EP3641938A1 - Procédé d'application, sur un support solide, d'au moins un partenaire de liaison à une molécule - Google Patents

Procédé d'application, sur un support solide, d'au moins un partenaire de liaison à une molécule

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Publication number
EP3641938A1
EP3641938A1 EP18737957.3A EP18737957A EP3641938A1 EP 3641938 A1 EP3641938 A1 EP 3641938A1 EP 18737957 A EP18737957 A EP 18737957A EP 3641938 A1 EP3641938 A1 EP 3641938A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
container
analyte
solution
solid support
partner
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP18737957.3A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Patrick BLASCO
Perrine COSIN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP3641938A1 publication Critical patent/EP3641938A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L9/00—Supporting devices; Holding devices
    • B01L9/54—Supports specially adapted for pipettes and burettes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/069—Absorbents; Gels to retain a fluid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0832—Geometry, shape and general structure cylindrical, tube shaped
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/16—Surface properties and coatings
    • B01L2300/161—Control and use of surface tension forces, e.g. hydrophobic, hydrophilic
    • B01L2300/163—Biocompatibility
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/02—Burettes; Pipettes
    • B01L3/0275—Interchangeable or disposable dispensing tips

Definitions

  • the present invention relates to the field of in vitro detection of analytes in test samples likely to contain these analytes.
  • the invention relates to a novel method for applying binding partners to the desired analyte, on a solid support in the form of a tube, which support is then used for the detection of the analyte.
  • test samples that may contain analytes of interest
  • the analysis of the test sample may include the implementation of an analyte binding partner to be detected or quantified in the sample.
  • the binding partner makes it possible to isolate the analyte to be tested in order to carry out its revelation by obtaining a reaction product emitting a signal such as a colored signal or a fluorescence signal.
  • the binding partner used to isolate the analyte from the test sample is most often bound to the surface of a solid support.
  • solid supports such as solid supports, for example balls, hollow supports having a bottom, said closed hollow supports or hollow supports closed at one end, for example wells, or hollow bottomless supports, said open hollow supports or hollow supports open at each end, in the form of tubes, such as cones or pipettes.
  • the analyte binding partners used are fixed, for example by adsorption (it is said that they are coated), inside the support, on its internal surface.
  • the application of the bonding partners to the inner surface of the hollow supports is done by bringing into contact with a solution containing the bonding partners with the internal surface of the support, statically, for a long period, more than 6 hours, and an average of one night, as described in patent application FR2417094. Due to this long preparation time, the biological analysis using these supports can not be implemented quickly because it is necessary to wait at least the time of preparation of the support and, in the majority of the cases, it is necessary to carry out support preparation and analysis over at least two days. In fact, for a biological analysis to be acceptable, especially in the in vitro diagnostic, and especially in the case where an analysis record is urgent, it is necessary that the total analysis time be as short as possible.
  • the media are prepared in advance, dried, and stored in desiccant bags to avoid any problem of stability. They are then used with the other elements necessary for the analysis, such as reagents.
  • the application of the binding partners on the surface of the hollow supports is thus done over a long time, generally using a single and only solution containing these binding partners, called sensitization or coating solution, in a closed system, c ' that is to say that one always uses the same solution whose concentration of binding partners is exhausted when they are applied on the inner surface of the hollow supports. It is then necessary for the solution to contain these binding partners in large excess, which is expensive. Nevertheless, the biggest disadvantage with this method is the contact time required to obtain the right amount of bonding partner applied.
  • Another method of applying binding partners in closed hollow supports, such as microplates has been developed. It consists in bringing together a sensitization solution containing the binding partners, then optionally stirring the plate by means of a vibration stirring plate or orbital motion, for several hours, on average 4 hours. Even if the coating time is a little shortened compared to a static process, it is far from acceptable. In addition, again, as the stirring is done in a closed system, as for the static application, it is necessary that the sensitization solution contains the binding partners in large excess. This method also has the disadvantage that it can not be implemented with open hollow supports. Finally, this method also has the disadvantage that the media thus coated with the connecting partners are not very reproducible because the process can not be automated.
  • the hollow supports open at each end have the advantage of being able to serve also for the pipetting and transport of reaction liquids, including the sample. They are used in particular to suck the liquids, then to repress them.
  • VIDAS® system biologicalMérieux
  • VIDAS® system biologicalMérieux
  • the analysis bar introduced into the system, comprises several cuvettes, some of which are filled with predetermined liquids, useful for analysis.
  • the analysis bar also comprises a bowl adapted to receive a sample to be tested and a bowl for reading the analysis result.
  • the cone contains a part of the reagents necessary for the emission of the signal and the analysis bar contains the other part of the reagents.
  • the cone is used to suck up a quantity of said sample and deposit said sample inside the various cuvettes present in the analysis bar.
  • the liquids present inside the different cuvettes can react with the sample to obtain, at the end of a liquid transfer cycle, for example from one cuvette to another, a liquid, or reaction medium, on which measurements of a fluorescence signal is made. If the analyte to be detected or quantified is present in the test sample, it will bind to the binding partner present on the surface of the cone, then the liquids present in the different cuvettes will be used to obtain the revelation of this analyte. As part of the VIDAS® instrument, binding partners are pre-applied in the cones for approximately 12 hours, in a static manner, so that sold kits contain previously coated cones and are stored for later use. .
  • this system requires the use of at least two instruments of different nature and functionality, one to perform the capture partners application. and the other to do the analysis.
  • the present invention therefore aims to overcome the drawbacks of the state of the art by proposing a method dynamically and rapidly applying one or more connecting partners on the inner surface of an open hollow support, allowing to significantly shorten the time of application of liaison partners. So, he is possible to continue immediately the analysis, thus avoiding the storage of the support thus coated. Moreover, with such a method, only one type of instrument can be sufficient for both the application of the link partner (s) and for the analysis, even if these two steps are not implemented immediately one after the other. Finally, having such a method that significantly shortens the application time of the binding partner (s) and using a sensitization solution in which the quantity of binding partners is reduced, also allows a significant economic gain during the production of the supports. open hollows.
  • the object of the invention relates to a method of application, in a solid support tube-shaped, flared or not, having a circular or ellipsoidal opening at each end, such as a cone or a pipette, at least one analyte binding partner PI to be detected or quantified in a test sample, comprising the steps of:
  • the method according to the invention comprises in combination one and / or the other of the following characteristics:
  • the contact time of step (iii) between the sensitization solution SI and the internal surface of the solid support is between 2s and 1min, preferably between 5s and 25s, more preferably between 6s and 20s;
  • steps (ii) to (iv) are repeated from 10 to 150 times, preferably from 35 to 80 times;
  • the total of the repeated cycles is between 10 and 20 min and is preferably 15 min;
  • the SI sensitization solution also contains at least one P2 binding partner to the analyte binding partner PI.
  • the partner P2 of binding to the analyte binding partner PI to be detected or quantified may advantageously be applied to the inner surface of the solid hollow support according to the same method of the invention as that described above by taking the following steps :
  • the application method of the partner P2 comprises in combination one and / or the other of the following characteristics:
  • steps (e) to (g) forming a cycle can be at least 1 time, for a total duration of at least 1 min and at most 2:30;
  • the open hollow solid support, coated with the analyte-binding partner PI, via or without the PI binding partner P2, is advantageously used for the detection or quantification of the analyte contained in a test sample.
  • another subject of the invention relates to a method for the in vitro detection or quantification of an analyte in a test sample capable of containing said analyte, said method using at least one solid support in the form of a tube, flared or not , having a circular or ellipsoidal opening at each end, such as a cone or a pipette, in which at least one analyte-binding partner PI is applied to be detected or quantified in the test sample according to the method of application of the invention, which detection or quantification method comprises steps of contacting the test sample with the solid support and revealing the binding, if the analyte is present, said analyte and said at least one PI liaison partner.
  • the method of detection or quantification comprises in combination one and / or the other of the following characteristics:
  • the binding partner PI is an immunoassay partner
  • the revelation of the binding of said analyte is carried out by a sandwich test using another analyte binding partner, of different or different nature, which is labeled, or else by a test in competition using a labeled compound entering into competition with the analyte to detect or quantify;
  • an enzyme and an enzymatic substrate catalyzed by said enzyme preferably alkaline phosphatase and 4-methylumbelliferyl phosphate;
  • the steps of contacting the test sample with the solid support and revealing the binding, if the analyte is present, said analyte and said at least one binding partner PI are implemented just after the process applying at least one PI connection partner in said solid support as defined above, preferably with the same instrument or an instrument of the same range;
  • the steps of contacting the test sample with the solid support on which said at least one PI partner for binding is applied, and of revealing the binding of said analyte and said at least one linking partner PI comprise the following steps consists in :
  • the method may comprise one or more washing steps between steps (1) and (2) and steps (2) and (3), implemented as described below.
  • the at least one binding partner is attached to the interior of the support by any means known to those skilled in the art such as adsorption, the covalent bond, the hydrogen bond, the electrostatic bond and the ionic bond, etc.
  • the type of attachment of the connection partners inside the hollow support depends on the nature of the support and in particular its surface.
  • the support may be plastic, such as polycarbonate, styrene-butadiene copolymers, polymers (polystyrene, polypropylene, polypropylene, polyethylene ...) or stainless steel, with or without prior treatment of the inner surface.
  • the inner surface of hollow support may have been functionalized by reactive groups which will cause the formation of a covalent bond with the binding partner.
  • the inner surface of the hollow support may also have undergone treatments to improve the attachment of binding partners, such as ionizing radiation treatment such as X-ray irradiation, accelerated electrons or gamma radiation.
  • ionizing radiation treatment such as X-ray irradiation, accelerated electrons or gamma radiation.
  • Such carriers previously treated or not are commercially available, as for example Thermo fisher.
  • analyte to detect or quantify any molecule representative of the presence of microorganisms or disease to detect, characterize or follow. We also hear the screening of drugs or physico-active substances, drugs and the monitoring of treatments in patients.
  • the detection or quantification of this analyte is carried out by an immunoassay which is a test widely known to those skilled in the art, involving immunological reactions between this analyte to be detected and one or more binding partner (s). analyte.
  • examples of analytes include antibodies, for example autoantibodies or antibodies directed against pathogen proteins, for example viruses such as HIV, SIV, IVF, HCV, HBV, HAV, HEV, VZV, CMV, EBV, HSV1, HSV2, bacteria such as Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Borrelia burgdorferi stricto sensu, Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Borrelia spielmanii, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Salmonella, Klebsiella, Leugionella, Proteus, Klebsiella, Escherichia coli, Shigella, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Treponema pallidum, Yeasts such as Candida albicans, Fungi such as Aspergillus fumigatus, Mucorales etc.),
  • the analyte is likely to be contained in a test sample that can be of various origins, for example of food, environmental, biological, veterinary, clinical, pharmaceutical or cosmetic origin.
  • Examples of food-based samples include, but are not limited to, a sample of milk products (yogurt, cheese, etc.), meat, fish, egg, fruit, vegetable, water, drink (milk, fruit juice, soda, etc.). Of course, these food-based samples may also come from sauces or more elaborate dishes or unprocessed or partially processed raw materials.
  • a food sample may also be derived from a feed intended for animals, such as cakes, animal meal. All these samples, if they are not liquid, are previously treated to be in liquid form.
  • the sample may be of environmental origin and may consist of, for example, surface sampling, water, air, etc.
  • the sample may also consist of a biological sample, of human or animal origin, which may correspond to samples of biological fluid (urine, whole blood or derivatives such as serum or plasma, saliva, pus, cerebrospinal fluid, etc.), stool (eg cholera diarrhea), nose, throat, skin, wound, isolated organs, tissues or cells, swab specimens.
  • biological fluid urine, whole blood or derivatives such as serum or plasma, saliva, pus, cerebrospinal fluid, etc.
  • stool eg cholera diarrhea
  • nose, throat skin, wound, isolated organs, tissues or cells, swab specimens.
  • sample refers to a part or quantity, more specifically a small part or a small quantity, taken from one or more entities for analysis.
  • This sample may possibly have undergone prior treatment, involving for example mixing, dilution or grinding steps, in particular if the starting entity is in the solid state.
  • analyte binding partner PI to be detected or quantified in a test sample is meant any partner capable of binding to said analyte.
  • the analyte is the compound present in the test sample, while the PI binding partner, which is applied according to the method of the invention, is the compound that will bind to the analyte.
  • the nature of the PI binding partner depends on the nature of the analyte and the type of test used.
  • the test will be an immunoassay.
  • immunoassay for example, is not to be considered in this application as strictly indicating that the binding partner is an immunological partner, such as an antibody. Indeed, those skilled in the art also use this term widely when the binding partner, also called ligand, is not an immunological partner but is for example a receptor for the analyte that is to be assayed.
  • immunoassay binding partner PI examples include binding partners of nature or immunological origin such as antibodies (monoclonal or polyclonal) and antibody fragments (such as Fab, Fab ', F (ab') 2), chains scFv (single chain variable fragment), dsFv (Double-stranded variable fragment)), well known to those skilled in the art, as well as binding partners that are not of nature or of immunological origin, such as proteins other than antibodies, peptides, oligonucleotides, nanofitins, analyte receptors if they exist, aptamers, DARPins or any other molecule that is known to interact with said analyte.
  • binding partners of nature or immunological origin such as antibodies (monoclonal or polyclonal) and antibody fragments (such as Fab, Fab ', F (ab') 2), chains scFv (single chain variable fragment), dsFv (Double-stranded variable
  • Nanofitins are small proteins that, like antibodies, are able to bind to a biological target that can detect, capture or simply target within an organism.
  • RNA or DNA oligonucleotides
  • SELEX Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment
  • Most aptamers are composed of RNA, because of the ability of RNA to adopt varied and complex structures, which allows to create on its surface cavities of varied geometries, allowing to fix various ligands.
  • biotechnological, diagnostic or therapeutic applications Their selectivity and ligand binding properties are comparable to that of antibodies.
  • DARPins for Designed Ankyrin Repeat ProteINS (Boersma YL and Plutckthun A, 2011) are another class of proteins that mimic antibodies and bind with high affinity and selectivity to target proteins. They derive from the family of ankyrin proteins that are adapter proteins that make it possible to bind integral membrane proteins to the spectrin / actin network that constitutes the "spine" of the cellular plasma membrane. The structure of the ankyrins is based on the repetition of a pattern of about 33 amino acids and so are the DARPins. Each pattern has a secondary structure of the helix-turn-helix type. DARPins contain at least three, preferably four to five repeated motifs and are obtained by " screening of combinatorial libraries.
  • the SI sensitizing solution comprises the binding partner PI in a concentration that the skilled person will adapt according to the sensitivity of the test that he wishes to perform, the binding partner PI to be applied in the solid support, the analyte sought and the nature of the sample.
  • the sensitization solution comprises an antibody or an antibody fragment
  • it may be used in a concentration of between 0.01 and 100 ⁇ g / ml.
  • the amount of binding partner PI may be lower, for example by 10% relative to the concentration used in static.
  • the sensitization solution S1 also comprises all the components necessary to facilitate the application of the binding partner PI in the solid support, such as pH buffers, for example carbonate, phosphate, TRIS, HEPES, salts such as NaCl, preservatives such as azide, MIT; stabilizers such as glycerol, Tween 20, SDS, and saturation or passivation proteins such as BSA, casein.
  • pH buffers for example carbonate, phosphate, TRIS, HEPES, salts such as NaCl, preservatives such as azide, MIT; stabilizers such as glycerol, Tween 20, SDS, and saturation or passivation proteins such as BSA, casein.
  • the container RI containing the sensitization solution SI may be any container for containing a solution containing biological compounds such as PI binding partners.
  • the container RI can be made of plastic, such as ethylene vinyl acetate (EVA copolymer), polyethylene, polypropylene copolymer, fluorinated ethylene propylene (nalgene), glass, or stainless steel. It can be in any form, for example, bottle, well, can, box, jerricans.
  • EVA copolymer ethylene vinyl acetate
  • polyethylene polypropylene copolymer
  • fluorinated ethylene propylene (nalgene) fluorinated ethylene propylene (nalgene)
  • glass or stainless steel.
  • stainless steel stainless steel
  • It can be in any form, for example, bottle, well, can, box, jerricans.
  • This container RI can be closed before its implementation in the method of the invention and then opened during the suction step.
  • this container RI may be a well covered with
  • VIDAS® range which comprises the VIDAS®, mini VIDAS® and VIDAS® 3 instruments.
  • link partner or partners can be implemented. with a VIDAS® instrument, then the analysis can be performed with another VIDAS® instrument or with a VIDAS® 3 instrument.
  • the first step of the method of the invention relates to the connection of the solid support to a suction-discharge device.
  • the connection can be implemented manually, or mechanically by the instrument in which the support and the suction-discharge device is located.
  • the method of the invention comprises several suction (ii) / contact (iii) / discharge (iv) cycles.
  • the first step of this cycle is the suction step (ii) which consists of returning the sensitization solution SI in the hollow solid support by one of its ends, without overflowing by the other end.
  • this suction step can be implemented by any method known to those skilled in the art.
  • this suction step can be implemented by effecting a pressure difference in the solid support, in particular by means of a piston driven by any means known to those skilled in the art, such as, for example, using a screw coupled to a motor, forming a pump block or by the use of a device for creating a depression.
  • the pump unit may be more or less remote from the solid support, for example via a pipe.
  • the solid support can be used to directly suck the sensitization solution from the RI container or the suction can be implemented via a tubular on the one hand connected to the end of the solid support by which the sensitizing solution PI is sucked and on the other hand immersed in the container RI.
  • the discharge step (iv) consists of bringing the sensitization solution SI out of the hollow solid support by one of its ends.
  • the end by which the sensitization solution is discharged may be the same as that used to aspirate, as for example in the case of the VIDAS® instrument, or it may be the opposite end.
  • the discharge vessel that recovers the repressed sensitization solution may be the RI vessel, for example when the same end of the solid support is used for suction and delivery.
  • the discharge container may also consist of a bin.
  • the discharge step can be implemented by any method known to those skilled in the art, as described for the suction step.
  • the same system for example a pump unit as described above, is used for both the suction and the discharge stages.
  • Figure 1 shows a diagram for the application of a bonding partner, in a solid cone type support, with a loop coating system.
  • Figure 2 shows a schematic for the application of a link partner, in a solid cone type support, with an on-line system.
