CN118091153A - 一种基于液相芯片法的过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒及其应用 - Google Patents
一种基于液相芯片法的过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物检测领域,公开了一种基于液相芯片法的过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒及其应用。该试剂盒基于液相芯片法,且所用载体颗粒采用组装微球,能够明显提高检测的灵敏度,降低非特异性吸附;本发明将常见过敏原及其过敏原组分抗原分别包被在不同编码微球上,实现单管检测多个指标,本发明还公开了上述抗体检测试剂的应用。具有样本使用量少、灵敏度高、高通量、自动化程度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域,具体涉及一种基于液相芯片法的过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒及其应用。
背景技术
过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒是用于检测过敏原特异性IgE抗体的,通过检测过敏原特异性IgE抗体可作为Ⅰ型变态反应中最常用的辅助诊断方法。
过敏诊断包括临床病史、皮肤试验和过敏原特异性IgE检测三部分,只有在三者一致的情况下,才能确诊。特异性IgE阳性结果可以帮忙鉴别出特定的过敏原,采取进一步的避免措施,并对过敏原临床反应的风险给出提示。阴性结果的临床价值在于可以排除过敏的症状和病因,依据客观事实提供恰当的治疗方案。
根据固相支持物和报告分子的不同,过敏原特异性IgE抗体检测的方法可以分成三类:(1)荧光酶联免疫吸附法,由瑞典的Phadia公司开发ImmunoCAP,使用纤维素衍生物为固相支持物,具有过敏原种类多,结果准确的优点,临床认可度高,可定量,自动化程度高,不过价格相对昂贵;(2)酶联免疫法或化学发光法,通常采用微孔或微球为固相支持物,报告分子为碱性磷酸酶或吖啶酯,也是最常见的方法之一;(3)免疫印迹法及蛋白质芯片法是将过敏原吸附到膜或玻璃上,通过过敏原在固相支持物上不同的位置来区分不同种的过敏原。方法(1)和(2)可以进行定量或半定量地检测过敏原特异性IgE抗体,但是它们主要的技术缺点是每次反应只能检测一种指标,并且使用血清样品量较大。而方法(3),虽然理论上一次可以检测多个指标,但是免疫化学反应发生在固相-液相之间,重复性差,灵敏度低,结果不稳定,只能进行定性检测,并且使用样品量大。
液相芯片法(也叫流式荧光发光法)用于过敏原检测是近几年发展起来的,相对于传统检测方法具有高通量定量测试,灵敏度高,线性范围宽,反应快速,自动化,重复性好等优势,其核心在于液相芯片系统,其中编码微球为其关键技术。原理是作为蛋白、核酸等生物分子反应的载体,编码微球技术最初由美国Luminex公司开发,它利用多种荧光物质组成一系列编码的微球,作为相关生物分子反应的载体,在更有利于保持蛋白质的天然构象的液相环境中进行反应,可以实现对蛋白、核酸等生物分子进行高通量、多重检测。早期检测方法虽具有使用样品量少,可以一次同时检测多个指标等优点,但是存在以下缺点:灵敏度不如荧光酶联免疫法或化学发光法;可以实现二级诊断(以提取物过敏原为代表),但未实现三级诊断(以单分子为代表)。
发明内容
有鉴于此,本发明首先提出了一种基于液相芯片法的过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒,该试剂盒基于液相芯片法,且所用载体颗粒采用主客体结构组装微球、多荧光通道编码,能够明显提高检测的灵敏度,降低非特异性吸附;本发明将常见过敏原及其过敏原组分抗原分别包被在不同编码微球上,多个指标同管检测,样本使用量少、高通量、自动化程度高,为过敏性疾病的诊断提供了一种全面、准确、方便的临床检测手段。
为解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案予以实现:
一种基于液相芯片法的过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒,包括被不同的捕获探针包被的编码微球混合液、反应缓冲液、生物素标记物、荧光结合物、校准品和质控品;
