JP2002500363A - ボルナ病ウィルス(bdv)感染の検出方法 - Google Patents
ボルナ病ウィルス(bdv)感染の検出方法Info
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Abstract
Description
出方法、一般のCICおよび特にBDV特異的CICの検出方法、ならびにこれ
らの検出方法に適した診断キットに関する。
人間に見出される。BDVは5個の遺伝子をコードする陰性の極性の非セグメン
ト化一本鎖RNAから成るゲノムを有する直径90nmの被包化ウィルスである
(ゲノムのサイズ:8.9キロベース)。同種のウィルスには、たとえば狂犬病
ウィルスおよび麻疹ウィルスが含まれる。遺伝子の特殊性(宿主細胞の細胞核中
の増殖)に基づき、BDVはプロトタイプとして独自のウィルスファミリに分類
されている(ボルナヴィリダエ)。BDVは大脳辺縁系中の神経細胞、行動、情
動および記憶力がコントロールされる機能単位に対して特別の選好を有する。さ
らにまた、他のBDVの細胞型も発生する。診断上特に重要なのは末梢血単核白
血球細胞(PBMC)である。
壊しない(細胞病原性の効果なし)。BDVの第一の病原性の効果は、感染した
脳細胞中の機能障害に基づいており、これはおそらく神経伝達物質受容体によっ
て誘発される。動物実験に基づくデータからグルタミン酸受容体の(不可逆性の
)細胞内皮系遮断に対する暗示がある。正確な機構および受容体型はまだ知られ
ていない。
を伴う段階状の行動障害に結びついている。人間の場合、再発性の内因性情動障
害を有する患者から感染性のヒトボルナウィルスの単離後、前記機能障害および
場合によって他の大脳機能障害への関与は非常に蓋然性がある(同様におそらく
神経伝達物質機能に関しても)。躁鬱病の形態を含む内因性の再発性抑鬱状態は
1〜5%で重要な精神医学的疾患に属し、さらにまた該当者にとり侵害の重度に
よって社会にとっても社会経済的な視点から重要な健康上の問題である。
完全に知られていない。感染経過は潜在的かつ活動的な段階を特徴とする。活動
的な段階中に、臨床上の症状が現われることがある。動物(最もよく調査されて
いるのはウマである)の場合、多くの感染は疾患が無い(無症候性の保菌者)。
その数は罹患が登録されたウマ在高の50%にまでなることがある。激しい疾患
に結び付く感染の活動的段階の危険性は発生学上の因子および個体の遺伝的負荷
(ストレス因子、免疫抑制)に左右される。
的な罹患の危険性はないであろう。逆に、すでに症状発現性の情動障害を有する
、情動障害の進展に対して先天的な素因を有する人物の場合、および該人物のま
だ健康な一親等の血縁者の場合、狭義の意味でBDV感染によって増加した罹患
の危険性が与えられている。
ールするためにも、BDV感染の把握に向けて論争の余地の無い信頼できる診断
システムに対する需要の増加がある。
るので、慣例的な抗体試験が知られている。1993年までは血清中の抗体試験
の可能性だけがあった。抗体は一般にBDV核タンパク質p40(40kDa相
対分子量)および燐タンパク質p24(24kDa)に合せている。これらの抗
体はウィルスを中性にしない。やがて特異的抗体の欠失はBDV感染を排除しな
いことが明らかになった。これは、抗体が感染者の血清中に永続しない(または
非常に長く)永続しないことを意味する。さらに人間および動物で自然感染によ
って達成されたAK濃度(力価)は元々ごく僅かであり、より無感覚な試験シス
テムによっては常に検出可能ではない。
Cが単離によって細胞中に検出できるウィルスタンパク質を表現するという発見
によって行なうことができた。これらのタンパク質は時々プラスマ中にも見出さ
れる。タンパク質(AG)形質発現は重要な活性化パラメータであることが証明
された。この活性化は良好に臨床的な罹患と相関関係があり(人間および動物)
、定量的に測定可能であり、別の経過(予後回復の機会、抗鬱剤の要求など)の
評価に非常に重要である。AG決定は、それによって単にウィルス自体を検出す
るが、該ウィルスの現在のまたは予想される将来の活性化に関して何も読取るこ
とができないので、PBMC中のネステッドRT−PCRによる増幅を介したウ
ィルス核酸の検出に置き換えることができない。
、回復期にはもはや検出できない。AKはそれに続き活性化促進のそれぞれの強
度に応じて間欠的に検出可能にすることができ、さらにまた該AKは完全に欠失
することもある。
物)の無症状の間欠期(これは数年かかることがある)で、および既往罹患のな
い感染した個体で、すなわち要約すれば潜在的状態におけるBDV感染で機能を
発揮していない。この両試験パラメータAGおよびAKは、潜在的段階で依然と
して存在する感染の場合に偽陰性に検出されることがある。
階の変化中に非常に長い期間にわたり持続することがある該BDV感染の可能な
限り完全な把握を可能にするために、感染に対する新規の検出方法を開発するこ
とにある。同様にこのような検出のために使用可能の診断キットを提供すること
である。
出方法が考慮されていて、この方法では体液中の被検体液試料で自由に循環する
BDV抗原とそれに蓄積した特異的抗体とから成る免疫複合体が適切な免疫学的
試験によって検出される。従って本発明は特定の疾患段階において体液中で、た
とえば血清中で、高い濃度で循環するBDV抗原と身体によってそのために特異
的に形成された抗体とから成る免疫複合体が発生することを検出できたという重
要な観点に基づく。これらの免疫複合体は特に抗原および/または抗体がまさに
検出できない疾患段階でも存在することがある。
漏なく把握するための完全に新しい診断コンセプトが提示される。それにより新
たに見出されたパラメータCICがすでに公知のパラメータすなわち抗原(AG
)および抗体(AK)と組合せて決定され、これが従来不可能であった永続的な
BDV感染の種々の段階の把握を可能にする。それにより付加的に決定された抗
原は、好ましくは“Nタンパク質”とも呼ばれるBDV核タンパク質p40(4
