes to be assayed, that is to say to carry out X * Y assays reserved for calibration, X being the number of analytes to measure simultaneously (or the number of particles sensitized by ligands with different properties) and Y the number of calibration points.
  • This method therefore involves not only an additional handling cost, but also a practical management problem, due to the size of the wells of the micro-titration plates, (the tests being generally carried out on ELISA micro-titration plates of 96 wells), as well as an increase in handling time.
  • this system involves the constitution of 10 different calibration systems, i.e. for 100 samples tested, an additional consumption of reagents ranging from 10 to 40% depending on the number of calibration points, and an obvious problem of congestion.
  • the present invention aims to remedy the drawbacks of the prior art by proposing a new unique, rapid, simple and reproducible calibration method making it possible to reduce the consumption of reagents devoted to calibration, while also reducing the size of the plates. of titration.
  • This object is achieved in the sense that the present invention relates to a calibration method, requiring only one calibration system, making it possible to simultaneously quantify several analytes in the same biological sample, a method which is based on the preparation and use of a specific immunological reagent.
  • a first aspect of the present invention relates to a method for the preparation of an immunological reagent used in the composition of a calibration system applied to the assay of multiple analytes in the same biological sample, said method implementing different categories of particles, each category of particles being sensitized by association with a specific ligand of one of the analytes to be assayed, said method comprising the steps which consist in: a) determining, for each category of sensitized particles and for each of n quantities ligand data associated with said particles, the response curve as a function of the concentration of homologous compound over a range of concentrations corresponding to the known measurement range of the analyte to be assayed; b) select, for each category of sensitized particles, the curve corresponding to the smallest quantity of ligand which gives a significant response signal and which is compatible with the use of a sample dilution and a labeling reagent common to all the analytes simultaneously dosed; c) evaluating, for each category
  • the method which is the subject of the present invention therefore applies to assay methods using different categories of sensitized particles. More particularly, such methods consist mainly of immunoassays of the type:
  • the reaction developed by bringing the different categories of particles, each sensitized by a ligand, into contact with the analytes to be assayed is measured by flow cytometry according to different modes of particle identification. Mention may be made, for example, of particles of different colors and of uniform size (identified according to their specific color, with quantification of the analyte-ligand reactions by addition of an external compound with excitation and emission lengths different from those of particles), particles of different sizes and identical color (identified according to their size, with quantification of the analyte-ligand reactions by measuring the size of the resulting aggregates) or particles of different sizes and of identical color (classified according to their size , with quantification of the analyte-ligand reactions by adding an external compound with excitation and emission wavelengths different from those of the particles). In practice, one or the other of these methods is selected as a function of the more or less large number of parameters to be tested.
  • These particles generally consist of polystyrene. However, they can also be made of any polymer which gives them specific physicochemical properties (functionality, density or even solubility) such as styrene-maleic acid, styrene-methacrylic acid, styrene-acrylamide or poly (methyl methacrylate). ).
  • ligand is meant an antigen, an antibody, mono- or polyclonal, or any molecule capable of binding to the particles and which is capable of interacting, in any way whatsoever, directly or indirectly, with analyte to be assayed.
  • antigen means any substance from which the production of antibodies can be generated. Among these substances, mention may be made of proteins, haptens, allergens, peptides, medicaments or even drugs.
  • homologous compound it is necessary to understand an antibody, an antigen or any molecule capable of binding to a given ligand and whose interaction site with said ligand is similar to the interaction site between 1 analyte to be assayed and said ligand.
  • the homologous compound can be the analyte itself.
  • the first step of the process therefore consists in determining for each category of sensitized particles, as described above, the correlation which exists, for a given quantity of ligand fixed to the particles, between the quantity of homologous compound and the magnitude of the signal emitted, representative of ligand / analyte interactions.
  • several tests are carried out by fixing a given quantity, different for each test, of the same ligand to said particles, then bringing the particles thus sensitized into contact with different quantities of homologous compound, identical for all the tests, and by measuring the signal resulting from their interaction.
  • the quantities of ligand used vary in steps from 2 to 4.
  • the different quantities of homologous compound are selected so as to be included in the measurement range of the analyte which it is sought to assay.
  • one seeks to assay an analyte whose concentration can vary between 0 and 100 biological units, one will choose, for example, six given quantities of homologous compound corresponding to 0, 20, 40, 60, 80 and 100 biological units .
  • a population of samples characterized and certified on clinical-biological criteria is used, that is to say the presence or absence of a given analyte is validated by a clinical diagnosis and / or by the estimation of the analyte by one or more other assay method (s).
  • the result of this operation results in obtaining a dose / response curve between the quantity of homologous compound and the signals obtained for each of the n given quantities of ligand.
  • the concept of expression of the concentration in biological units is based on the assignment, for example, of a range 0-150 to the measurement range of each of the analytes to be assayed. It is understood that these measurement ranges differ, in absolute terms, from one analyte to another and that, consequently, the same concentration of different analytes expressed in biological units, for example 95 biological units (for short 95 UB) does not correspond to the same concentration, in absolute terms, in these same analytes.
  • the concentration of homologous compounds is expressed, in the same way, in biological units over an identical range for all the analytes.
  • the sensitization of the particles can be carried out in various ways, namely by covalence, by means of an intermediate molecular layer biologically and / or chemically reactive, or by the use of a system. of affinity interaction.
  • the sensitized particles insofar as they contain a reactive functionality, can be sensitized by covalence.
  • numerous immobilization protocols have been described as involving, without limitation, the following functional groups between the particles and the ligand:
  • the activation can be carried out by water-soluble carbodiimides, and be carried out in a single stage or, according to a particularly preferred embodiment, in two stages, with the carbodiimide alone or in the presence of N-hydroxysuccinimide. It is followed by the elimination of the excess activator before fixing the ligand.
  • a homo- or hetero-bifunctional spacer arm having reactive chemical functions at each end, respectively identical or different, can be attached to the previously activated particles.
  • These arms of variable length and functionality can be activated and covalently coupled, firstly, to the particles by one end, and secondly, to the compound to be fixed, by the other end.
  • Chemically or biologically active intermediates can also be used for sensitization. They create an intermediate molecular layer on the surface of the microparticles consisting of a protein (such as albumin), a mixture of proteins or a polymer (such as polylysine). This process is particularly used in the case of small particles which can then be coupled via bonding agents on the functions of this intermediate layer.
  • a protein such as albumin
  • a polymer such as polylysine
  • Another sensitization pathway consists in using, without limitation, affinity interaction systems: - the biotin-avidin system, using particles coupled to avidin which are brought into contact with compounds having been previously biotinylated, - protein A or protein G, having a receptor for the Fc fragment of the immunoglobulins, allowing the immobilization of an antibody and the outward orientation of its fragments Fab, responsible for antigenic recognition, or - indirect immobilization via an antibody specific for the compound to be fixed.
  • affinity interaction systems - the biotin-avidin system, using particles coupled to avidin which are brought into contact with compounds having been previously biotinylated, - protein A or protein G, having a receptor for the Fc fragment of the immunoglobulins, allowing the immobilization of an antibody and the outward orientation of its fragments Fab, responsible for antigenic recognition, or - indirect immobilization via an antibody specific for the compound to be fixed.
  • the sensitization medium consists of buffered water having a pH between 5 and 9 and an ionic strength between 0.01 and 0.1.
  • the ligand can be suspended in the same medium before carrying out said sensitization.
  • the dose / response curves have been obtained, it is determined, for each category of sensitized particles, as described in step b), the curve corresponding to the smallest quantity of ligand giving, graphically, a significant read signal compatible with the use of a sample dilution as well as a common labeling reagent for all the analytes simultaneously detected.
  • “Significant response signal” means a signal which is sufficiently high to ensure reading accuracy over the entire measurement range.
  • the curve selected must be substantially linear and have a sufficiently high measurement amplitude.
  • Each type of particle is therefore sensitized by one of the techniques described above using the quantity of ligand determined above.
  • the next step c) then consists in determining the mean signal (SM) associated with a concentration in biological units, identical for all the analytes.
  • a point characteristic of the dose / response curve used in step b) is selected and the signal corresponding graphically to said point is taken as the mean signal SM.
  • the characteristic point otherwise called positive point or point of high positivity, is chosen arbitrarily in the upper quarter of the linear part of the curve.
  • the average signals SM obtained for the different categories of sensitized particles are then compared with one another and, if necessary, readjusted so that they are all included in a ratio of 1 to 5.
  • the reactivity is then readjusted by selecting in the dose / response curve another quantity of ligand and recommencing the operation of sensitizing said particles with this new quantity of ligand until the resulting SM enters the ratio of 1 to 5 above.
  • the SM of the different sensitized particles constituting the immunological reagent are all included in a ratio of 1 to 5 is decisive for ensure a relatively equivalent immunological reactivity for each type of sensitized particles used and therefore to obtain, in a range of measurements compatible with biological reality, values sufficiently close to allow the use of a single calibration system common to all the analytes.
  • the immunological reagent is then constituted by mixing, in a solvent, the different types of sensitized particles thus obtained.
  • solvents mixtures of proteins and amino acids or else a mixture of proteins inert with respect to the analytes to be assayed and allowing particle stabilization.
  • the solvents used are selected so as to allow the conservation of all the sensitized particles, and their choice is therefore dictated by the nature of the most restrictive ligands. Therefore, said solvent can be defined so that it is suitable and common to all of the ligands.
  • the experimental sensitization conditions namely the pH, the ionic strength, the volume, the temperature or even the duration of the coupling, are previously fixed and standardized for all the particles. Only the quantity of ligand to be adjusted then varies, as described above.
  • the solvent used is buffered at a pH of between 7 and 9 and has an ionic strength of between 0.01 and 0.1.