在本发明的一些具体实施方案中,所述编码微球混合液为抗原包被编码微球和质控品包被编码微球的混合液,或抗人IgE单克隆抗体包被编码微球和质控品包被编码微球的混合液;
在本发明的一些具体实施方案中,所述编码微球提供了一种基于量子点编码和组装微球的载体颗粒,其包括母球、位于母球表面的子球;母球和/或至少一个子球包括至少一种类型的量子点,实现多种荧光编码。其母球和/或子球包括磁性纳米颗粒,使母球和子球都具有磁性,或母球和子球其中之一具有磁性。
在本发明的一些具体实施方案中,所述编码微球混合液的编码微球表面上包被的捕获探针为抗原;抗原包被编码微球是捕获探针为一种过敏原或过敏原组分抗原包被的编码微球,不同种类的捕获探针分别对应不同的荧光编码微球。
优选地,所述过敏原一般来源于下面的物质或其提取物:屋尘螨、粉尘螨、蟑螂、烟曲霉、交链孢霉、猫毛皮屑、狗毛皮屑、普通豚草、艾蒿、梯牧草、百慕达草、白桦树、枫叶梧桐、柳树、鸡蛋白、鸡蛋黄、牛奶、鳕鱼、小麦、蟹、虾、牛肉、羊肉和交叉反应糖类决定簇。
优选地,所述过敏原组分抗原为高度纯化的天然提取抗原或基因工程重组抗原,一般常用的为以下组分抗原(采用WHO过敏原命名法):Derp 1、Der p 2、Der p 10、Der p23、Fel d 1、Can f 1、Art v 1、Gal d 1、Gal d 2、Gal d 3、Gal d4、Bos d4、Bos d 5、Bosd 6、Bos d 8等。
优选地,所述抗人IgE单克隆抗体包被编码微球,其表面包被的捕获探针为抗人IgE单克隆抗体,所述抗人IgE单克隆抗体包被编码微球用于特异性IgE定标曲线。
优选地,所述过敏原为亲水性聚合物修饰的过敏原,两者结合形成亲水性聚合物-过敏原的复合物,所述亲水性聚合物选自多聚-L-赖氨酸、九聚精氨酸、聚乙烯亚胺,优选为多聚-L-赖氨酸,其分子量为1000~20000Da;所述亲水性聚合物与所述过敏原提取物的摩尔比为1:50~1:300;
所述过敏原包被的编码微球混合液的制备方法包括如下步骤:
将编码微球(如甲苯磺酰基编码微球)和包被缓冲液(0.1mol/L BoratebufferpH9.5)加入到微管中,并利用混匀器进行涡旋混匀,磁分离后除去上清液;再加入0.1mol/L包被缓冲液,并混匀,添加过敏原或过敏原组分抗原,并混匀;添加反应催化溶液(3mol/LAmmonium sulfate/0.1mol/LBoratebufferpH 9.5),在37℃的条件下混匀18小时;
添加封闭剂(1%人血清白蛋白和5%甘氨酸),并在37℃的条件下混匀6小时以上;磁分离后除去上清液,添加清洗缓冲液(含有Tween20的磷酸盐缓冲液),重复清洗3次;使用编码微球稀释液重悬,并保存于2~8℃条件下。
优选地,所述编码微球还具有质控编码微球系统,其包括多个质控编码微球,所述质控编码微球系统与检测编码微球系统(被不同的捕获探针包被的编码微球混合液)在同一反应管中且相互独立,所述质控编码微球包括内部质控编码微球和空白对照质控编码微球,所述内部质控编码微球用于阳性质控,空白对照质控编码微球用于阴性质控。
在本发明的一些具体实施方案中,所述液相芯片检测试剂,在使用时可以根据具体情况灵活地加以组合和简化,例如,如果只检测部分过敏原特异性抗体,可以只使用一种过敏原探针或多种过敏原探针的选择性组合。
在本发明的一些具体实施方案中,所述荧光结合物为别藻蓝蛋白(APC,Allophycocyanin)或Alexa Fluor 647或Cy5标记的链霉亲和素;
所述荧光结合物优选为别藻蓝蛋白标记的链霉亲和素,其制备方法包括:将如下重量百分含量的组分混合:0.5~3%人血清白蛋白、1~10%海藻糖、0.05-0.2%Tween-20、0.06~0.3%Proclin 300,再用一定比例去离子水的0.1M磷酸盐缓冲液(pH=7~8)配制成每个指标0.1~3.0μg/mL,即得别藻蓝蛋白标记的链霉亲和素;
优选地,所述生物素标记物包括生物素标记抗人IgE抗体和抗DNP抗体。生物素标记抗人IgE抗体为生物素标记的鼠抗人IgE抗体,所述生物素标记抗人IgE抗体每个指标的浓度为0.1~3.0μg/mL;所述生物素标记抗DNP抗体为生物素标记的鼠抗DNP单克隆抗体,所述生物素标记抗DNP抗体的浓度为0.1~3.0μg/mL;