  • FIG. 3 represents a diagram for the application of a link partner, in a solid cone-type support, with a reciprocating system, as implemented for example in the VIDAS® instrument.
  • FIG. 4 represents a bar and a VIDAS® cone during the implementation of a suction cycle (FIG. 4A) / contact (FIG. 4B) / discharge cycle (FIG. 4C) according to one embodiment of the invention for the application of a connection partner, the bar being constituted of several containers including the container SI or S2.
  • Figure 5 is a histogram representation of the Relative Fluorescence Value (RFV) values for both types of sample 1 and 2 when detecting TSH with the VIDAS® instrument, depending on the different application conditions.
  • RSV Relative Fluorescence Value
  • the binding partner in dynamics with a concentration of binding partner and a contact time that vary - 2.5 ⁇ g / mL for 5, 10 or 15 min or 5 ⁇ g / mL for 5, 10 or 15 min, or static with a concentration of 6 ⁇ g / mL for 20 h).
  • Figure 6 is a histogram representation of the Relative Fluorescence Value (RFV) values for the three sample types (white, weak and strong - Figure 6A) or only for the white sample (representation of the histograms of the Figure 6A whose scale is enlarged - FIG. 6B) during the detection of anti-Tg antibodies with the VIDAS® instrument, according to the different conditions of application of the binding partner (in dynamics for 5, 15 or 30 min. , or static for 20 hours).
  • RSV Relative Fluorescence Value
  • FIG. 7 is a graph giving the RFV signal as a function of the concentration of the TnI during the detection of TnI with the VIDAS instrument (FIG. 7A: low concentration in TnI and FIG. 7B: high concentration in TnI) using a cone coated with 3 binding partners according to the method of the invention (invention) or according to the prior art (reference), namely biotinylated BSA, then streptavidin, then a mixture of anti-Tnl biotinylated antibodies.
  • FIG. 8 is a representation of the histogram type giving the RFV signal for five samples having an increasing concentration of TSH by using either a cone coated with an anti-TSH antibody according to the invention (dynamic coating at 4 ⁇ g / ml), or a cone coated with an anti-TSH antibody according to the prior art (static coating at 6 ⁇ g / mL).
  • Figures 1 to 3 are particular embodiments of implementation of suction / contact / discharge cycles according to the method of the invention.
  • the device for applying the partner PI of connection in an open hollow support 1, of cone type comprises a container RI 4 containing the sensitization solution SI containing said partner PI of connection, a pump 2 which makes it possible to make circulate the sensitization solution, via a tubing system 3, in the direction arrows indicated.
  • the first step is to suck, in the direction of the arrow, using the pump 2, the sensitization solution of the container RI 4 in the support 1, then to let contact or not the sensitization solution and the support 1, then to discharge, always in the direction of the arrows, using the pump 2, the sensitization solution of the support 1 in the container 4, these steps being repeated.
  • the sensitization solution is resumed at each step in the container 4, entered through one of the two ends of the support 1 and is forced into the container 4 by the other end of the support 1.
  • the sensitization solution SI after being sucked into the support 1 by one of its ends, is discharged into the container RI 4 by the same end.
  • the device for applying the partner PI of connection in an open hollow support 1, of cone type comprises a container RI 4 containing the sensitization solution SI containing said partner PI of connection, a pump 2 which makes it possible to circulate the sensitization solution, via a tubing system 3, in the indicated direction of the arrows.
  • the first step is to suck, in the direction of the arrow, using the pump 2, the sensitization solution of the container RI 4 in the support 1, then to let contact or not the sensitization solution and the support 1, then to push back, always in the direction of the arrows, using the pump 2, the sensitization solution of the support 1 in the container 5 which is a waste container, these steps being repeated and the sensitization solution being resumed at each step in the container RI 4.
  • the sensitization solution is taken up at each step in the container 4, entered through one of the two ends of the support 1 and is forced into the container 5 by the other end of the support 1.
  • the suction / contact / discharge cycles are done using the same end of the support 1 and it is only during the last cycle that the sensitization solution is discharged into a garbage container.
  • the device for applying the partner PI of connection in an open hollow support 1, of the cone type comprises a container RI 4 containing the sensitization solution SI containing said partner PI of connection, a pump 2 which allows to circulate the sensitization solution, via a tubing system 3, in the indicated direction of the arrows.
  • the first step is to suck, in the direction of the arrow going to the right, with the aid of the pump 2, the sensitization solution of the container RI 4 in the support 1, then to leave in contact or not with the solution of sensitization and support 1, then to push back, always in the direction of the arrow to the left, using the pump 2, the sensitization solution of the support 1 in the container 4, these steps being repeated.
  • the sensitization solution is resumed at each step in the container 4, enters through one of the two ends of the support 1 and is forced into the container 4 by the same end.
  • FIG. 4 shows a bar 6 and a cone 1 VIDAS®.
  • the analysis bar 6 contains different wells, including a well 10 for receiving the test sample, a well 4 containing the sensitization solution SI, a reading well 11 in which the fluorescence will be read after the implementation of the test.
  • biological analysis of the sample, and wells 7, 8, 9 may contain various elements such as washing pads or a trash well in which the sensitizer solution fraction brought into contact with the cone is discharged.
  • FIG. 4A shows the first step of the method of the invention, of sucking in the cone 1, via a pipe 3 connected to a suction-discharge device (not shown in FIG.
  • Figure 4B shows the 2nd step during which contact is allowed to the coating solution and the cone 1.
  • Figure 4C shows the discharge step to push back the sensitization solution in the well 4.
  • the contact step (iii) between the sensitization solution SI and the solid support is carried out for a time between 0 s and 11 min.
  • the contact time is Os, this means that the suction and discharge stages are linked together, with no pause between the two.
  • the contact time can also be at most 10 min, 9 min, 8 min, 7 min, 6 min, 5 min, 4 min, 3 min, 2 min, 1 min, 55 s, 50 s, 45 s, 40s, 35s, 30s, 25s, 20s or 15s.
  • the contact time may be at least 1s, 2s, 3s, 4s, 5s, 6s, 7s, 8s, 9s, 10s, 11s, 12s, 13s, 14s , 15s, 20s, 30s, 35s or 40s.
  • the contact time also varies according to the number of cycles implemented which is at least two. The minimum and maximum number of cycles depends on the total duration of the application process, depending on the contact time chosen.
  • the number of repetition cycles of steps (i) to (ii) can be at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 18, 20 or 25 and not more than 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 , 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 ,,,,,,, 417, 464, 500, 510, 556, 600, 603, 649, 700, 800, 900, 1000, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000 or 6000 times.
  • the total process time is at least 1 min and at most about 2:30. This total time may be at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 min and not more than 2h, 1:30, lh, 55 min , 50 min, 45 min, 40 min, 39 min, 38 min, 37, min, 36 min, 35 min, 34 min, 33 min, 32 min, 31 min, 30 min, 29 min, 28 min, 27, min , 26 min, 25 min, 24 min, 23 min, 22 min, 21 min, 20 min, 19 min, 18 min, 17, min or 16 min.
  • the combination of contact time, number of cycles and total duration of the process will be chosen by the skilled person according to the sensitivity of the analyte detection or quantification test that he wants to implement. This combination will condition the amount of binding partner PI that will be applied to the inner surface of the solid support.
  • the temperature at which the method of application of the invention is carried out is any temperature compatible with the binding partner PI, that is to say at any temperature which makes it possible to retain the binding capacities for the analyte of said partner.
  • PI link In general, the temperature is between 10 ° C and 45 ° C.
  • the ambient temperature from about 17 ° C to about 25 ° C, is therefore suitable.
  • the temperature can also be a function of the instrument used. Thus, in the context of the VIDAS® instrument, the temperature used is 37 ° C.
  • washing solution L1 to remove unbound partners.
  • the washing solutions useful for this purpose are conventional and known of the skilled person. They include buffers, such as phosphate buffers, Tris, HEPES salts such as NaCl, detergents such as Triton X-100 0.2%, Tween 20. They can also contain saturation agents, also called passivation agent, such as BSA or milk proteins, in order to saturate the inner surface of the solid support, thus avoiding the non-specific bonds that might occur when the test sample and the support come into contact with each other solid. Again, the only requirement for this L1 wash solution is that it should not destroy the analyte binding ability of said binding partner PI.
  • the washing of the inner surface of the solid support can be carried out by any method known to those skilled in the art, such as for example by dipping the solid support in a container containing said washing solution L1. It can also be implemented by reproducing the aspiration (ii) / contact cycles
  • the application method also comprises the following steps, implemented when the suction (ii) / contact (iii) / discharge cycles
  • steps (v) to (vii) forming a cycle that can be repeated at least once, for a total duration of at least 1 min and at most 2:30.
  • the solution used can be discharged into the washing container RL1 or into another container which can then be the same container as that used after step (iii).
  • waste container that will be identical both for the application of the PI liaison partner for washing.
  • the connecting partner PI can be applied directly to the inner surface of the solid support. Or it can be applied via another binding partner, said P2 partner binding to the partner PI binding to the analyte.
  • the analyte is the compound present in the test sample
  • the P2 binding partner is the compound that will bind to the PI binding partner which will itself bind to the analyte.
  • These P2 binding partners are of origin or non-immunological, as previously described.
  • the binding partner P2 may be an anti-species antibody, for example an anti-mouse antibody when the PI partner is a mouse antibody.
  • the binding partner P2 may also be an anti-IgM antibody when the binding partner PI is an IgM.
  • the binding partner P2 may be an antigen, for example a peptide
  • the binding partner P2 may be an anti-peptide antibody.
  • the binding partner PI may have been modified beforehand with a ligand, for example a biotin, the binding partner P2 then being an antitigand, for example streptavidin.
  • Other examples of binding partner P2 are widely known to those skilled in the art.
  • the link partner P2 may be contained in the sensitization solution SI, which constitutes a particular embodiment of the invention.
  • the bonding partner P2 / partner PI bonding formation on the solid support will be implemented during the suction cycles (ii) / contact (iii) / discharge (iv) of the application method of the invention.
  • This is applicable when the P2 partner is more easily bound to the support than the PI partner, for example when the P2 partner is streptavidin and the PI partner is a biotinylated antibody.
  • the binding partner P2 may also have previously applied to the internal surface of the solid support according to any method known to those skilled in the art, for example in static or dynamic, reproducing the same cycles as those described above for the application of the link partner PI.
  • At least one P2 binding partner to an analyte binding partner PI to detect or quantify in a test sample the binding partner P2 can be applied in the solid tube-shaped support, flared or not, having a circular or ellipsoidal opening at each end, such as a cone or a pipette, by a method comprising the following steps:
  • steps (ii), (iii) and (iv) also apply to steps (b), (c) and (d).
  • the solution used can be discharged into the sensitization vessel R2 or into another container which can then be the same container as that used with the other discharge steps described above ( garbage container).
  • the binding partner P2 After application of the binding partner P2 to the inner surface of the solid support, it can be washed with a washing solution L2 to remove unbound partners.
  • the washing may also comprise the following steps, implemented when the suction cycles (b) / contact (c) / discharge (d) are completed:
  • the washing solution L2 has the same characteristics as the washing solution L1 described above. It may be identical (it will speak either indifferently washing solution L for the solution L1 and L2 solution) or it may be different from the washing solution L1, both in relation to the nature of its container. It is preferably in a container RL2 different from the container RL1, but the washing can be carried out with the same solution contained in the same container (we will speak of container RL).
  • the discharge of the washing solution can be carried out in the washing container itself (RL2 or RL) or in a waste container, for example common for all the discharge steps.
  • the method for applying the binding partner P2 also comprises the application, in said solid support, after the aspiration (b) / contact (c) / discharge (d) cycles, of said at least one a PI link partner.
  • the binding partner PI may be applied to the internal surface of the solid support according to any method known to those skilled in the art, for example in static or dynamic such as reproducing the same cycles of steps (ii) to (iv) described above for the application of said link partner PI, which constitutes another embodiment.
  • the application method of the link partner PI can be implemented in a manner not linked in time with respect to the application method of the link partner P2, that is to say that there is an expectation of at least 5 minutes between the two processes, or it can be implemented just after the application process of the link partner P2. Preferably, they will be implemented with the same instrument or with two instruments of the same range.
  • the different containers used in the method of application of the connecting partners can be physically separated, manipulable with respect to each other, as for example bottles that are placed in a carousel of an instrument.
  • the containers may be integral, such as for example in the form of a well in a bar, such as the bar VIDAS® (bioMérieux) shown in Figure 4 (bar 6).
  • the container RI, the container RL1, and optionally the container R2 and / or the container RL2 are contained in the same analysis bar, which consists of several containers.
  • the analysis bar or the instrument incorporating the different containers are intended for the in vitro detection or quantification of an analyte, they may also comprise other containers containing other components necessary for the detection or quantification of said analyte.
  • the components necessary for the detection or quantification of said analyte are known to those skilled in the art and will be described hereinafter in the context of the detection or quantification of the analyte. By way of examples of such components, mention may be made of labeled binding partners, also called conjugates, washing solutions and revelation substrates.
  • containers there may be mentioned a VIDAS® bar comprising all the reagents (for coating and detection or quantification), or two VIDAS® strips, one for coating and ⁇ others for detection or quantification.
  • In vitro detection or quantification of an analyte that may be contained in a test sample may be carried out by any in vitro method known to those skilled in the art using at least one binding partner PI to the test sample. analyte. It comprises steps of contacting the test sample with the solid support coated with the binding partner PI and revealing the binding, if the analyte is present, said analyte and said at least one partner PI binding.
  • the support may also comprise a binding partner P2, also applied as described above.
  • test sample is a sample of biological, chemical, food or environmental origin.
  • the detection or quantification of analyte can be carried out by any method of analysis known to those skilled in the art such as methods immunoassay.
  • enzyme immunoassay methods are coupled to an enzyme catalyzed reaction using an enzyme substrate.
  • an enzyme substrate Depending on the enzymatic substrate chosen, one can have a colorimetric signal (ELISA for Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) (Rassasie, MJ, et al, 1992), a fluorescence signal (ELFA technology for Enzyme Linked Fluorescent Assay) or a chemiluminescent signal ( CLIA for Chemiluminescence Immuno Assays) (Stabler TV, et al, 1991).
  • ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
  • fluorescence signal ELFA technology for Enzyme Linked Fluorescent Assay
  • CLIA Chemiluminescence Immuno Assays
  • the amount of signal detected is generally proportional to the amount of analyte to be measured (for example in a sandwich test) or inversely proportional to the amount of analyte to be measured (eg competitive test).
  • a detection partner which is coupled directly or indirectly to a marker, such as an enzyme capable of lysing an enzymatic substrate, for example fluorogenic for an ELFA detection, for its attachment to the partner complex PI binding-analyte,
  • the marker when the marker is an enzyme, bringing into the presence of an enzymatic substrate and of the partner-analyte-analyte-partner partner complex of detection coupled to an enzyme for the formation of a reaction medium, and
  • the detection for example by immunofluorescence in the context of an ELFA detection, of the presence and / or the amount of analyte by measuring the signal (for example fluorescence) emitted in the reaction medium.
  • detection partner is meant any partner capable of binding to the analyte to detect or quantify, which will be coupled directly or indirectly to a marker, for example an enzyme. It may be of the same nature as the PI partner of liaison or of a different nature. Examples are given previously with the link partner PI.
  • direct or indirect coupling of the marker to the detection partner it is meant that the marker is attached directly to the detection partner recognizing the analyte (direct coupling) or the enzyme is coupled to a binding partner which recognizes the partner detecting the analyte itself (indirect coupling).
  • the conjugate in the context of direct coupling, the complex formed at the end of the assay, called the conjugate, will consist of: "capture partner / analyte / detection partner coupled to the marker”.
  • the complex formed at the end of the assay will consist of: "capture partner / analyte / detection partner / binding partner coupled to the marker”.
  • the binding partner is well known to those skilled in the art and may be for example an anti-IgG antibody (immunoglobulin) when the detection partner is an IgG recognizing the analyte. interest.
  • marker is meant, in particular, any molecule containing a group reactive with a group of the detection partner, directly without chemical modification, or after chemical modification to include such a group, which molecule is capable of directly or indirectly generating a detectable signal.
  • a non-limiting list of these direct detection markers consists of:
  • enzymes which produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence, luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase,
  • chromophores such as fluorescent compounds, luminescent compounds, dyes, radioactive molecules such as 32P, 35S or 1251,
  • the binding partner PI used in the detection or quantification method is an immunoassay partner and the revelation of the binding of said analyte is implemented by a sandwich test using another binding partner.
  • analyte called a detection partner, of different or different nature, which is marked by a marker.
  • an analogue of the analyte coupled to a marker for example an enzyme capable of lysing an enzyme substrate, for example fluorogenic, and said sample, which compete for binding to the binding partner PI,
  • the marker when the marker is an enzyme, the placing in the presence of an enzymatic substrate, complexes of PI partner-analyte partner and PI partner binding-analog to the analyte for the formation of a reaction medium, and
  • the detection for example by immunofluorescence, of the presence and / or quantity of analyte by measuring the signal, for example the fluorescence, emitted in the reaction medium.
  • Analogous to the analyte is any molecule which has the same binding capacity to the binding partner PI as the analyte.
  • the marker coupled to the analyte analogue is equivalent to the useful marker in a sandwich test.
  • the binding partner PI used in the detection or quantification method is an immunoassay partner and the revelation of the binding or not of said analyte is implemented by a test in competition. using a labeled compound competing with the analyte to be detected or quantified, otherwise known as the labeled analyte analog.
  • the enzyme is a widely appropriate marker and may be mentioned in particular as examples sulfatase, alkaline phosphatase (PAL), acid phosphatase, glucose oxidase (GOx), glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) and ⁇ -galactosidase ( ⁇ -gal).
  • PAL alkaline phosphatase
  • GOx glucose oxidase
  • G6PD glucose-6-phosphate dehydrogenase
  • ⁇ -galactosidase ⁇ -gal.
  • the corresponding enzyme substrates are widely known to those skilled in the art and include, for example, 4-methylumbelliferyl phosphate or 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside.
  • the revelation of the analyte is carried out using an enzyme and an enzymatic substrate catalyzed by said enzyme, preferably alkaline phosphatase and 4 methylcellulose phosphate.