  • the latter relates to an immunological reagent intended for the determination of multiple analytes in biological samples, said reagent comprising a solvent and, mixed within said solvent, different categories of particles, each of which is sensitized by association with a given quantity of a specific ligand of one of the analytes to be assayed, with, for each of the categories of particles, and for a given concentration of compound homolog of the ligand, as expressed in biological units, the said given quantity of ligand resulting in a signal called "average signal", which is included in a ratio of 1 to 5 with the average signals obtained for the other categories of particles.
  • the present invention relates to a kit for assaying multiple analytes in biological samples using different categories of particles, each category of particles being sensitized by a specific ligand for one of the analytes to be assayed, which comprises : i) an immunological reagent resulting from the process as described above, ii) at least one calibration standard consisting of a single homologous compound reacting with one of the categories of particles entering into the composition of the immunological reagent, iii) a correlation table between the concentration, expressed in biological units, of the homologous compound constituting the calibration standard and that of each of the compounds homologous to the other ligands attached to the other categories of particles entering into the composition of the immunological reagent, and iv) a labeling reagent.
  • said calibration standard comprises a homologous compound reacting directly or indirectly with the ligand attached to the sensitized particle.
  • Indirect fixation can be done, for example, via a protein used to saturate the binding sites of the particle not occupied by the ligand.
  • This protein must be chosen so as not to interfere with the specific system and be present on a single particle category.
  • the quantification medium must contain a specific labeling reagent for the analytes to be assayed (consisting of one or more compounds) and a specific labeling reagent for the inert protein.
  • said homologous compound is of the same origin as the analyte to be assayed, for example, of human origin.
  • said homologous compound and the analyte to be assayed are of different origins.
  • the analyte to be assayed is of human origin, such as autoantibodies present in human blood samples
  • the homologous compound may be, for example, of animal origin as long as it is capable of reacting specifically with the ligand.
  • the quantification medium must, in this case, contain both a specific labeling reagent for samples of human origin and a specific labeling reagent for the standard of animal origin.
  • the preparation of the calibration standard involves prior optimization of its concentration so as to produce an SM comprised in a ratio of 1 to 5 compared to the SM obtained for each category of particles sensitized during the preparation of the immunological reagent.
  • the “correspondence table” consists of a reference system, which can be in the form of a table, a graph, etc., which gives the different concentrations, expressed in biological units, of the homologous compound constituting the calibration standard and that of each of the compounds homologous to the other ligands attached to the other categories of particles entering into the composition of the immunological reagent.
  • the correspondence table is produced empirically, prior to the preparation of the kits, in the following manner.
  • the signal obtained during the reaction between the calibration standard and the immunological reagent is likewise measured and the concentration, expressed in biological units, corresponding to this same signal value, is noted on each curve previously obtained. .
  • a calibration range that is to say from several calibration standards each consisting of the same homologous compound, but according to different concentrations.
  • labeling reagent this consists of an immunological compound capable of quantifying the reaction between the analytes and the immunological reagent, said immunological compound being coupled to a marker which is preferably a fluorochrome.
  • immunological compound any compound, natural or synthetic, capable of complexing specifically with a complementary compound, such as antibodies and antigens.
  • said labeling reagent reacts with the complex of homologous compound or analyte to be assayed / ligand, in which case the assay is direct, or with the uncomplexed ligand, in which case the assay is indirect.
  • the labeling reagent can be prepared from a single compound, reacting with, for example, an antigen specificity common to all of the homologous compounds, or result from the mixture of different compounds reacting specifically with different homologous compounds.
  • the present invention relates to a method for assaying analytes present in a biological sample and, more particularly, a method for implementing the kit as described above which consists in measuring the signals resulting from the interaction between the immunological reagent and, on the one hand, the biological sample, on the other hand, the calibration standard, and determining and applying, to the various resulting signals, a correction factor so as to obtaining the titration, expressed in biological units, of each analyte in the sample, said correction factor being the ratio between the signal obtained for the calibration standard and the concentrations from the correspondence table.
  • the method of implementing the kit according to the present invention therefore rests on three steps, namely a first step of determining the different signals emitted by flow cytometry, a second step of calculation to determine the different correction factors from the signal emitted by the calibration standard and a third calculation step for the titration of each analyte in the sample from the correction factor previously obtained and the signals emitted by the different samples tested.
  • the method which is the subject of the present invention comprises the following steps: a) incubating, on the one hand, the biological sample and, on the other hand, the calibration standard, with a predetermined quantity of immunological reagent; b) add the labeling reagent; c) measuring, by flow cytometry, the signals emitted, on the one hand, by the calibration standard, on the other hand by the sample; d) determining, for each category of sensitized particles, a correction factor which corresponds to the ratio between the concentration in biological units of each analyte to be assayed as given by the correspondence table and the signal corresponding to the calibration standard and measured at step c); e) multiply by said correction factor, calculated for each analyte, the signal emitted by each category of particles and measured in step c) to deduce therefrom the concentration in biological units of each analyte in the test sample.
  • the method which is the subject of the present invention can be applied to direct dosages.
  • the labeling reagent is specific to the analytes which it is desired to assay and, therefore, the amount of analytes included in a sample is directly proportional to the signal emitted by said labeling reagent.
  • a first application to the simultaneous and direct quantification of antibodies of different antigen specificities is envisaged with said analytes to be assayed which consist of antibodies, said ligands in antigens and said labeling reagent consists of one or more second antibodies labeled with a fluorochrome reacting specifically with the antibodies that one seeks to assay.
  • the immunological reagent consists of different categories of particles each sensitized by a specific antigen.
  • the antibodies which one seeks to assay will complex with the said antigen (s) attached to the particles.
  • the labeling reagent which consists of one or more second antibodies labeled with a fluorochrome and specific for the antibodies that one seeks to assay, will bind to said antibodies previously complexed with the antigens forming the particle awareness layer.
  • the signal emitted by the fluorochrome associated with each category of particles is proportional to the quantity of antibodies present in the sample.
  • second antibodies it is necessary to understand any substance capable of complexing with the antibodies which it is sought to assay, that is to say capable of reacting with an epitope of said antibodies different from that used to ensure their fixation to the ligand.
  • a second application to the simultaneous and direct quantification of different antigens is envisaged with said analytes to be assayed which consist of antigens, said ligands in antibodies and said labeling reagent in a mixture of second antibodies labeled with a fluorochrome reacting specifically with antigens that we are trying to dose.
  • the method which is the subject of the present invention can be applied to so-called dosages indirect.
  • Such assays are no longer based solely on the complementarity between two immunological species, but on the competition between two close immunological species to complex with a third immunological species.
  • the immunological reagent consists of different categories of particles each sensitized by a specific antibody.
  • the antigens that one seeks to assay will then enter into competition with the said antigen (s), labeled with a fluorochrome, constituting the labeling reagent.
  • the increase in the concentration of antigen which it is sought to assay results in the increase in the concentration of antigen complexes which it is sought to assay / fixed antibody, to the detriment of the formation of labeled antigen / fixed antibody complexes. , with a corresponding decrease in signal.
  • the signal emitted by the fluorochrome associated with each category of particles is inversely proportional to the quantity of antigens present in the sample.
  • a second application to the simultaneous and indirect quantification of different antibodies is envisaged with said analytes to be assayed which consist of antibodies, said ligands in antigens and said labeling reagent in a mixture of antibodies labeled with a fluorochrome competing with the analytes to be assayed to complex with the ligands.
  • the system of sensitized particles used in the examples below belongs to the Luminex system.
  • the particles used are of uniform size
  • the detection system for these particles is a flow cytometer interfacing with a computer system for processing the signal emitted by different lasers: a first laser, classifying each category of particles on the basis of its unique fluorescence intensity, allows identify which compound is being analyzed. In parallel, a green laser excites an external fluorescent compound used to quantify the reaction specifically associated with each category of colored particles.
  • lasers other than a green laser can also be used.
  • Example 1 Simultaneous determination of antinuclear antibodies (ANA) directed against the following antigens: SSA, SSB, Sm. Sm / RNP, Scl70. Pretty. dsDNA, centromere.
  • ANA antinuclear antibodies
  • the particles thus activated are then sensitized by different antigens, depending on the category of particles, by suspension of each solution of activated particles in a volume of 1 ml containing 50 to 500 ⁇ g of different antigens.
  • the immunological reagent then consists of a mixture of an aliquot of 500 ⁇ l of each category of colored and sensitized particles, and it is stored at + 4 ° C until use.
  • Figures 1 and 2 give, by way of example, three dose / response curves obtained for two types of ligands (respectively SSA and SSB) expressing the fluorescence signal emitted (Y axis) as a function of the concentration of homologous compound in biological units (X axis). These curves make it possible to select the smallest quantity of ligand corresponding to a significant response signal, this over a measurement range from 0 to 150 biological units approximately.
  • the three curves shown A, B and C correspond respectively to concentrations of SSA antigens of 300, 150 and 75 ⁇ g / ml of particles.
  • the curve used for the SSA system is curve B, corresponding to a concentration of 150 ⁇ g of SSA antigen per ml of particles.
  • the higher concentration of 300 ⁇ g (curve A) results in saturation of the antigen-antibody reaction for the high values.
  • curve C does not make it possible to obtain a response of sufficient amplitude, hence a potential imprecision of the results.
  • the three curves represented A ', B' and C correspond respectively to SSB antigen concentrations of 100, 50 and 25 ⁇ g / ml of particles.
  • the curve used for the SSB system is curve B ′, corresponding to 50 ⁇ g of SSB antigen per ml of particles.
  • the higher concentration of 100 ⁇ g (curve A ') resulting in an almost identical curve is not retained.