优选地,所述反应缓冲液含有Tween-20、Procline300的磷酸盐缓冲液;
优选地,所述校准品为IgE蛋白,所述校准品浓度包括0AU/mL、0.1AU/mL、0.35AU/mL、0.70AU/mL、3.5AU/mL、17.5AU/mL、50AU/mL、100AU/mL。
优选地,所述质控品为特异性IgE曲线质控品和特异性IgE质控品,特异性IgE曲线质控品为IgE蛋白,特异性IgE质控品通过三个含高、中、低浓度的IgE抗体血清来实现过敏原特异性IgE的室内质控,如特异性IgE多项阴性、屋尘螨(D1)IgE抗体、白桦树(T3)IgE抗体、牛奶(F2)IgE抗体。
在本发明的一些具体实施方案中,本发明的基于液相芯片法的过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒的检测步骤:
S1、向反应管中加入待测样本(或者校准品和质控品)、反应缓冲液,并向反应管中加入被不同的捕获探针包被的编码微球混合液,搅拌混合均匀后于37℃进行反应;
S2、反应结束后,进行磁分离,舍弃上清液,并加入清洗缓冲液,搅拌混匀后,进行磁分离,再次舍弃上清液;重复清洗步骤,共计三次;
S3、然后向反应管中加入生物素标记物,搅拌混匀后于37℃进行反应;
S4、重复S2的清洗步骤,共计三次;
S5、然后向反应管中加入荧光结合物,搅拌混匀后于37℃进行反应;
S6、重复S2的清洗步骤,共计三次;
S7、向反应管中加入等体积的检测液(磷酸盐缓冲液、Proclin300等),搅拌混匀并将反应管置于流式点阵发光仪进行读数,测定荧光值;
S8、利用校准品得到校准曲线,iMatrix的分析软件将荧光值带入公式计算出待测样本中的过敏原特异性IgE抗体的浓度值;
S9、S1~S8采用iMatrix全自动液相芯片分析仪器配套使用,实现自动化检测。
本发明也提供了一种上述过敏原特异性IgE抗体检测试剂的应用。所述试剂用于屋尘螨、粉尘螨、蟑螂、烟曲霉、交链孢霉、猫毛皮屑、狗毛皮屑、普通豚草、艾蒿、梯牧草、百慕达草、白桦树、枫叶梧桐、柳树、鸡蛋白、鸡蛋黄、牛奶、鳕鱼、小麦、蟹、虾、牛肉、羊肉、交叉反应糖类决定簇、Derp 1、Der p 2、Derp 10、Der p 23、Fel d 1、Can f 1、Art v 1、Gal d1、Gal d 2、Gal d 3、Gal d 4、Bos d 4、Bos d 5、Bos d 6、Bos d 8中的至少一种的过敏原特异性IgE抗体定量检测。
本发明采用微米或亚微米尺寸的编码微球表面连接纳米尺寸的微球所形成的具有主客体结构的组装微球作为生物检测的固相载体,较之单一的表面光滑的微球,能够明显提高检测的灵敏度。通过在过敏原上进行亲水聚合物修饰,形成多聚过敏原,提高了磁性编码微球表面过敏原的包被量。采用红色荧光报告分子(如APC),样本背景比较低。通过以上设计,降低了非特异性背景,明显提高了灵敏度。
该液相芯片检测试剂,包含了二级诊断(以提取物过敏原为代表)和三级诊断(以单分子为代表),临床可应用过敏性疾病精准诊断与治疗。有助于识别主要致敏组分,鉴别交叉致敏、提示可能的交叉反应性;有助于提示严重过敏反应相关的组分,提高诊断准确性,用于提示潜在的严重反应、系统性反应和轻微反应的风险;有助于识别特定的蛋白致敏组分,以筛选特定适合脱敏免疫疗法的患者,提高脱敏免疫疗法的成功率;有助于识别组分蛋白的稳定性特征,避免简单粗暴的回避食物过敏原,精准的为食物过敏的患者提供健康安全的饮食方式指导。
本发明的有益效果包括但不限于:
1)本发明的试剂盒以磁性编码微球为固相载体,采用微米或亚微米尺寸的微球(母球)表面连接纳米尺寸的微球(子球)所形成的具有拓扑结构的组装微球,较之单一的表面光滑的微球,具有极大的比表面积,可以显著提高识别与捕获待检IgE抗体的反应动力学以及捕获IgE抗体的能力,进而提高试剂的检测灵敏度。
2)本发明的试剂盒利用亲水性聚合物的多功能基位点,获得亲水性聚合物修饰的过敏原,进一步提高了磁性编码微球表面过敏原的包被量,增加过敏原与IgE抗体复合物的潜在数量,提高了检测系统的灵敏度。
3)本发明的试剂盒检测靶标物包含提取物过敏原(以二级诊断)和组分抗原(三级诊断),临床可应用于过敏性疾病精准诊断与治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为图1为实施例10检测的磁性编码微球分群图。