0kDa相対分子量)および“Pタンパク質”とも呼ばれるBDV燐タンパク質
p24(24kDa相対分子量)である。この組合せによる方法は全部を含む試
験システムを考慮しており、このシステムでは血漿中のBDV特異的な循環免疫
複合体(CIC)、白血球(PBMC)中ならびにプラスマ中のBDV特異的タ
ンパク質(抗原、AG)および/または血漿中のBDV特異的抗体(AK)の決
定から成る試験組合せが実施される。
mlのクエン酸塩添加血のただ1回の血液試料によって決定することができる。
以下の試験を実施する: (1)BDV抗原の抗原検出、 (2)BDV特異的抗体の抗体検出、 (3)CIC検出、好ましくは請求項5ないし9のいずれか1つによる; (b)血液試料から血漿分画および髄液分画を調製し、(a)(1)による試験
を血液試料の場合に髄液分画および/または血漿分画で実施する。
染経過の理解に重要な役割が与えられることを示すことができた。見出されたよ
うに、CICは溶解性の、AK試験で検出可能のBDV抗体よりも著しく長く永
続し、急性の臨床段階においてのみ発生する細胞性BDV−AGよりも長く永続
する。CICはより長い無症状の段階後、AK試験およびAG試験が陰性を示し
、AG遊離とこのAG複合体AKとによる過去の活性化段階への逆推論を許容す
る場合、まだ検出可能である。
タとしてのCICの導入によって、本発明は事前に橋渡しできなかった診断上の
間隙を埋める。
種々のシステム用に公知である。血清中のAKによるAGの自由複合体化および
その逆は、すでに種々の免疫学的試験のために活用されている。BDV感染時の
CICの存在、特に潜在的間欠期でも長く持続する高濃度のCICとそれに関係
する診断上のCICの重要性は従来完全に知られていなかった。
週のコントロールによって例外なく著しく高いCIC濃度を検出可能であるが、
しかしPBMC中の自由AKおよびAGはまったく測定できない。これらの患者
は慣例的な診断によってはそもそも全く検出されなくなる。この感染経過では、
高濃度で形成されるPBMC中に形成されたBDV−AGが即時にプラスマの中
へ入り込み、CIC中に存在するAKによって結合されると推定しなければなら
ない。
る試験組合せは、このため永続的なBDV感染にその潜在期と活性化との間で変
動する経過によって初めて適切に扱われ、それによって罹患した個体の診断上の
世話のためにも健常人における潜在的感染の把握のためにも大きな意義を有する
。
BDV診断を可能にする。健常人の場合の潜在的感染の調査は、少ないウィルス
活性化のために理論的に木目細かなコントロールによってのみ可能であったが、
実際上ほとんど実行できなかった。CIC試験と試験組合せによって潜在的感染
はより健全に見出すことができ、これは感染源および伝染機構が人間と動物の場
合でまだ解明されていないので、疫学上の重要性がある。
、臨床上の罹患に無関係に可能である。本発明による検出方法によって人間と種
々の動物種のためのBDV特異的CICを定量化することができる。
相対的なCIC濃度の定量的決定も力価の形態で可能であるように使用する。
て本発明により以下の段階を有する方法を提案する: (1)適切な方法で必要がある場合はそのために準備された保菌者のFc部位
上に、CIC中に含有された抗原に特異的に結合するモノクロナール抗体または
ポリクロナール抗体の固定; (2)抗体と、CICの存在を試験されるべき体液試料、好ましくは血漿試料
の接触; (3)段階(1)および(2)によって処理された試料と、種の体液試料が使
用された該種の抗体に特異的である被験種、好ましくはヤギ抗種抗体の接触; (4)適切な免疫学上の検出方法による二次抗体の量の検出および/または決
定。
はモノクロナールBDV特異的Nタンパク質および/またはPタンパク質抗体で
ある。
試験プレートまたは対応する試験小管にすることができ、このプレートまたは小
管は好ましくは初めにCIC抗原特異的抗体が得られた種に対して特異的である
二次抗体により可能な限り完全にコーティングされ、それに続くプレート準備段
階でCIC抗原特異的抗体がこの二次抗体層の表面に取込まれる。
リスチレン担体上にC1qから成る基層の取込みによって、抗体を適切に整列し
て確実にプレート上に固定することを可能にする適切な別の方法でも行なうこと
ができる。このような基層の取込みは、一般にコストのかかるCIC特異的抗体
をより節約して扱うことができることを生ぜしめる。
行なうことができ、これで適切な基質によって発色反応が誘発される。目下のと
ころ有利な実施形態では二次抗体がアルカリ性のホスファターゼと結合され、ア
ルカリ性のホスファターゼとパラ−ニトロフェニルリン酸塩との間で黄色の色素
を生ぜしめる反応が利用されることによって、p−ニトロフェニルリン酸塩で視
覚的に可視化もしくは光学式検出器で読出可能にされる。
「異種」として識別された他の種の抗体に特異的である抗体が挙げられる。
ことができる。目下のところ有利な実施形態では、試験が好ましく行われる体液
はクエン酸塩添加血から得られた血漿試料である。ただしそれらの中でも髄液も
使用することができる。
としてBDVに感染した細胞を使用することができる。この試験は、単離された
抗原の代りに(同質化された)抗原を含有する細胞懸濁液が直接使用される場合
、妨害または偽和されない。例に引用した試験(「AK試験」参照)では、たと
えばボルナ病で死亡したウマの10%脳懸濁液を希釈して使用した。
BDVで感染させた胎児ヒト稀突起神経膠細胞を異種ウィルスおよびマイコプラ
スマなしで寄託した。この寄託はブダペスト協定の条件に従って1997年12
月12日に行われた;培養OLIGO/TLには名称および識別番号“DSM
ACC 2334”が指定された。
しに永続的にBDVに感染している。約110の継代接種を通過したこの細胞株
の内部名称は、OLIGO/TL(もしくはOL/TL)である。この細胞から
いつでも本発明による使用に適した抗原を得ることができる。さらに、この細胞
株によって別の細胞株 − たとえば動物細胞株も − 感染させることができ
る。力価は約103FFU/mlである。特にこの細胞は上記抗原p40および