  • the lower concentration of 25 ⁇ g (curve C) does not make it possible to obtain a response of sufficient amplitude, in particular at low values.
  • the calibration standard that is to say the homologous compound, is here a solution, diluted in phosphate buffer pH 7.4, of human antibodies purified and directed against the SSA antigen.
  • an average signal is obtained by flow cytometry, tested at least in duplicate , corresponding to 80, for example.
  • the above concentrations expressed in biological units in the correspondence table, are divided by the value of the signal measured for the calibration standard, i.e. say the value obtained with the particles 1 sensitized with the SSA antigen (80).
  • EXAMPLE 2 Simultaneous determination of anti-cytoplasm antibodies of neutrophils (ANCA) directed against the following antigens: myeloperoxidase (MPO) and proteinase 3 (PR3).
  • MPO myeloperoxidase
  • PR3 proteinase 3
  • the immunological reagent is then constituted by a mixture of an aliquot of 500 ⁇ l of each category of colored particles. It is stored at + 4 ° C until use.
  • b) Calibration For calibration, according to the very principle of the invention, a single calibration standard is used. In this example, the category of particles fixed to the MPO antigen is chosen.
  • the calibration standard that is to say the homologous compound, is here a solution, diluted in phosphate buffer pH 7.4, of human antibodies purified and directed against the MPO antigen.
  • the protocol is the same as that used in Example 1.
  • the correspondence table for this calibration standard is as follows:
  • the titer of the PR3 analyte can be determined by multiplying the value of this signal by the correction factor associated with the PR3 analyte (here 1.66).
  • Example 3 evaluation of the reagents prepared in examples 1 and 2 and comparison with reference methods.
  • the specificity was assessed from 50 serum samples from blood donors and 34 samples selected for their potential biological interference (hypergammaglobulinelia, monoclonal gammopathies, other autoantibodies, plasma samples ). These samples constitute group 1.
  • the sensitivity was evaluated from serum samples, selected for each multiparametric assay, clinically characterized and resulting from the routine analysis of an immunology laboratory (Hôpital Tenon, Paris, France). These samples constitute group 2, that is 57 and 35 samples respectively for the detection of ANA and ANCA.
  • This protocol consists in taking 50 ⁇ l of immunological reagent prepared in example 1 and mixing it, on the one hand, with 100 ⁇ l of calibration standard (deposited in duplicate) and, on the other hand, with 100 ⁇ l d 'samples prediluted to 1/200 in phosphate buffer (PBS type, pH 7.4).
  • PBS type, pH 7.4 phosphate buffer
  • the deposits and mixtures are made in a 96-well microplate having at their base a 1.2 ⁇ m filter membrane.
  • One well is reserved for mixing the immunological reagent with the buffer, alone, in order to constitute the “reagent blank”, making it possible to evaluate the signal associated with each category of particles which will then be systematically subtracted from the signal obtained for the other wells.
  • the following steps consist of:
  • labeling reagent consisting of a goat antibody reacting specifically with human immunoglobulins G and conjugated with phycoerythrine. Its concentration is adapted to all the "ligand-homologous compound" systems to be detected simultaneously,
  • At least 200 particles from each category are analyzed for 15 to 25 seconds depending on the number of categories present simultaneously.
  • the computer system classifies each of the particles according to its color and then determines the average fluorescence emitted by the conjugate for each specificity of antibodies.
  • ANCA detection all the samples in group 1 were found negative by the multiparametric test using the reagents prepared in example 2; only one result was discordant using an ELISA kit: it was a false positive for the determination of the PR3 antigen specificity developed by a sample from a patient with hypergammaglobulinemia IgG.
  • Detection of ANA it was carried out on 57 clinically characterized samples for 'detecting ANA from the group 2. A match of 98.7% was obtained of 399 tests carried out simultaneously with the multi-test using the reagents prepared in 'example 1 and with an ELISA kit.
  • Figure 3 attached shows the comparative results obtained, expressed in biological units (BU), for the multi-parameter test (Y axis) compared to the individual ELISA test (X axis). The correlation coefficients are between 0.92 and 0.97 for the ANA specificities. For the centromere, total agreement was obtained with the indirect immunofluorescence (10 positive samples and 47 samples negative).
  • the indirect immunofluorescence method consists of a semi-quantitative method using as substrate human transfected Hep-2 tumor cells.
  • the autoantibodies attached to the substrate are revealed using a human anti-immunoglobulin conjugate labeled with fluorescein isothiocyanate.
  • the presence of anti-centromere antibodies results in a speckled fluorescence on the nucleus at the interphase.
  • the reading is carried out under a fluorescence microscope, determining the last dilution of the sample where this fluorescence remains visible.
  • ANCA detection it was carried out on 35 samples clinically characterized for the detection of ANCA and from group 2. A concordance of 97.1% was obtained on 70 tests carried out simultaneously with the multi-parameter test using the reagents prepared in the example 2 and with an ELISA kit.
  • Figure 4 appended presents the comparative results obtained, expressed in biological units (BU), for the multiparametric test
  • the correlation coefficients are between 0.87 and 0.85 for the ANCA specificities. These lower coefficients than those of ANA detection are due to the strong amplification of positive values in the case of multiparametric dosing.

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Abstract

L’invention utilise différentes catégories de particules sensibilisées, chacune, par un ligand spécifique de l’un des analytes à doser. On prépare un réactif immunologique constitué par un mélange de chacune desdites catégories de particules respectivement sensibilisées par une quantité sélectionnée de ligand, mesure les signaux résultants de l’interaction entre ledit réactif immunologique et, d’une part, l’échantillon biologique, d’autre part, un standand d’étalonnage, détermine un facteur de correction à appliquer aux différents signaux résultants de manière à obtenir la titration, en unités biologiques, de chaque analyte de l’échantillon.

Description

Procédé d'obtention d'un système d'étalonnage unique appliqué aux dosages multiparamétriques d'échantillons biologiques, réactif immunologique préparé à cette fin et procédé de dosage.
La présente invention concerne, d'une manière générale, le domaine des dosages d' analytes à partir d'échantillons biologiques et, plus particulièrement l'étalonnage de tels procédés de dosage. De manière spécifique, la présente invention a pour objet un nouveau procédé d'obtention d'un système d'étalonnage unique, permettant de quantifier simultanément plusieurs analytes, quel que soit leur nombre et dans un même milieu réactionnel . Par système d'étalonnage "unique", on entend un seul système quel que soit le nombre d' analytes recherchés simultanément .
La quantification des analytes compris dans un échantillon biologique étant devenue indispensable tant au niveau de la recherche que de la médecine classique, celle-ci a fait l'objet de nombreux développements visant non seulement à améliorer la fiabilité et la reproductibilité des dosages, mais également à en diminuer les coûts. Les techniques classiques consistent à doser chaque analyte séparément et, pour ce faire, à réaliser pour chacun desdits analytes un étalonnage propre du système utilisé. Il en résulte un grand nombre de manipulations et une consommation importante en réactifs, ce qui a pour conséquence un prix relativement élevé.
Si une telle manière d'opérer reste envisageable dans le contexte de la recherche où la quantité de paramètres à doser est limitée et ciblée, elle pose un sérieux problème de coût dans le contexte de la médecine, où, en laboratoires d'analyse, l'on cherche à doser rapidement un grand nombre d' analytes. Il a récemment été décrit, notamment dans les demandes de brevet internationales WO 99/36564 et WO 97/14028, une technique permettant de quantifier, de façon précise et reproductible, plusieurs analytes en un seul et même dosage à partir du même échantillon. Cette technique repose sur l'utilisation de différentes catégories de particules fluorescentes, chaque catégorie de particules étant sensibilisée par des ligands ayant des propriétés différentes, lesdits ligands étant adaptés à se lier de façon directe ou indirecte aux analytes et consistant généralement en des anticorps ou des antigènes. La quantification de la réaction entre ligand et analytes est réalisée par l'intermédiaire d'un composé fluorescent de longueurs d'onde d'excitation et d'émission différentes de celles des particules fluorescentes.
Ainsi, une simple lecture par cytométrie en flux permet de quantifier la réaction associée à chaque catégorie de particules et donc de déduire de ladite quantification les quantités des différents analytes présents dans un même échantillon.
Cependant, cette quantification nécessite au préalable la construction d'autant de systèmes d'étalonnage que d' analytes à doser, c'est-à-dire de réaliser X*Y dosages réservés à l'étalonnage, X étant le nombre d' analytes à doser simultanément (ou le nombre de particules sensibilisées par des ligands ayant des propriétés différentes) et Y le nombre de points d'étalonnage. Cette méthode entraîne donc non seulement un surcoût de la manipulation, mais également un problème de gestion pratique, du fait de l'encombrement des puits des micro-plaques de titration, (les tests étant généralement réalisés sur des plaques de micro-titration ELISA de 96 puits), ainsi qu'une augmentation de la durée de la manipulation . Par exemple, pour le dosage simultané de 10 analytes, ce système implique la constitution de 10 systèmes d'étalonnage différents, soit pour 100 échantillons testés, une consommation supplémentaire en réactifs allant de 10 à 40% selon le nombre de points d'étalonnage, et un problème évident d ' encombrement .
La présente invention vise à remédier aux inconvénients de l'art antérieur en proposant un nouveau procédé d'étalonnage unique, rapide, simple et reproductible permettant de diminuer la consommation de réactifs consacrée à l'étalonnage, tout en diminuant également l'encombrement des plaques de titration. Ce but est atteint en ce sens que la présente invention concerne un procédé d'étalonnage, ne nécessitant qu'un seul système d'étalonnage, permettant de quantifier simultanément plusieurs analytes dans un même échantillon biologique, procédé qui repose sur la préparation et l'utilisation d'un réactif immunologique spécifique.