具体实施方式
为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明,下面将结合附图,对本发明作进一步的说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明的过敏原特异性IgE抗体试剂盒,包括编码微球混合液、反应缓冲液、生物素标记物、荧光结合物、校准品和质控品;
所述编码微球混合液为过敏原提取物或过敏原组分抗原包被编码微球和质控微球的混合液,或抗人IgE单克隆抗体包被编码微球和质控微球的混合液。
一、编码微球制备
所述编码微球中,提供了一种基于量子点编码和组装微球的载体颗粒,其包括母球、位于母球表面的子球;母球和/或至少一个子球包括至少一种类型的量子点。其母球和/或子球包括磁性纳米颗粒,即母球和子球都具有磁性,或母球和子球其中之一具有磁性。
本发明的编码微球的制备主要由母球与子球两个结构单元构成,母球与子球分别通过其各自表面的功能基团间化学共价反应最终组装形成具有类似树莓结构的组装微球,如图1所示,母球与子球结构单元的制备方法分别如下所述,采用两种中心发射波长的量子点,但同样可以采用下述的方法和编码思想,使用两种或两种以上中心发射波长绝对值相差不低于30nm的量子点,或者母球内部或表面装载一种类型量子点,而子球内部装载一种与母球所装载量子点荧光中心发射波长相差不低于50nm的有机荧光染料。优选为5~6μm的磁性聚合物微球,拥有良好的悬浮性以实现自动化检测。详见专利CN 105219373 B所述。
二、包被物单元以及制备方法
类型一
所述编码微球表面上包被有捕获探针,其表面上包被的捕获探针为抗原。所述抗原包被的编码微球混合液为过敏原或过敏原组分抗原包被的编码微球的混合液。
所述过敏原一般提取自:屋尘螨、粉尘螨、蟑螂、烟曲霉、交链孢霉、猫毛皮屑、狗毛皮屑、普通豚草、艾蒿、梯牧草、百慕达草、白桦树、枫叶梧桐、柳树、鸡蛋白、鸡蛋黄、牛奶、鳕鱼、小麦、蟹、虾、牛肉、羊肉和交叉反应糖类决定簇等。
所述过敏原组分抗原为高度纯化的天然提取抗原或基因工程重组抗原,一般常用的为以下组分抗原:Der p 1、Derp 2、Derp 10、Derp 23、Fel d 1、Can f 1、Art v 1、Gal d1、Gal d 2、Gal d 3、Gal d 4、Bos d 4、Bos d 5、Bos d 6、Bos d 8等。
所述过敏原还与亲水性聚合物结合组成亲水性聚合物-过敏原复合物,所述亲水性聚合物选自多聚-L-赖氨酸、九聚精氨酸、聚乙烯亚胺,优选为多聚-L-赖氨酸,其分子量为1000~20000Da;所述亲水性聚合物与所述过敏原提取物的摩尔比为1:50~1:300,优选为1:180~1:210;
检测试剂的制备方法:
步骤一:所述亲水性聚合物-过敏原复合物的制备:取适量过敏原溶于0.05M~0.2MMES(pH=5.0)缓冲液中,加入过量新鲜配制的EDC溶液和适量亲水性聚合物(多聚-L-赖氨酸),涡旋混匀后,置于恒温混匀仪上,室温以1000rpm孵育0.5~3h,反应完毕以脱盐柱洗脱,取洗脱液,复合物的浓度为2mg/mL。
步骤二:将编码微球(如6um甲苯磺酰基编码微球)和0.1mol/L包被缓冲液加入到微管中,并利用混匀器进行涡旋混匀,磁分离后除去上清液;再加入0.1mol/L包被缓冲液,并混匀,添加亲水性聚合物-过敏原复合物或过敏原组分抗原,并混匀;添加3mol/L反应催化溶液,在37℃的条件下避光混匀18小时;
步骤三:优选地,添加封闭剂,并在37℃的条件下避光混匀6小时以上;磁分离后除去上清液,添加清洗缓冲液,重复清洗3次;使用编码微球保存液重悬,并保存于2~8℃条件下。
类型二
所述编码微球,其表面包被的捕获探针为抗人IgE单克隆抗体,所述编码微球用于特异性IgE定标曲线,该类型的所述编码微球为羧基编码微球、甲苯磺酰基编码微球,优选羧基编码微球。
在一些实施方式中,还包括质控编码微球系统,包括多个包被有质控品的质控微球,所述质控微球至少包括内部质控微球和空白对照质控微球中的一种。内部质控微球用于检测仪器检测系统和试剂状况,空白对照质控微球用于检测样本非特异结合情况。所述编码微球为羧基编码微球、甲苯磺酰基编码微球,优选羧基编码微球。
抗人IgE单克隆抗体包被编码微球和质控微球的制备方法:
步骤一:将编码微球(如6um羧基编码微球)和0.05mol/L包被缓冲液加入到微管中,并利用混匀器进行涡旋混匀,磁分离后除去上清液;再加入0.05mol/L包被缓冲液,并混匀;添加适量的EDC和NHS,室温1000rpm振荡活化30min;磁分离后除去上清液,添加清洗缓冲液,重复清洗3次;添加鼠抗人IgE单克隆抗体或DNP-BSA,并混匀,在室温条件下避光混匀2小时;重复清洗3次。
步骤二:添加封闭剂,并在室温的条件下避光混匀2小时以上;磁分离后除去上清液,添加清洗缓冲液,重复清洗3次;使用编码微球保存液重悬,并保存于2~8℃条件下。
所述液相芯片检测试剂在使用时可以根据具体情况灵活地加以组合和简化,例如,如果只检测部分过敏原特异性抗体,可以只使用一种过敏原探针或多种过敏原探针的任意组合。
实施例1
本实施例的过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒中,所述编码微球混合液包括第一组吸入抗原,所述第一组吸入抗原包括屋尘螨D1、粉尘螨D2、蟑螂I6、烟曲霉M3、交链孢霉M6、猫毛皮屑E1、狗毛皮屑E5、普通豚草W1、艾蒿W6、百慕达草G2、梯牧草G6、白桦树T3、枫叶梧桐T11、柳树T12和交叉反应糖类决定簇CCD抗原中的至少9种抗原。一些具体的实施例中,所述吸入组1抗原包括屋尘螨D1、粉尘螨D2、蟑螂I6、烟曲霉M3、猫毛皮屑E1、狗毛皮屑E5、普通豚草W1、艾蒿W6和交叉反应糖类决定簇CCD。
实施例2
过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的检测试剂中,编码微球混合液包括第二组吸入抗原,所述第二组吸入抗原包括Der p 1、Der p 2、Der p 10、Der p 23、Fel d 1、Can f1、Art v 1中的至少4种抗原。一些具体的实施例中,所述吸入组2抗原包括Der p 1、Derp2、Derp 10、Derp 23。
实施例3
过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的检测试剂中,编码微球混合液包括第三组吸入抗原,所述第三组吸入抗原包括屋尘螨D1、粉尘螨D2、Derp 1、Derp 2、Der p 10、Der p23共6种抗原。
实施例4
过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的编码微球混合液包括第四组吸入抗原,所述第四组吸入抗原包括第一组吸入抗原和第二组吸入抗原。
实施例5
过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的检测试剂中,编码微球混合液包括第一组食物抗原,所述第一组食物抗原包括鸡蛋白F1、鸡蛋黄F75、牛奶F2、鳕鱼F3、小麦F4、蟹F23、虾F24、牛肉F27、羊肉F28和交叉反应糖类决定簇CCD抗原中的至少8种抗原。一些具体的实施例中,所述第一组食物抗原包括鸡蛋白F1、鸡蛋黄F75、牛奶F2、鳕鱼F3、花生F13、大豆F14、蟹F23、虾F24和交叉反应糖类决定簇CCD。
实施例6
过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的检测试剂中,编码微球混合液包括第二组食物抗原,所述第二组食物抗原包括Gal d 1、Gal d 2、Gal d 3、Gal d 4、Bos d4、Bos d 5、Bos d 6、Bos d 8抗原中的至少8种抗原。一些具体的实施例中,所述食物组1抗原包括Gald1、Gal d 2、Gal d 3、Gal d 4、Bos d 4、Bos d 5、Bos d 6、Bos d 8。
实施例7
过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的检测试剂中,编码微球混合液包括第三组食物抗原,所述第三组食物抗原包括牛奶F2、Bos d4、Bos d 5、Bos d 6、Bos d 8共5种抗原。
实施例8
过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的检测试剂中,编码微球混合液包括第四组食物抗原,所述第四组食物抗原包括第一组食物抗原和第二组食物抗原。
实施例9