  • the method for detecting or quantifying the analyte may also include one or more additional washing steps after each step, such as:
  • the washing steps are steps known to those skilled in the art. They are implemented with buffers compatible with the reaction medium and the reading of the signal.
  • the method for detecting or quantifying an analyte may be implemented at any time after the implementation of the method for applying the binding partner PI to the internal surface of the solid support and, where appropriate, the partner link P2. It can be implemented one or more days after the application of the link partner PI and, if applicable, the link partner P2, or even 1 or several weeks later. In this case, the solid support must be dried and then stored in a desiccant bag to avoid any stability problem.
  • the steps of contacting the test sample with the solid support and of revealing the binding, if the analyte is present, of said analyte and of said at least one binding partner PI of the detection method or quantification of the invention are implemented just after the method of applying at least one PI binding partner in said solid support as defined above.
  • just after is meant that the detection or quantification method is implemented within minutes, or even the seconds following the application procedure of the link partner PI. There is no more than 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1 min between the last step of the PI partner application process and the first step of the analyte detection or quantification method.
  • This small time may be useful for introducing the test sample and / or containers that will be used for detection or quantification.
  • the method for applying at least one link partner PI, or even beforehand at least one P2 partner, and the detection or quantification method are implemented successively.
  • the method of detection or quantification of the analyte is implemented with the same instrument or the same type of instrument as that used for the application of the linking partner PI, or even the connecting partner P2, or even the different washing processes.
  • the steps of bringing the test sample into contact with the solid support to which said at least one PI partner for binding is applied, and of revealing the binding of said analyte and said at least one PI linking partner comprise or consist of in the following steps:
  • the different containers RE, RC and RS used are as described above and can for example be separated or contained in the same analysis bar, which constitutes a particular embodiment.
  • the last step (4) consists of measuring the transmitted signal.
  • This step is well known to those skilled in the art.
  • This measurement can be converted into a representative quantity by the user such as the analyte concentration by using a standard curve, also called a calibration curve, the production of which is widely known to those skilled in the art and can be obtained i) in measuring the signal generated by standards, also called standards or calibrators, and then ii) by plotting the curve giving the signal as a function of quantity or concentration.
  • a standard curve also called a calibration curve
  • the method may also include washing steps, as previously described.
  • Thyrotropic hormone or thyrotropic hormone is a hormone secreted by thyrotropic cells of the anterior pituitary gland. This hormone is the main factor in stimulating the thyroid gland that determines the production of thyroid hormones T3 and T4. In return, these thyroid hormones exert a retro-control on the anterior pituitary blocking the secretion of TSH. Secretion of TSH is further under the control of the central nervous system via a hypothalamic neuropeptide, TRH, and neuromediators such as somatostatin or dopamine.
  • TRH hypothalamic neuropeptide
  • neuromediators such as somatostatin or dopamine.
  • the blood test for TSH is a diagnostic aid for thyroid or pituitary disorders.
  • VIDAS® cones are sensitized with 300 ⁇ l of an anti-TSH mouse monoclonal antibody solution (bioMérieux reference 30400) at 2.5 or 5 ⁇ g / ml in Tris HCl buffer pH 7.3 (sensitization solution). contained in one well of a VIDAS® bar, using the VIDAS® instrument, as follows:
  • This cycle is repeated 20 times.
  • This cycle is repeated 25 times.
  • This cycle is repeated 35 times.
  • VIDAS® cones have been statically sensitized as follows:
  • the cones are sensitized with 300 ⁇ l of the same anti-TSH mouse monoclonal antibody solution, except that the antibody concentration is 6 ⁇ g / ml. After about 20 h at room temperature (18-25 ° C) with the sensitizing solution, the cones are emptied. Then, 330 ⁇ l of a saturation solution containing in particular animal proteins are added for the passivation of the cones for about 6 hours. The cones are then emptied, dried and stored at 4 ° C until use, protected from moisture.
  • the cones coated with anti-TSH antibodies according to 1.1. and 1.2. above are implemented with strips of the VIDAS® TSH kit (bioMérieux ref 30400), which include the other reagents of the immunological reaction.
  • the sample in the sample well (200 ⁇ l) of the strip is taken and transferred to the well containing the anti-TSH antibody labeled with alkaline phosphatase (conjugate).
  • the sample / conjugate mixture is sucked and then sucked successively by the cone for about 16 minutes. This operation allows the antigen to bind on the one hand to immunoglobulins fixed on the cone and on the other hand to the conjugate thus forming a "sandwich".
  • the substrate (4-methylumbelliferyl phosphate) contained in a well of the bar is sucked into the cone and then returned to the revelation well; the conjugate enzyme catalyzes the hydrolysis reaction of this substrate in a product (4-Methombelliferone) whose fluorescence emitted is measured at 450 nm in the well of revelation.
  • TSH human serum sample containing TSH
  • FIG. 5 is a histogram representation of Relative Fluorescence Value (RFV) values for both types of sample 1 and 2 when TSH is detected with the VIDAS® instrument, based on different conditions of application of the binding partner (in dynamics with a concentration of binding partner and a contact time that vary - 2.5 ⁇ g / mL for 5, 10 or 15 min or 5 ⁇ g / mL for 5, 10 or 15 min, or static with a concentration of 6 ⁇ g / mL for 20 h).
  • RSV Relative Fluorescence Value
  • Figure 5 shows that the RFV signal obtained for sensitization concentrations of 2.5 ⁇ g / mL and 5 ⁇ g / mL in dynamics is quite comparable, regardless of the duration of sensitization. From 5 minutes of dynamic coating, the RFV signal for sample 1 is about 500 RFV. Sample 2 renders VFRs greater than 3500. All the conditions of dynamic application of the anti-TSH antibody used according to the invention exhibit excellent signal dynamics, equivalent to the reference condition obtained in several days according to a method of the invention. static incubation.
  • Thyroglobulin is a glycoprotein. produced in the thyroid gland and is the main component of the follicular colloid. Its main role is the storage and synthesis of thyroid hormones. Anti-thyroglobulin autoantibodies are often present in patients with thyroid autoimmune. Thus they are detected in 30% of patients with Graves' disease (Basedow) and in 85% of patients with Hashimoto's disease (2). Anti-Tg antibodies are associated with cases of hypothyroidism or mild hyperthyroidism and are frequently present in patients with other autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, pernicious anemia and type I diabetes (3). , 4).
  • VIDAS® cones are sensitized with 300 ⁇ l of a solution of native Tg antigen (bioMérieux reference 30462) at 7 ⁇ g / mL in a phosphate buffer (sensitization solution) contained in one of the wells of a VIDAS® strip , using the VIDAS® instrument, as follows:
  • This cycle is repeated 20 times.
  • This cycle is repeated 35 times.
  • This cycle is repeated 50 times.
  • VIDAS® cones For comparative purposes, the VIDAS® cones have been statically sensitized as follows:
  • the cones are sensitized with 300 ⁇ l of the same solution of native Tg antigen. After about 6h at room temperature (18-25 ° C) with the sensitizing solution, the cones were emptied. Then, 330 ⁇ l of a saturation solution containing in particular animal proteins are added for the passivation of the cones for about 6 hours. The cones are then emptied, dried and stored at 4 ° C until use, protected from moisture.
  • the sample (100 ⁇ ) is taken by the instrument from the sample well of the strip and then transferred to the well containing a sample diluent.
  • the diluted sample is aspirated and discharged for about 3 minutes. This step allows the anti-Tg antibodies present in the sample to bind to the antigen attached to the cone.
  • the unbound components of the serum are removed by 3 washes in wells of the VIDAS anti-Tg bar for about 3 min.
  • An incubation step with the developing conjugate is carried out for about 6 minutes, with suction / discharge cycles of 30 * 8sec.
  • the conjugate binds specifically to the previously fixed anti-Tg antibodies in the sample. A washing cycle identical to the previous one makes it possible to eliminate the excess of unfixed conjugate before the revelation.
  • the substrate (4-methylumbelliferyl phosphate) contained in a well of the bar is sucked into the cone and then returned to the revelation well; the enzyme of the conjugate catalyzes the hydrolysis reaction of this substrate into a product (4-Methombelliferone) whose emitted fluorescence is measured at 450 nm in the revealing well.
  • the assayed samples are samples of natural human serum with a concentration corresponding to 60 IU / mL (low sample) and 1000 IU / mL (strong sample).
  • the white sample is a mixture of negative samples.
  • Figure 6 is a histogram representation of Relative Fluorescence Value (RFV) values for the three sample types (white, weak and strong - Figure 6A) or only for the blank sample (representation histograms of Figure 6A whose scale is enlarged - Figure 6B) when detecting anti-Tg antibodies with the VIDAS® instrument, according to the different conditions of application of the binding partner (in dynamics during 5, 15 or 30 minutes, or in static mode for about 6 hours).
  • RSV Relative Fluorescence Value
  • FIG. 6A shows that the dynamic application conditions for fixing the Tg antigen on the support according to the method of the invention give signals that are equivalent or even better than those obtained with the static reference condition.
  • the signal obtained on the weak and strong human serum samples is satisfactory from 5 minutes of dynamic adsorption time. It is at its maximum for the 30-minute protocol, making it possible to obtain a signal higher than the reference with the strong sample.
  • the white sample signal is used to evaluate the nonspecific signal.
  • the signal for this sample should be at the lowest. As shown in FIG. 6B, with the dynamic application conditions, this non-specific signal is lower (less than 20 RFV) than for the static reference for which the signal is 25 RFV.
  • Troponin is a protein complex that sensitizes muscle cells to the calcium responsible for inhibiting myosin binding. actin (by masking the actin site that binds to myosin). It therefore has an inhibitory function which has the effect of initiating the muscular decontraction, .protein used.
  • Troponin I (TnI) is a subunit. Its assay is widely used as a diagnostic tool for myocardial infarction (MI) and a 30-day risk stratification for all-cause mortality and major adverse cardiac events (MACE) including infarction myocardial and revascularization in patients with symptoms suggestive of acute coronary syndrome (ACS).
  • VIDAS® cones are sensitized with 300 of a biotinylated BSA solution (bioMérieux reference 30448) at 1 ⁇ g / mL in a carbonate buffer contained in one of the wells of a VIDAS® strip.
  • the cycles addressed by VIDAS® and repeated 50 times are:
  • these same cones are incubated with 300 .mu.l of streptavidin solution (bioMérieux reference 30448) at 5 .mu.g / ml diluted in PBS buffer for 50 cycles of 20 seconds (aspiration, 20 s incubation and discharge).
  • the cones are then sensitized with a mixture of biotinylated anti-cTni antibodies (bioMérieux reference 30448) at 2 ⁇ g / mL and 3 ⁇ g / mL, respectively, over 300 ⁇ . Incubation is 50 times 20 seconds.
  • VIDAS® cones For comparative purposes, the VIDAS® cones have been statically sensitized as follows:
  • the cones are sensitized with 300 ⁇ of the same solution of biotinylated BSA for about 20 h at room temperature (18-25 ° C).
  • the cones are then emptied and then filled with 300 ⁇ l of streptavidin solution for about 20 h at room temperature (18-25 ° C).
  • the sensitization step about 300 with the mixture of biotinylated anti-cTni antibodies at the same concentration as in 3.1. continues for about 20 hours.
  • the cones are then emptied, dried and stored at 4 ° C until use, protected from moisture.
  • All the steps of the test are performed automatically by the instrument according to a standard operating mode of the instrument. They consist of a succession of suction / discharge cycles of the reaction medium.
  • the sample 200 ⁇ l
  • the sample is removed and transferred to the well containing alkaline phosphatase-labeled cardiac anti-troponin antibodies (conjugate).
  • the sample / conjugate mixture is sucked and then sucked successively by the cone for about 10 minutes (50 * 8 s). This operation allows the antigen to bind on the one hand to immunoglobulins fixed on the cone and on the other hand to the conjugate thus forming a "sandwich".
  • the substrate (4-methylumbelliferyl phosphate) is sucked and then forced back into the cone; the enzyme of the conjugate catalyzes the hydrolysis reaction of this substrate into a product (4-Methombelliferone) whose emitted fluorescence is measured at 450 nm.
  • the value of the fluorescence signal is proportional to the concentration of the antigen present in the sample.
  • the results are calculated automatically by the instrument with respect to two stored calibration curves corresponding to the two stages of the test. revelation.
  • a threshold signal manages the choice of the calibration curve to be used for each sample. Then the results are printed.
  • the assayed samples are human sera of Tni concentration ranging from 0.001 ⁇ g / L to 14.03 ⁇ g / L (samples 1 to 11).
  • FIG. 7 The RFV signal results as a function of the Tni concentration are given in FIG. 7 (FIG. 7A: samples 1 to 6 and FIG. 7B: samples 7 to 11) which shows that the signal is equivalent between the two types of coating, whatever the concentration of the tested sample.
  • FIG. 7A samples 1 to 6
  • FIG. 7B samples 7 to 11
  • VIDAS® cones are sensitized with 300 ⁇ l of anti-TSH mouse monoclonal antibody solution at 4 ⁇ g / ml in Tris HCl buffer pH 7.3 (sensitization solution) contained in one of the wells of a VIDAS® bar, using the VIDAS® instrument, as follows:
  • This cycle is repeated 139 times.
  • VIDAS® cones of VIDAS® are sensitized according to the prior art as follows:
  • the cones are sensitized with 300 ⁇ l of a mouse monoclonal anti-TSH solution (bioMérieux reference 30400) at 6 ⁇ g / ml in a Tris HCl pH 7.3 buffer. After about 20 h at room temperature (18-25 ° C) with the sensitizing solution, the cones are emptied. Then, 330 ⁇ l of this same solution including animal proteins are added for the passivation of the cones for about 6 hours. The cones are then emptied, dried and stored at 4 ° C until use, protected from moisture.
  • a mouse monoclonal anti-TSH solution bioMérieux reference 30400
  • TSH TSH is carried out as described in Example 1.
  • the assayed samples SCI 3, SCI 4, SCI 5, SCI 6 and SCI 7) are human sera with increasing concentrations of TSH.
  • FIG. 8 is a representation of the histogram type giving the RFV signal for each sample using either a cone coated with an anti-TSH antibody according to the invention (dynamic coating at 4 ⁇ g / mL ), or a cone coated with an anti-TSH antibody according to the prior art (static coating at 6 ⁇ g / mL).
  • FIG. 8 shows that the signals obtained between the two fabrications of cones (according to the invention and according to the prior art) are very comparable, whereas the manufacture of the invention uses 1/3 less anti-antibodies.
  • -TSH in the sensitization solution (4 ⁇ g / mL against 6 ⁇ g / mL) and allows production of these cones for use in immunoassay in lh against 2 steps of more than 6h each according to the prior art. All the other experimental conditions being identical, the application of anti-TSH antibodies according to the invention allows a significant saving of raw materials and time.
  • Bibliographical References 4 ⁇ g / mL against 6 ⁇ g / mL

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Abstract

La présente invention concerne un procédé d'application, dans un support solide (1) en forme de tube, évasé ou non, présentant une ouverture circulaire ou ellipsoïdale à chaque extrémité, tel qu'un cône ou une pipette, d'au moins un partenaire P1 de liaison à un analyte à détecter ou à quantifier dans un échantillon de test, comprenant les étapes suivantes: (i) connecter le support solide à un dispositif d'aspiration-refoulement (2, 3), (ii) aspirer dans le support solide, par l'une de ses extrémités, une solution comprenant ledit au moins un partenaire P1 de liaison, dite solution de sensibilisation S1, contenue dans un récipient (4, 7, 8, 9), appelé récipient R1, (iii)poursuivre le contact entre la solution de sensibilisation S1 etla surface interne du support solide pendant un temps compris entre 0s et 11 min, (iv) refouler la solution de sensibilisation S1 dans un récipient (4, 7, 8, 9), lequel est ou non ledit récipient R1, les étapes (ii) à (iv) formant un cycle pouvant être répété au moins 1 fois, sur une durée totale d'au moins 1 min et d'au plus 2h30. Elle concerne également l'utilisation du support ainsi revêtu pour la détection ou quantification d'un analyte dans un échantillon de test.

Description

Procédé d'application, sur un support solide, d'au moins un partenaire de liaison à une molécule
La présente invention concerne le domaine de la détection in vitro d'analytes dans des échantillons de test susceptibles de contenir ces analytes. En particulier, l'invention concerne un nouveau procédé d'application de partenaires de liaison à l'analyte recherché, sur un support solide en forme de tube, lequel support est ensuite utilisé pour la détection de l'analyte.
Dans le domaine de l'analyse d'échantillons de tests susceptibles de contenir des analytes d'intérêt, il est connu d'utiliser des méthodes basées sur des mesures spécifiques telles que des mesures de signaux. L'analyse de l'échantillon à tester peut comprendre la mise en œuvre d'un partenaire de liaison à l'analyte à détecter ou à quantifier dans l'échantillon. Le partenaire de liaison permet d'isoler l'analyte à tester afin de mettre en œuvre sa révélation via l'obtention d'un produit de réaction émettant un signal tel qu'un signal coloré ou un signal de fluorescence.
Le partenaire de liaison utilisé pour isoler l'analyte de l'échantillon de test est le plus souvent lié à la surface d'un support solide. Différents supports solides peuvent être utilisés tels que des supports pleins, par exemple des billes, des supports creux possédant un fond, dit supports creux fermés ou supports creux fermés à une extrémité, par exemple des puits, ou bien des supports creux sans fond, dit supports creux ouverts ou supports creux ouverts à chaque extrémité, en forme de tube, tels que des cônes ou des pipettes.
Lorsque les supports sont des supports creux, ouverts ou fermés, les partenaires de liaison à l'analyte mis en œuvre sont fixés, par exemple par adsorption (on dit alors qu'ils sont coatés), à l'intérieur du support, sur sa surface interne.
Habituellement, l'application des partenaires de liaison à la surface interne des supports creux se fait par mise en présence d'une solution contenant les partenaires de liaison avec la surface interne du support, de façon statique, pendant une période longue, de plus de 6 heures, et en moyenne d'une nuit, comme décrit dans la demande de brevet FR2417094. De part ce temps long de préparation, l'analyse biologique utilisant ces supports ne peut pas être mise en œuvre rapidement car il faut au moins attendre le temps de préparation du support et, dans la majorité des cas, il faut effectuer la préparation du support et l'analyse sur au moins deux jours. En effet, pour qu'une analyse biologique soit acceptable, notamment dans le diagnostic in vitro, et surtout dans le cas où un rendu d'analyse est urgent, il est nécessaire que le temps total d'analyse soit le plus court possible.