Plus particulièrement, un premier aspect de la présente invention concerne un procédé de préparation d'un réactif immunologique entrant dans la composition d'un système d'étalonnage appliqué au dosage d' analytes multiples dans un même échantillon biologique, ledit procédé mettant en oeuvre différentes catégories de particules, chaque catégorie de particules étant sensibilisée par association avec un ligand spécifique de l'un des analytes à doser, ledit procédé comprenant les étapes qui consistent à : a) déterminer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées et pour chacune de n quantités données de ligand associées auxdites particules, la courbe de réponse en fonction de la concentration en composé homologue sur une gamme de concentrations correspondant à la plage de mesure connue de 1 ' analyte à doser; b) sélectionner, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, la courbe correspondant à la plus petite quantité de ligand qui donne un signal de réponse significatif et qui est compatible avec l'utilisation d'une dilution d'échantillon et d'un réactif de marquage communs à tous les analytes simultanément dosés ; c) évaluer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, d'après la courbe retenue à l'étape b) , le signal moyen correspondant au signal associé à un point caractéristique de chacune desdites courbes, obtenant ainsi autant de signaux moyens que de catégories de particules ; d) ajuster, le cas échéant, les quantités de ligand associé à chaque catégorie de particules de sorte que l'ensemble des signaux moyens évalués à l'étape c) soit compris dans un rapport de 1 à 5 , et e) mélanger, dans un solvant approprié, les différentes catégories de particules sensibilisées qui répondent au critère de l'étape d) .
Le procédé objet de la présente invention s'applique donc à des procédés de dosage mettant en oeuvre différentes catégories de particules sensibilisées. Plus particulièrement, de tels procédés consistent principalement en des immunodosages du type :
- dosage direct, par une méthode immunométrique ou "sandwich", par exemple, d'un anticorps ayant réagi avec l'antigène spécifique fixé préalablement sur les particules,
- dosage direct, par une méthode immunométrique ou "sandwich", par exemple, d'un antigène ayant réagi avec l'anticorps spécifique fixé préalablement sur les particules, ou
- dosage indirect, par une méthode dite "par compétition", d'un antigène entrant en compétition avec un antigène similaire marqué, pour sa réaction avec l'anticorps préalablement fixé sur les particules, ou vice- versa.
Ces différents dosages seront décrits plus en détail par la suite.
La réaction développée par mise en contact des différentes catégories de particules, sensibilisées chacune par un ligand, avec les analytes à doser est mesurée par cytometrie en flux selon différents modes d'identification des particules. On peut citer, par exemple, des particules de couleurs différentes et de taille uniforme (identifiées selon leur couleur spécifique, avec quantification des réactions analyte- ligand par adjonction d'un composé externe de longueurs d'excitation et d'émission différentes de celles des particules) , des particules de tailles différentes et de couleur identique (identifiées selon leur taille, avec quantification des réactions analyte-ligand par mesure de la taille des agrégats résultants) ou encore des particules de tailles différentes et de couleur identique (classées selon leur taille, avec quantification des réactions analyte-ligand par adjonction d'un composé externe de longueurs d'onde d'excitation et d'émission différentes de celles des particules) . En pratique, l'un ou l'autre de ces procédés est sélectionné en fonction du nombre, plus ou moins important, de paramètres à tester.
Ces particules sont constituées généralement de polystyrène. Toutefois, elles peuvent être également constituées de tout polymère leur conférant des propriétés physico-chimiques spécifiques (fonctionnalité, densité ou encore solubilité) comme du styrène-acide maléique, du styrène-acide méthacrylique, du styrène-acrylamide ou du poly (méthacrylate de méthyle) .
Par "ligand", il faut comprendre un antigène, un anticorps, mono- ou polyclonal, ou toute molécule capable de se fixer aux particules et qui est susceptible d' interagir, de quelque manière que ce soit, directement ou indirectement, avec l' analyte à doser.
On entend par "antigène" toute substance à partir de laquelle peut être générée la production d'anticorps. Parmi ces substances, on peut citer les protéines, les haptènes, les allergènes, les peptides, les médicaments ou encore les drogues .
Par "composé homologue", il faut comprendre un anticorps, un antigène ou toute molécule capable de se fixer à un ligand donné et dont le site d'interaction avec ledit ligand est similaire au site d'interaction entre 1 ' analyte à doser et ledit ligand. Le composé homologue peut être l' analyte lui-même.
La première étape du procédé consiste donc à déterminer pour chaque catégorie de particules sensibilisées, telles que décrites plus haut, la corrélation qui existe, pour une quantité donnée de ligand fixée aux particules, entre la quantité de composé homologue et la grandeur du signal émis, représentatif des interactions ligand/analyte . En pratique, pour chaque catégorie de particules, plusieurs essais sont effectués en fixant une quantité donnée, différente pour chaque essai, d'un même ligand auxdites particules, en mettant ensuite en contact les particules ainsi sensibilisées avec différentes quantités de composé homologue, identiques pour l'ensemble des essais, et en mesurant le signal résultant de leur interaction.
Plus particulièrement, les quantités de ligand utilisées varient par pas de 2 à 4. Les différentes quantités de composé homologue sont sélectionnées de manière à être comprises dans la plage de mesure de 1 ' analyte que l'on cherche à doser. Ainsi, si l'on cherche à doser un analyte dont la concentration peut varier entre 0 et 100 unités biologiques, on choisira, par exemple, six quantités données de composé homologue correspondant à 0, 20, 40, 60, 80 et 100 unités biologiques. Dans la pratique, on utilise une population d'échantillons caractérisés et certifiés sur des critères clinico-biologiques, c'est-à-dire dont la présence ou l'absence en un analyte donné est validée par un diagnostic clinique et/ou par l'estimation de 1 ' analyte par une ou plusieurs autre (s) méthode (s) de dosage.
Le résultat de cette opération se traduit par l'obtention d'une courbe dose/réponse entre la quantité de composé homologue et les signaux obtenus pour chacune des n quantités données de ligand. Le concept d'expression de la concentration en unités biologiques repose sur l'affectation, par exemple, d'une gamme 0-150 à la plage de mesure de chacun des analytes à doser. On comprend que ces plages de mesure diffèrent, dans l'absolu, d'un analyte à l'autre et que, par suite, une même concentration en différents analytes exprimée en unités biologiques, par exemple 95 unités biologiques (en abrégé 95 UB) ne correspond pas à la même concentration, dans l'absolu, en ces mêmes analytes. La concentration en composés homologues est exprimée, de même façon, en unités biologiques sur une gamme identique pour tous les analytes.
A ce niveau, il faut noter que la sensibilisation des particules peut être effectuée de différentes manières, à savoir par covalence, par le biais d'une couche moléculaire intermédiaire biologiquement et/ou chimiquement réactive, ou encore par l'utilisation d'un système d'interaction par affinité.
Les particules sensibilisées, dans la mesure où elles comportent une fonctionnalité réactive, peuvent être sensibilisées par covalence. Ainsi, de nombreux protocoles d'immobilisation ont été décrits comme faisant intervenir de façon non limitative les groupements fonctionnels suivants entre les particules et le ligand :
- COOH/R-NH2 ou R-OH,
- CO-NH2/NH2 -NH2 ,
- C ( =0) -0- CH3/NH2 -NH2 ,
- NH2CHO/RCOOH , ou encore
R-NH2 ou NH2 - H,
Il est à noter que, lors de l'utilisation de la plupart des couples cités plus haut, il est nécessaire d'activer préalablement certaines fonctions, comme par exemple les fonctions COOH, afin qu'elles puissent réagir, par exemple, avec les groupements fonctionnels du ligand, tels que des groupements aminés aliphatiques ou aromatiques . Selon une autre forme d'exécution préférée, l'activation peut être réalisée par des carbodiimides hydrosolubles, et être effectuée en une seule étape ou, selon une forme d'exécution particulièrement préférée, en deux étapes, avec le carbodiimide seul ou en présence de N-hydroxysuccinimide . Elle est suivie de l'élimination de l'excès d'activateur avant fixation du ligand.
Selon encore une autre forme d'exécution, un bras espaceur homo- ou hétéro-bifonctionnel , présentant des fonctions chimiques réactives à chaque extrémité, respectivement identiques ou différentes, peut être fixé aux particules préalablement activées. Ces bras de longueur et de fonctionnalité variables peuvent être activés et couplés par covalence, dans un premier temps, aux particules par l'une des extrémités, et dans un deuxième temps, au composé à fixer, par l'autre extrémité.
Des intermédiaires chimiquement ou biologiquement actifs peuvent également être utilisés pour la sensibilisation. Ils créent à la surface des microparticules une couche moléculaire intermédiaire constituée par une protéine (telle que l'albumine), un mélange de protéines ou un polymère (tel que la polylysine) . Ce procédé est particulièrement utilisé dans le cas de particules de petite taille qui peuvent ensuite être couplées par l'intermédiaire d'agents de liaison sur les fonctions de cette couche intermédiaire.
Une autre voie de sensibilisation, cette fois non covalente, consiste à utiliser, de façon non limitative, des systèmes d'interaction par affinité : - le système biotine-avidine, en utilisant des particules couplées à 1 ' avidine qui sont mises en présence de composés ayant été préalablement biotinylés, - la protéine A ou la protéine G, disposant d'un récepteur pour le fragment Fc des immunoglobulines, permettant l'immobilisation d'un anticorps et l'orientation vers l'extérieur de ses fragments Fab, responsables de la reconnaissance antigénique, ou encore - l'immobilisation indirecte par l'intermédiaire d'un anticorps spécifique du composé à fixer. Cette énumération n'est aucunement limitative et il est évident que tout procédé de sensibilisation similaire connu de l'homme du métier peut également être utilisé.