过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的检测试剂中,编码微球混合液包括第一组综合抗原,所述第一组综合抗原包括第一组吸入抗原和第一组食物抗原,具体包括屋尘螨D1、粉尘螨D2、蟑螂I6、烟曲霉M3、交链孢霉M6、猫毛皮屑E1、狗毛皮屑E5、普通豚草W1、艾蒿W6、百慕达草G2、梯牧草G6、白桦树T3、枫叶梧桐T11、柳树T12、鸡蛋白F1、鸡蛋黄F75、牛奶F2、鳕鱼F3、小麦F4、蟹F23、虾F24、牛肉F27、羊肉F28和交叉反应糖类决定簇CCD。该实施例在同一个反应管中能够同时检测24种特异性IgE抗体。
实施例10
过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒的检测试剂中,编码微球混合液包括第二组综合抗原,所述第二组综合抗原包括第一组吸入抗原、第二组吸入抗原、第一组食物抗原和第二组食物抗原,具体包括屋尘螨D1、Der p 1、Der p 2、Der p 10、Derp 23、粉尘螨D2、蟑螂I6、烟曲霉M3、交链孢霉M6、猫毛皮屑E1、Fel d 1、狗毛皮屑E5、Can f 1、普通豚草W1、艾蒿W6、Art v 1、百慕达草G2、梯牧草G6、白桦树T3、枫叶梧桐T11、柳树T12、鸡蛋白F1、鸡蛋黄F75、Gal d 1、Gal d 2、Gal d 3、Gal d4、牛奶F2、Bos d 4、Bos d 5、Bos d 6、Bos d 8、鳕鱼F3、小麦F4、蟹F23、虾F24、牛肉F27、羊肉F28和交叉反应糖类决定簇CCD。该实施例在同一个反应管中能够同时检测39种特异性IgE抗体。
三、液相芯片检测试剂制备方法、检测过程和结果
本发明实施例提供了一种基于液相芯片法的过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒,试剂盒包括编码微球混合液、荧光结合物、生物素标记物、反应缓冲液、清洗缓冲液及检测液、校准品和质控品,可同时检测多种过敏原特异性IgE抗体。表1是本发明过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的主要组成成分,试剂盒为50人份和100人份,清洗缓冲液、检测液等通用溶液是含有Tween20的磷酸盐缓冲液。
表1.是本发明过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的主要组成成分
所述检测试剂的编码微球混合液,为过敏原包被编码微球(实施例1~10)和质控微球的混合液,所述质控微球包括阳性质控微球和阴性质控微球,所述阳性质控微球为DNP-BSA包被的编码微球,阴性质控微球不含包被物。
所述定标曲线试剂的编码微球混合液,为鼠抗人IgE单克隆抗体包被编码微球和质控微球的混合液,所述质控微球包括阳性质控微球和阴性质控微球。
所述荧光结合物为发射波长为620nm~760nm的别藻蓝蛋白(APC,Allophycocyanin)或Alexa Fluor 647或Cy5标记的链霉亲和素,优选为别藻蓝蛋白标记的链霉亲和素;
以别藻蓝蛋白为例,所述荧光结合物的制备方法包括:将链霉亲和素与别藻蓝蛋白偶联得到荧光结合物,将别藻蓝蛋白标记的链霉亲和素用含0.5~3%人血清白蛋白、1~10%海藻糖、0.05-0.2%Tween-20、0.06~0.3%Proclin 300的0.1M磷酸盐缓冲液(pH=7~8)配制成每个指标0.1~5.0μg/mL,即得别藻蓝蛋白标记的链霉亲和素;
所述生物素标记抗人IgE抗体为生物素标记的鼠抗人IgE抗体,生物素标记抗DNP抗体为生物素标记的鼠抗DNP单克隆抗体。其制备方法为取适量抗人IgE抗体或抗DNP抗体加入NHS活化的生物素,室温孵育0.5~2h,以20mM PBST为透析液进行透析,保存于含人血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中。所述生物素标记抗人IgE抗体每个指标的浓度为0.1~5.0μg/mL,所述生物素标记抗DNP抗体的浓度为0.1~5.0μg/mL;
所述反应缓冲液和检测液含有Tween-20、Procline300的磷酸盐缓冲液;
所述校准品为IgE蛋白,所述校准品浓度包括0AU/mL、0.1AU/mL、0.35AU/mL、0.70AU/mL、3.5AU/mL、17.5AU/mL、50AU/mL、100AU/mL。