p24も含有する。
有する細胞懸濁液によって、常時BDV特異的モノクロナール抗体またはポリク
ロナール抗体を自体公知の方法で産生することができる。目下のところマウスの
モノクロナールN抗体およびP抗体が有利である。そのため、通例のように、マ
ウスが感染もしくは免疫性にされ、そのB−細胞からハイブリドーマ培養が製造
される。上澄液はBDV特異的に“着色”する抗体で連続的に試験される(スク
リーニング)。抗体の獲得に関しては“H.Ludwigら、Arch.Vir
ol.(1993)Suppl.7:111−113”も参照。
くはこの試験または検出システムはBDV特異的モノクロナール抗体またはポリ
クロナール抗体、試料がBDV抗原またはBDV−CICを含有することが推測
される該試料と前記抗体の接触手段、ならびに蓄積された抗原または抗原抗体複
合体(CIC)の検出手段を含有する。選択肢として、このキットはBDV抗原
でコーティングBDV特異的モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体、試
料がBDV抗体を含有することが該試料から推測される場合、該試料とこの抗原
コーティング抗体の接触手段、ならびにその場合に蓄積したBDV抗体の検出手
段を含有する。
動化されて存在する該ユニットを包含してもよい。このようなユニットは一定の
方法で準備した試験プレートまたは内部をコーティングした試験小管とすること
ができる。
クロナールの、ある種Iから得られた抗体であり、これは該抗体がもう1つの種
(種II)から得られた種II抗種I IgGによってコーティングされた担体
上に、好ましくは試験プレートまたは試験小管の形態で取込まれ、それによって
固定されていることによって不動化されている。
ス抗体、好ましくはPタンパク質および/またはNタンパク質特異的モノクロナ
ールのマウス抗体であり、担体の吸着性のコーティングが抗マウスIgG、好ま
しくはヤギ抗マウスIgGから成る。選択肢としてBDV特異的抗体はユニット
上にまたはその中にポリスチレン結合C1qを介しても固定もしくは他の適切な
方法で不動化することができる。
合せの技術的な詳細を説明する。この応用は個々の例によって解明する。これら
の例は単に解明上の目的に利用する。もちろん本発明の原理は他の方法に置き換
えることもできる。
の場合、0.106モルのクエン酸ナトリウム−2−水化物溶液9mlの1ml
に静脈の発端者血液を加えて、よく混合する。推奨に値するのは既製のクエン酸
塩小管、たとえばSarstedtの10mlモノベッテ9NCの使用である。
この試料は発送するまで調査実験室に4℃で保管しなければならない。冷却(期
間1日〜最長3日まで)しないで速達による発送は、試料品質を損わない。
分とに分離する。プラスマ分画はCIC、AGおよびAKの試験に使用する。白
血球(PBMC)の細胞分画は調製後AG試験に使用する。CICに関してのみ
試験される場合またはプラスマ試験のみを実施する場合、細胞分画を除くことが
できる。
l分離溶液(バイオクロム)を使用する。
分離溶液を満たし、その上に最大6mlクエン酸塩添加血を入れる。
ist Minifuge)で遠心分離する(Ficoll<1.090密度を
有する全試料に);密度1.090を有するFicollで20分間1249g
(2400rpm)で遠心分離する。
く;同日の即時試験のために4℃で保管し、後の試験用には−20℃で保管する
。
成し、他方(不要の)Ficoll中の赤血球はペレットとして存在する。プラ
スマの除去後、細胞環を使い捨てパスツールピペットで採取し、新しい円錐形の
10mlプラスチック小管の中に移し、PBSを満たし、よく混合する。
離する。上澄液を捨て、ペレットを最大0.5ml PBS=約10倍に濃縮の
中に取込む。溶液をねじキャップ付きの滅菌凍結小管(たとえばNunc、1.
5ml)の中に移す。
保管を4℃で、後の試験の場合に最低−20℃で、より良くは−70℃で保管。
の試験のためにEIA(酵素免疫定量法)−ベース(固相定量法)の試験組合せ
を使用する。第1の両試験段階は3つの試験システム全てに等しい。従って試験
プロトコルの形式における以下の説明は次のように分けられる: (A)試験プレートのコーティング(A1およびA2) (B、C、D)AG、CICおよびAK試験用プロトコル
ジュール(Nunc(R)Maxi Sorp F8、Cat.No.4699
49)を使用する。1つのフレームの中に垂直に配置した8つの平らなプラスチ
ック凹部を備えた12モジュールを挿入し、正確に96穴の微量滴定プレートの
寸法を有する(EIAシステム用の標準):
gG、Fcフラグメント、ヒト、ウシ、ウマ血清タンパク質(Dianova(
R)、Kat.Nr.115−005−071)に対して吸着し、結合緩衝液中
で1:1000(=ミリメートルあたりタンパク質1.8μg)に希釈する;夜
通し4℃でまたは2時間37゜でインキュベート。
Pタンパク質p24に対するモノクロナール抗体(W1およびKFU2、参照文
献:Arch.Virol.(1993)Suppl.7:111−133)(
“捕捉”抗体として)、それぞれ希釈緩衝液中で1:500に希釈。2時間37
℃でまたは夜通し4℃でインキュベート。
る。
)(Branson Sonifier B15P;参照文献Mol.Psyc
hiatry(1996)1:200−212)。
.1mlをのせ、Aで超音波処理したPBMC(0.1ml)または血漿(0.
1ml)を加え(=1:2)、別の7段階でベース2(1:256まで)にさら
に希釈する;夜通し4℃でインキュベート。 洗浄緩衝液中で3回洗浄
12、免疫蛍光力価1:10000)(=検出抗体)を対応する希釈比(1:1
000、IF力価より10倍に濃縮)で希釈緩衝液の中へ;2時間37℃でイン
キュベート。 洗浄緩衝液中で3回洗浄
finiPure(R)ヤギ抗イエウサギIgG、Fcフラグメント特異的、ヒ
ト血清タンパク質(Dianova(R)、Kat.Nr.111−055−0