Pour chaque ligand à fixer, la sélection d'un des systèmes précités est réalisée initialement pendant la phase initiale de mise au point. Les conditions opératoires sont ensuite fixées et appliquées ultérieurement de façon systématique .
Dans une forme d'exécution préférée, le milieu de sensibilisation est constitué d'eau tamponnée ayant un pH compris entre 5 et 9 et une force ionique comprise entre 0,01 et 0,1. Afin de maintenir constant le milieu, le ligand peut être mis en suspension dans le même milieu avant d'effectuer ladite sensibilisation.
L'intérêt d'un tel système réside dans sa simplicité d'utilisation, son faible coût et son indépendance réactionnelle par rapport aux autres réactions simultanées. Cela est rendu possible par le fait que la réaction produite par chaque catégorie de particules sensibilisées est standardisée et reproductible, que le signal fourni par cette réaction est représentatif de l'ensemble des réactions ligand-analyte se développant simultanément et que l'ensemble de ces réactions est maîtrisé au niveau du procédé de sensibilisation de chaque catégorie de particules de façon à ce qu'elles produisent toutes un signal similaire en présence d'échantillons de même degré de positivité, c'est-à-dire comprenant sensiblement la même quantité en l' analyte dosé telle qu'exprimée sur sa gamme d'unités biologiques particulière.
Une fois les courbes dose/réponse obtenues, il est déterminé, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, comme décrit à l'étape b) , la courbe correspondant à la plus petite quantité de ligand donnant, graphiquement, un signal de lecture significatif et compatible avec l'utilisation d'une dilution d'échantillon ainsi que d'un réactif de marquage communs pour l'ensemble des analytes simultanément détectés. Par "signal de réponse significatif", il faut comprendre un signal suffisamment élevé pour assurer une précision de lecture sur l'ensemble de la plage de mesure.
En pratique, la courbe sélectionnée doit être sensiblement linéaire et avoir une amplitude de mesure suffisamment élevée.
Chaque type de particule est donc sensibilisé par l'une des techniques décrites plus haut en employant la quantité de ligand déterminée ci-dessus.
L'étape suivante c) consiste alors à déterminer le signal moyen (SM) associé à une concentration en unités biologiques, identique pour tous les analytes.
Pour ce faire, un point caractéristique de la courbe dose/réponse retenue à l'étape b) est sélectionné et le signal correspondant graphiquement audit point est pris comme signal moyen SM.
Le point caractéristique, autrement appelé point positif ou de forte positivité, est choisi arbitrairement dans le quart supérieur de la partie linéaire de la courbe. Les signaux moyens SM obtenus pour les différentes catégories de particules sensibilisées sont ensuite comparés entre eux et, si nécessaire, réajustés de sorte qu'ils soient tous compris dans un rapport de 1 à 5. En pratique, pour les catégories de particules ayant un SM non compris dans ledit rapport, la réactivité est alors réajustée en sélectionnant dans la courbe dose/réponse une autre quantité de ligand et en recommençant l'opération de sensibilisation desdites particules par cette nouvelle quantité de ligand jusqu'à obtenir que le SM résultant entre dans le rapport de 1 à 5 précité. Le fait que les SM des différentes particules sensibilisées constituant le réactif immunologique soient tous compris dans un rapport de 1 à 5 est déterminant pour assurer une réactivité immunologique relativement équivalente pour chaque type de particules sensibilisées utilisées et donc d'obtenir, dans une gamme de mesures compatible avec la réalité biologique, des valeurs suffisamment proches pour permettre l'utilisation d'un système d'étalonnage unique et commun à l'ensemble des analytes .
Le réactif immunologique est alors constitué par mélange, dans un solvant, des différents types de particules sensibilisées ainsi obtenues.
On peut citer comme solvants possibles : des mélanges de protéines et d'acides aminés ou encore un mélange de protéines inertes vis-à-vis des analytes à doser et permettant une stabilisation de particules. En tout état de cause, les solvants utilisés sont sélectionnés de manière à permettre la conservation de l'ensemble des particules sensibilisées, et leur choix se trouve donc dicté par la nature des ligands les plus contraignants . De ce fait, ledit solvant peut être défini de sorte qu'il est adapté et commun à l'ensemble des ligands.
Afin de rendre industrialisable un tel procédé de préparation du réactif immunologique, faisant intervenir la réactivité individuelle de différentes particules couplées à des ligands spécifiques, les conditions expérimentales de sensibilisation, à savoir le pH, la force ionique, le volume, la température ou encore la durée du couplage, sont préalablement fixés et standardisés pour l'ensemble des particules. Seule varie ensuite, comme décrit plus haut, la quantité de ligand à ajuster.
En pratique, le solvant utilisé est tamponné à un pH compris entre 7 et 9 et a une force ionique comprise entre 0, 01 et 0,1.
Selon un second aspect de la présente invention, celle-ci porte sur un réactif immunologique destiné au dosage d' analytes multiples dans des échantillons biologiques, ledit réactif comprenant un solvant et, mélangées au sein dudit solvant, différentes catégories de particules, dont chacune est sensibilisée par association avec une quantité donnée en un ligand spécifique de l'un des analytes à doser, avec, pour chacune des catégories de particules, et pour une concentration donnée en composé homologue du ligand, telle qu'exprimée en unités biologiques, ladite quantité donnée de ligand débouchant sur un signal dit "signal moyen", qui est compris dans un rapport de 1 à 5 avec les signaux moyens obtenus pour les autres catégories de particules.
Selon un troisième aspect, la présente invention concerne un kit de dosage d' analytes multiples dans des échantillons biologiques mettant en oeuvre différentes catégories de particules, chaque catégorie de particules étant sensibilisée par un ligand spécifique de l'un des analytes à doser, qui comprend : i) un réactif immunologique issu du procédé tel que décrit plus haut, ii) au moins un standard d'étalonnage constitué d'un unique composé homologue réagissant avec l'une des catégories de particules entrant dans la composition du réactif immunologique, iii) une table de correspondance entre la concentration, exprimée en unités biologiques, du composé homologue constituant le standard d'étalonnage et celle de chacun des composés homologues aux autres ligands fixés sur les autres catégories de particules entrant dans la composition du réactif immunologique, et iv) un réactif de marquage. Plus particulièrement, ledit standard d'étalonnage comprend un composé homologue réagissant directement ou indirectement avec le ligand fixé à la particule sensibilisée .
La fixation indirecte peut se faire, par exemple, par l'intermédiaire d'une protéine utilisée pour saturer les sites de fixation de la particule non occupés par le ligand. Cette protéine doit être choisie de façon à ne pas interférer avec le système spécifique et être présente sur une seule catégorie de particule. Dans ce cas, le milieu de quantification devra contenir un réactif de marquage spécifique des analytes à doser (constitué d'un ou de plusieurs composés) et un réactif de marquage spécifique de la protéine inerte.
Dans une première forme d'exécution, ledit composé homologue est de même origine que 1 ' analyte à doser, par exemple, d'origine humaine.
Dans une seconde forme d'exécution, ledit composé homologue et 1 ' analyte à doser sont d'origines différentes.
Alors que, par exemple, 1 ' analyte à doser est d'origine humaine, tel que des autoanticorps présents dans des échantillons sanguins humains, le composé homologue peut être, par exemple, d'origine animale pour autant qu'il soit capable de réagir spécifiquement avec le ligand. Le milieu de quantification devra, dans ce cas, contenir, à la fois un réactif de marquage spécifique des échantillons d'origine humaine et un réactif de marquage spécifique du standard d'origine animale.
La préparation du standard d'étalonnage implique une optimisation préalable de sa concentration de façon à produire un SM compris dans un rapport de 1 à 5 par rapport aux SM obtenus pour chaque catégorie de particules sensibilisées lors de la préparation du réactif immunologique .
Pour ce qui est de la "table de correspondance", celle-ci consiste en un référentiel, pouvant se présenter sous la forme d'un tableau, d'un graphique, etc., qui donne les différentes concentrations, exprimées en unités biologiques, du composé homologue constituant le standard d'étalonnage et celle de chacun des composés homologues aux autres ligands fixés sur les autres catégories de particules entrant dans la composition du réactif immunologique . La table de correspondance est réalisée empiriquement, préalablement à la préparation des kits, de la manière suivante.
On fait réagir plusieurs échantillons, comprenant des quantités différentes et connues d' analytes à doser avec le réactif immunologique qui fera partie du kit. On mesure les signaux résultants et l'on trace, pour chaque analyte, la droite de régression linéaire liant les signaux émis aux quantités connues, exprimées en unités biologiques, des analytes dosés, selon une équation de type y=ax, avec y=signal et x=concentration en unités biologiques.
On mesure, de même, le signal obtenu lors de la réaction entre le standard d'étalonnage et le réactif immunologique et l'on relève, sur chaque courbe précédemment obtenue, la concentration, exprimée en unités biologiques, correspondant à cette même valeur de signal.
C'est l'ensemble de ces concentrations en analytes, exprimées en unités biologiques, qui constitue la table de correspondance . La concentration du standard peut être ensuite vérifiée à partir de la table de correspondance et ajustée si nécessaire.
Dans une variante, il peut être souhaité de réaliser une gamme d'étalonnage, c'est-à-dire de partir de plusieurs standards d'étalonnage constitué chacun du même composé homologue, mais selon différentes concentrations.
Dans ce cas, le principe de réalisation de la table de correspondance reste le même, mis à part que l'on trace pour chaque analyte, à partir des différents signaux obtenus, la droite de régression liant les signaux émis aux quantités connues, en unités biologiques, des analytes à doser selon une équation de type log y=a(log x) , avec y=signal et x=concentration en unités biologiques.
