CN102127148B - 血管内皮细胞表面决定簇部分多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡CD34部分多肽，其中，其氨基酸序列为：Cys Gln Ser Ser Ala HisPro Ser Thr His Pro Ser Val His Pro Ser Thr His，本发明提供了一种血管内皮细胞表面决定簇部分多肽，该多肽的特异性和敏感性好。

Description

血管内皮细胞表面决定簇部分多肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种血管内皮细胞表面决定簇部分多肽，本发明特别涉及鸡的血管内皮细胞表面决定簇部分多肽及多肽的应用。

背景技术

多克隆抗体技术(Polyclone antibodies preparation technique)，抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体(Monclone antibody)。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。动物的选择常根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关。如要获得大量的抗体，多采用大动物；如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体；如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备；一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备。免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物，雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫抗体则非常不合适，有时甚至不产生抗体。由于对免疫应答的个别差异，免疫时应同时选用数只动物进行免疫。

血管内皮细胞表面决定簇CD34(Cluster of Differentiation 34，白细胞分化抗原34)是一种分子量为105kD-120kD的高度糖基化的I型跨膜蛋白，其分子中的35％氨基酸由苏氨酸和丝氨酸组成。这种蛋白能够选择性地表达于早期造血干细胞、胚胎纤维母细胞和内皮祖细胞的膜表面。在二十世纪八十年代中期，Civin等人首次用髓系细胞KG-Ia制备出单克隆抗体My10，发现这种抗体能够特异性地与造血干细胞的膜蛋白相结合，并将此膜蛋白命名为CD34抗原。进而发现，编码CD34抗原基因位于第一条染色体长臂上，全长cDNA为2.65kb，ORF为119bp，编码383个氨基酸。经过核苷酸序列分析表明，CD34抗原与任何其他已知细胞表面分子编码基因无明显的同源性。目前用来从外周血、周围组织微血管中分离内皮前体细胞、血管内皮细胞的方法主要依赖于选择CD34，进而再扩增富集这些细胞。根据血管内皮细胞表面表达CD34的原理，还可以分离和纯化血管内皮细胞(Endothelial Cell，EC)。Arts等从皮下脂肪提取微血管内皮细胞(MicrovascularEndothelial Cell，MVEC)，以Nexell通用法作CD34抗体选择，经过分离、培养和恢复MVEC，使MVEC富集到86％。

自从发现、纯化和标记抗CD34单克隆抗体以后，使利用流式细胞定量检测在外周血或骨髓中的CD34阳性造血干细胞成为可能。CD34单克隆抗体识别CD34抗原的不同表位，这些表位根据他们对神经氨酸酶，木瓜蛋白酶和糖蛋白酶的敏感程度不同，可以分为三类：I类(对三种酶均敏感)；II类(对神经氨酸酶抵抗，对木瓜蛋白酶和糖蛋白酶敏感)；III类(对三种酶抵抗)，在正常造血干细胞中这些表位的分布不同，可能与造血干细胞的分化，成熟和功能有关。这一个强大而标准化的CD34分析系统的建立，极大地推动了CD34研究领域的迅速进步。例如，荧光素标记的单克隆抗体可用于CD34鉴定细胞，同时结合流式细胞仪，为鉴定和计数CD34细胞提供了一个快速、定量、重复性好的方法，进而决定动员干细胞及采集最佳时间。内皮细胞的CD34抗原可与L选择素结合，但造血干细胞上的CD34抗原的配体尚未发现，此抗原在细胞粘附中起作用。

尽管现已证实造血干细胞表达CD34抗原，然而用其鉴别多能干细胞的工作相当复杂且刚起步。近年利用CD34单克隆抗体显示血管EC的研究结果表明，CD34为EC的最敏感的特异性标记，优于EC的其他标记物。但是目前关于CD34的多克隆抗体报道罕见，特别在家禽方面，造成了以家禽为模式生物进行科学研究的限制。

发明内容

本发明的目的为提供一种CD34部分多肽，及其在制备CD34多克隆抗体方面的应用。

一种血管内皮细胞表面决定簇部分多肽，其中，其氨基酸序列为序列表中的序列1。

一种复合蛋白，是多肽与载体蛋白偶联形成的复合蛋白，其中，所述多肽的氨基酸序列为序列表中的序列1。

本发明的复合蛋白，其中，载体蛋白是匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白。

一种免疫原，是复合蛋白和免疫佐剂的混合物；所述复合蛋白是多肽与载体蛋白偶联形成的复合蛋白，所述多肽的氨基酸序列为序列表中的序列1。

本发明的免疫原，其中：所述载体蛋白为匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白。

本发明的免疫原在制备多克隆抗体中的应用。

与血管内皮细胞表面决定簇特异结合的多克隆抗体，是用免疫原免疫动物，采取免疫后动物的血液，获得的血清；所述免疫原是复合蛋白和免疫佐剂的混合物；所述复合蛋白是多肽与载体蛋白偶联形成的复合蛋白，所述多肽的氨基酸序列为序列表中的序列1。