46)に対して吸着(=二次抗体)、抱合体希釈緩衝液中で1:3000に希釈
;1時間37℃でインキュベート。 洗浄緩衝液中で3回洗浄
リン酸塩;Sigma、基質ペレットとして入手可能)を基質希釈緩衝液に;室
温で5−10分間、もしくは陽性検査で発色反応(無色から黄色へ反転)が現わ
れるまでインキュベート。
50EIA READERまたはDynatech)にて405nmで測定;“
ブランク”−非転換基質に対する測定。準定量評価で十分:(+)=弱陽性ない
し最大4+=非常に強い陽性;+/−は限度値を表し、第2回目の調査を必要と
する。(例は応用の場合を参照)。
各凹部の中へ取る;Aで:希釈緩衝液0.09mlを加え+I.で調製した血漿
0.01ml(=希釈1:20)を、別の7段階でベース2(1:2560まで
)にさらに希釈する;37℃で1−2時間インキュベート(標準時間:37℃で
1時間)。 洗浄緩衝液中で3回洗浄
抗種(試料の種に対応)IgG、Fcフラグメント(同様にDianova(R
)から入手可能)(=二次抗体)、抱合体希釈緩衝液中で1:3000に希釈;
37℃で1時間インキュベート。 洗浄緩衝液中で3回洗浄
リン酸塩;Sigma、基質ペレットとして入手可能)を基質希釈緩衝液の中へ
;室温で5−10分間もしくは陽性検査で発色反応(無色から黄色へ反転)が現
われるまでインキュベート。
Dynatech)にて405nmで測定;“ブランク”−非転換基質に対する
測定。準定量評価で十分:(+)から4+まで(試験Bも参照);しかし同様に
最終点決定による力価表示も可能(例は応用参照)。
検出抗原)を対応する希釈比(1:50)で希釈緩衝液の中へ;選択肢として1
997年12月12日にNr DSM ACC2334でDSMZに寄託した永
続的にボルナ病ウィルス株に感染した細胞株の細胞培養上澄液を希釈緩衝液中1
:100〜1:300の間で希釈して使用することができる(ウィルス力価10 6 ffu/ml:1:300で)。4℃で夜通しインキュベート(ffu=fo
cus forming unit)。 洗浄緩衝液中で3回洗浄
各凹部の中へ取る;Aで:希釈緩衝液0.08mlを加え+I.で調製した血漿
0.02ml、前希釈1:5、(=希釈1:50)を、別の7段階でベース2(
1:6400まで)にさらに希釈する;37℃で1時間インキュベート。 洗浄緩衝液中で3回洗浄
抗種(試料の種に対応)IgG、Fcフラグメント特異的(Dianova(R
))(=二次抗体)、抱合体希釈緩衝液中で1:3000に希釈;37℃で1時
間インキュベート。 洗浄緩衝液中で3回洗浄
リン酸塩;Sigma、基質ペレットとして入手可能)を基質希釈緩衝液の中へ
;室温で5−10分間もしくは陽性検査で発色反応(無色から黄色へ反転)が現
われるまでインキュベート。
Dynatech)にて405nmで測定;“ブランク”−非転換基質に対する
測定。評価方法は試験Cの通り。
A.bidestへ
l A.bidestへ
idest pH7.6へ
なければならない。
、次いで1000mlまで満たす。
を加え、pH9.8に調整する。
7ベルリン 2.クエン酸塩小管:Sarstedt、D−51588ニュンブレヒト 3.EIA微量滴定−ストリップ(Maxi Sorp Immunoモジュ
ール)F−型:Nunc、Roskilde、デンマーク 4.二次抗体用酵素抱合体:Dianova、製造者:Jackson Im
muno Research Labs Inc.、ウェスト グローブ、ペン
シルベニア州、米国 5.EIA−試験用洗浄装置:Dynatech Ultrawash pl
us;Dynatech Labs.Inc.、キャンティリー、ヴァージニア
州、米国 6.酵素抱合体用基質(アルカリ性ホスファターゼ用): Sigma Chemical Co.、セントルイス、ミズーリ州、米国 7.KCLを除く緩衝液物質(IIIに):Merck KGaA、D−64
271ダルムシュタット、Fluka Chemie AG、CH−9471ブ
フス 8.光度計(微量滴定プレート用):BIO RAD Labs.Hercu
les、カリフォルニア州、米国またはDynatech Labs.Ind.
、キャンティリー、ヴァージニア州、米国 9.PBMCの細胞単離用超音波装置:Branson Sonifier、
B15JP、Branson Sonic Power Company、ダン
バリー、コネティカット州、米国
。結合部位は変わらない。すなわち宿主種すべてにわたって識別される。抗体は
参照文献Arch.Virol.(Suppl)(1993)7:111−13
3に特徴づけられている。
する。結合部位は変わらない。すなわち宿主種すべてにわたって識別される。抗
体は参照文献Arch.Virol.(Suppl)7:111−133(19
93)に特徴づけられている。
1aに同じ)。この血清は免疫蛍光試験で1:2000の最小力価を有し、ウェ
スタンブロットでBDVの少なくともNおよびPタンパク質(p40およびp2
4)を識別しなければならない。ボルナウィルスは現在の研究水準によれば遺伝
学的に非常に安定しているので、すなわち種々のウィルス株の中に僅かな配列差
が見出されているだけなので、ポリクロナール抗血清は一般に異なる種のボルナ
ウィルスのタンパク質を識別する。
然変異を示すにもかかわらず、従来得られていた僅かなヒト株にも該当する(参
照文献Mol.Psychiatry(1996)1:200−212;Vir
us Res.(1996)44:33−44)。
られた抗血清に加えて、種々のヒトBDV株による実験的な感染によって作られ
た特定のイエウサギ血清を使用し(参照文献Mol.Psychiatry(1
996)1:200−212)、ウィルス性タンパク質の全スペクトルを識別す
ることができる。
質(特にNおよびPタンパク質)を含有する。BDV感染の結果として現われる
致死性の進行性(progrediente)の神経学罹患は段階的に発生し自
発的に減退する行動障害もしくは臨床的症状が現われずに経過するBDV感染に
比べてまれである(参照文献:Arch.Virol(1997)Suppl.