Cette équation est ensuite appliquée aux signaux correspondant aux différentes concentrations connues de standard d'étalonnage de façon à déduire la correspondance entre chacune desdites concentrations et la concentration de chaque analyte, exprimée en unités biologiques.
Pour ce qui est du "réactif de marquage", celui-ci consiste en un composé immunologique susceptible de quantifier la réaction entre les analytes et le réactif immunologique, ledit composé immunologique étant couplé à un marqueur qui est, de préférence un fluorochrome .
Par "composé immunologique", il faut comprendre tout composé, naturel ou de synthèse, susceptible de se complexer spécifiquement avec un composé complémentaire, tels que les anticorps et les antigènes.
Selon une forme d'exécution préférée, ledit réactif de marquage réagit avec le complexe composé homologue ou analyte à doser / ligand, auquel cas le dosage est direct, ou avec le ligand non complexé, auquel cas le dosage est indirect .
En outre, le réactif de marquage peut être préparé à partir d'un composé unique, réagissant avec, par exemple, une spécificité antigénique commune à l'ensemble des composés homologues, ou résulter du mélange de différents composés réagissant spécifiquement avec différents composés homologues .
Selon un dernier aspect de la présente invention, celle-ci porte sur un procédé de dosage d' analytes présents dans un échantillon biologique et, plus particulièrement, un procédé de mise en oeuvre du kit tel que décrit plus haut qui consiste à mesurer les signaux résultants de l'interaction entre le réactif immunologique et, d'une part, l'échantillon biologique, d'autre part, le standard d'étalonnage, et à déterminer et appliquer, aux différents signaux résultants, un facteur de correction de manière à obtenir la titration, exprimée en unités biologiques, de chaque analyte de l'échantillon, ledit facteur de correction étant le rapport entre le signal obtenu pour le standard d'étalonnage et les concentrations issues de la table de correspondance. Le procédé de mise en oeuvre du kit selon la présente invention repose donc sur trois étapes, à savoir une première étape de détermination des différents signaux émis par cytometrie en flux, une seconde étape de calcul pour déterminer les différents facteurs de correction à partir du signal émis par le standard d'étalonnage et une troisième étape de calcul pour la titration de chaque analyte de l'échantillon à partir du facteur de correction précédemment obtenu et les signaux émis par les différents échantillons testés.
Plus particulièrement, le procédé objet de la présente invention comprend les étapes suivantes : a) incuber, d'une part, l'échantillon biologique et, d'autre part, le standard d'étalonnage, avec une quantité prédéterminée de réactif immunologique ; b) ajouter le réactif de marquage ; c) mesurer, par cytometrie en flux, les signaux émis, d'une part, par le standard d'étalonnage, d'autre part par l'échantillon ; d) déterminer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, un facteur de correction qui correspond au rapport entre la concentration en unités biologiques de chaque analyte à doser telle que donnée par la table de correspondance et le signal correspondant au standard d'étalonnage et mesuré à l'étape c) ; e) multiplier par ledit facteur de correction, calculé pour chaque analyte, le signal émis par chaque catégorie de particules et mesuré à l'étape c) pour en déduire la concentration en unités biologiques de chaque analyte dans l'échantillon testé.
Dans une première variante, le procédé objet de la présente invention peut être appliqué à des dosages directs. Dans de tels dosages, le réactif de marquage est spécifique des analytes que l'on cherche à doser et, de ce fait, la quantité d' analytes compris dans un échantillon est directement proportionnelle au signal émis par ledit réactif de marquage. Une première application à la quantification simultanée et directe d'anticorps de spécificités antigéniques différentes est envisagée avec lesdits analytes à doser qui consistent en des anticorps, lesdits ligands en des antigènes et ledit réactif de marquage est constitué par un ou plusieurs seconds anticorps marqués par un fluorochrome réagissant spécifiquement avec les anticorps que l'on cherche à doser.
Dans ce cas, le réactif immunologique est constitué de différentes catégories de particules sensibilisées chacune par un antigène spécifique. Les anticorps que l'on cherche à doser vont se complexer avec le ou lesdits antigène (s) fixé (s) aux particules. Le réactif de marquage, qui est constitué par un ou plusieurs second (s) anticorps marqué (s) par un fluorochrome et spécifique (s) des anticorps que l'on cherche à doser, va se fixer auxdits anticorps préalablement complexés avec les antigènes formant la couche de sensibilisation des particules. Ainsi, le signal émis par le fluorochrome associé à chaque catégorie de particules est proportionnel à la quantité d'anticorps présents dans l'échantillon.
Par "seconds anticorps", il faut comprendre toute substance capable de se complexer avec les anticorps que l'on cherche à doser, c'est-à-dire capable de réagir avec un épitope desdits anticorps différent de celui mis en oeuvre pour assurer leur fixation au ligand.
Une seconde application à la quantification simultanée et directe de différents antigènes est envisagée avec lesdits analytes à doser qui consistent en des antigènes, lesdits ligands en des anticorps et ledit réactif de marquage en un mélange de seconds anticorps marqués par un fluorochrome réagissant spécifiquement avec les antigènes que l'on cherche à doser.
Le principe est ici identique à celui décrit plus haut .
Dans une seconde variante, le procédé objet de la présente invention peut être appliqué à des dosages dits indirects. De tels dosages sont non plus basés uniquement sur la complémentarité entre deux espèces immunologiques, mais sur la compétition entre deux espèces immunologiques proches à se complexer avec une troisième espèce immunologique .
Ainsi, selon une première possibilité, il est envisagé la quantification simultanée et indirecte de différents antigènes avec lesdits analytes à doser qui consistent en des antigènes, lesdits ligands en des anticorps et ledit réactif de marquage en un mélange d'antigènes marqués par un fluorochrome entrant en compétition avec les analytes à doser pour se complexer avec les ligands.
Dans ce cas, le réactif immunologique est constitué de différentes catégories de particules sensibilisées chacune par un anticorps spécifique. Les antigènes que l'on cherche à doser vont alors entrer en compétition avec le ou lesdits antigènes, marqués par un fluorochrome, constituant le réactif de marquage. Ainsi, l'augmentation de la concentration en antigène que l'on cherche à doser entraîne l'augmentation de la concentration en complexes antigène que l'on cherche à doser / anticorps fixé, au détriment de la formation de complexes antigène marqué / anticorps fixé, avec corrélativement une diminution du signal. Il en résulte que le signal émis par le fluorochrome associé à chaque catégorie de particules est inversement proportionnel à la quantité d'antigènes présente dans 1 ' échantillon.
Une seconde application à la quantification simultanée et indirecte de différents anticorps est envisagée avec lesdits analytes à doser qui consistent en des anticorps, lesdits ligands en des antigènes et ledit réactif de marquage en un mélange d'anticorps marqués par un fluorochrome entrant en compétition avec les analytes à doser pour se complexer avec les ligands.
La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples suivants. MATERIEL ET METHODE
Le système de particules sensibilisées utilisées dans les exemples ci -après appartient au système Luminex .
Les particules utilisées sont de taille uniforme
(5,5 μm) et se distinguent les unes des autres par une coloration spécifique (100 couleurs, du rouge à l'orange).
Le système de détection de ces particules est un cytomètre en flux interface avec un système informatique pour le traitement du signal émis par différents lasers : un premier laser, en classant chaque catégorie de particules sur la base de son intensité de fluorescence unique, permet d'identifier quel composé est analysé. Parallèlement, un laser vert excite un composé fluorescent externe utilisé pour quantifier la réaction spécifiquement associée à chaque catégorie de particules colorées.
Selon d'autres formes d'exécution, et d'après les connaissances de l'homme du métier, il peut également être utilisé des lasers autres qu'un laser vert.
Exemple 1 : Dosage simultané des anticorps antinucléaires (ANA) dirigés contre les antigênes suivants : SSA, SSB, Sm. Sm/RNP, Scl70. Jol . dsDNA, centromère.
a) Préparation du réactif immunologique. Huit catégories de particules de polystyrène colorées et fonctionnalisées par des groupements COOH sont sélectionnées. Préalablement à la sensibilisation, les particules sont activées par un procédé qui consiste en :
- la séparation des huit catégories de particules dans huit tubes différents,
- l'ajout de 1 ml d'une solution de carbodiimide dosé entre 10 et 40 mg/ml , fraîchement préparée, à 1 ml de chaque type de particules (soit environ 10 particules) ,
- l'incubation pendant 20 à 60 minutes à température ambiante, et - trois lavages des particules à l'eau distillée en centrifugeant à lOOOOxg pendant 2 minutes pour éliminer l'excès de carbodiimide.
Parallèlement, les quantités en chaque ligand, ou antigène, devant être fixées aux différentes catégories de particules ont été déterminées suivant l'invention, comme décrit plus haut .
Les particules ainsi activées sont ensuite sensibilisées par des antigênes différents, selon la catégorie de particules, par suspension de chaque solution de particules activées dans un volume de 1 ml contenant de 50 à 500 μg d'antigènes différents.
On obtient ainsi le système suivant :
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Les étapes suivantes consistent en :
- 1 ' incubation pendant 4 à 6 heures à température ambiante, - le lavage des particules à l'eau distillée,
- la mise en suspension dans un tampon pH 8 contenant un mélange de substances aminées afin de saturer les sites libres et ramener les particules à une concentration de l'ordre de 10 à 5.10 particules par ml. Le réactif immunologique est alors constitué d'un mélange d'un aliquote de 500 μl de chaque catégorie de particules colorées et sensibilisées, et il est conservé à +4°C jusqu'à son utilisation.