De ce fait, en routine, les supports sont préparés en avance, séchés, puis stockés dans des sachets dessicants pour éviter tout problème de stabilité. Ils sont ensuite utilisés avec les autres éléments nécessaires à l'analyse, tels que des réactifs.
L'application des partenaires de liaison sur la surface des supports creux se fait donc sur un temps long, en utilisant généralement une seule et unique solution contenant ces partenaires de liaison, appelée solution de sensibilisation ou de coating, dans un système fermé, c'est-à-dire qu'on utilise toujours la même solution dont la concentration en partenaires de liaison s'épuise lors de leur application sur la surface interne des supports creux. Il est alors nécessaire que la solution contienne ces partenaires de liaison en large excès, ce qui est coûteux. Néanmoins, le plus gros inconvénient avec cette méthode est le temps de contact nécessaire pour obtenir la bonne quantité de partenaire de liaison appliquée.
Un autre procédé d'application des partenaires de liaison dans les supports creux fermés, tels que des microplaques, a été développé. Il consiste à mettre en présence une solution de sensibilisation contenant les partenaires de liaison, puis éventuellement à agiter la plaque au moyen d'un plateau d'agitation par vibration ou à mouvement orbital, pendant plusieurs heures, en moyenne 4 heures. Même si le temps de coating est un peu raccourci par rapport à un procédé en statique, il est loin d'être acceptable. De plus, là encore, comme l'agitation se fait dans un système fermé, comme pour l'application en statique, il est nécessaire que la solution de sensibilisation contienne les partenaires de liaison en large excès. Ce procédé a également pour inconvénient qu'il ne peut pas être mis en œuvre avec des supports creux ouverts. Enfin, ce procédé a également pour inconvénient que les supports ainsi revêtus des partenaires de liaison sont peu reproductibles car le procédé ne peut pas être automatisé.
Par rapport aux supports creux fermés à une extrémité, les supports creux ouverts à chaque extrémité ont pour avantage de pouvoir servir également pour le pipetage et le transport des liquides de réaction, dont l'échantillon. Ils sont utilisés notamment pour aspirer les liquides, puis les refouler.
Un exemple de système utilisant un tel support creux ouvert dans lequel sont appliqués les partenaires de liaison, est le système VIDAS® (bioMérieux). Cet instrument utilise, pour l'analyse d'échantillons de test, un couple cône + barrette d'analyse. La barrette d'analyse, introduite dans le système, comprend plusieurs cuvettes, dont certaines sont remplies de liquides prédéterminés, utiles à l'analyse. La barrette d'analyse comprend aussi une cuvette adaptée pour recevoir un échantillon à tester et une cuvette pour la lecture du résultat d'analyse. Ainsi, dans ce système, le cône contient une partie des réactifs nécessaires à l'émission du signal et la barrette d'analyse contient l'autre partie des réactifs. Lors de l'analyse de cet échantillon de test, le cône est utilisé pour aspirer une quantité dudit échantillon et déposer ledit échantillon à l'intérieur des différentes cuvettes présentes dans la barrette d'analyse. Les liquides présents à l'intérieur des différentes cuvettes peuvent réagir avec l'échantillon pour obtenir, à la fin d'un cycle de transfert de liquides, par exemple d'une cuvette à une autre, un liquide, ou milieu de réaction, sur lequel les mesures d'un signal de fluorescence est effectué. Si l'analyte à détecter ou quantifier est présent dans l'échantillon de test, il se liera au partenaire de liaison présent à la surface du cône, puis les liquides présents dans les différentes cuvettes serviront à obtenir la révélation de cet analyte. Dans le cadre de l'instrument VIDAS®, les partenaires de liaison sont appliqués au préalable dans les cônes pendant environ 12h, de façon statique, de sorte que les kits vendus contiennent des cônes préalablement revêtus et sont stockés en vue d'une utilisation ultérieure.
Quelle que soit la façon d'appliquer le partenaire de liaison et quel que soit le support, ce système nécessite l'utilisation d'au moins deux instruments de nature et de fonctionnalité différentes, l'un pour effectuer l'application des partenaires de capture et l'autre pour faire l'analyse.
La présente invention vise donc à remédier aux inconvénients de l'état de la technique en proposant un procédé appliquant de façon dynamique et rapide un ou des partenaires de liaison sur la surface interne d'un support creux ouvert, permettant de raccourcir nettement le temps d'application des partenaires de liaison. Ainsi, il est possible de pouvoir poursuivre immédiatement l'analyse, évitant ainsi le stockage du support ainsi revêtu. Par ailleurs, avec un tel procédé, un seul type d'instrument peut être suffisant tant pour l'application du ou des partenaires de liaison que pour l'analyse, même si ces deux étapes ne sont pas mises en œuvre immédiatement l'une après l'autre. Enfin, disposer d'un tel procédé raccourcissant nettement le temps d'application du ou des partenaires de liaison et utilisant une solution de sensibilisation dans laquelle la quantité de partenaires de liaison est réduite, permet également un gain économique important lors de la production des supports creux ouverts.
Pour atteindre un tel objectif, l'objet de l'invention concerne un procédé d'application, dans un support solide en forme de tube, évasé ou non, présentant une ouverture circulaire ou ellipsoïdale à chaque extrémité, tel qu'un cône ou une pipette, d'au moins un partenaire PI de liaison à un analyte à détecter ou à quantifier dans un échantillon de test, comprenant les étapes suivantes :
(i) connecter le support solide à un dispositif d'aspiration-refoulement,
(ii) aspirer dans le support solide, par l'une de ses extrémités, une solution comprenant ledit au moins un partenaire PI de liaison, dite solution de sensibilisation SI, contenue dans un récipient, appelé « récipient RI »,
(iii) poursuivre le contact entre la solution de sensibilisation SI et la surface interne du support solide pendant un temps compris entre 0 s et 11 min,
(iv) refouler la solution de sensibilisation PI dans un récipient, lequel est ou non ledit récipient RI,
les étapes (ii) à (iv) formant un cycle pouvant être répété au moins 1 fois, sur une durée totale d'au moins 1 min et d'au plus poursuivre le contact entre 2h30.
Le procédé selon l'invention comporte en combinaison l'une et/ou l'autre des caractéristiques suivantes :
- le temps de contact de l'étape (iii) entre la solution de sensibilisation SI et la surface interne du support solide est compris entre 2s et 1min, de préférence entre 5 s et 25 s, de préférence encore entre 6s et 20 s ;
- les étapes (ii) à (iv) sont répétées de 10 à 150 fois, de préférence de 35 à 80 fois ;
- le total des cycles répétés est compris entre 10 et 20 min et est de préférence de 15 min ;
- les étapes (v) à (vii) suivantes sont mises en œuvre lorsque les cycles d'aspiration (ii)/contact (iii)/refoulement (iv) sont terminés :
(v) aspirer dans le support solide dans lequel sont appliqués lesdits au moins un partenaire de liaison PI, une solution de lavage Ll contenue dans un récipient appelé récipient RL1,
(vi) poursuivre le contact entre la solution de lavage Ll et la surface interne du support solide pendant un temps compris entre 0 s et 5 min,
(vii) refouler la solution de lavage Ll dans un récipient, lequel est ou non ledit récipient RL1 ,
les étapes (v) à (vii) formant un cycle pouvant être répété au moins 1 fois, sur une durée totale d'au moins 1 min et d'au plus 2h30 ;
- la solution de sensibilisation SI contient également au moins un partenaire P2 de liaison au partenaire PI de liaison à Panalyte.
Le partenaire P2 de liaison au partenaire PI de liaison à l'analyte à détecter ou à quantifier peut avantageusement être appliqué à la surface interne du support creux solide selon le même procédé de l'invention que celui décrit ci-dessus en reprenant les étapes suivantes :
(a) connecter le support solide à un dispositif d'aspiration-refoulement,
(b) aspirer dans le support solide, par l'une de ses extrémités, une solution comprenant ledit au moins un partenaire P2 de liaison, dite solution de sensibilisation S2, contenue dans un récipient, appelé récipient R2,
(c) poursuivre le contact entre la solution de sensibilisation S2 et la surface interne du support solide pendant un temps compris entre 0 s et 11 min,
(d) refouler la solution de sensibilisation S2 dans un récipient, lequel est ou non ledit récipient R2,
les étapes (b) à (d) formant un cycle pouvant être répété au moins 1 fois, sur une durée totale d'au moins 1 min et d'au plus 2h30.
Le procédé d'application du partenaire P2 comporte en combinaison l'une et/ou l'autre des caractéristiques suivantes :
- il comprend également les étapes (e) à (g) suivantes, mises en œuvre lorsque les cycles d'aspiration (b)/contact (c)/refoulement (d) sont terminés :
(e) aspirer dans le support solide dans lequel sont appliqués lesdits au moins un partenaire de liaison P2, une solution de lavage L2 contenue dans un récipient appelé récipient RL2,
(f) poursuivre le contact entre la solution de lavage L2 et la surface interne du support solide pendant un temps compris entre Os et 5 min,
(g) refouler la solution de lavage L2 dans un récipient, lequel est ou non ledit récipient RL2,
les étapes (e) à (g) formant un cycle pouvant être au moins 1 fois, sur une durée totale d'au moins 1 min et d'au plus 2h30 ;
- il comprend également l'application, dans ledit support solide, après les cycles d'aspiration (b)/contact (c)/refoulement (d), dudit au moins un partenaire PI de liaison ;
- l'application dudit au moins un partenaire PI de liaison, lorsqu'elle est mise en œuvre, est effectuée selon un procédé d'application de l'invention, tel que décrit précédemment.
Le support solide creux ouvert, revêtu du partenaire PI de liaison à l'analyte, par l'intermédiaire ou non du partenaire P2 de liaison à PI est avantageusement utilisé pour la détection ou la quantification de l'analyte contenu dans un échantillon de test. Aussi, un autre objet de l'invention concerne un procédé de détection ou quantification in vitro d'un analyte dans un échantillon de test susceptible de contenir le dit analyte, ledit procédé utilisant au moins un support solide en forme de tube, évasé ou non, présentant une ouverture circulaire ou ellipsoïdale à chaque extrémité, tel qu'un cône ou une pipette, dans lequel est appliqué au moins un partenaire PI de liaison à un analyte à détecter ou à quantifier dans l'échantillon de test selon le procédé d'application de l'invention, lequel procédé de détection ou quantification comprend des étapes de mise en contact de l'échantillon de test avec le support solide et de révélation de la liaison, si l'analyte est présent, dudit analyte et dudit au moins un partenaire PI de liaison.
Le procédé de détection ou quantification comporte en combinaison l'une et/ou l'autre des caractéristiques suivantes :
- le partenaire PI de liaison est un partenaire d'immunoessai ; - la révélation de la liaison dudit analyte est mise en œuvre par un test sandwich utilisant un autre partenaire de liaison à l'analyte, de nature différente ou non, lequel est marqué, ou bien par un test en compétition utilisant un composé marqué entrant en compétition avec l'analyte à détecter ou quantifier ;
- la révélation de l'analyte est mise en œuvre en utilisant une enzyme et un substrat enzymatique catalysé par ladite enzyme, de préférence la phosphatase alcaline et le 4-méthylombelliferyl phosphate ;
- les étapes de mise en contact de l'échantillon de test avec le support solide et de révélation de la liaison, si l'analyte est présent, dudit analyte et dudit au moins un partenaire PI de liaison sont mises en œuvre juste après le procédé d'application d'au moins un partenaire de liaison PI dans ledit support solide tel que défini précédemment, de préférence avec le même instrument ou un instrument de la même gamme ;
- les étapes de mise en contact de l'échantillon de test avec le support solide sur lequel est appliqué ledit au moins partenaire PI de liaison, et de révélation de la liaison dudit analyte et dudit au moins partenaire PI de liaison, comprennent les étapes suivantes consistant à :
(1) aspirer dans ledit support solide, par une de ses extrémités, ledit échantillon contenu dans un récipient, appelé récipient RE, laisser en contact et refouler ledit échantillon dans un récipient, lequel est ou non ledit récipient RE,
(2) aspirer dans ledit support solide, par la même extrémité, une solution comprenant un composé conjugué à un marqueur, tel qu'un autre partenaire de liaison à l'analyte ou un composé entrant en compétition avec l'analyte, appelée solution de conjugué SC, ladite solution de conjugué SC étant contenue dans un récipient appelé récipient RC, laisser en contact et refouler ladite solution de conjugué SC dans un récipient, lequel est ou non ledit récipient RC,
(3) si le marqueur utilise un substrat de révélation, aspirer dans ledit support solide, par la même extrémité, une solution comprenant un substrat de révélation avec lequel le marqueur va réagir, appelée solution de substrat SS, ladite solution de substrat SS étant contenue dans un récipient appelé récipient
RS, laisser en contact et refouler ladite solution de substrat dans un récipient, lequel est ou non ledit récipient RS, et
(4) mesurer le signal émis.
Bien entendu, le procédé peut comprendre une ou plusieurs étapes de lavage entre les étapes (1) et (2) et les étapes (2) et (3), mises œuvre comme décrit plus loin.
Par application dans un support solide creux ouvert d'au moins un partenaire de liaison, on entend que ledit au moins partenaire de liaison est fixé à l'intérieur du support par tout moyen connu de l'Homme du Métier tel que l'adsorption, la liaison covalente, la liaison hydrogène, la liaison électrostatique et la liaison ionique, etc. Le type de fixation des partenaires de liaison à l'intérieur du support creux dépend de la nature du support et en particulier de sa surface. Ainsi, le support peut être en plastique, tel que polycarbonate, copolymères styrène-butadiène, polymères (polystyrène, polypropène, polypropylène, polyéthylène...) ou en inox, avec ou sans traitement préalable de la surface interne. La surface interne de support creux peut avoir été fonctionnalisée par des groupements réactifs qui entraîneront la formation d'une liaison covalente avec le partenaire de liaison. La surface interne du support creux peut également avoir subi des traitements pour améliorer la fixation des partenaires de liaison, comme un traitement par rayonnement ionisant tel que l'irradiation aux rayons X, aux électrons accélérés ou au rayonnement gamma. De tels supports préalablement traités ou non sont disponibles dans le commerce, comme par exemple chez Thermo fisher.
Par analyte à détecter ou à quantifier, on entend toute molécule représentative de la présence de microorganismes ou d'une maladie à détecter, caractériser ou suivre. On entend aussi le dépistage de drogues ou de substances physico-actives, de médicaments ainsi que le suivi des traitements chez les patients. De préférence, la détection ou quantification de cet analyte est effectuée par un immunoessai qui est un test largement connu de l'homme du métier, impliquant des réactions immuno logiques entre cet analyte à détecter et un ou des partenaire(s) de liaison à cet analyte. De ce fait, des exemples d'analytes comprennent des anticorps, par exemple des autoanticorps ou des anticorps dirigés contre des protéines de pathogènes, par exemple de virus tels que virus du VIH, SIV, FIV, VHC, VHB, VHA, VHE, virus VZV, CMV, EBV, VHS1, VHS2, de bactéries telles que Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Borrelia burgdorferi stricto sensu, Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Borrelia spielmanii, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, les salmonelles, Klebsiella, Leugionella, Proteus, Klebsiella, Escherichia coli, Shigella, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Treponema pallidum, de levures telles que Candida albicans, de champignons tels que Aspergillus fumigatus, les Mucorales, etc.), des protéines différentes des anticorps, par exemple des biomarqueurs tels que la procalcitonine (PCT), les hormones de la thyroïde (TSH par exemple), les troponines cardiaques (Tnl, TnT, et complexes associés), la BNP, la NT-proBNP, le D- dimère, la CRP, la S100B, la L-FABP, la H-FABP, les marqueurs cancéreux tels que CA-15-3, CA-19-9, etc., ou des protéines de pathogènes, des peptides, par exemple des fragments de protéines de pathogènes tels que décrits précédemment, et des haptènes, par exemple des stéroïdes ou des vitamines.
L'analyte est susceptible d'être contenu dans un échantillon de test qui peut être de diverses origines, par exemple d'origine alimentaire, environnementale, biologique, vétérinaire, clinique, pharmaceutique ou cosmétique.
Parmi les échantillons d'origine alimentaire, on peut citer, de façon non- exhaustive, un échantillon de produits lactés (yaourts, fromages, etc.), de viande, de poisson, d'œuf, de fruit, de légume, d'eau, de boisson (lait, jus de fruits, soda, etc.). Bien évidemment, ces échantillons d'origine alimentaire peuvent aussi provenir de sauces ou de plats plus élaborés ou des matières premières non transformées ou partiellement transformées. Un échantillon alimentaire peut également être issu d'une alimentation destinée aux animaux, telle que des tourteaux, des farines animales. Tous ces échantillons, s'ils ne sont pas liquides, sont préalablement traités pour être sous forme liquide.
Tel qu'indiqué précédemment, l'échantillon peut être d'origine environnementale et peut consister, par exemple, en un prélèvement de surface, d'eau, d'air, etc.
L'échantillon peut également consister en un échantillon biologique, d'origine humaine ou animale, pouvant correspondre à des prélèvements de fluide biologique (urine, sang total ou dérivés tels que sérum ou plasma, salive, pus, liquide céphalo- rachidien, etc.), de selles (par exemple diarrhées cholériques), de prélèvements de nez, de gorge, de peau, de plaies, d'organes, de tissus ou de cellules isolées, d'échantillons d'écouvillonnage. Cette liste n'est évidemment pas exhaustive.
D'une manière générale, le terme « échantillon » se réfère à une partie ou à une quantité, plus particulièrement une petite partie ou une petite quantité, prélevée à partir d'une ou plusieurs entités aux fins d'analyse. Cet échantillon peut éventuellement avoir subi un traitement préalable, impliquant par exemple des étapes de mélange, de dilution ou encore de broyage, en particulier si l'entité de départ est à l'état solide.