13:167−182)。いわゆる典型的なボルナ病と呼ばれる脳炎は、おそら
くコントロールがきかなくなったウィルス産生に起因する。脳内のウィルス力価
は105〜106FFU/mlに達し、それにより実験的に感染した実験室動物
の範囲にある(参照文献:Prog.med.Virol(1988)35:1
07−151)。
使用することができる。上記構造におけるAK試験のために、永続的にBDV(
動物および人間株)に感染した細胞株から成る懸濁液も使用可能である。後者は
特に標準化目的に適している。使用可能の細胞株はブダペスト協定に基づき番号
DSM ACC 2334のもとにDSMZに寄託されている(寄託日1997
年12月12日)。 一定の抗原溶液は陽性検査として試験B(AG試験)に使用可能である。
ータ、すなわち抗原(AG、試験B)、循環免疫複合体(CIC、試験C)およ
び抗体(AK、試験D)のための三重試験として考案されている。これらの試験
は、たとえば全く特定の予測された疾患段階の検査のために、それぞれ個別的に
実施することもできる。これらの試験は固相定量法として構成されていて、光度
測定により評価される。試験反応および経過は今日実験室標準である微量滴定シ
ステムで行なう。
く利用される。ベースコーティングはこの試験組合せの核心部であり、高いBD
V特異性に対して責任を負う。これはボルナウィルスのNおよびPタンパク質(
p40、p24)の典型的なエピトープに向けられた2つのモノクロナール抗体
から成るセットにより作られる。この“捕捉”抗体の非常に効果的な使用は抗マ
ウス抗体によるプレコーティングによって達成される。このプレコーティングが
無い場合、特異的モノクロナール抗体のアフィニティクロマトグラフィの洗浄が
必要である。AG検出用の試験BではPBMCまたは血漿中に(自由に)存在す
るp40およびp24タンパク質が“捕捉”抗体によって結合される。同様にB
DV特異的であるイエウサギのポリクロナール検出抗体により、結合した抗原は
試料から識別され、酵素結合指示薬系を介して可視化される。このいわゆる“二
重サンドイッチ方式”は多量の細胞タンパク質中の少量のBDV抗原を2種類の
抗体系への特異的結合によって検出可能になるという長所を有する。
「捕捉」−抗体によって結合される。免疫複合体の抗体部は次の反応段階で酵素
標識された抗−抗体(二次抗体)と結合し、これは指示薬系を介して可視化され
る。この実際上当惑させる簡単な試験構造により、BDV特異的であり、それに
より診断的に重要であるCICだけが可視化される。この試験は本発明の核心部
であり、従来存在していた診断上の間隙を埋める。BDV特異的CICは本発明
者によって見出され、その検出が開発された。
に抗するBDV抗体が、あらかじめ“捕捉”−抗体によって結合された検出抗原
溶液を介して決定される。特異的に結合した抗体は、酵素標識された抗−抗体(
二次抗体)、指示薬系を介して可視化される。試験構造は検出抗原溶液として洗
浄されていない感染した脳または細胞培養懸濁液を、特異性を失わずに使用でき
るという長所を有する。この特異性は“捕捉”−抗体によって保証される。
チック担体に結合されなければならない常に洗浄された抗原溶液が必要になるで
あろう。これらの試験はたしかに実施においてより短くなるが、抗原洗浄によっ
て労力およびコストがかかる。
(参照文献:J.Med.Virol.(1992)36:309−315)。
この試験は新しいシステムに比べ、結果が定量的および定性的に他の実験室と比
較することができるという長所を有する(Review:CTMI(1995)
190:103−130)。免疫蛍光力価は一般にEIA力価よりも低い。第V
II部に示した縦断面調査では、血清学的な基礎に基づいてのみ調査された別の
結果との比較可能性を保証するために、抗体が免疫蛍光によって決定された。試
験組合せに示したEIAベースのAK試験はより高い感受性によって抗体の検出
方法を改善するが、最終結果で序文に記載した低い力価および検出限界を下回る
低下では何も変化しない。このため従来の方法で欠けているAK検出はBDV感
染を除外しない。自由抗体の一過性だけの発生はCIC形成によって説明可能で
ある。
ている。cAGは疾患段階の短い間だけ測定可能である。
生する。一般にcAGより少し遅く現われ、さらにまた多くは該cAGと同時に
現われ、しばしば数週間で検出可能である。pAGは同様に疾患段階中の急性マ
ーカーである。ただし該急性マーカーの検出可能性は抗体およびそれに続くCI
C形成の速さに依存する。経過調査(毎週)では、個々の試料でpAGのみが陽
性に測定されることが確認された(たとえば1週目;pAGのみ、2週目:pA
G+CICなど)。
マーカーである。抗ウィルス性の治療下で長期的にCICの消滅が観察され、も
しくは新規形成が全く観察されなかった。CICの半減期は理論的に4週間にな
る;ただしCICは急性疾患発生後4週間でもしばしばまだ検出可能である。治
療しない場合、CICの代謝レベルは一般に維持されたままになる。CICの測
定は、そのため潜在的感染のスクリーニングとして健常人にも適している。
抗体力価は、抗体が免疫複合体中で結合されるので、低いかまたは検出できない
。抗体は回復期でより良く検出可能である。(注釈:以前に第三者側から刊行さ
れたデータが常に著しく非感受的である免疫蛍光試験(IF)に係わるため、そ
の結果、時々抗体が検出可能であったことについて指摘する)。
なウィルス感染のこの型にとって(活性化段階中の低い増殖率により)診断的に
複数のパラメータの検出が好適であることを示す。
れらの例は、特に7か月までの長い観察期間が平均を超える大きい試料数(1つ
の個体から23まで)によって調査することができたため、複数から選択された
。
or depressive disorder)、さらに神経性の関与 − 調査:急性の抑鬱状態の症状発現 − 観察期間:27週間(約7か月、1996年5月〜11月) − 試料数:23、その中の13は毎週間隔で − 概要試験結果: 抗原:4/23 CIC:23/23 抗体:0/23 経過詳細:表1
の症状発現;自然治癒(Arch Virol(1993)Suppl 13、
in press) − 調査:急性疾患段階でおよび回復後 開始:疾患開始後3週間 − 観察期間:28週間(7か月、1995年6月〜1996年1月まで) − 試料数:8(6完全調査) − 概要試験結果: 抗原:4/6 CIC:4/6 抗体:5/6 経過詳細:表4
); 第1症状発現1994年に、これは自然治癒 − 観察期間:14週間(1996年5月〜8月まで) − 試料数:3血液試料、1髄液試料 − 概要試験結果: 血液:抗原:2/3 CIC:3/3 抗体:0/3 髄液:AG:所見+/0 CIC:1/1 抗体:0/1 経過詳細:表5
対応する経過がある。これらの経過は、急性疾患段階で調査して、再発性(rM
DDまたは分極罹患)の情動罹患にとり典型的である。
抗原および抗体はもはや検出できない。CICの永続性の期間および力価高さは
先行するBDV感染の活性化段階の強度に依存する。我々のこれまでの調査にれ
ば、CICは少なくとも3か月継続する(疾患症状発現後)。非常に長い無症状
の間欠期(たとえば数年)の場合、まったく体系的な調査がない。個々の調査か
ら、我々はCICも消滅することがあることを知っている。長い健康の間欠期後
の新たな抑鬱状態の症状発現の開始には、3つのパラメータの全ての状態が開始
調査で陰性になることがある。従って確実にBDV感染を排除できるようにする
ため、ただ1回の調査だけでは十分ではない。むしろ少なくとも疾患症状発現の
最初3分の1で第2の調査が必要である。感染がある場合、一般にその場合は少
なくともCICがまだ陰性AGもしくはAK所見で見出される。
およびAGとAKを併せて考慮する新しい三重試験によって、十分な安全性で識
別できることを意味する。
しばしばCICによってのみ検出可能である。健康なストック中の調査例はX.