Les figures 1 et 2 donnent, à titre d'exemple, trois courbes dose/réponse obtenues pour deux types de ligands (respectivement SSA et SSB) exprimant le signal de fluorescence émis (axe des Y) en fonction de la concentration en composé homologue en unités biologiques (axe des X) . Ces courbes permettent de sélectionner la plus petite quantité de ligand correspondant à un signal de réponse significatif, ceci sur une plage de mesure de 0 à 150 unités biologiques environ.
Pour chaque système, cinq échantillons ont été sélectionnés en fonction de leur titre en unités biologiques, déterminé par ELISA (coffret ENA-LISA, commercialisé par la déposante) . La concentration en composé homologue, la prise d'essai et la dilution sont communes .
Pour ce qui est du système SSA (Figure 1) , les trois courbes représentées A, B et C correspondent respectivement à des concentrations en antigènes SSA de 300, 150 et 75 μg/ml de particules. La courbe retenue pour le système SSA est la courbe B, correspondant à une concentration de 150 μg d'antigène SSA par ml de particules. La concentration supérieure de 300 μg (courbe A) se traduit par une saturation de la réaction antigène-anticorps pour les valeurs élevées. La concentration inférieure de 75 μg
(courbe C) ne permet pas d'obtenir une réponse d'amplitude suffisante, d'où une imprécision potentielle des résultats.
Pour ce qui est du système SSB, les trois courbes représentées A', B' et C correspondent respectivement à des concentrations en antigênes SSB de 100, 50 et 25 μg/ml de particules. La courbe retenue pour le système SSB est la courbe B', correspondant à 50 μg d'antigène SSB par ml de particules. La concentration supérieure de 100 μg (courbe A') se traduisant par une courbe quasi-identique n'est pas retenue. La concentration inférieure de 25 μg (courbe C) ne permet pas d'obtenir une réponse d'amplitude suffisante, notamment dans les faibles valeurs.
b) Etalonnage.
Un seul standard d'étalonnage est réalisé. Dans cet exemple, on choisit la catégorie de particules 1 fixées à l'antigène SSA. Le standard d'étalonnage, c'est-à-dire le composé homologue, est ici une solution, diluée en tampon phosphate pH 7,4, d'anticorps humains purifiés et dirigés contre l'antigène SSA.
La table de correspondance, pour ce standard d'étalonnage est la suivante :
Figure imgf000023_0001
Cette table a été obtenue comme indiqué plus haut .
c) Mesure du signal émis par le standard d'étalonnage Pour les particules 1, sensibilisées à l'antigène SSA, réagissant avec le standard d'étalonnage, on obtient par cytometrie en flux un signal moyen (SM) , testé au moins en double, correspondant à 80, par exemple.
d) Détermination des facteurs de correction.
Afin de déterminer les facteurs de correction à attribuer à chaque spécificité, on divise les concentrations ci-dessus, exprimées en unités biologiques dans la table de correspondance, par la valeur du signal mesuré pour le standard d'étalonnage, c'est-à-dire la valeur obtenue avec les particules 1 sensibilisées avec l'antigène SSA (80) .
On obtient les facteurs de correction suivants :
Figure imgf000023_0002
Ces facteurs de correction seront utilisés lors du dosage d' analytes dans des échantillons biologiques. Ainsi, si l'on dose, au moyen du réactif immunologique ayant précédemment donné un signal de 80 avec le standard d'étalonnage, l' analyte SSB dans un échantillon, et que l'on obtient un signal correspondant à 120, on pourra déterminer le titre de l' analyte SSB en multipliant la valeur de ce signal par le facteur de correction associé à l' analyte SSB (ici 0,75). Le titre de SSB dans l'échantillon sera donc, dans cet exemple, égal à 0,75 x 120 = 90 UB.
Exemple 2 : Dosage simultané des anticorps anti- cytoplasme de polynucléaires neutrophiles (ANCA) dirigés contre les antigènes suivants : myéloperoxydase (MPO) et protéinase 3 (PR3) .
a) Préparation du réactif immunologique.
Dans cet exemple, seules deux particules colorées différentes sont sensibilisées séparément avec les deux antigènes MPO et PR3 , de façon identique à l'exemple 1.
Le réactif immunologique est ensuite constitué par un mélange d'un aliquote de 500 μl de chaque catégorie de particules colorées. Il est conservé à +4°C jusqu'à utilisation.
b) Etalonnage. Pour l'étalonnage, selon le principe même de l'invention, on utilise un seul standard d'étalonnage. Dans cet exemple, on choisit la catégorie de particules fixées à l'antigène MPO. Le standard d'étalonnage, c'est-à-dire le composé homologue, est ici une solution, diluée en tampon phosphate pH 7.4, d'anticorps humains purifiés et dirigés contre l'antigène MPO. Le protocole est le même que celui utilisé dans l'exemple 1. La table de correspondance, pour ce standard d'étalonnage, est la suivante :
Figure imgf000025_0001
c) Mesure du signal émis par le standard d'étalonnage Le même protocole que dans l'exemple 1 est utilisé pour déterminer ledit signal. Le signal moyen (SM) obtenu pour le standard d'étalonnage (testé en double) réagissant avec les particules MPO correspond, par exemple, à 150.
d) Détermination des facteurs de correction Afin de déterminer les facteurs de correction à attribuer à chaque spécificité, on divise les concentrations ci -dessus, exprimées en unités biologiques, par la valeur du signal du standard d'étalonnage, c'est-à-dire les particules 1 sensibilisées à l'antigène MPO (S=150) .
On obtient les facteurs de correction suivants :
Figure imgf000025_0002
De manière similaire à l'exemple 1, si l'on dose, au moyen du réactif immunologique ayant précédemment donné un signal de 150 avec le standard d'étalonnage, l' analyte PR3 dans un échantillon, et que l'on obtient un signal correspondant à 110, on pourra déterminer le titre de l' analyte PR3 en multipliant la valeur de ce signal par le facteur de correction associé à l'analyte PR3 (ici 1,66). Le titre de PR3 dans l'échantillon sera donc, dans cet exemple, égal à 1,66 x 110 = 183 UB . Exemple 3 : évaluation des réactifs préparés dans les exemples 1 et 2 et comparaison avec des méthodes de références .
Afin d'évaluer les réactifs immunologiques préparés dans les exemples 1 et 2 et comparer leurs résultats avec ceux des méthodes de référence de type ELISA, la spécificité et la sensibilité desdits réactifs ont été étudiées .
a) Détermination de la spécificité.
La spécificité a été évaluée à partir de 50 échantillons sériques issus de donneurs de sang et de 34 échantillons sélectionnés pour leurs interférences biologiques potentielles (hypergammaglobulinélie, gammopathies monoclonales, autres autoanticorps, échantillons plasmatiques ... ) . Ces échantillons constituent le groupe 1.
b) Détermination de la sensibilité.
La sensibilité a été évaluée à partir d'échantillons sériques, sélectionnés pour chaque dosage multiparamétrique, caractérisés cliniquement et issus de l'analyse de routine d'un laboratoire d'immunologie (Hôpital Tenon, Paris, France) . Ces échantillons constituent le groupe 2, soit respectivement 57 et 35 échantillons pour la détection des ANA et des ANCA.
c) Protocole d'évaluation de la spécificité et de la sensibilité des échantillons :
Ce protocole consiste à prélever 50 μl de réactif immunologique préparé dans l'exemple 1 et à le mélanger, d'une part, à 100 μl de standard d'étalonnage (déposé en double) et, d'autre part, à 100 μl d'échantillons prédilués au 1/200 dans un tampon phosphate (type PBS, pH 7,4) . Les dépôts et mélanges se font dans une microplaque de 96 puits disposant à leur base d'une membrane filtrante de 1,2 μm. Un puits est réservé au mélange du réactif immunologique avec le tampon, seul, afin de constituer le « blanc réactif », permettant d'évaluer le signal associé à chaque catégorie de particules qui sera ensuite soustrait systématiquement du signal obtenu pour les autres puits. Les étapes suivantes consistent à :
- incuber pendant 30 minutes à température ambiante,
- laver deux fois avec filtration à travers la membrane filtrante de la microplaque, - remettre le milieu en suspension dans 100 μl de réactif de marquage, constitué par un anticorps de chèvre réagissant spécifiquement avec les immunoglobulines G humaines et conjugué à la phycoerythrine. Sa concentration est adaptée à l'ensemble des systèmes "ligand-composé homologue" à détecter simultanément,
- incuber pendant 30 minutes, et
- analyser par cytometrie en flux.
Ce faisant, au moins 200 particules de chaque catégorie sont analysées pendant 15 à 25 secondes selon le nombre de catégories présentes simultanément. Pendant ce temps, le système informatique classe chacune des particules selon sa couleur et détermine ensuite la fluorescence moyenne émise par le conjugué pour chaque spécificité d'anticorps.
d) Méthodes comparatives utilisées.
Les résultats obtenus avec les réactifs préparés dans les exemples 1 et 2 ont été comparés avec ceux issus de la mise en oeuvre de trousses de dosage du commerce (Biomédical Diagnostics, Marne-La-Vallée, France) : coffrets ELISA (DNA-LISA, ENA-LISA, MPO-LISA et PR3-LISA) et substrat Hep2000 pour la détermination par immunofluorescence indirecte du centromère . RESULTATS
Evaluation de la spécificité (échantillons du groupe 1) .
détection des ANA : tous les échantillons du groupe 1 ont été trouvés négatifs par le test multiparamétrique utilisant les réactifs préparés dans l'exemple 1 et par le protocole utilisant un coffret ELISA.
détection des ANCA : tous les échantillons du groupe 1 ont été trouvés négatifs par le test multiparamétrique utilisant les réactifs préparés dans l'exemple 2 ; un seul résultat était discordant en utilisant un coffret ELISA : il s'agissait d'un faux positif pour la détermination de la spécificité antigénique PR3 développé par un échantillon issu d'un patient présentant une hypergammaglobulinémie IgG.