Par partenaire PI de liaison à l'analyte à détecter ou à quantifier dans un échantillon de test, on entend tout partenaire capable de se lier audit analyte. Bien entendu, les notions d'analyte et de partenaire de liaison sont bien distinctes l'une de l'autre. L'analyte est le composé présent dans l'échantillon de test, alors que le partenaire de liaison PI, qui est appliqué selon le procédé de l'invention, est le composé qui va se lier à l'analyte. La nature du partenaire de liaison PI dépend de la nature de l'analyte et du type d'essai mis en œuvre. De préférence, le test sera un immunoessai.
Le terme « immuno » dans « immunoessai » par exemple, n'est pas à considérer dans la présente demande comme indiquant strictement que le partenaire de liaison est un partenaire immunologique, tel qu'un anticorps. En effet, l'homme du métier utilise également largement ce terme lorsque le partenaire de liaison, aussi appelé ligand, n'est pas un partenaire immunologique mais est par exemple un récepteur à l'analyte que l'on veut doser. Ainsi, il est connu de parler du dosage ELISA (« Enzyme-Linked Immunosorbent Assay » littéralement « dosage d'immunoadsorption par enzyme liée ») pour des dosages qui utilisent des partenaires de liaison non immunologiques, appelés plus largement en anglais « Ligand Binding Assay », que l'on pourrait traduire par « Dosage utilisant la liaison à un ligand », alors que le terme « immuno » est inclus dans l'acronyme ELISA. Par souci de clarté, la Demanderesse utilisera dans toute la demande le terme « immuno » pour tout test ou dosage utilisant un partenaire de liaison, même quand il n'est pas un partenaire immunologique.
A titre d'exemples de partenaire de liaison PI d'immunoessai, on peut citer les partenaires de liaison de nature ou d'origine immunologique tels que les anticorps (monoclonaux ou polyclonaux) et les fragments d'anticorps (tels que Fab, Fab', F(ab')2), chaînes scFv (Single chain variable fragment), dsFv (Double-stranded variable fragment)), bien connus de l'Homme du Métier, ainsi que les partenaires de liaison n'étant pas de nature ou d'origine immunologique tels que les protéines différentes des anticorps, les peptides, les oligonucléotides, les nanofitines, les récepteurs à l'analyte s'ils existent, les aptamères, les DARPins ou toute autre molécule qui est connue pour avoir une interaction avec ledit analyte.
Les nanofitines (nom commercial) sont de petites protéines qui, comme les anticorps, sont capables de se lier à une cible biologique permettant ainsi de la détecter, de la capturer ou tout simplement de la cibler au sein d'un organisme.
Les aptamères sont des oligonucléotides, généralement ARN ou ADN, identifiés dans des banques contenant jusqu'à 1015 séquences différentes, par une méthode combinatoire de sélection in vitro appelée SELEX pour « Systematic Evolution of Ligands by Exponentiel Enrichment » (Ellington AD et Szostak JW., 1990). La plupart des aptamères sont composés dARN, en raison de la capacité de 1ARN à adopter des structures variées et complexes, ce qui permet de créer à sa surface des cavités de géométries variées, permettant de fixer des ligands divers. Il s'agit d'outils biochimiques d'intérêt qui peuvent être utilisés dans des applications biotechnologiques, diagnostiques ou thérapeutiques. Leur sélectivité et leurs propriétés de fixation de ligands sont comparables à celle des anticorps.
Les « DARPins » pour Designed Ankyrin Repeat ProteINS (Boersma YL et Plutckthun A, 2011) sont une autre classe de protéines permettant de mimer les anticorps et de pouvoir se fixer avec une affinité et une sélectivité élevées sur des protéines cibles. Ils dérivent de la famille des protéines ankyrines qui sont des protéines adaptatrices permettant de fixer les protéines de membrane intégrales au réseau spectrine/actine qui constitue « la colonne vertébrale » de la membrane plasmatique cellulaire. La structure des ankyrines est basée sur la répétition d'un motif d'environ 33 acides aminés et il en est de même des DARPins. Chaque motif a une structure secondaire de type hélice-coude-hélice (« helix-turn- hélix »). Les DARPins contiennent au moins trois, de préférence quatre à cinq motifs répétés et sont obtenus par « screening » de banques combinatoires.
La solution de sensibilisation S I comprend le partenaire PI de liaison selon une concentration que l'homme du métier adaptera en fonction de la sensibilité du test qu'il souhaite effectuer, du partenaire PI de liaison à appliquer dans le support solide, de l'analyte recherché et de la nature de l'échantillon. Ainsi, par exemple, lorsque la solution de sensibilisation comprend un anticorps ou un fragment d'anticorps, il pourra être utilisé selon une concentration comprise entre 0,01 et 100 μg/mL. Contrairement à un procédé d'application classique, en statique ou en support creux fermé, la quantité de partenaire PI de liaison peut être inférieure, par exemple de 10% par rapport à la concentration utilisée en statique.
La solution de sensibilisation SI comprend également tous les composants nécessaires pour faciliter l'application du partenaire PI de liaison dans le support solide, tels que des tampons pH, par exemple des tampons carbonate, phosphate, TRIS, HEPES, des sels tels que NaCl, des conservateurs tels que l'azide, le MIT ; des stabilisants tels que le glycérol, le Tween 20, le SDS, et des protéines de saturation ou passivation telles que la BSA, de la caséine.
Le récipient RI contenant la solution de sensibilisation SI peut être n'importe quel récipient permettant de contenir une solution contenant des composés biologiques tels que les partenaires PI de liaison. La seule condition est que les parois du récipient soient inertes par rapport aux partenaires de liaison PI afin que ces derniers ne se fixent pas aux parois. Ainsi, le récipient RI peut être en matière plastique, telle qu'en éthylene acétate de vinyle (copolymère EVA), Polyéthylène, polypropylène copolymère, Fluorinated ethylene propylene (nalgène), en verre, ou en inox. Il peut être sous n'importe quelle forme, par exemple, flacon, puits, bidon, boîte, jerricanes. Ce récipient RI peut être fermé avant sa mise en œuvre dans le procédé de l'invention et ensuite ouvert lors de l'étape d'aspiration. Par exemple, ce récipient RI peut être un puits recouvert d'un opercule en feuille d'aluminium qui sera percé par le support solide lui- même quand celui-ci viendra aspirer la solution de sensibilisation.
Par mis en œuvre avec le même instrument, on entend que les étapes concernées utilisent un seul instrument, alors que par mis en œuvre avec deux instruments de la même gamme, on entend que les étapes concernées utilisent deux instruments différents mais du même constructeur et ayant des caractéristiques comparables pour être interchangeables. Dans ce dernier cas, on parle indifféremment d'instruments de la même gamme ou d'instruments du même type. A titre d'exemples, on peut citer la gamme VIDAS® de la Demanderesse qui comprend les instruments VIDAS®, mini VIDAS® et VIDAS® 3. Ainsi, par exemple, l'application du ou des partenaires de liaison peut être mise en œuvre avec un instrument VIDAS®, puis l'analyse peut être mise en œuvre avec un autre instrument VIDAS® ou bien avec un instrument VIDAS® 3.
La première étape du procédé de l'invention concerne la connexion du support solide à un dispositif d'aspiration-refoulement. La connexion peut être mise en œuvre manuellement, ou bien mécaniquement par l'instrument dans lequel se trouve le support et le dispositif d'aspiration-refoulement.
Le procédé de l'invention comprend plusieurs cycles d'aspiration (ii)/ contact (iii)/ refoulement (iv). La première étape de ce cycle est l'étape d'aspiration (ii) qui consiste à faire rentrer la solution de sensibilisation SI dans le support solide creux par l'une de ses extrémités, sans déborder par l'autre extrémité. Elle peut être mise en œuvre par toute méthode connue de l'homme du métier. Par exemple, cette étape d'aspiration peut être mise en œuvre en effectuant une différence de pression dans le support solide, notamment à l'aide d'un piston entraîné par tout moyen connu de l'homme du métier, comme par exemple à l'aide d'une vis couplée à un moteur, formant un bloc pompe ou par l'utilisation d'un dispositif de création d'une dépression. Le bloc pompe peut être plus ou moins éloigné du support solide, par exemple par l'intermédiaire d'une tubulure. Des joints entre le support solide et le bloc pompe sont présents pour faire l'étanchéité. Tous ces éléments constituent un exemple de dispositif d'aspiration/refoulement. L'homme du métier adaptera la vitesse et la puissance d'aspiration de la pompe en fonction de la quantité de solution de sensibilisation à faire entrer dans le support solide et, le cas échéant, en fonction de la longueur et section de la tubulure entre la pompe et le support solide. Ainsi, par exemple, dans le cadre de l'instrument VIDAS® où le bloc pompe est proche du cône, la vitesse d'aspiration sera comprise entre 10 et 180 μΐ /seconde. Comme indiqué précédemment, le support solide pourra servir à aspirer directement la solution de sensibilisation du récipient RI ou bien l'aspiration pourra être mise en œuvre par l'intermédiaire d'une tubulure d'une part reliée à l'extrémité du support solide par laquelle la solution de sensibilisation PI est aspirée et d'autre part plongée dans le récipient RI .
A l'opposé de l'étape d'aspiration (ii), l'étape de refoulement (iv) consiste à faire sortir la solution de sensibilisation SI du support solide creux par l'une de ses extrémités. L'extrémité par laquelle la solution de sensibilisation est refoulée peut être la même que celle utilisée pour aspirer, comme par exemple dans le cas de l'instrument VIDAS®, ou bien ce peut être l'extrémité opposée.
Le récipient de refoulement qui récupère la solution de sensibilisation refoulée peut être le récipient RI, par exemple lorsqu'on utilise la même extrémité du support solide pour l'aspiration et le refoulement. Le récipient de refoulement peut également consister en une poubelle.
L'étape de refoulement peut être mise en œuvre par toute méthode connue de l'homme du métier, comme décrit pour l'étape d'aspiration. De façon commode, le même système, par exemple un bloc pompe tel que décrit précédemment, est utilisé à la fois pour les étapes d'aspiration et les étapes de refoulement.
Diverses autres caractéristiques ressortent de la description faite ci-dessous en référence aux Figures 1 à 8 annexées qui montrent, à titre d'exemples non limitatifs, des modes de réalisation des objets de l'invention.
La Figure 1 représente un schéma pour l'application d'un partenaire de liaison, dans un support solide de type cône, avec un système de coating en boucle.
La Figure 2 représente un schéma pour l'application d'un partenaire de liaison, dans un support solide de type cône, avec un système en ligne.
La Figure 3 représente un schéma pour l'application d'un partenaire de liaison, dans un support solide de type cône, avec un système de type va-et-vient, comme mis en œuvre par exemple dans l'instrument VIDAS®.
La Figure 4 représente une barrette et un cône VIDAS® lors de la mise en œuvre d'un cycle d'aspiration (figure 4 A)/contact (figure 4B)/refoulement (Figure 4C) selon un mode de réalisation de l'invention pour l'application d'un partenaire de liaison, la barrette étant constituée de plusieurs récipients dont le récipient SI ou S2. La Figure 5 est une représentation de type histogramme des valeurs de Relative Fluorescence Value (RFV) pour les deux types d'échantillon 1 et 2 lors de la détection de la TSH avec l'instrument VIDAS®, en fonction des différentes conditions d'application du partenaire de liaison (en dynamique avec une concentration en partenaire de liaison et un temps de contact qui varient - 2,5 μg/mL pendant 5, 10 ou 15 min ou bien 5 μg/mL pendant 5, 10 ou 15 min, ou en statique avec une concentration à 6 μg/mL pendant 20 h).
La Figure 6 est une représentation de type histogramme des valeurs de Relative Fluorescence Value (RFV) pour les trois types d'échantillon (blanc, faible et fort - Figure 6 A) ou uniquement pour l'échantillon blanc (représentation des histogrammes de la Figure 6A dont l'échelle est agrandie - Figure 6B) lors de la détection d'anticorps anti-Tg avec l'instrument VIDAS®, en fonction des différentes conditions d'application du partenaire de liaison (en dynamique pendant 5, 15 ou 30 min, ou bien en statique pendant 20 h).
La Figure 7 est un graphe donnant le signal RFV en fonction de la concentration de la Tnl lors de la détection de Tnl avec l'instrument VIDAS (Fig 7 A : concentration faible en Tnl et Fig 7B : concentration élevée en Tnl) en utilisant un cône revêtu de 3 partenaires de liaison selon le procédé de l'invention (invention) ou selon l'art antérieur (référence), à savoir de la BSA biotinylée, puis de la streptavidine, puis un mélange d'anticorps biotinylés anti-Tnl.
La Figure 8 est une représentation de type histogramme donnant le signal RFV pour cinq échantillons ayant une concentration croissante en TSH en utilisant soit un cône revêtu d'un anticorps anti-TSH selon l'invention (coating dynamique à 4 μg/mL), soit un cône revêtu d'un anticorps anti-TSH selon l'art antérieur (coating statique à 6 μg/mL).
Les Figures 1 à 3 sont des modes de réalisation particuliers de mise en œuvre de cycles d'aspiration/contact/refoulement selon le procédé de l'invention.
Selon la Figure 1, le dispositif pour appliquer le partenaire PI de liaison dans un support creux ouvert 1 , de type cône, comprend un récipient RI 4 contenant la solution de sensibilisation SI contenant ledit partenaire PI de liaison, une pompe 2 qui permet de faire circuler la solution de sensibilisation, via un système de tubulure 3, dans le sens des flèches indiqué. La première étape consiste à aspirer, dans le sens de la flèche, à l'aide de la pompe 2, la solution de sensibilisation du récipient RI 4 dans le support 1, puis à laisser en contact ou non la solution de sensibilisation et le support 1, puis à refouler, toujours dans le sens des flèches, à l'aide de la pompe 2, la solution de sensibilisation du support 1 dans le récipient 4, ces étapes étant répétées. Ainsi, la solution de sensibilisation est reprise à chaque étape dans le récipient 4, rentre par une des deux extrémités du support 1 et est refoulée dans le récipient 4 par l'autre extrémité du support 1.
Selon une variante de ce mode de réalisation et comme indiqué précédemment, la solution de sensibilisation SI, après avoir été aspirée dans le support 1 par l'une de ses extrémités, est refoulée dans le récipient RI 4 par la même extrémité.
Selon la Figure 2, le dispositif pour appliquer le partenaire PI de liaison dans un support creux ouvert 1 , de type cône, comprend un récipient RI 4 contenant la solution de sensibilisation SI contenant ledit partenaire PI de liaison, une pompe 2 qui permet de faire circuler la solution de sensibilisation, via un système de tubulure 3, dans le sens des flèches indiqué. La première étape consiste à aspirer, dans le sens de la flèche, à l'aide de la pompe 2, la solution de sensibilisation du récipient RI 4 dans le support 1, puis à laisser en contact ou non la solution de sensibilisation et le support 1, puis à refouler, toujours dans le sens des flèches, à l'aide de la pompe 2, la solution de sensibilisation du support 1 dans le récipient 5 qui est un récipient poubelle, ces étapes étant répétées et la solution de sensibilisation étant reprise à chaque étape dans le récipient RI 4. Ainsi, la solution de sensibilisation est reprise à chaque étape dans le récipient 4, rentre par une des deux extrémités du support 1 et est refoulée dans le récipient 5 par l'autre extrémité du support 1.
Selon une variante de ce mode de réalisation, les cycles d'aspiration/contact/refoulement se font en utilisant la même extrémité du support 1 et c'est uniquement lors du dernier cycle que la solution de sensibilisation est refoulée dans un récipient poubelle.
Selon la Figure 3, le dispositif pour appliquer le partenaire PI de liaison dans un support creux ouvert 1 , de type cône, comprend un récipient RI 4 contenant la solution de sensibilisation SI contenant ledit partenaire PI de liaison, une pompe 2 qui permet de faire circuler la solution de sensibilisation, via un système de tubulure 3, dans le sens des flèches indiqué. La première étape consiste à aspirer, dans le sens de la flèche allant vers la droite, à l'aide de la pompe 2, la solution de sensibilisation du récipient RI 4 dans le support 1, puis à laisser en contact ou non la solution de sensibilisation et le support 1 , puis à refouler, toujours dans le sens de la flèche vers la gauche, à l'aide de la pompe 2, la solution de sensibilisation du support 1 dans le récipient 4, ces étapes étant répétées. Ainsi, la solution de sensibilisation est reprise à chaque étape dans le récipient 4, rentre par une des deux extrémités du support 1 et est refoulée dans le récipient 4 par la même extrémité.
Un exemple de procédé consistant à aspirer et refouler la solution de sensibilisation en utilisant la même extrémité du support creux est donné sur la Figure 4 qui représente une barrette 6 et un cône 1 VIDAS®. La barrette d'analyse 6 contient différents puits, dont un puits 10 pour recevoir l'échantillon de test, un puits 4 contenant la solution de sensibilisation SI, un puits de lecture 11 dans lequel la fluorescence sera lue après la mise en œuvre de l'analyse biologique de l'échantillon, et des puits 7, 8, 9 pouvant contenir différents éléments tels que des tampons de lavage ou bien un puits poubelle dans lequel la fraction de solution de sensibilisation mise en contact avec le cône est refoulée. La figure 4A montre la première étape du procédé de l'invention, consistant à aspirer dans le cône 1, via une tubulure 3 reliée à un dispositif d'aspiration-refoulement (non montré sur la Figure 4, mais comme illustré sur la figure 3), une fraction de la solution de sensibilisation contenue dans le puits 4. La Figure 4B montre la 2eme étape pendant laquelle on laisse en contact la solution de sensibilisation et le cône 1. Enfin, la figure 4C montre l'étape de refoulement consistant à refouler la solution de sensibilisation dans le puits 4.
L'étape de contact (iii) entre la solution de sensibilisation SI et le support solide est effectuée pendant un temps compris entre 0 s et 11 min. Lorsque le temps de contact est de Os, cela signifie que les étapes d'aspiration et de refoulement s'enchaînent, sans temps de pause entre les deux. Le temps de contact peut également être d'au plus 10 min, 9 min, 8 min, 7 min, 6 min, 5 min, 4 min, 3 min, 2 min, 1 min, 55 s, 50 s, 45 s, 40 s, 35 s, 30 s, 25 s, 20 s ou 15 s. Le temps de contact peut être d'au moins ls, 2 s, 3 s, 4 s, 5 s, 6 s, 7 s, 8 s, 9 s, 10 s, 11 s, 12 s, 13 s, 14 s, 15 s, 20 s, 30 s, 35 s ou 40 s. Le temps de contact varie également en fonction du nombre de cycles mis en œuvre qui est d'au moins deux. Le nombre de cycles minimal et maximal dépend de la durée totale du procédé d'application, et ce en fonction du temps de contact choisi. Ainsi, le nombre de cycles de répétition des étapes (i) à (ii) peut être d'au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20 ou 25 et d'au plus 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 120, 139, 150, 185, 200, 232, 250, 278, 300, 325, 371, 400, 417, 464, 500, 510, 556, 600, 603, 649, 700, 800, 900, 1000, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000 ou 6000 fois.
