WO2005012908B1 - Procede d’obtention d’un systeme d’etalonnage unique applique au dosage multiparametrique d’anticorps, preferentiellement d’au moins des anticorps anti-gliadine et anticorps anti-transglutaminase - Google Patents
Procede d’obtention d’un systeme d’etalonnage unique applique au dosage multiparametrique d’anticorps, preferentiellement d’au moins des anticorps anti-gliadine et anticorps anti-transglutaminaseInfo
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Abstract
L'invention utilise différentes catégories de particules sensibilisées, chacune par un antigène spécifique de l'un des anticorps à doser notamment des anticorps anti-Gliadine et des anticorps anti-Transglutaminase. On prépare un réactif immunologique constitué par un mélange de chacune desdites catégories de particules respectivement sensibilisées par une quantité sélectionnée d'antigènes donnés, notamment GLIA et tTG, mesure les signaux résultants de l'interaction entre ledit réactif immunologique et, d'une part, l'échantillon biologique, d'autre part, un standard d' étalonnage, détermine un facteur de correction à appliquer aux différents signaux résultants de manière à obtenir la titration, en unités biologiques, de chaque anticorps de l'échantillon.
Claims
1. Procédé de préparation d'un réactif immunologique entrant dans la composition d'un système d'étalonnage appliqué au dosage des anticorps anti-GLIA et anti-tTG dans un même échantillon biologique, ledit procédé mettant en oeuvre deux catégories de particules, chaque catégorie de particules étant respectivement sensibilisée par association avec les antigènes correspondants, à savoir la GLIA et la tTG, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent à : a) déterminer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées et pour chacune de n quantités données de GLIA et tTG associées auxdites particules, la courbe de réponse en fonction de la concentration en composé homologue sur une gamme de concentrations correspondant à la plage de mesure connue des anticorps à doser; b) sélectionner, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, la courbe correspondant à la plus petite quantité d'antigène qui donne un signal de réponse significatif et qui est compatible avec l'utilisation d'une dilution d'échantillon et d'un réactif de marquage communs aux anticorps anti-GLIA et anti-tTG simultanément dosés ; c) évaluer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, d'après la courbe retenue à l'étape b) , le signal moyen correspondant au signal associé à un point caractéristique de chacune desdites courbes, obtenant ainsi autant de signaux moyens que de catégories de particules ; d) ajuster, le cas échéant, les quantités de GLIA et/ou tTG associée à chaque catégorie de particules de sorte que l'ensemble des signaux moyens évalués à l'étape c) soit compris dans un rapport de 1 à 5, et e) mélanger, dans un solvant approprié, les différentes catégories de particules sensibilisées qui répondent au critère de l'étape d) . 38
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, dans l'étape a), les quantités d'antigène, notamment de GLIA et/ou de tTG, utilisées varient par pas de 2 à 4.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que la sensibilisation desdites particules par lesdits antigènes, notamment la GLIA et/ou la tTG, est effectuée par covalence, par le biais d'une couche moléculaire intermédiaire biologiquement et/ou chimiquement réactive, ou encore par l'utilisation d'un système d'interaction par affinité.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration en composé homologue est exprimée en unités biologiques sur une gamme qui est identique pour tous les anti-corps, notamment, anti- GLIA et anti-tTG.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le solvant utilisé à l'étape e) est adapté et commun à l'ensemble des antigènes, notamment la GLIA et la tTG.
6. Réactif immunologique destiné au dosage d' anticorps multiples, notamment anti-GLIA et anti-tTG, dans des échantillons biologiques, ledit réactif comprenant un solvant et, mélangées au sein dudit solvant, différentes catégories de particules, dont chacune est sensibilisée par association avec respectivement une quantité donnée en un antigène spécifique de l'un des anticorps à doser, notamment la GLIA et tTG, caractérisé en ce que, pour chacune des catégories de particules, et pour une concentration donnée en composé homologue de l'antigène, telle qu'exprimée en unités biologiques, ladite quantité donnée d'antigène débouche sur un signal dit "signal moyen", qui est compris dans un rapport de 1 à 5 avec les signaux moyens obtenus pour les autres catégories de particules.