所述质控品为特异性IgE曲线质控品和特异性IgE质控品,特异性IgE曲线质控品为IgE蛋白,特异性IgE质控品通过三个含高、中、低浓度的IgE抗体血清来实现过敏原特异性IgE的室内质控,如特异性IgE多项阴性,浓度范围分别为0.35~3.5AU/mL、3.5~17.5AU/mL、17.5~100AU/mL的屋尘螨(D1)IgE抗体、白桦树(T3)IgE抗体、牛奶(F2)IgE抗体。或以特异性IgE阴性血清稀释至上述三个浓度范围的屋尘螨(D1)IgE抗体、白桦树(T3)IgE抗体、牛奶(F2)IgE抗体IgE抗体血清,即为质控品。
所述曲线质控品为IgE蛋白,所述曲线质控品浓度包括0.7AU/mL和17.5AU/mL。
本发明提供了一种利用上述过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒的检测方法,优选地,所述检测方法利用中翰盛泰生物技术股份有限公司的iMatrix全自动液相芯片分析仪,进行全自动化检测;包括以下检测步骤:
S1、向反应管中加入待测样本(或者校准品和质控品)、反应缓冲液,并向反应管中加入编码微球混合液以及抗人IgE单克隆抗体包被编码微球工作液,搅拌混合均匀后于37℃进行反应;
S2、反应结束后,进行磁分离,舍弃上清液,并加入清洗缓冲液,搅拌混匀后,进行磁分离,再次舍弃上清液;重复清洗步骤,共计三次;
S3、然后向反应管中加入生物素标记物,搅拌混匀后于37℃进行反应;
S4、重复S2的清洗步骤,共计三次;
S5、然后向反应管中加入荧光结合物,搅拌混匀后于37℃进行反应;
S6、重复S2的清洗步骤,共计三次;
S7、向反应管中加入等体积的检测液,搅拌混匀并将反应管置于流式点阵发光仪进行读数,测定荧光值;
S8、利用校准品得到校准曲线,iMatrix的分析软件将荧光值带入公式计算出待测样本中的过敏原特异性IgE抗体的浓度值。
S9、S1~S8采用iMatrix全自动液相芯片分析仪器配套使用,实现自动化检测。也可以手工操作,搭配常规流式细胞式检测。
所述实施例9中,1AU/mL=1IU/mL,可溯源至世界卫生组织(WHO)人血清免疫球蛋白E的第3代国际标准品11/234。
所述实施例9和实施例10,进行试剂分析性能评估。
效果例1级别一致率和阴、阳性符合率评估。
所述实施例10,每个项目选择40份以上样本,所有样本同时采用Phadia或海柯生物检测试剂盒作为对比试剂进行了测定,以0.35AU/mL作为参考值,评估结果如表2所示,±1级符合率基本大于90%,总符合率基本大于85%。
表2一致率和符合率汇总
效果例2最低检出限评估
对阴性样本进行20次平行检测,测定结果取平均值加2倍标准偏差,实施例10,求得的最低检测限均不大于0.2AU/mL。实施例9,求得的最低检测限均不大于0.1AU/mL,达到荧光酶联免疫法或化学发光法的灵敏度。
效果例3线性范围
实施例10,在0.1~100AU/mL浓度范围内10个浓度点进行检测,线性相关系数r≥0.9900。
效果例4精密度评估
实施例10,对精密度参考品进行10次平行检测,测定结果计算变异系数(CV)≤10%。
效果例5特异性评估
实施例10,样本中血红蛋白<400mg/L,甘油三酯或胆固醇<1500mg/dL、胆红素<5.0mg/dL、类风湿因子<1000IU/mL,对检测结果不产生影响。对阴性样本配置的IgA溶液、IgM溶液和IgG溶液(含量均不低于400μg/mL)进行检测,结果均为不高于0.2AU/mL;对含有浓度不低于100IU/mL总IgE且不含特异性抗体的样本进行检测,结果均为不高于0.2AU/mL。
上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于这里的实施例,本领域技术人员根据本发明的揭示,对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于液相芯片法的过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒,其特征在于,包括:捕获探针包被的编码微球、荧光结合物、生物素标记物、反应缓冲液、校准品和质控品;其中,