Le temps total du procédé est d'au moins 1 min et d'au plus environ 2h30. Ce temps total peut être d'au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 min et d'au plus 2h, lh30, lh, 55 min, 50 min, 45 min, 40 min, 39 min, 38 min, 37, min, 36 min, 35 min, 34 min, 33 min, 32 min, 31 min, 30 min, 29 min, 28 min, 27, min, 26 min, 25 min, 24 min, 23 min, 22 min, 21 min, 20 min, 19 min, 18 min, 17, min ou 16 min.
La combinaison temps de contact, nombre de cycles et durée totale du procédé sera choisie par l'homme du métier en fonction de la sensibilité du test de détection ou quantification d'analyte qu'il veut mettre en œuvre. Cette combinaison conditionnera la quantité de partenaire PI de liaison qui sera appliquée à la surface interne du support solide.
La température à laquelle est effectuée le procédé d'application de l'invention est toute température compatible avec le partenaire PI de liaison, c'est-à-dire à toute température qui permet de conserver les capacités de liaison à l'analyte dudit partenaire PI de liaison. De façon générale, la température est comprise entre 10°C et 45°C. La température ambiante, d'environ 17°C à environ 25°C, est donc appropriée. La température peut également être fonction de l'instrument mis en œuvre. Ainsi, dans le cadre de l'instrument VIDAS®, la température mise en œuvre est de 37°C.
Une fois le partenaire PI de liaison appliqué à la surface interne du support solide, celui-ci peut être lavé avec une solution de lavage Ll pour éliminer les partenaires non liés. Les solutions de lavage utiles à cette fin sont classiques et connues de l'homme du métier. Elles comprennent des tampons, tels que des tampons phosphate, du Tris, HEPES des sels tels que le NaCl, des détergents tels que le Triton X-100 0,2%, Tween 20. Elles peuvent également contenir des agents de saturation, également appelés agent de passivation, comme par exemple la BSA ou les protéines de lait, afin de saturer la surface interne du support solide, évitant ainsi les liaisons non spécifiques qui pourraient se produire lors de la mise en contact de l'échantillon de test et du support solide. Là encore, la seule condition pour cette solution de lavage Ll est qu'elle ne doit pas détruire la capacité de liaison à l'analyte dudit partenaire PI de liaison.
Le lavage de la surface interne du support solide peut être mis en œuvre par toute méthode connue de l'homme du métier, comme par exemple en trempant le support solide dans un récipient contentant ladite solution de lavage Ll . Il peut également être mis en œuvre en reproduisant les cycles d'aspiration (ii)/contact
(iii) /refoulement (iv) tels que décrits précédemment. Ainsi, selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé d'application comprend également les étapes suivantes, mises en œuvre lorsque les cycles d'aspiration (ii)/contact (iii)/refoulement
(iv) sont terminés :
(v) aspirer dans le support solide dans lequel sont appliqués lesdits au moins un partenaire de liaison PI, une solution de lavage Ll contenue dans un récipient appelé récipient RLl,
(vi) poursuivre le contact entre la solution de lavage Ll et la surface interne du support solide pendant un temps compris entre 0s et 11 min,
(vii) refouler la solution de lavage Ll dans un récipient, lequel est ou non ledit récipient RLl,
les étapes (v) à (vii) formant un cycle pouvant être répété au moins 1 fois, sur une durée totale d'au moins 1 min et d'au plus 2h30.
Toutes les caractéristiques décrites ci-dessus pour les étapes (ii), (iii) et (iv) s'appliquent également aux étapes (v), (vi) et (vii).
Comme indiqué précédemment, à la fin de l'étape de refoulement, la solution utilisée peut être refoulée dans le récipient de lavage RLl ou dans un autre récipient qui pourra alors être le même récipient que celui utilisé après l'étape (iii). On parlera alors de récipient poubelle qui sera identique tant pour l'application du partenaire PI de liaison que pour le lavage.
La partenaire PI de liaison peut être appliqué directement sur la surface interne du support solide. Ou bien il peut être appliqué par l'intermédiaire d'un autre partenaire de liaison, dit partenaire P2 de liaison au partenaire PI de liaison à l'analyte. Là encore, les notions d'analyte et de partenaire de liaison P2 sont bien distinctes l'une de l'autre. L'analyte est le composé présent dans l'échantillon de test, alors que le partenaire de liaison P2 est le composé qui va se lier au partenaire de liaison PI qui va lui-même se lier à l'analyte. Ces partenaires de liaison P2 sont d'origine ou non immunologique, comme décrit précédemment. Lorsque le partenaire PI de liaison est un anticorps, le partenaire P2 de liaison peut être un anticorps anti-espèce, par exemple un anticorps anti-souris lorsque le partenaire PI est un anticorps de souris. Le partenaire P2 de liaison peut également être un anticorps anti-IgM lorsque le partenaire PI de liaison est une IgM. Lorsque le partenaire PI de liaison est un antigène, par exemple un peptide, le partenaire P2 de liaison peut être un anticorps anti-peptide. Le partenaire PI de liaison peut avoir été modifié au préalable avec un ligand, par exemple une biotine, le partenaire P2 de liaison étant alors un antiligand, par exemple la streptavidine. D'autres exemples de partenaire P2 de liaison sont largement connus de l'homme du métier.
Le partenaire P2 de liaison peut être contenu dans la solution de sensibilisation SI, ce qui constitue un mode de réalisation particulier de l'invention. Dans ce cas, la formation partenaire P2 de liaison/partenaire PI de liaison sur le support solide sera mise en œuvre pendant les cycles d'aspiration (ii)/ contact (iii)/ refoulement (iv) du procédé d'application de l'invention. Ceci est applicable lorsque le partenaire P2 se lie plus facilement au support que le partenaire PI , comme par exemple lorsque le partenaire P2 est la streptavidine et le partenaire PI est un anticorps biotinylé.
Le partenaire P2 de liaison peut également avoir préalablement appliqué à la surface interne du support solide selon tout procédé connu de l'homme du métier, par exemple en statique ou en dynamique, en reproduisant les mêmes cycles que ceux décrits ci-dessus pour l'application du partenaire PI de liaison.
Ainsi, au moins un partenaire P2 de liaison à un partenaire PI de liaison à un analyte à détecter ou quantifier dans un échantillon de test le partenaire P2 de liaison peut être appliqué dans le support solide en forme de tube, évasé ou non, présentant une ouverture circulaire ou ellipsoïdale à chaque extrémité, tel qu'un cône ou une pipette, par un procédé comprenant les étapes suivantes :
(a) connecter le support solide à un dispositif d'aspiration-refoulement,
(b) aspirer dans le support solide, par l'une de ses extrémités, une solution comprenant ledit au moins un partenaire P2 de liaison, dite solution de sensibilisation S2, contenue dans un récipient, appelé récipient R2,
(c) poursuivre le contact entre la solution de sensibilisation S2 et la surface interne du support solide pendant un temps compris entre Os et 11 min,
(d) refouler la solution de sensibilisation S2 dans un récipient, lequel est ou non ledit récipient R2,
les étapes (b) à (d) formant un cycle pouvant être répété au moins 1 fois, sur une durée totale d'au moins 1 min et d'au plus 2h30.
Toutes les caractéristiques décrites ci-dessus pour les étapes (ii), (iii) et (iv) s'appliquent également aux étapes (b), (c) et (d).
Comme indiqué précédemment, à la fin de l'étape de refoulement, la solution utilisée peut être refoulée dans le récipient de sensibilisation R2 ou dans un autre récipient qui pourra alors être le même récipient que celui utilisé avec les autres étapes de refoulement précédemment décrites (récipient poubelle).
Après application du partenaire P2 de liaison à la surface interne du support solide, celui-ci peut être lavé avec une solution de lavage L2 pour éliminer les partenaires non liés.
Le lavage peut également comprendre les étapes suivantes, mises en œuvre lorsque les cycles d'aspiration (b)/contact (c)/refoulement (d) sont terminés :
(e) aspirer dans le support solide dans lequel sont appliqués lesdits au moins un partenaire de liaison P2, une solution de lavage L2 contenue dans un récipient appelé récipient RL2,
(f) poursuivre le contact entre la solution de lavage L2 et la surface interne du support solide pendant un temps compris entre Os et 11 min,
(g) refouler la solution de lavage L2 dans un récipient, lequel est ou non ledit récipient RL2, les étapes (e) à (g) formant un cycle pouvant être répété au moins 1 fois, sur une durée totale d'au moins 1 min et d'au plus 2h30.
La solution de lavage L2 comporte les mêmes caractéristiques que la solution de lavage Ll précédemment décrite. Elle peut être identique (on parlera alors indifféremment de solution de lavage L pour la solution Ll et la solution L2) ou elle peut être différente de la solution de lavage Ll, tant par rapport à la nature que par rapport à son contenant. Elle est de préférence dans un récipient RL2 différent du récipient RL1, mais le lavage peut être effectué avec la même solution contenue dans le même récipient (on parlera alors de récipient RL).
Tout comme précédemment, le refoulement de la solution de lavage peut être effectué dans le récipient de lavage lui-même (RL2 ou RL) ou dans un récipient poubelle, par exemple commun pour toutes les étapes de refoulement.
Qu'il y ait ou non des étapes de lavage, afin d'utiliser le support solide pour détecter ou quantifier un analyte susceptible d'être contenu dans un échantillon de test, celui-ci sera ensuite revêtu du partenaire PI de liaison. Selon un mode de réalisation, le procédé d'application du partenaire P2 de liaison comprend également l'application, dans ledit support solide, après les cycles d'aspiration (b)/contact (c)/refoulement (d), dudit au moins un partenaire PI de liaison.
Le partenaire PI de liaison peut être appliqué à la surface interne du support solide selon tout procédé connu de l'homme du métier, par exemple en statique ou en dynamique tel qu'en reproduisant les mêmes cycles des étapes (ii) à (iv) décrits ci- dessus pour l'application dudit partenaire PI de liaison, ce qui constitue un autre mode de réalisation.
Le procédé d'application du partenaire PI de liaison peut être mis en œuvre de façon non enchaînée dans le temps par rapport au procédé d'application du partenaire P2 de liaison, c'est-à-dire qu'il y a une attente d'au moins 5 min entre les deux procédés, ou bien il peut être mis en œuvre juste après le procédé d'application du partenaire P2 de liaison. De préférence, ils seront mis en œuvre avec le même instrument ou bien avec deux instruments de la même gamme.
Les différents récipients utilisés dans le procédé d'application des partenaires de liaison peuvent être séparés physiquement, manipulables les uns par rapport aux autres, comme par exemple des flacons qui sont placés dans un carroussel d'un instrument. Ou bien les récipients peuvent être solidaires, comme par exemple sous forme de puits dans une barrette, telle que la barrette VIDAS® (bioMérieux) représentée sur la Figure 4 (barrette 6). Selon un mode de réalisation, le récipient RI, le récipient RL1, et le cas échéant le récipient R2 et/ou le récipient RL2 sont contenus dans la même barrette d'analyse, laquelle est constituée de plusieurs récipients.
Comme la barrette d'analyse ou l'instrument incorporant les différents récipients sont destinés à la détection ou quantification in vitro d'un analyte, ils peuvent également comprendre d'autres récipients contenant d'autres composants nécessaires à la détection ou quantification dudit analyte. Les composants nécessaires à la détection ou quantification dudit analyte sont connus de l'homme du métier et seront décrits ci- après dans le cadre de la détection ou quantification de Γ analyte. A titre d'exemples de tels composants, on peut citer les partenaires de liaison marqués, également appelés conjugués, les solutions de lavage et les substrats de révélation. A titre d'exemples de récipients, on peut citer une barrette VIDAS® comportant tous les réactifs (pour le coating et la détection ou quantification), ou bien deux barrettes VIDAS®, une pour le coating et Γ autres pour la détection ou quantification.
La détection ou quantification in vitro d'un analyte susceptible d'être contenu dans un échantillon de test peut être mis en œuvre par tout procédé in vitro connu de l'homme du métier mettant en œuvre au moins un partenaire PI de liaison à l'analyte. Il comprend des étapes de mise en contact de l'échantillon de test avec le support solide revêtu du partenaire PI de liaison et de révélation de la liaison, si l'analyte est présent, dudit analyte et dudit au moins un partenaire PI de liaison.
Le procédé d'application du partenaire PI de liaison a été décrit précédemment. Le support peut également comprendre un partenaire P2 de liaison, appliqué également comme décrit précédemment.
L'analyte et l'échantillon de test susceptible de le contenir sont également tels que décrit précédemment. Selon un mode de réalisation, l'échantillon de test est un échantillon d'origine biologique, chimique, alimentaire ou environnemental.
La détection ou quantification d'analyte peut être mise en œuvre par toute méthode d'analyse connue de l'homme du métier telle que des méthodes d'immunoessai. Ces méthodes dites de dosage immuno-enzymatique ou EIA pour « enzyme linked immunoassay » sont couplées à une réaction catalysée par une enzyme en utilisant un substrat enzymatique. Selon le substrat enzymatique choisi, on peut avoir un signal colorimétrique (ELISA pour Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) (Rassasie, M.J., et al, 1992), un signal de fluorescence (technologie ELFA pour Enzyme Linked Fluorescent Assay) ou un signal chemiluminescent (CLIA pour Chemiluminescence Immuno Assays) (Stabler T.V., et al, 1991).
Ces méthodes sont basées sur des mesures permettant de quantifier les signaux émis au cours de l'analyse de l'échantillon de test. La quantité de signaux détectée est généralement proportionnelle à la quantité d'analyte à mesurer (par exemple lors d'un essai en sandwich) ou inversement proportionnelle à la quantité d'analyte à mesurer (par exemple essai en compétition).
Des étapes classiques de procédé de détection et/ou quantification in vitro d'un analyte par immunoessai de type sandwich, dans un échantillon de test susceptible de contenir ledit analyte, comprennent ou consistent en :
- la mise en présence du support solide à l'intérieur duquel est appliqué ledit au moins un partenaire PI de liaison et dudit échantillon pour la fixation de l'analyte sur le partenaire PI,
- l'ajout d'un partenaire de détection, lequel est couplé directement ou indirectement à un marqueur, telle qu'une enzyme capable de lyser un substrat enzymatique, par exemple f uorogène pour une détection ELFA, pour sa fixation sur le complexe partenaire PI de liaison-analyte,
- lorsque le marqueur est une enzyme, la mise en présence d'un substrat enzymatique et du complexe partenaire PI de liaison-analyte-partenaire de détection couplé à une enzyme pour la formation d'un milieu réactionnel, et
- la détection, par exemple par immuno fluorescence dans le cadre d'une détection ELFA, de la présence et/ou la quantité d'analyte en mesurant le signal (par exemple fluorescence) émis dans le milieu réactionnel.
Par partenaire de détection, on entend tout partenaire capable de se lier à l'analyte à détecter ou quantifier, lequel sera couplé directement ou indirectement à un marqueur, par exemple une enzyme. Il peut être de même nature que le partenaire PI de liaison ou de nature différente. Des exemples sont donnés précédemment avec le partenaire PI de liaison.
Par couplage direct ou indirect du marqueur sur le partenaire de détection, on entend que le marqueur est fixé directement sur le partenaire de détection reconnaissant l'analyte (couplage direct) ou bien l'enzyme est couplé à un partenaire de liaison qui reconnaît le partenaire de détection qui reconnaît lui-même l'analyte (couplage indirect).
Ainsi, dans le cadre du couplage direct, le complexe formé à la fin du dosage, appelé conjugué, sera constitué de : « Partenaire de capture/analyte/partenaire de détection couplé au marqueur ».
Dans le cadre du couplage indirect, le complexe formé à la fin du dosage sera constitué de : « Partenaire de capture/analyte/partenaire de détection/partenaire de liaison couplé au marqueur ».
Dans le cadre de ce dernier mode de réalisation, le partenaire de liaison est bien connu de l'homme du métier et peut être par exemple un anticorps anti-IgG (Immunoglobuline) lorsque le partenaire de détection est une IgG reconnaissant l'analyte d'intérêt.
Par marqueur, on entend, notamment, toute molécule contenant un groupement réactif avec un groupement du partenaire de détection, directement sans modification chimique, ou après modification chimique pour inclure un tel groupement, laquelle molécule est capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. Une liste non limitative de ces marqueurs de détection directe consiste en :
les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la β-galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase,
les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants, les molécules radioactives comme le 32P, le 35S ou le 1251,
les molécules fluorescentes telles que les Alexa ou les phycocyanines, et · les sels électrochimiluminescents tels que des dérivés organo -métalliques à base d'acridinium ou de ruthénium. Selon un mode de réalisation particulier, le partenaire PI de liaison utilisé dans le procédé de détection ou quantification est un partenaire d'immunoessai et la révélation de la liaison dudit analyte est mise en œuvre par un test sandwich utilisant un autre partenaire de liaison à l'analyte, appelé partenaire de détection, de nature différente ou non, lequel est marqué par un marqueur.
Des étapes classiques de procédé de détection et/ou quantification in vitro d'un analyte par immunoessai de type compétition, dans un échantillon de test susceptible de contenir ledit analyte, comprennent :
- la mise en présence du support solide à l'intérieur duquel est appliqué ledit au moins un partenaire PI de liaison, d'un analogue à l'analyte couplé à un marqueur, par exemple une enzyme capable de lyser un substrat enzymatique, par exemple fluorogène, et dudit échantillon, lesquels entrent en compétition pour la fixation sur le partenaire PI de liaison,
- lorsque le marqueur est une enzyme, la mise en présence d'un substrat enzymatique, des complexes partenaire PI de liaison-analyte et partenaire PI de liaison-analogue à l'analyte pour la formation d'un milieu réactionnel, et
- la détection, par exemple par immuno fluorescence, de la présence et/ou quantité d' analyte en mesurant le signal, par exemple la fluorescence, émis dans le milieu réactionnel.