Evaluation de la sensibilité (échantillons du groupe 2 )
détection des ANA : elle a été effectuée sur 57 échantillons cliniquement caractérisés pour 'la détection des ANA et issus du groupe 2. Une concordance de 98,7% a été obtenue sur 399 tests réalisés simultanément avec le test multiparamétrique utilisant les réactifs préparés dans l'exemple 1 et avec un coffret ELISA. La figure 3 annexée présente les résultats comparatifs obtenus, exprimés en unités biologiques (UB) , pour le test multiparamétrique (axe des Y) par rapport au test ELISA individuel (axe des X) . Les coefficients de corrélation sont compris entre 0,92 et 0,97 pour les spécificités ANA. Pour le centromère, une concordance totale a été obtenue avec 1 ' immunofluorescence indirecte (10 échantillons positifs et 47 échantillons négatifs). La méthode d' immunofluorescence indirecte consiste en une méthode semi-quantitative utilisant comme substrat des cellules humaines tumorales Hep-2 transfectées . La révélation des autoanticorps fixés au substrat se fait grâce à un conjugué anti -immunoglobulines humaines marqué à 1 ' isothiocyanate de fluorescéine . La présence d'anticorps anti-centromère se traduit par une fluorescence mouchetée sur le noyau à 1 ' interphase . La lecture s'effectue au microscope à fluorescence, en déterminant la dernière dilution de l'échantillon où cette fluorescence reste visible.
détection des ANCA : elle a été effectuée sur 35 échantillons cliniquement caractérisés pour la détection des ANCA et issus du groupe 2. Une concordance de 97,1% a été obtenue sur 70 tests réalisés simultanément avec le test multiparamétrique utilisant les réactifs préparés dans l'exemple 2 et avec un coffret ELISA. La figure 4 annexée présente les résultats comparatifs obtenus, exprimés en unités biologiques (UB) , pour le test multiparamétrique
(axe des Y) par rapport au test ELISA individuel (axe des
X) . Les coefficients de corrélation sont compris entre 0,87 et 0,85 pour les spécificités ANCA. Ces coefficients plus faibles que ceux de la détection des ANA sont dus à la forte amplification des valeurs positives dans le cas du dosage multiparamétrique.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'un réactif immunologique entrant dans la composition d'un système d'étalonnage appliqué au dosage d' analytes multiples dans un même échantillon biologique, ledit procédé mettant en oeuvre différentes catégories de particules, chaque catégorie de particules étant sensibilisée par association avec un ligand spécifique de l'un des analytes à doser, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent à : a) déterminer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées et pour chacune de n quantités données de ligand associées auxdites particules, la courbe de réponse en fonction de la concentration en composé homologue sur une gamme de concentrations correspondant à la plage de mesure connue de l'analyte à doser; b) sélectionner, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, la courbe correspondant à la plus petite quantité de ligand qui donne un signal de réponse significatif et qui est compatible avec l'utilisation d'une dilution d'échantillon et d'un réactif de marquage communs à tous les analytes simultanément dosés ; c) évaluer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, d'après la courbe retenue à l'étape b) , le signal moyen correspondant au signal associé à un point caractéristique de chacune desdites courbes, obtenant ainsi autant de signaux moyens que de catégories de particules ; d) ajuster, le cas échéant, les quantités de ligand associé à chaque catégorie de particules de sorte que l'ensemble des signaux moyens évalués à l'étape c) soit compris dans un rapport de 1 à 5 , et e) mélanger, dans un solvant approprié, les différentes catégories de particules sensibilisées qui répondent au critère de 1 ' étape d) .
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, dans l'étape a), les quantités de ligand utilisées varient par pas de 2 à 4.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 , caractérisé en ce que la sensibilisation desdites particules par lesdits ligands est effectuée par covalence, par le biais d'une couche moléculaire intermédiaire biologiquement et/ou chimiquement réactive, ou encore par l'utilisation d'un système d'interaction par affinité.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration en composé homologue est exprimée en unités biologiques sur une gamme qui est identique pour tous les analytes.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le solvant utilisé à l'étape e) est adapté et commun à l'ensemble des ligands.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdits ligands consistent en des antigènes et/ou des anticorps.
7. Réactif immunologique destiné au dosage d' analytes multiples dans des échantillons biologiques, ledit réactif comprenant un solvant et, mélangées au sein dudit solvant, différentes catégories de particules, dont chacune est sensibilisée par association avec une quantité donnée en un ligand spécifique de l'un des analytes à doser, caractérisé en ce que, pour chacune des catégories de particules, et pour une concentration donnée en composé homologue du ligand, telle qu'exprimée en unités biologiques, ladite quantité donnée de ligand débouche sur un signal dit "signal moyen", qui est compris dans un rapport de 1 à 5 avec les signaux moyens obtenus pour les autres catégories de particules.
8. Kit de dosage d' analytes multiples dans des échantillons biologiques mettant en oeuvre différentes catégories de particules, chaque catégorie de particules étant sensibilisée par un ligand spécifique de l'un des analytes à doser, caractérisé en ce qu'il comprend : i) un réactif immunologique issu du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ii) au moins un standard d'étalonnage constitué d'un unique composé homologue réagissant avec l'une des catégories de particules entrant dans la composition du réactif immunologique, iii) une table de correspondance entre la concentration, exprimée en unités biologiques, du composé homologue constituant le standard d'étalonnage et celle de chacun des composés homologues aux autres ligands fixés sur les autres catégories de particules entrant dans la composition du réactif immunologique, et iv) un réactif de marquage.
9. Kit selon la revendication 8, caractérisé en ce que ledit standard d'étalonnage comprend un composé homologue réagissant directement ou indirectement avec le ligand fixé à la particule sensibilisée.
10. Kit selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que ledit composé homologue est de même origine que l'analyte à doser.
11. Kit selon la revendication 8 ou 9 , caractérisé en ce que ledit composé homologue et l'analyte à doser sont d'origines différentes.
12. Kit selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisé en ce que ledit réactif de marquage consiste en un composé immunologique susceptible de quantifier la réaction entre les analytes et le réactif immunologique, ledit composé immunologique étant couplé à un marqueur qui est, de préférense un fluorochrome.
13. Kit selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit réactif de marquage réagit avec le complexe composé homologue ou analyte à doser / ligand, auquel cas le dosage est direct, ou avec le ligand non complexé, auquel cas le dosage est indirect.
14. Procédé de mise en oeuvre du kit selon l'une quelconque des revendications 8 à 13, caractérisé en ce qu'il consiste à mesurer les signaux résultants de l'interaction entre le réactif immunologique et, d'une part, l'échantillon biologique, d'autre part, le standard d'étalonnage, et à déterminer et appliquer, aux différents signaux résultants, un facteur de correction de manière à obtenir la titration, exprimée en unités biologiques, de chaque analyte de l'échantillon, ledit facteur de correction étant le rapport entre le signal obtenu pour le standard d'étalonnage et les concentrations issues de la table de correspondance.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent à : a) incuber, d'une part, l'échantillon biologique et, d'autre part, le standard d'étalonnage, avec une quantité prédéterminée de réactif immunologique ; b) ajouter le réactif de marquage ; c) mesurer, par cytometrie en flux, les signaux émis, d'une part, par le standard d'étalonnage, d'autre part par l'échantillon ; d) déterminer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, un facteur de correction qui correspond au rapport entre la concentration en unités biologiques de chaque analyte à doser telle que donnée par la table de correspondance et le signal mesuré à l'étape c) pour le standard d'étalonnage ; e) multiplier par ledit facteur de correction, calculé pour chaque analyte, le signal émis par chaque catégorie de particules et mesuré à l'étape c) pour en déduire la concentration en unités biologiques de chaque analyte dans l'échantillon testé.
16. Procédé selon la revendication 15, appliqué à la quantification simultanée et directe d'anticorps de spécificités antigéniques différentes, caractérisé en ce que lesdits analytes à doser consistent en des anticorps, lesdits ligands consistent en des antigènes et en ce que ledit réactif de marquage est constitué par un ou plusieurs seconds anticorps marqués par un fluorochrome réagissant spécifiquement avec les anticorps que l'on cherche à doser.
17. Procédé selon l'une des revendications 15 ou 16, appliqué à la quantification simultanée et directe de différents antigènes, caractérisé en ce que lesdits analytes à doser consistent en des antigènes, lesdits ligands consistent en des anticorps et en ce que ledit réactif de marquage consiste en un mélange de seconds anticorps marqués par un fluorochrome réagissant spécifiquement avec les antigènes que l'on cherche à doser.
18. Procédé selon la revendication 15 ou 16, appliqué à la quantification simultanée et indirecte de différents antigènes, caractérisé en ce que lesdits analytes à doser consistent en des antigènes, lesdits ligands consistent en des anticorps et en ce que ledit réactif de marquage consiste en un mélange d'antigènes marqués par un fluorochrome entrant en compétition avec les analytes à doser pour se complexer avec les ligands.
19. Procédé selon la revendication 15 ou 16, appliqué à la quantification simultanée et indirecte de différents anticorps, caractérisé en ce que lesdits analytes à doser consistent en des anticorps, lesdits ligands consistent en des antigènes et en ce que ledit réactif de marquage consiste en un mélange d'anticorps marqués par un fluorochrome entrant en compétition avec les analytes à doser pour se complexer avec les ligands.
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