本发明的多克隆抗体，其中：所述载体蛋白为匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白。

本发明的优点为：

提供了一种血管内皮细胞表面决定簇部分多肽，该多肽的特异性和敏感性好。

本发明的另一个优点为使用该多肽所制备的多克隆抗体的特异性和敏感性较高，使用该多肽制备多克隆抗体的方法，操作过程简单节省时间，节约经费。

附图说明

图1免疫组化检测SPF新西兰大耳白兔五回免疫后阳性血清图：A图为相差图片，B

图为相差与荧光叠加图片，C图为荧光图片。

图2免疫组化检测SPF新西兰大耳白兔免疫前阴性血清图：A图为相差图片，B图为相差与荧光叠加图片，C图为荧光图片。

图3免疫组化以PBS代替血清图：A图为相差图片，B图为相差与荧光叠加图片，C图为荧光图片。

图4免疫印迹法检测检测SPF新西兰大耳白兔五回免疫后阳性血清图。

具体实施方式

(一)合成免疫原

人工合成免疫多肽，其氨基酸序列为CQSSAHPSTHPSVHPSTH。

人工合成对照多肽，其氨基酸序列为CLATSEVDQECLLLILDGN。

对人工合成的多肽进行检测。

结果表明，人工合成的免疫多肽为白色冻干粉末，分子量为1897.03，HPLC(220nm，C18，线性梯度)检测纯度为90％。

对照多肽为白色冻干粉末，分子量为2049.34，HPLC(220nm，C18，线性梯度)检测纯度为90％。

(二)与鸡CD34特异结合的多克隆抗体

免疫多肽与载体蛋白按照质量比1∶1偶联，形成多肽-载体复合蛋白，载体蛋白可以是匙孔血蓝蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)，本实施例为免疫多肽-KLH复合蛋白。

对照多肽与KLH按照质量比1∶1偶联，形成对照多肽-KLH复合蛋白。

免疫多肽-KLH复合蛋白与费氏完全佐剂(Sigma)混合，制成免疫原。

对照多肽-KLH复合蛋白与费氏完全佐剂(Sigma)混合，制成对照免疫原。

用上述制备的免疫原和对照免疫原分别免疫SPF新西兰大耳兔。

20周龄以内，2.5-3Kg的SPF新西兰大耳兔，随机分成两组，免疫多肽组和对照多肽组，每组2只。免疫多肽组注射免疫原，对照多肽组注射对照免疫原。

免疫的具体过程如下：

第1周，每天多点背部皮下注射免疫SPF新西兰大耳兔一次，每只SPF新西兰大耳兔注射免疫多肽-KLH复合蛋白或对照多肽-KLH复合蛋白的总量为0.1mg；

第2周，对SPF新西兰大耳兔不做任何处理；

第3周-第7周，每天多点背部皮下注射免疫SPF新西兰大耳兔一次，每只SPF新西兰大耳兔注射免疫多肽-KLH复合蛋白或对照多肽-KLH复合蛋白的总量为0.1mg；

第7周免疫结束，处死SPF新西兰大耳兔，从耳部及心脏采取150ml血液，用促凝剂促凝，3000转离心20分钟。

免疫多肽组获得免疫血清01和02。

对照多肽组获得对照血清01和02。

ELISA检测免疫血清和对照血清的效价，具体方法如下：

1)上述鸡CD34特异结合的多克隆抗体用PBS配成100μg/ml的溶液，按100μl/每孔加入96孔酶标板，4℃过夜吸附；

2)次日将过夜包被的酶标板中未吸附的鸡CD34特异结合的多克隆抗体倒掉，以PBS洗3次。加入3％(质量百分比)BSA(用PBS配制不含Tween20，)封闭，100μl/每孔，37℃，1.5小时；

3)用PBS彻底洗2)中的沉淀4次后加入免疫血清或对照血清(用PBS按体积比为1∶100、1∶500、1∶2500、1∶12500或1∶62500稀释)，100μl/每孔，37℃，1.5小时；