以下に記載した。
該患者では急性疾患段階において毎週の検査でほぼもっぱら非常に高いCIC濃
度になるが、しかしPBMC中には自由抗体を全く検出できず、ごくまれにAG
が検出可能であった(序文も参照)。我々は、PBMC中に形成されたBDV−
AGが即時にプラスマの中へ入り込み、CIC中に存在する抗体によって結合さ
れることを想定する。このような患者は従来の試験方法によってはCICを考慮
せずに実質的に検出できないであろう。
しただけでなく、各々1つだけモノクロナール“捕捉”−抗体の使用により(試
験段階A2)それぞれp40またはp24により形成されたCICの量を決定し
た。補充表ではp40−CICおよびp24−CICの量が明らかに変化し、時
間的な濃度特性が識別可能になることが明らかである。これらのデータはCIC
検出の非常に高い特異性に関する付加的な証拠としても提供される。すなわちA
2(“捕捉”−AKの選択)でそれぞれのプレコーティングに応じて、CICは
個々のウィルスタンパク質に関しても決定することができる。
2 2204 11 +++ 0.830 +++ 0.820 陰性コントロール 0.05絶滅の場合:
た多数の患者にも当てはまる。急性マーカー“PBMC中のAG”はピーク値の
形態で検出可能であるが、数週間にわたるプラトーとしては検出できない。しか
しCIC測定は、抗原が連続的に一団で形成され、細胞からの抽出後に抗体によ
って複合体化されることを示す。従って自由抗体は散在的だけでも全間欠期にお
いて検出可能である。
きた。最も信頼できるパラメータは再びCICの形態で可視化できた。この例は
、比較的低くかつ短い抗原産生の場合でもCICが検出可能であることを示して
いるが、ただしその場合は低濃度でのみ検出可能である。
18疾患週(第15試験週)で少し後退;第20疾患週以降は完全治癒まで常時
回復。
完全治癒には至らなかった。ただし陽性抗体試験の頻度はむしろ非典型的であり
、これはおそらくPBMC中の非常に強い抗原産生(まれにこのように高い)に
起因している。疾患段階がより短い場合、抗体は一般に同様に散在的であり、抑
鬱状態のヒト患者の場合のように低い力価で検出可能である。
では、それにもかかわらずプラスマ中に自由抗体を検出することができなかった
。この感染は重度の疾病にもかかわらず血清学的な方法によってだけでは検証で
きなかったであろう。このウマの場合、過度のCIC力価およびPBMC中のA
Gが見出されている。これは、最終的にコントロール不能に陥らざるを得ないウ
ィルス感染の強い活性化段階を示している(髄液も陽性であった)。 非常に高いCIC力価は、ヒト患者の場合のように、BDV感染したウマの場合
もむしろまれである。
べきである。各パラメータは、試料あたり8段階の希釈系列で測定される。希釈
と平行に減少する絶滅は力価評価で付加的な安全性を与える。該絶滅は考慮して
よいが、しかし最終点力価決定のために考慮してはならない。
絶滅減少を検出できなければならない。限度値の試験は非常にまれである。なぜ
ならバックグラウンド発色がまったく発生しないからである。前記絶滅範囲は基
準値とみなす。
にバックグラウンド発色):0.1〜<0.2絶滅。 +/−限度値0.2〜0.3 1:50および1:100の場合、次いで減退 (+)弱陽性>0.3〜0.4 1:50の場合、透明の希釈系列 +陽性>0.4−0.6 1:50の場合 ++やや陽性>0.6−0.8 1:50の場合 +++強陽性>0.8およびそれ以上 1:50の場合
陰性コントロールのベース絶滅は>0.2であってはならない。
準定量的な評価を優先する。AK試験のための例はIX以下に記載する。
である。CICパラメータは経過調査で以前の間欠期を評価する。CIC値がこ
の間欠期に上昇する場合、これはウィルス抗原が形成されていて、試験時点です
でに複合体の形態で存在することを意味する。自由抗体が検出可能かどうかは、
抗原産生との関係で抗体産生によって決定される。抗体産生がまさに初めて活性
化一団によって新たに開始された場合、殆ど自由抗体は検出できないが、それに
対しCICは検出可能である。後の時点で抗原産生が減少する場合、自由抗体の
検出の機会が増大する(同時のCIC検出ありまたはなし)。 この関係を考慮する三重試験の解釈は臨床的な経過の評価に非常に役立つ。
ていない。 3.AG陽性 CIC陽性 AK陰性または陽性 感染があり、活性化開始はすでに数週間前であるが、活性化は調査時点でまだ
急性である。 4.AG陰性 CIC陽性 AK陰性または陽性 感染があり、活性化開始はすでに数週間前であり、場合によっては数か月前で
ある(それぞれの調査間欠期による)。活性化は調査時点の直前でもはやない。
初回調査の場合、:“感染がある”という明言だけを行なうことができる。 5.AG陰性 CIC陰性 AK陰性 BDV感染の徴候なし。急性疾患段階で2つの完全な陰性試験の場合、感染を
除外することができる。
ても抗ウィルス性の治療の終了前(Lancet(1997)349:178−
179)に要求される。
マーカーであることを示している。該マーカーはすでに実施された臨床的な回復
後の最後のパラメータとしてまだしばしば検出可能であるが、治療の継続により
後に消滅する。
異なり、ここでは強陽性のヒト試料(1437)と弱陽性(AGにとっては完全
に陰性の)試料(890)とが完全な希釈系列で表わされなければならない。両
試料は米国から由来し、4日間を要する輸送後同一の試験項目で4/94で試験
された。
試験0.1〜0.5の場合、非典型的、やや増加した“バックグラウンド”
とができる)。
明らかにより低くなる。試料1437では配列3(VIII、評価参照)が当て
はまる。すなわちAG陽性、CIC陽性およびAK陽性である。感染の活性化段
階は急性であるが、すでに数時間経っている。さらに注目すべきことは、標準免
疫蛍光試験がまさにまだ検出可能の1:10の力価を生じたのに対し、三重試験
セットのAK試験はより高い感受性に基づき明らかに陽性のAK結果をもたらし
た。
準抗体試験は同様に陰性であった。この両方のパラメータによっては潜在的感染
は識別できなかったであろう。両方の抗原および対応するAK試験(三重セット
)のためのCIC試験は限度値であった。すなわち感染の疑いがあった。このよ
うな場合には、上述のように個々の抗原のための試験の応用が解明の機会を提供
する。それ以外このような場合には、明確な結果に到達するため、別の継続試料
を調査する必要がある。試料890にはVIII(評価)における配列4(もし
くは5)が当てはまる。
血培養ウマがBDVについて調査された。この場合、三重組合せからAG試験お
よびCIC試験が使用された。抗体は標準免疫蛍光試験によって調査された。タ
ネウマ飼育場あたりの調査したウマの平均の数はa6.7+−5.1であった。