7. Kit de dosage d'anticorps multiples, notamment des anticorps anti-GLIA et anti-tTG, dans des échantillons biologiques mettant en oeuvre différentes catégories de particules, chaque catégorie de particules étant respectivement sensibilisée par un antigène spécifique de l' anti-corps à doser, notamment de la GLIA et de la tTG, caractérisé en ce qu'il comprend : i) un réactif immunologique issu du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ii) au moins un standard d'étalonnage constitué d'un unique composé homologue réagissant avec l'une des catégories de particules entrant dans la composition du réactif immunologique, iii) une table de correspondance entre la concentration, exprimée en unités biologiques, du composé homologue constituant le standard d'étalonnage et celle de chacun des composés homologues aux antigènes fixés sur les autres catégories de particules entrant dans la composition du réactif immunologique, et iv) un réactif de marquage.
8. Kit selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit standard d'étalonnage comprend un composé homologue réagissant directement ou indirectement avec l'antigène fixé à la particule sensibilisée.
9. Kit selon la revendication 7 ou 8 , caractérisé en ce que ledit composé homologue est de même origine que l'anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, à doser.
10. Kit selon la revendication 7 ou 8 , caractérisé en ce que ledit composé homologue et les anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, à doser sont d'origines différentes.
11. Kit selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que ledit réactif de marquage consiste en un composé immunologique susceptible de quantifier la réaction entre les anticorps, notamment anti- GLIA et anti-tTG, et le réactif immunologique, ledit composé immunologique étant couplé à un marqueur qui est, de préférence un fluorochrome.
12. Kit selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit réactif de marquage réagit avec le complexe composé homologue ou anticorps, notamment anti-GLIA et/ou anti-tTG, à doser / antigène notamment, GLIA et/ou tTG, auquel cas le dosage est direct, ou avec l'antigène, notamment la GLIA et/ou la tTG, non complexé, auquel cas le dosage est indirect.
13. Procédé de mise en oeuvre du kit selon l'une quelconque des revendications 7 à 12, caractérisé en ce qu'il consiste à mesurer les signaux résultants de l'interaction entre le réactif immunologique et, d'une part, l'échantillon biologique, d'autre part, le standard d'étalonnage, et à déterminer et appliquer, aux différents signaux résultants, un facteur de correction de manière à obtenir la titration, exprimée en unités biologiques, des anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, de l'échantillon, ledit facteur de correction étant le rapport entre le signal obtenu pour le standard d'étalonnage et les concentrations issues de la table de correspondance.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent à : a) incuber, d'une part, l'échantillon biologique et, d'autre part, le standard d'étalonnage, avec une quantité prédéterminée de réactif immunologique ; b) ajouter le réactif de marquage ; c) mesurer, par cytométrie en flux, les signaux émis, d'une part, par le standard d'étalonnage, d'autre part par l'échantillon ; d) déterminer, pour chaque catégorie de particules sensibilisées, un facteur de correction qui correspond au rapport entre la concentration en unités biologiques de chacun des anticorps, notamment anti-GLIA et anti-tTG, à doser telle que donnée par la table de correspondance et le signal mesuré à l'étape c) pour le standard d'étalonnage ; e) multiplier par ledit facteur de correction, calculé pour chaque anticorps, le signal émis par chaque catégorie de particules et mesuré à l'étape c) pour en déduire la concentration en unités biologiques de chaque anticorps dans l'échantillon testé. 41
15. Procédé de mise en oeuvre du kit selon la revendication 14 caractérisé en ce qu'il consiste à déduire le diagnostic de la maladie coeliaque de la concentration en unités biologique pour chaque anticorps, anti-GLIA et anti-tTG, testé.
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