所述捕获探针包括抗原或抗人IgE单克隆抗体,所述抗原包括过敏原和过敏原组分抗原,过敏原和过敏原组分抗原分别包被编码微球形成过敏原包被的编码微球和过敏原组分抗原包被的编码微球;抗人IgE单克隆抗体包被磁性编码微球形成抗人IgE单克隆抗体包被的编码微球,用于特异性IgE定标曲线;
所述编码微球为包括母球、位于母球表面的子球的组装微球结构。
2.如权利要求1所述的基于液相芯片法的过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒,其特征在于,所述过敏原提取自屋尘螨、粉尘螨、蟑螂、烟曲霉、交链孢霉、猫毛皮屑、狗毛皮屑、普通豚草、艾蒿、梯牧草、百慕达草、白桦树、枫叶梧桐、柳树、鸡蛋白、鸡蛋黄、牛奶、鳕鱼、小麦、蟹、虾、牛肉、羊肉和交叉反应糖类决定簇;
所述过敏原组分抗原为高度纯化的天然提取抗原或基因工程重组抗原,来自Der p 1、Derp 2、Derp 10、Der p 23、Fel d 1、Can f 1、Art v 1、Gal d 1、Gal d 2、Gal d 3、Gald4、Bos d 4、Bos d 5、Bos d 6、Bos d 8。
3.如权利要求1所述的基于液相芯片法的过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒,其特征在于,所述过敏原为亲水性聚合物修饰的过敏原,亲水性聚合物与过敏原结合形成复合物,所述亲水性聚合物为多聚-L-赖氨酸、九聚精氨酸、聚乙烯亚胺,优选为多聚-L-赖氨酸,其分子量为1000~20000Da;所述亲水性聚合物与所述过敏原的摩尔比为1:50~1:300,优选为1:180~1:210。
4.如权利要求1所述的基于液相芯片法的过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒,其特征在于,所述编码微球为羧基编码微球、甲苯磺酰基编码微球,优选羧基编码微球。
5.如权利要求1所述的基于液相芯片法的过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒,其特征在于,还具有质控编码微球系统,其包括多个包被有质控品的编码微球,质控编码微球至少包括内部质控编码微球和空白对照质控编码微球中的一种,内部质控编码微球(即阳性质控微球)用于检测仪器检测系统和试剂状况,空白对照质控编码微球(即阴性质控微球)用于检测样本非特异结合情况,所述质控编码微球系统与检测编码微球系统(被不同的捕获探针包被的编码微球混合液)在同一反应管中且相互独立。
6.如权利要求1所述的基于液相芯片法的过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒,其特征在于,所述荧光结合物为发射波长为620nm~760nm的荧光材料标记的链霉亲和素;荧光材料选自别藻蓝蛋白或Alexa Fluor 647或Cy5。
7.如权利要求1所述的基于液相芯片法的过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒,其特征在于,所述生物素标记物包括生物素标记抗人IgE抗体和抗DNP抗体,生物素标记抗人IgE抗体为生物素标记的鼠抗人IgE抗体,生物素标记抗DNP抗体为生物素标记的鼠抗DNP单克隆抗体。
8.如权利要求1所述的基于液相芯片法的过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒,其特征在于,所述反应缓冲液为含有Tween-20、Procline300的磷酸盐缓冲液。
9.如权利要求1所述的基于液相芯片法的过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒,其特征在于,所述校准品为IgE蛋白,所述校准品浓度包括0AU/mL、0.1AU/mL、0.35AU/mL、0.70AU/mL、3.5AU/mL、17.5AU/mL、50AU/mL、100AU/mL;
所述质控品为特异性IgE曲线质控品和特异性IgE质控品,特异性IgE曲线质控品为IgE蛋白,特异性IgE质控品通过三个含高、中、低浓度的IgE抗体血清来实现过敏原特异性IgE的室内质控。
10.如权利要求1所述的基于液相芯片法的过敏原特异性IgE抗体定量检测试剂盒在制备过敏诊断和预后的产品中的应用。
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