4%)。活性化された感染の徴候としてのPBMC中のAGは、221頭のウマ
のうち38頭だけであった(=17.2%)。AK(IF試験)は222頭のう
ち68頭(=30.6%)に検出された。両方の百分率は健康な在高の中の他の
調査に相当する。しかし実際の浸潤はCIC試験によって初めて明らかになる。
我々は陽性CICを219頭のウマのうち156頭に見出した(=71.2%)
。ウマの4分1強(26.2%)でCICがただ1つの感染マーカーであった(
221頭の動物のうち58頭)。すなわち各々4頭に1頭の健康な動物は潜在的
に感染していたが、CICパラメータを介してのみ検出することができた。
の完全な滴定による調査結果をまとめる。
Nr.529)の高齢にかかわらず、CIC値は必ずしも高くなっていない。
ウマ2a(495)は感染していて、平均のCIC値を有していた。メスウマ2
b(8496)は、それに対しCIC陰性であって、感染していなかった。
を示す(23歳および9歳)。より若い動物は非常に高いCIC値を有していた
。
であることが等しく当てはまる。
スマ中の抗体(AK)と、新たに見出された血漿中の試験パラメータ“循環免疫
複合体”(CIC)の組合せによって初めて種を包含する(ほぼ)遺漏のないB
DV感染の種々の段階の検出を可能にする。3つのパラメータは、全てただ1つ
の血液試料によって決定することができる。本発明に初めて記述された、唯一の
長期に永続する感染マーカーとしてBDV特異的CICの検出は、健康な保菌者
の検出(潜在的感染)も罹患した個体における感染経過および治療効果の評価を
も可能にする。その場合、体液中の被検体液試料で自由循環免疫複合体がBDV
抗原とそれに蓄積された特異的抗体とから適切な免疫学的試験によって検出され
る。
続的に変化し、永続的ウィルス感染のこの型にとり(活性化段階中の低増殖率に
より)診断的に複数のパラメータの検出が好適であることを概略的に示す。記載
されているのは、それぞれ“数週間”にわたる405nmでの絶滅である(調査
経過)。各図面は以下の経過を示す: CIC−循環免疫複合体 cAg−細胞抗原 pAg−プラスマ中の抗原 Ab−抗体(EIA)
歳のrMDD患者のデータを示す(抗原抑鬱薬による治療、非抗ウィルス性)。
調査期間は約3か月であった(18週間)。試験システム:EIA;希釈:cA
G1:2、CIC1:20、pAG1:2、1:100以上;排除限度0.1試
料源:cAG用:cAG用に超音波処理したPBMC、その他対応するプラスマ
試料。
ssive compulsive disorder入院による臨床的処置中)。BDV感染はこの患者 の場合、抑鬱状態の患者の場合と同様に重要な役割を演ずる。両患者グループ
− 抑鬱状態もOCD患者も − セロトニンコントロールされた過程を妨げら
れることがある。これは、BDVウィルスが機能的に一定の位置を脳内と神経節
に係合するので、それと関連していると思われる。図1および図2は互いに類似
のパラメータ推移を示す。
ではそれぞれ試料を1つだけ調査した。pAG(自由プラスマ抗原)およびAb
(=自由プラスマ抗体(AK)、EIAで測定)とCICの関係を良く識別でき
る。試料4311は1997年3月に(疑いのある)臨床診断に基づき“ボルナ
病”が調査された北ドイツ(原始細胞G.)産のウマから得られた。IF抗体力
価は1:40であった。試料5231は、1997年5月に臨床診断に基づきボ
ルナ病が調査された南ドイツ(原始細胞D.)産のウマから得られた。IF抗体
試験は陰性であった。このウマは2か月前に、1997年3月に罹患し、感情鈍
麻および嗜眠状態を示した。5月にまだ残っていた症状は首振りと硬直した歩み
であった(EIAの測定パラメータ:希釈cAG1:2、CIC 1:20、p
AG1:2、1:100以上、排除限度=0.1、試料基礎:cAg:超音波処
理したPBMC、その他は対応するプラスマ試料)。
)〜c)は情動障害における高い陽性の抗原マーカーと、d)は精神分裂病にお
ける陰性の試験結果とを示す。
歳。
9歳。
; 患者62:精神分裂病、偏執症性型、非特異的、女性、37歳; 患者130:精神分裂病、偏執症性型、準慢性、女性、20歳
のプロトタイプとみなされる。BDVは神経細胞、さらにまた大脳中の非神経細
胞および細胞を破壊しない身体に感染する。BDV感染は永続的である。該BD
V感染は人間および多くの家畜および有用動物に現われる。ヒトBDV感染は高
い確率で段階的な情動障害に関与していて、動物の場合、BDVは段階的な行動
障害を引起こす。個体の危険因子は潜在的感染の活性化の頻度とそれにより罹患
危険性とを決定する。無症状の保菌者はそれぞれの種の中に存在する。診断はウ
ィルスの低増殖率と長い潜在的段階とによって困難になる。
マ中のAKと、新たに見出された試験パラメータ、血漿中のCICの組合せによ
って人間および動物におけるボルナ病ウィルス(BDV)による感染のほぼ遺漏
のない検出を可能にする。3つのパラメータは全てただ1つの血液試料(10m
lクエン酸塩添加血)によって決定することができる。
のBDV特異的CICの検出は、健康な保菌者の検出(潜在的感染)も罹患した
個体における感染経過および治療効果の評価をも可能にする。
9歳のrMDD患者のデータを示すグラフである。
=obsessive compulsive disorder入院による臨床的処置中)。
物)の無症状の間欠期(これは数年かかることがある)で、および既往罹患のな
い感染した個体で、すなわち要約すれば潜在的状態におけるBDV感染で機能を
発揮していない。この両試験パラメータAGおよびAKは、潜在的段階で依然と
して存在する感染の場合に偽陰性に検出されることがある。 『臨床微生物学ジャーナル』、1979年、35巻、7号、1661乃至16 66頁、T・ホリモト他(MEDLINE記事番号97339570による)では、BDVに特 異的な抗体を検出するELISA試験が記載される。この試験では、このBDV 核タンパク質に特異的な抗体を取り出して検出するために、マイクロウエルプレ ートに、BDVp40抗原が被覆された。そこでは、他の方法でセロポジティブ で事前に試験された多くの試料が、抗体に関して陰性の結果を生じることが認め られた。このことから、偽陽性の結果の高い割合が他の実験において存在したで あろうとの結論が導き出された。しかし、これらの結果からは、BVD感染が抗 体力価によっていずれにせよ検出されないとの結論も導き出されるであろう。従 って、完全な診断思想が必要と思われる。
出方法が考慮されていて、この方法では体液中の被検体液試料で自由に循環する
BDV抗原とそれに蓄積した特異的抗体とから成る免疫複合体が適切な免疫学的
試験によって検出される。従って本発明は特定の疾患段階において体液中で、た