Par analogue à l'analyte, on entend toute molécule qui présente les mêmes capacités de liaison au partenaire PI de liaison que l'analyte.
Le marqueur couplé à l'analogue à l'analyte est équivalent au marqueur utile dans le cadre d'un test sandwich.
Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le partenaire PI de liaison utilisé dans le procédé de détection ou quantification est un partenaire d'immunoessai et la révélation de la liaison ou non dudit analyte est mise en œuvre par un test en compétition utilisant un composé marqué entrant en compétition avec l'analyte à détecter ou quantifier, autrement appelé analogue à l'analyte marqué.
Quel que soit le type de méthode utilisée, en sandwich ou en compétition, l'enzyme est un marqueur largement approprié et on peut citer notamment comme exemple la sulfatase, la phosphatase alcaline (PAL), la phosphatase acide, la glucose oxydase (GOx), la glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PD) et la β-galactosidase (β-gal). Les substrats enzymatiques correspondants sont largement connus de l'homme du métier et comprennent par exemple le 4-méthylombelliferyl phosphate ou le 5- bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside.
Selon un mode de réalisation particulier, dans le procédé de détection ou quantification selon l'invention, la révélation de l'analyte est mise en œuvre en utilisant une enzyme et un substrat enzymatique catalysé par ladite enzyme, de préférence la phosphatase alcaline et le 4-méthylombelliferyl phosphate.
Le procédé de détection ou quantification de l'analyte peut également comprendre une ou plusieurs étapes supplémentaires de lavage après chaque étape, comme par exemple :
- avant l'ajout du partenaire de détection, une étape de lavage de façon à éliminer l'analyte non lié au complexe partenaire PI de liaison-analyte ; et
- après l'ajout du partenaire de détection, une étape de lavage de façon à éliminer le partenaire de détection non lié.
Les étapes de lavage sont des étapes connues de l'homme du métier. Elles sont mises en œuvre avec des tampons compatibles avec le milieu réactionnel et la lecture du signal.
Le procédé de détection ou quantification d'un analyte peut être mis en œuvre à n'importe quel moment après la mise en œuvre du procédé d'application du partenaire PI de liaison à la surface interne du support solide, et le cas échéant du partenaire de liaison P2. Il peut être mis en œuvre un ou plusieurs jours après l'application du partenaire PI de liaison et le cas échéant du partenaire P2 de liaison, voire 1 ou plusieurs semaines plus tard. Dans ce cas, le support solide doit être séché et puis stocké dans un sachet dessicant pour éviter tout problème de stabilité. De façon avantageuse, les étapes de mise en contact de l'échantillon de test avec le support solide et de révélation de la liaison, si l'analyte est présent, dudit analyte et dudit au moins un partenaire PI de liaison du procédé de détection ou quantification de l'invention sont mises en œuvre juste après le procédé d'application d'au moins un partenaire de liaison PI dans ledit support solide tel que défini précédemment. Par « juste après », on entend que le procédé de détection ou quantification est mis en œuvre dans les minutes, voire les secondes qui suivent le procédé d'application du partenaire PI de liaison. Il n'y a pas plus de 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 min entre la dernière étape du procédé d'application du partenaire PI de liaison et la première étape du procédé de détection ou quantification d'analyte. Ce petit temps peut être utile pour introduire l'échantillon de test et/ou les récipients qui seront utilisés pour la détection ou quantification. Autrement dit, le procédé d'application d'au moins un partenaire PI de liaison, voire au préalable d'au moins un partenaire P2, et le procédé de détection ou quantification sont mis en œuvre de façon successive.
Afin de faciliter l'organisation de l'utilisateur, de maîtriser les coûts et l'espace du laboratoire, le procédé de détection ou quantification de l'analyte est mis en œuvre avec le même instrument ou le même type d'instrument que celui utilisé pour l'application du partenaire PI de liaison, voire du partenaire P2 de liaison, voire des différents procédés de lavage. Aussi, les étapes de mise en contact de l'échantillon de test avec le support solide sur lequel est appliqué ledit au moins partenaire PI de liaison, et de révélation de la liaison dudit analyte et dudit au moins partenaire PI de liaison, comprennent ou consistent en les étapes suivantes consistant à :
(1) aspirer dans ledit support solide, par une de ses extrémités, ledit échantillon contenu dans un récipient, appelé récipient RE, laisser en contact et refouler ledit échantillon dans un récipient, lequel est ou non ledit récipient RE,
(2) aspirer dans ledit support solide, par la même extrémité, une solution comprenant un composé conjugué à un marqueur, tel qu'un autre partenaire de liaison à l'analyte ou un composé entrant en compétition avec l'analyte, appelée solution de conjugué SC, ladite solution de conjugué C étant contenue dans un récipient appelé récipient RC, laisser en contact et refouler ladite solution de conjugué SC dans un récipient, lequel est ou non ledit récipient RC,
(3) si le marqueur utilise un substrat de révélation, aspirer dans ledit support solide, par la même extrémité, une solution comprenant un substrat de révélation avec lequel le marqueur va réagir, appelée solution de substrat SS, ladite solution de substrat SS étant contenue dans un récipient appelé récipient RS, laisser en contact et refouler ladite solution de substrat dans un récipient, lequel est ou non ledit récipient RS, et
(4) mesurer le signal émis. Si nécessaire, ces étapes sont précédées d'une étape de connexion du support solide à un dispositif d'aspiration-refoulement tel qu'un bloc pompe.
Les étapes (1) et (2) d'aspiration et refoulement peuvent être mises en œuvre comme décrit précédemment.
Les différents composants utilisés, par exemple les partenaires PI de liaison, les partenaires de détection, les marqueurs, etc. sont tels que décrits précédemment.
Les différents récipients RE, RC et RS utilisés sont tels que décrits précédemment et peuvent être par exemple séparés ou contenus dans la même barrette d'analyse, ce qui constitue un mode de réalisation particulier.
La dernière étape (4) consiste à mesurer le signal émis. Cette étape est bien connue de l'homme du métier. Cette mesure peut être transformée en grandeur représentative par l'utilisateur telle que la concentration en analyte en utilisant une courbe étalon, également appelée courbe de calibration, dont l'obtention est largement connue de l'homme du métier et peut être obtenue i) en mesurant le signal généré par des étalons, également appelés standards ou encore calibrateurs, puis ii) en traçant la courbe donnant le signal en fonction de la quantité ou de la concentration. Très souvent, il est d'usage de trouver un modèle mathématique qui représente, de la manière la plus fidèle possible, cette relation entre le signal et la quantité ou la concentration, afin de pouvoir calculer facilement les résultats d'un immunoessai quantitatif.
Outre les étapes (1) à (4), le procédé peut également inclure des étapes de lavage, comme décrit précédemment.
L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants qui sont donnés à titre illustratif et non limitatif.
EXEMPLES
Exemple 1 : Application d'un anticorps anti-TSH dans un cône et détection de la TSH
L'hormone thyréotrope ou hormone thyréostimulante (TSH) est une hormone sécrétée par les cellules thyréotropes de l'hypophyse antérieure. Cette hormone constitue le principal facteur de stimulation de la glande thyroïde déterminant la production des hormones thyroïdiennes T3 et T4. En retour, ces hormones thyroïdiennes exercent un rétrocontrôle sur l'antéhypophyse freinant la sécrétion de TSH. La sécrétion de TSH est de plus, sous le contrôle du système nerveux central par l'intermédiaire d'un neuropeptide hypothalamique, la TRH, et de neuromédiateurs comme la somatostatine ou la dopamine. Le dosage sanguin de la TSH est une aide au diagnostic des désordres thyroïdiens ou hypophysaires.
1.1.Application d'un anticorps anti-TSH dans un cône VIDAS® selon l'invention
Des cônes VIDAS® sont sensibilisés avec 300 μΐ d'une solution d'anticorps monoclonal de souris anti-TSH (bioMérieux référence 30400) à 2,5 ou 5 μg/mL dans un tampon Tris HCl pH 7,3 (solution de sensibilisation) contenus dans l'un des puits d'une barrette VIDAS®, en utilisant l'instrument VIDAS®, comme suit :
Protocole 5 min :
- aspiration à ΙΟΟμΙ/s de la solution de sensibilisation
- incubation 10 secondes
- refoulement de la solution.
Ce cycle est répété 20 fois.
Protocole 10 min :
- aspiration à ΙΟΟμΙ/s de la solution de sensibilisation
- incubation 18 secondes
- refoulement de la solution.
Ce cycle est répété 25 fois.
Protocole 15 min :
- aspiration à ΙΟΟμΙ/s de la solution de sensibilisation
- incubation 20 secondes
- refoulement de la solution.
Ce cycle est répété 35 fois.
Les cônes vidés sont prêts pour être utilisés extemporanément pour le dosage de TSH dans un échantillon biologique. 1.2.Application d'un anticorps anti-TSH dans un cône VIDAS® selon l'art antérieur
A des fins de comparaison, les cônes du VIDAS® ont été sensibilisés en statique comme suit :
Les cônes sont sensibilisés avec 300 μΐ de la même solution d'anticorps monoclonal de souris anti-TSH à ceci près que la concentration en anticorps est de 6 μg/mL. Après environ 20 h à température ambiante (18-25°C) avec la solution de sensibilisation, les cônes sont vidés. Ensuite, 330 μΐ d'une solution de saturation contenant notamment des protéines animales sont ajoutés pour la passivation des cônes pendant environ 6h. Les cônes sont ensuite vidés, séchés puis conservés à 4°C jusqu'à utilisation, à l'abri de l'humidité.
1.3.Dosage de la TSH dans un échantillon
Les cônes revêtus des anticorps anti-TSH selon les points 1.1. et 1.2. ci-dessus sont mis en œuvre avec des barrettes du kit VIDAS® TSH (bioMérieux ref 30400), lesquelles comprennent les autres réactifs de la réaction immunologique.
Toutes les étapes du dosage sont effectuées automatiquement par l'instrument VIDAS® selon un mode opératoire classique de cet instrument.
L'échantillon contenu dans le puits échantillon (200 μΐ) de la barrette est prélevé, puis transféré dans le puits contenant l'anticorps anti-TSH marqué à la phosphatase alcaline (conjugué). Le mélange échantillon/conjugué est aspiré puis refoulé successivement par le cône pendant environ 16 minutes. Cette opération permet à l'antigène de se lier d'une part aux immunoglobulines fixées sur le cône et d'autre part au conjugué formant ainsi un "sandwich".
Trois étapes de lavage successives de 3 cycles de 5 secondes, mises en œuvre par l'instrument en utilisant la solution de lavage contenue dans la barrette du kit VIDAS TSH éliminent les composés non fixés.
Lors de l'étape finale de révélation, le substrat (4-Méthylombelliferyl phosphate) contenu dans un puits de la barrette est aspiré dans le cône puis refoulé dans le puits de révélation ; l'enzyme du conjugué catalyse la réaction d'hydrolyse de ce substrat en un produit (4-Méthylombelliferone) dont la fluorescence émise est mesurée à 450 nm dans le puits de révélation. La valeur du signal de fluorescence (RFV=relative fluorescence value) est proportionnelle à la concentration de l'antigène présent dans l'échantillon.
Deux types d'échantillon de sérum humain contenant de la TSH ont été utilisés pour chaque condition de concentration et chaque durée de protocole, à savoir un échantillon 1 contenant une concentration normale de TSH (3 μυΐ/mL de TSH ) et un échantillon 2 contenant une concentration élevée de TSH, correspondant à une hypothyroïdie, (40 μυΐ/mL de TSH).
Les résultats sont donnés sur la Figure 5 qui est une représentation de type histogramme des valeurs de Relative Fluorescence Value (RFV) pour les deux types d'échantillon 1 et 2 lors de la détection de la TSH avec l'instrument VIDAS®, en fonction des différentes conditions d'application du partenaire de liaison (en dynamique avec une concentration en partenaire de liaison et un temps de contact qui varient - 2,5 μg/mL pendant 5, 10 ou 15 min ou bien 5 μg/mL pendant 5, 10 ou 15 min, ou en statique avec une concentration à 6 μg/mL pendant 20 h).
La Figure 5 montre que le signal RFV obtenu pour des concentrations de sensibilisation de 2,5 μg/mL et 5 μg/mL en dynamique est tout à fait comparable, quelle que soit la durée du sensibilisation. Dès 5 min de coating dynamique, le signal RFV pour l'échantillon 1 est d'environ 500 RFV. L'échantillon 2 rend des RFV supérieurs à 3500. Toutes les conditions d'application dynamique de l'anticorps anti- TSH utilisées selon l'invention présentent une excellente dynamique du signal, équivalente à la condition référence obtenue en plusieurs jours selon un procédé d'incubation statique.
Exemple 2 : Application d'un antigène Tg dans un cône et détection des anticorps anti-Tg
La thyroglobuline (Tg) est une glycoprotéine. produite dans la glande thyroïde et constitue le composant principal de la colloïde folliculaire. Son rôle principal est le stockage et la synthèse des hormones thyroïdiennes. Des auto-anticorps anti- thyroglobuline sont souvent présents chez les patients atteints de maladies thyroïdiennes auto-immunes. Ainsi ils sont détectés chez 30 % des patients atteints de la maladie de Graves (Basedow) et chez 85 % des patients atteints de la maladie d'Hashimoto (2). Les anticorps anti-Tg sont associés à des cas d'hypothyroïdie ou d'hyperthyroïdie légère et sont fréquemment présents chez des patients atteints d'autres maladies autoimmunes telles que l'arthrite rhumatoïde, l'anémie pernicieuse et le diabète de type I (3, 4).
2.1.Application d'un antigène Tg dans un cône VIDAS® selon l'invention
Des cônes VIDAS® sont sensibilisés avec 300 μΐ d'une solution d'antigène Tg natif (bioMérieux référence 30462) à 7 μg/mL dans un tampon phosphate (solution de sensibilisation) contenus dans l'un des puits d'une barrette VIDAS®, en utilisant l'instrument VIDAS®, comme suit :
Protocole 5 min :
- aspiration à ΙΟΟμΙ/s de la solution de sensibilisation
- incubation 10 secondes
- refoulement de la solution.
Ce cycle est répété 20 fois.
Protocole 15 min :
- aspiration à ΙΟΟμΙ/s de la solution de sensibilisation
- incubation 20 secondes
- refoulement de la solution.
Ce cycle est répété 35 fois.
Protocole 30 min :
- aspiration à ΙΟΟμΙ/s de la solution de sensibilisation
- incubation 30 secondes
- refoulement de la solution.
Ce cycle est répété 50 fois.
Les cônes vidés sont prêts pour être utilisés extemporanément pour le dosage des anticorps anti-Tg dans un échantillon biologique. 2.2. Application d'un antigène Tg dans un cône VIDAS® selon l'art antérieur
A des fins comparatifs, les cônes du VIDAS® ont été sensibilisés en statique comme suit :
Les cônes sont sensibilisés avec 300 μΐ de la même solution d'antigène Tg natif. Après environ 6h à température ambiante (18-25°C) avec la solution de sensibilisation, les cônes ont été vidés. Ensuite, 330 μΐ d'une solution de saturation contenant notamment des protéines animales sont ajoutés pour la passivation des cônes pendant environ 6h. Les cônes sont ensuite vidés, séchés puis conservés à 4°C jusqu'à utilisation, à l'abri de l'humidité.
2.3. Dosage des anticorps anti-Tg dans un échantillon
Les cônes ainsi revêtus de l'antigène Tg selon les points 2.1. et 2.2. ci-dessus sont utilisés avec des barrettes du kit VIDAS anti-TG (ref 30462).
L'échantillon (100 μΐ) est prélevé par l'instrument du puits échantillon de la barrette, puis transféré dans le puits contenant un diluant échantillon. L'échantillon dilué est aspiré puis refoulé pendant environ 3 min. Cette étape permet aux anticorps anti-Tg présents dans l'échantillon de se lier à l'antigène fixé sur le cône. Les composants non liés du sérum sont éliminés par 3 lavages dans des puits de la barrette VIDAS anti-Tg, pendant environ 3 min. Une étape d'incubation avec le conjugué de révélation est réalisée pendant 6 min environ, en respectant des cycles d'aspiration / refoulement de 30*8sec. Le conjugué se fixe spécifiquement sur les anticorps anti-Tg de l'échantillon préalablement fixés. Un cycle de lavage identique au précédent permet d'éliminer l'excès de conjugué non fixé avant la révélation.
Lors de l'étape finale de révélation, le substrat (4-Méthylombelliferyl phosphate) contenue dans un puits de la barrette est aspiré dans le cône puis refoulé dans le puits de révélation; l'enzyme du conjugué catalyse la réaction d'hydrolyse de ce substrat en un produit (4-Méthylombelliferone) dont la fluorescence émise est mesurée à 450 nm dans le puits de révélation. La valeur du signal de fluorescence (RFV=relative fluorescence value) est proportionnelle à la concentration de l'antigène présent dans l'échantillon. Les échantillons dosés sont des échantillons de sérum humain naturel ayant une concentration correspondant à 60 UI/mL (échantillon faible) et 1000 UI/mL (échantillon fort). L'échantillon blanc est un mélange d'échantillons négatifs.
Les résultats sont donnés sur la Figure 6 qui est une représentation de type histogramme des valeurs de Relative Fluorescence Value (RFV) pour les trois types d'échantillon (blanc, faible et fort - Figure 6A) ou uniquement pour l'échantillon blanc (représentation des histogrammes de la Figure 6 A dont l'échelle est agrandie - Figure 6B) lors de la détection d'anticorps anti-Tg avec l'instrument VIDAS®, en fonction des différentes conditions d'application du partenaire de liaison (en dynamique pendant 5, 15 ou 30 min, ou bien en statique pendant environ 6 h).
La Figure 6 A montre que les conditions d'application dynamique de fixation de l'antigène Tg sur le support selon le procédé de l'invention donnent des signaux équivalents voire meilleurs que ceux obtenus avec la condition référence statique. Le signal obtenu sur les échantillons de sérum humain faibles et forts est satisfaisant dès 5 minutes de durée d'adsorption dynamique. Il est à son maximum pour le protocole de 30 minutes, permettant d'obtenir un signal plus élevé que la référence avec l'échantillon fort.