4)用PBS洗3)中的沉淀4次，加二抗(羊抗兔IgG用PBS按体积比为1∶10000稀释)，100μl/每孔，37℃，1hr；

5)用PBS洗4)中的沉淀4次，加AP显色液P-NPP(2mg/ml)，80μl/每孔，避光反应，加等体积0.2M NaOH终止反应。

6)取100μl 5)中终止反应后的溶液100μl，用酶标仪测定405nm下的OD值。实验重复三次，结果以三次的平均值表示。

血清效价检测结果如表1所示；

表1.血清效价检测结果

稀释倍数    100    500    2500    12500    62500    对照对照血清01  0.632  0.476  0.238   0.036    0.009    0.006免疫血清01  1.582  1.556  1.289   0.723    0.210    0.005对照血清02  0.677  0.564  0.277   0.051    0.012    0.006免疫血清02  1.609  1.624  1.448   0.984    0.384    0.007

免疫血清效价检测结果表明，免疫血清能和血管内皮细胞表面决定簇CD34特异结合，其效价可达到为1∶60000；对照血清不能和血管内皮细胞表面决定簇CD34特异结合。

(三)细胞水平上检测血管内皮细胞表面决定簇CD34的表达

使用免疫组化法检测血管内皮细胞表面决定簇CD34的表达。

设置空白对照组、对照血清组和免疫血清组。

空白对照组采用PBS作为一抗，羊抗兔IgG(中杉金桥Zf-0311)作为二抗；

对照血清组采用对照血清01作为一抗(1∶500稀释)，羊抗兔IgG(中杉金桥Zf-0311)作为二抗；

免疫血清组采用免疫血清01作为一抗(1∶500稀释)，羊抗兔IgG(中杉金桥Zf-0311)作为二抗；

免疫组化具体方法如下：

1、标本制备

将细胞接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片，待细胞在盖玻片上贴壁，PBS清洗三次，4％的多聚甲醛固定。

2、染色

1)固定后的盖玻片在0.25％Tritonx-100通透15分钟；

2)用PBS洗2min/次×3次；

3)加一滴封闭用山羊血清于盖玻片上封闭30分钟；

4)倒掉或吸干液体；

5)每张盖玻片加100ul一抗，湿盒内孵育30～60分钟；

6)用PBS洗2min/次×3次；

7)每张盖玻片加一滴二抗，孵育60分钟；

8)用PBS洗2min/次×3次；

9)镜检。

激光共聚焦显微镜下观察免疫组化结果，空白对照组的结果如图1所示，对照血清组的结果如图2所示，在显微镜下空白对照组和对照血清组均没有荧光，表明PBS和对照血清均不能和鸡内皮祖细胞内的鸡血管内皮生长因子受体特异结合；免疫血清组的结果如图3所示，在显微镜下95％的细胞有荧光，表明免疫血清能与鸡内皮祖细胞内的鸡血管内皮生长因子受体特异结合。

(四)免疫印迹法对鸡CD34多克隆抗体的检测

提取体外培养的鸡内皮祖细胞总蛋白，用鸡CD34多克隆抗体通过常规蛋白免疫印迹法检测相应抗原的表达(免疫血清1∶1000稀释)，可见一特异性的阳性条带。通过免疫印迹法的方法可以进一步证明鸡CD34多克隆抗体的相应抗原在鸡内皮祖细胞中的表达，以及该抗原的生物学特性较好，见图4。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120>血管内皮细胞表面决定簇部分多肽

<160>1

<210>1

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>1

Cys Gln Ser Ser Ala His Pro Ser Thr His Pro Ser Val His Pro Ser

1               5                   10                  15

Thr His

Claims (5)

1.一种血管内皮细胞表面决定簇部分多肽，其特征在于，其氨基酸序列为序列表中的序列1。

2.一种复合蛋白，是多肽与载体蛋白偶联形成的复合蛋白，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为序列表中的序列1，所述载体蛋白是匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白。

3.一种免疫原，是复合蛋白和免疫佐剂的混合物；所述复合蛋白是多肽与载体蛋白偶联形成的复合蛋白，所述多肽的氨基酸序列为序列表中的序列1，所述载体蛋白为匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白。

4.权利要求3所述的免疫原在制备多克隆抗体中的应用。

5.与血管内皮细胞表面决定簇特异结合的多克隆抗体，是用免疫原免疫动物，采取免疫后动物的血液，获得的血清；所述免疫原是复合蛋白和免疫佐剂的混合物；所述复合蛋白是多肽与载体蛋白偶联形成的复合蛋白，所述多肽的氨基酸序列为序列表中的序列1，所述载体蛋白为匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白。

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