とえば血清中で、高い濃度で循環するBDV抗原と身体によってそのために特異
的に形成された抗体とから成る免疫複合体が発生することを検出できたという重
要な観点に基づく。これらの免疫複合体は特に抗原および/または抗体がまさに
検出できない疾患段階でも存在することがある。 基本的には、免疫複合体、すなわち、抗原及び抗体からなる血液中で自由に動 き得る複合体の存在は既に知られている。しかし、これらの複合体の重要性は、 個々の場合で非常に異なっている。 R・F・マセイェフ(他)[編]『免疫学的分析の方法』VCH出版協会、ヴ ァインハイム(他)、1993年、第1巻の646乃至656頁に記載の、U・ E・ニデッガー著の論文からは、例えばHIVに特異的なCIC用のELISA 試験が知られている。著者等は、HIV陽性の麻薬中毒において循環免疫複合体 の高いレベルを発見した。これに関しては、CIC中に普遍的に存在する血清I gGの約10分の1のみが複合体化されたことが記述されている。従って、CI Cの意義は明らかにウイルスに特異的である。BDV感染の場合に、部分的にH IV感染の場合のように、自由循環免疫複合体の割合がしばしば非常に高いこと があるので、「フリー」の抗体及び抗原はその中で著しく結合されている可能性 がある。
えばマウスから得られたモノクロナールBDV特異的Nタンパク質および/また
はPタンパク質抗体である。
Claims (15)
- 【請求項1】 ボルナ病ウィルス(BDV)感染の検出方法であって、体液
中の被検体液試料でBDV抗原とそれに蓄積した特異的抗体とから成る自由循環
免疫複合体が適切な免疫学的試験によって検出されることを特徴とする方法。 - 【請求項2】 請求項1に記載の方法であって、永続的BDV感染を実質的
に遺漏なく把握するために、付加的に、好ましくはBDV核タンパク質p40(
40kDa相対分子量、“Nタンパク質”)および/またはBDV燐タンパク質
p24(24kDA相対分子量、“Pタンパク質”)のBDV抗原検出および/
またはBDV特異的抗体の抗体検出が実施される方法。 - 【請求項3】 請求項1または2による方法であって、前記体液試料が血液
、尿、または髄液試料であることと、以下の(a)および(b)の処理を行い、 (a)血液試料から血漿分画を単離し、血漿、髄液または尿試料で互いに別々
に以下の試験を実施する: (1)BDV抗原の抗原検出、 (2)BDV特異的抗体の抗体検出、 (3)CIC検出、好ましくは請求項5ないし9のいずれか1つによる; (b)血液試料から血漿分画および髄液分画を調製する: 前記(a)(1)による試験を、血液試料の場合には髄液分画および/または
血漿分画で実施することとを特徴とする方法。 - 【請求項4】 請求項3に記載の方法であって、前記被検体液試料が血液試
料であり、全ての調査が1つの血漿試料で実施される方法。 - 【請求項5】 循環免疫複合体、特にBDV特異的CICの体液中の検出方
法であって、以下の段階を実施する方法: (1)適切な方法で必要がある場合はそのために準備した保菌者のFc部位上
に、CIC中に含有された抗原に特異的に結合するモノクロナール抗体またはポ
リクロナール抗体を固定すること; (2)固定された抗体と、CICの存在を試験されるべき体液試料、好ましく
は血漿試料をと接触させること; (3)段階(1)および(2)によって処理された試料と、種の体液試料が使
用された該種の抗体に特異的である被験種と異なる種の二次抗体、好ましくはヤ
ギ抗種抗体とを接触させること; (4)適切な免疫学上の検出方法による二次抗体の量の検出および/または決
定を行うこと。 - 【請求項6】 請求項5に記載の方法であって、段階(1)で使用した抗体
が、たとえばマウスから得られたモノクロナールBDV特異的Nタンパク質およ
び/またはPタンパク質抗体である方法。 - 【請求項7】 請求項5または6に記載の方法であって、前記担体が吸着的
に固定するプラスチック試験プレートであり、このプレートが初めにCIC抗原
特異的抗体が得られた種に対して特異的である二次抗体により可能な限り完全に
コーティングされ、それに続きCIC抗原特異的抗体がこの二次抗体層の表面に
取込まれる方法。 - 【請求項8】 請求項5または6に記載の方法であって、CIC抗原特異的
抗体の固定が、この方法の段階(1)でポリスチレン固定されたC1qで行われ
る方法。 - 【請求項9】 請求項5ないし8の何れか1項に吉舎の方法であって、前記
の段階(4)による二次抗体の検出が、EIAまたはRIA法を介して行なわれ
、好ましくは、二次抗体がアルカリ性ホスファターゼと結合され、p−ニトロフ
ェニルリン酸塩による発色反応を利用して視覚的に可視化または光学式検出器で
読出可能にされるように行われる方法。 - 【請求項10】 BDV感染検出用の診断キットであって、BDV特異的モ
ノクロナール抗体またはポリクロナール抗体と、試料がBDV抗原またはBDV
−CICを含有することが推測される該試料と前記抗体とを接触させる手段と、
蓄積された抗原または抗原抗体複合体(CIC)を検出手段とを具備する診断キ
ット。 - 【請求項11】 BDV感染検出用の診断キットであって、BDV抗原でコ
ーティングされたBDV特異的モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体と
、試料がBDV抗体を含有することが推測される該試料と前記抗原コーティング
抗体とを接触させる手段と、および蓄積された抗体を検出する手段とを具備する
診断キット。 - 【請求項12】 請求項10または11に記載の診断キットであって、該キ
ットが、ユニット上にまたはその中にBDV特異的抗体が不動化されて存在する
該ユニットを具備する診断キット。 - 【請求項13】 請求項12に記載の診断キットであって、BDV特異的抗
体が、ある種Iから得られたモノクロナールまたはポリクロナール抗体であり、
該抗体がもう1つの種(種II)から得られた種II抗種I IgGによってコ
ーティングされた担体上に、好ましくは試験プレートまたは試験小管の形態で取
込まれ、それにより固定されることによって不動化されている診断キット。 - 【請求項14】 請求項13による診断キットであって、種Iの抗体がポリ
クロナールまたはモノクロナールのマウス抗体、好ましくはPタンパク質および
/またはNタンパク質特異的なモノクロナールマウス抗体であり、担体の吸着性
コーティングが抗マウスIgG、好ましくはヤギ抗マウスIgGから成る診断キ
ット。 - 【請求項15】 請求項12に記載の診断キットであって、BDV特異的抗
体がポリスチレン結合C1qを介して固定もしくは不動化された診断キット。
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