Le signal de l'échantillon blanc permet d'évaluer le signal non spécifique. Le signal pour cet échantillon doit être au plus faible. Comme montré sur la Figure 6B, avec les conditions d'application dynamique, ce signal non spécifique est plus faible (inférieur à 20 RFV) que pour la référence en statique pour lequel le signal est de 25 RFV.
Les conditions d'application de l'antigène Tg sur le support selon l'invention conduisent à un immunodosage équivalent, voire meilleur que la condition référence.
Exemple 3 : Application de plusieurs partenaires de liaison pour former un complexe BSA biotinylée / Streptavidine / Anticorps anti-cTni biotinylé et détection de la TNI
La troponine est un complexe de protéines qui sensibilise les cellules musculaires au calcium responsable de l'inhibition de la liaison entre la myosine et l'actine (en masquant le site de l'actine qui sert à la liaison avec la myosine). Elle a donc une fonction inhibitrice qui a pour effet d'amorcer la décontraction musculaire, .protéine utilisée. La Troponine I (Tnl) en constitue une sous-unité. Son dosage est largement utilisé comme outil d'aide au diagnostic de l'infarctus du myocarde (IDM) et à la stratification du risque à 30 jours relatif à la mortalité toutes causes confondues et aux événements cardiaques indésirables majeurs (MACE) comprenant l'infarctus du myocarde et la revascularisation chez les patients présentant des symptômes évoquant un syndrome coronarien aigu (SCA).
3.1. Sensibilisation dynamique des cônes avec de la BSA biotinylée puis de la Streptavidine pour la fixation d'anticorps spécifiques anti-cTni biotinylés
Des cônes VIDAS® sont sensibilisés avec 300 d'une solution de BSA biotinylée (bioMérieux référence 30448) à 1 μg/mL dans un tampon carbonate contenus dans l'un des puits d'une barrette VIDAS®. Les cycles adressés par le VIDAS® et répétés 50 fois sont :
aspiration à 100 μΕ/s de la solution de BSA biotinylée,
incubation 20 s puis
refoulement de la solution.
Ensuite, ces même cônes sont incubés avec 300 μΐ, d'une solution de streptavidine (bioMérieux référence 30448) à 5μg/mL diluée en tampon PBS pendant 50 cycles de 20 secondes (aspiration, incubation de 20 s et refoulement).
Les cônes sont ensuite sensibilisés avec un mélange d'anticorps anti-cTni biotinylés (bioMérieux référence 30448) à 2 μg/mL et 3 μg/mL respectivement, sur 300 μΐ. L'incubation est de 50 fois 20 secondes.
Après chacune de ces 3 étapes d'incubation, les cônes sont lavés 2 fois successivement sur 300 μΐ, pendant 8 fois 1 seconde dans des puits contenant une solution de lavage dans la cartouche VIDAS. Les cônes vidés sont prêts pour être utilisés extemporanément pour le dosage de la Tnl dans un échantillon biologique. 3.2. Application de la BSA biotinylée puis de la Streptavidine pour la fixation d'anticorps spécifiques anti-cTni biotinylés dans un cône VIDAS® selon l'art antérieur
A des fins comparatifs, les cônes du VIDAS® ont été sensibilisés en statique comme suit :
Les cônes sont sensibilisés avec 300 μΐ de la même solution de BSA biotinylée pendant environ 20 h à température ambiante (18-25°C). Les cônes sont ensuite vidés puis rempli avec 300 μΐ d'une solution de streptavidine pendant environ 20 h à température ambiante (18-25°C). Après vidage des cônes, l'étape de sensibilisation sur environ 300 avec le mélange d'anticorps anti-cTni biotinylés aux mêmes concentration qu'au point 3.1. se poursuit pendant environ 20 h. Les cônes sont ensuite vidés, séchés puis conservés à 4°C jusqu'à utilisation, à l'abri de l'humidité.
3.2. Dosage de la cTnl
Toutes les étapes du test sont réalisées automatiquement par l'instrument selon un mode opératoire classique de l'instrument. Elles sont constituées d'une succession de cycles d'aspiration/refoulement du milieu réactionnel. L'échantillon (200 μί) est prélevé puis transféré dans le puits contenant les anticorps anti-troponine cardiaque marqués à la phosphatase alcaline (conjugué). Le mélange échantillon/conjugué est aspiré puis refoulé successivement par le cône pendant environ 10 minutes (50 * 8 s). Cette opération permet à l'antigène de se lier d'une part aux immunoglobulines fixées sur le cône et d'autre part au conjugué formant ainsi un "sandwich".
Trois étapes de lavage successives de 3 cycles de 2 secondes éliminent les composés non fixés.
Deux étapes de révélation sont ensuite effectuées successivement. A chaque étape, le substrat (4-Méthylombelliferyl phosphate) est aspiré puis refoulé dans le cône ; l'enzyme du conjugué catalyse la réaction d'hydrolyse de ce substrat en un produit (4-Méthylombelliferone) dont la fluorescence émise est mesurée à 450 nm. La valeur du signal de fluorescence est proportionnelle à la concentration de l'antigène présent dans l'échantillon.
A la fin du test, les résultats sont calculés automatiquement par l'instrument par rapport à deux courbes de calibration mémorisées correspondant aux deux étapes de révélation. Un signal seuil gère le choix de la courbe de calibration à utiliser pour chaque échantillon. Puis les résultats sont imprimés.
Les échantillons dosés sont des sérums humains de concentration de Tni allant de 0,001 μg/L à 14,03 μg/L (échantillons 1 à 11).
Les résultats de signal RFV en fonction de la concentration de la Tni sont donnés sur la Figure 7 (Figure 7A : échantillons 1 à 6 et Figure 7B : échantillons 7 à 11) qui montre que le signal est équivalent entre les 2 types de coating, quelle que soit la concentration de l'échantillon testé. L'application du complexe BSA biotiniyée/streptavidine et anticorps biotinylé selon l'invention permet d'obtenir un immunodosage performant, selon un procédé beaucoup plus rapide qu'avec l'art antérieur.
Exemple 4 : Variation des concentrations de partenaire de liaison dans la solution de sensibilisation
4.1. Application d'un anticorps anti-TSH dans un cône VIDAS® selon l'invention
Des cônes VIDAS® sont sensibilisés avec 300 μΐ d'une solution d'anticorps monoclonal de souris anti-TSH à 4 μg/mL dans un tampon Tris HCl pH 7,3 (solution de sensibilisation) contenus dans l'un des puits d'une barrette VIDAS®, en utilisant l'instrument VIDAS®, comme suit :
Protocole 60 min :
- aspiration à ΙΟΟμΙ/s de la solution de sensibilisation
- incubation 20 secondes
- refoulement de la solution.
Ce cycle est répété 139 fois.
Les cônes vidés sont prêts pour être utilisés extemporanément pour le dosage de la TSH dans des échantillons biologiques. 4.2. Application d'un anticorps anti-TSH dans un cône VIDAS® selon l'art antérieur
A des fins comparatifs, les cônes du VIDAS® sont sensibilisés selon l'art antérieur comme suit :
Les cônes sont sensibilisés avec 300 μΐ d'une solution d'anticorps monoclonal de souris anti-TSH (bioMérieux référence 30400) à 6 μg/mL dans un tampon Tris HC1 pH 7.3. Après environ 20 h à température ambiante (18-25°C) avec la solution de sensibilisation, les cônes sont vidés. Ensuite, 330 μΐ de cette même solution contenant notamment des protéines animales sont ajoutés pour la passivation des cônes pendant environ 6h. Les cônes sont ensuite vidés, séchés puis conservés à 4°C jusqu'à utilisation, à l'abri de l'humidité.
4.3. Dosage de la TSH
Le dosage de la TSH est mise en œuvre comme décrit dans l'exemple 1. Les échantillons dosés (SCI 3, SCI 4, SCI 5, SCI 6 et SCI 7) sont des sérums humains ayant des concentrations croissantes en TSH.
Le résultat de ces dosages sont donnés sur la Figure 8 qui est une représentation de type histogramme donnant le signal RFV pour chaque échantillon en utilisant soit un cône revêtu d'un anticorps anti-TSH selon l'invention (coating dynamique à 4 μg/mL), soit un cône revêtu d'un anticorps anti-TSH selon l'art antérieur (coating statique à 6 μg/mL).
La figure 8 met en évidence que les signaux obtenus entre les 2 fabrications de cônes (selon l'invention et selon l'art antérieur) sont très comparables, alors que la fabrication de l'invention utilise 1/3 de moins d'anticorps anti-TSH dans la solution de sensibilisation (4 μg/mL contre 6 μg/mL) et permet une production de ces cônes pour l'utilisation en immunodosage en lh contre 2 étapes de plus de 6h chacune selon l'art antérieur. Toutes les autres conditions expérimentales étant identiques, l'application des anticorps anti-TSH selon l'invention permet de réaliser une économie non négligeable de matières premières et de temps. Références Bibliographiques
Boersma YL et Plûtckthun A, 2011, Curr. Opin. Biotechnol, 22 Ellington AD et Szostak JW., 1990, Nature, 346 : 818-822 Rassasie M.J. et al, 1992, Steroids, 57: 112
Stabler T.V., ét al, 1991, Clin. Chem., 37(11): 1987

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'application, dans un support solide (1) en forme de tube, évasé ou non, présentant une ouverture circulaire ou ellipsoïdale à chaque extrémité, tel qu'un cône ou une pipette, d'au moins un partenaire PI de liaison à un analyte à détecter ou à quantifier dans un échantillon de test, comprenant les étapes suivantes :
(i) connecter le support solide à un dispositif d'aspiration-refoulement (2, 3),
(ii) aspirer dans le support solide, par l'une de ses extrémités, une solution comprenant ledit au moins un partenaire PI de liaison, dite solution de sensibilisation SI, contenue dans un récipient (4, 7, 8, 9), appelé récipient RI,
(iii) poursuivre le contact entre la solution de sensibilisation SI et la surface interne du support solide pendant un temps compris entre 0 s et 11 min,
(iv) refouler la solution de sensibilisation SI dans un récipient (4, 7, 8, 9), lequel est ou non ledit récipient RI,
les étapes (ii) à (iv) formant un cycle pouvant être répété au moins 1 fois, sur une durée totale d'au moins 1 min et d'au plus 2h30.
2. Procédé d'application selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le temps de contact de l'étape (iii) entre la solution de sensibilisation SI et la surface interne du support solide est compris entre 2s et 1min, de préférence entre 5 s et 20 s, de préférence encore entre 6s et 15 s.
3. Procédé d'application selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que les étapes (ii) à (iv) sont répétées de 10 à 100 fois, de préférence de 30 à 80 fois.
4. Procédé d'application selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le total des cycles répétés est compris entre 10 et 20 min et est de préférence de 15 min.
5. Procédé d'application selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend également les étapes suivantes, mises en œuvre lorsque les cycles d'aspiration (ii)/contact (iii)/refoulement (iv) sont terminés :
(v) aspirer dans le support solide dans lequel sont appliqués lesdits au moins un partenaire de liaison PI, une solution de lavage Ll contenue dans un récipient appelé récipient RL1,
(vi) poursuivre le contact entre la solution de lavage Ll et la surface interne du support solide pendant un temps compris entre 0 s et 11 min,
(vii) refouler la solution de lavage Ll dans un récipient, lequel est ou non ledit récipient RL1,
les étapes (v) à (vii) formant un cycle pouvant être répété au moins 1 fois, sur une durée totale d'au moins 1 min et d'au plus 2h30.
6. Procédé d'application selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la solution de sensibilisation SI contient également au moins un partenaire P2 de liaison au partenaire PI de liaison à Panalyte.
7. Procédé d'application, dans un support solide (1) en forme de tube, évasé ou non, présentant une ouverture circulaire ou ellipsoïdale à chaque extrémité, tel qu'un cône ou une pipette, d'au moins un partenaire P2 de liaison à un partenaire PI de liaison à un analyte à détecter ou quantifier dans un échantillon de test, comprenant les étapes suivantes :
(a) connecter le support solide à un dispositif d'aspiration-refoulement (2, 3),
(b) aspirer dans le support solide, par l'une de ses extrémités, une solution comprenant ledit au moins un partenaire P2 de liaison, dite solution de sensibilisation S2, contenue dans un récipient (4, 7, 8, 9), appelé récipient R2,
(c) poursuivre le contact entre la solution de sensibilisation S2 et la surface interne du support solide pendant un temps compris entre 0 s et 11 min,
(d) refouler la solution de sensibilisation S2 dans un récipient (4, 7, 8, 9), lequel est ou non ledit récipient R2,
les étapes (b) à (d) formant un cycle pouvant être répété au moins 1 fois, sur une durée totale d'au moins 1 min et d'au plus 2h30.
8. Procédé d'application selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend également les étapes suivantes, mises en œuvre lorsque les cycles d'aspiration
(b) /contact (c)/refoulement (d) sont terminés :
(e) aspirer dans le support solide dans lequel sont appliqués lesdits au moins un partenaire de liaison P2, une solution de lavage L2 contenue dans un récipient appelé récipient RL2,
(f) poursuivre le contact entre la solution de lavage L2 et la surface interne du support solide pendant un temps compris entre 0 s et 11 min,
(g) refouler la solution de lavage L2 dans un récipient, lequel est ou non ledit récipient RL2,
les étapes (e) à (g) formant un cycle pouvant être répété au moins 1 fois, sur une durée totale d'au moins 1 min et d'au plus 2h30.
9. Procédé d'application selon la revendication 7 ou 8, comprenant également l'application, dans ledit support solide, après les cycles d'aspiration (b)/contact
(c) /refoulement (d), dudit au moins un partenaire PI de liaison.
10. Procédé d'application selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'application dudit au moins un partenaire PI de liaison est mise en œuvre selon un procédé d'application tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5.
11. Procédé d'application selon l'une quelconque des revendications 5 à 10, caractérisé en ce que le récipient RI, le récipient RL1, et le cas échéant le récipient R2 et/ou le récipient RL2 sont contenus dans la même barrette d'analyse (6), laquelle est constituée de plusieurs récipients (4, 7, 8, 9, 10, 11).
12. Procédé d'application selon la revendication 11, caractérisé en ce que la barrette d'analyse comprend également d'autres récipients contenant d'autres composants nécessaires à la détection ou quantification dudit analyte.
13. Procédé de détection ou quantification in vitro d'un analyte dans un échantillon de test susceptible de contenir le dit analyte, ledit procédé utilisant au moins un support solide (1) en forme de tube, évasé ou non, présentant une ouverture circulaire ou ellipsoïdale à chaque extrémité, tel qu'un cône ou une pipette, dans lequel est appliqué au moins un partenaire PI de liaison à un analyte à détecter ou quantifier dans l'échantillon de test selon un procédé d'application tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 6 et 9 à 12, lequel procédé de détection ou quantification comprend des étapes de mise en contact de l'échantillon de test avec le support solide et de révélation de la liaison, si Γ analyte est présent, dudit analyte et dudit au moins un partenaire PI de liaison.
14. Procédé de détection ou quantification selon la revendication 13, caractérisé en ce que le partenaire PI de liaison est un partenaire d'immunoessai et en ce que la révélation de la liaison dudit analyte est mise en œuvre par un test sandwich utilisant un autre partenaire de liaison à Γ analyte, de nature différente ou non, lequel est marqué.
15. Procédé de détection ou quantification selon la revendication 13, caractérisé en ce que le partenaire PI de liaison à l'analyte est un partenaire d'immunoessai et en ce que la révélation de la liaison ou non dudit analyte est mise en œuvre par un test en compétition utilisant un composé marqué entrant en compétition avec l'analyte à détecter ou quantifier.
16. Procédé de détection ou quantification selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que la révélation de l'analyte est mise en œuvre en utilisant une enzyme et un substrat enzymatique catalysé par ladite enzyme, de préférence la phosphatase alcaline et le 4-méthylombelliferyl phosphate.
17. Procédé de détection ou quantification selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisé en ce que les étapes de mise en contact de l'échantillon de test avec le support solide et de révélation de la liaison, si l'analyte est présent, dudit analyte et dudit au moins un partenaire PI de liaison sont mises en œuvre juste après le procédé d'application d'au moins un partenaire de liaison PI dans ledit support solide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 6 et 9 à 12.
18. Procédé de détection ou quantification selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisé en ce que les étapes de mise en contact de l'échantillon de test avec le support solide sur lequel est appliqué ledit au moins partenaire PI de liaison, et de révélation de la liaison dudit analyte et dudit au moins partenaire PI de liaison, comprennent les étapes suivantes consistant à :
(1) aspirer dans ledit support solide (1), par une de ses extrémités, ledit échantillon contenu dans un récipient (10), appelé récipient RE, laisser en contact et refouler ledit échantillon dans un récipient (10, 4, 7, 8, 9), lequel est ou non ledit récipient RE,
(2) aspirer dans ledit support solide, par la même extrémité, une solution comprenant un composé conjugué à un marqueur, tel qu'un autre partenaire de liaison à l'analyte ou un composé entrant en compétition avec l'analyte, appelée solution de conjugué SC, ladite solution de conjugué C étant contenue dans un récipient (4, 7, 8, 9) appelé récipient RC, laisser en contact et refouler ladite solution de conjugué SC dans un récipient (4, 7, 8, 9), lequel est ou non ledit récipient RC,
(3) si le marqueur utilise un substrat de révélation, aspirer dans ledit support solide, par la même extrémité, une solution comprenant un substrat de révélation avec lequel le marqueur va réagir, appelée solution de substrat SS, ladite solution de substrat SS étant contenue dans un récipient (4, 7, 8, 9, 10) appelé récipient RS, laisser en contact et refouler ladite solution de substrat dans un récipient, lequel est ou non ledit récipient RS, et
(4) mesurer le signal émis.
19. Procédé de détection ou quantification selon la revendication 18, caractérisé en ce que le récipient RE, le récipient RC et le récipient RS sont contenus dans la même barrette d'analyse (6).
20. Procédé de détection ou quantification selon l'une quelconque des revendications 13 à 19, caractérisé en ce que l'échantillon de test à analyser est un échantillon d'origine biologique, alimentaire ou environnemental.
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