JP3605035B2 - ボルナ病ウィルス（ｂｄｖ）感染の検出方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、体液中の循環免疫複合体（ＣＩＣ）の検出を介したＢＤＶ感染の検出方法、一般のＣＩＣおよび特にＢＤＶ特異的ＣＩＣの検出方法、ならびにこれらの検出方法に適した診断キットに関する。
【０００２】
ＢＤＶ感染は多くの有用動物および家畜（ウマ、ヒツジ、ウシ、ネコ）および人間に見出される。ＢＤＶは５個の遺伝子をコードする陰性の極性の非セグメント化一本鎖ＲＮＡから成るゲノムを有する直径９０ｎｍの被包化ウィルスである（ゲノムのサイズ：８．９キロベース）。同種のウィルスには、たとえば狂犬病ウィルスおよび麻疹ウィルスが含まれる。遺伝子の特殊性（宿主細胞の細胞核中の増殖）に基づき、ＢＤＶはプロトタイプとして独自のウィルスファミリに分類されている（ボルナヴィリダエ）。ＢＤＶは大脳辺縁系中の神経細胞、行動、情動および記憶力がコントロールされる機能単位に対して特別の選好を有する。さらにまた、他のＢＤＶの細胞型も発生する。診断上特に重要なのは末梢血単核白血球細胞（ＰＢＭＣ）である。
【０００３】
ＢＤＶは宿主（インビボ）中でも細胞培養（インビトロ）中でも宿主細胞を破壊しない（細胞病原性の効果なし）。ＢＤＶの第一の病原性の効果は、感染した脳細胞中の機能障害に基づいており、これはおそらく神経伝達物質受容体によって誘発される。動物実験に基づくデータからグルタミン酸受容体の（不可逆性の）細胞内皮系遮断に対する暗示がある。正確な機構および受容体型はまだ知られていない。
【０００４】
ＢＤＶ感染は動物において主症状の感情鈍麻、注意力喪失および運動平衡障害を伴う段階状の行動障害に結びついている。人間の場合、再発性の内因性情動障害を有する患者から感染性のヒトボルナウィルスの単離後、前記機能障害および場合によって他の大脳機能障害への関与は非常に蓋然性がある（同様におそらく神経伝達物質機能に関しても）。躁鬱病の形態を含む内因性の再発性抑鬱状態は１〜５％で重要な精神医学的疾患に属し、さらにまた該当者にとり侵害の重度によって社会にとっても社会経済的な視点から重要な健康上の問題である。
【０００５】
ＢＤＶ感染は動物および人間において、おそらく生涯永続する。感染源はまだ完全に知られていない。感染経過は潜在的かつ活動的な段階を特徴とする。活動的な段階中に、臨床上の症状が現われることがある。動物（最もよく調査されているのはウマである）の場合、多くの感染は疾患が無い（無症候性の保菌者）。その数は罹患が登録されたウマ在高の５０％にまでなることがある。激しい疾患に結び付く感染の活動的段階の危険性は発生学上の因子および個体の遺伝的負荷（ストレス因子、免疫抑制）に左右される。
【０００６】
人間の場合、おそらく情動障害への素因を持たない健康な感染者にとって一般的な罹患の危険性はないであろう。逆に、すでに症状発現性の情動障害を有する、情動障害の進展に対して先天的な素因を有する人物の場合、および該人物のまだ健康な一親等の血縁者の場合、狭義の意味でＢＤＶ感染によって増加した罹患の危険性が与えられている。
【０００７】
無症候性の保菌者の場合（疫学上の理由から）も罹患者で感染段階をコントロールするためにも、ＢＤＶ感染の把握に向けて論争の余地の無い信頼できる診断システムに対する需要の増加がある。
【０００８】
ＢＤＶウィルスはすでに良く調査されていて、すでに完全に配列決定されているので、慣例的な抗体試験が知られている。１９９３年までは血清中の抗体試験の可能性だけがあった。抗体は一般にＢＤＶ核タンパク質ｐ４０（４０ｋＤａ相対分子量）および燐タンパク質ｐ２４（２４ｋＤａ）に合せている。これらの抗体はウィルスを中性にしない。やがて特異的抗体の欠失はＢＤＶ感染を排除しないことが明らかになった。これは、抗体が感染者の血清中に永続しない（または非常に長く）永続しないことを意味する。さらに人間および動物で自然感染によって達成されたＡＫ濃度（力価）は元々ごく僅かであり、より無感覚な試験システムによっては常に検出可能ではない。
【０００９】
特にＢＤＶ感染の疾患で重要な活性化を評価するための重要な進歩は、ＰＢＭＣが単離によって細胞中に検出できるウィルスタンパク質を表現するという発見によって行なうことができた。これらのタンパク質は時々プラスマ中にも見出される。タンパク質（ＡＧ）形質発現は重要な活性化パラメータであることが証明された。この活性化は良好に臨床的な罹患と相関関係があり（人間および動物）、定量的に測定可能であり、別の経過（予後回復の機会、抗鬱剤の要求など）の評価に非常に重要である。ＡＧ決定は、それによって単にウィルス自体を検出するが、該ウィルスの現在のまたは予想される将来の活性化に関して何も読取ることができないので、ＰＢＭＣ中のネステッドＲＴ−ＰＣＲによる増幅を介したウィルス核酸の検出に置き換えることができない。
【００１０】
ＡＧマーカーは全般的に急性の疾患段階の一部（２−３週）に制限されていて、回復期にはもはや検出できない。ＡＫはそれに続き活性化促進のそれぞれの強度に応じて間欠的に検出可能にすることができ、さらにまた該ＡＫは完全に欠失することもある。
【００１１】
このようなＢＤＶ診断の現在の状態は特に回復期において患者（人間および動物）の無症状の間欠期（これは数年かかることがある）で、および既往罹患のない感染した個体で、すなわち要約すれば潜在的状態におけるＢＤＶ感染で機能を発揮していない。この両試験パラメータＡＧおよびＡＫは、潜在的段階で依然として存在する感染の場合に偽陰性に検出されることがある。
【００１２】
従って本発明の課題は、ＢＤＶ感染の永続性によって急性のおよび潜在的な段階の変化中に非常に長い期間にわたり持続することがある該ＢＤＶ感染の可能な限り完全な把握を可能にするために、感染に対する新規の検出方法を開発することにある。同様にこのような検出のために使用可能の診断キットを提供することである。
【００１３】
この課題を解決するために本発明によりボルナ病ウィルス（ＢＤＶ）感染の検出方法が考慮されていて、この方法では体液中の被検体液試料で自由に循環するＢＤＶ抗原とそれに蓄積した特異的抗体とから成る免疫複合体が適切な免疫学的試験によって検出される。従って本発明は特定の疾患段階において体液中で、たとえば血清中で、高い濃度で循環するＢＤＶ抗原と身体によってそのために特異的に形成された抗体とから成る免疫複合体が発生することを検出できたという重要な観点に基づく。これらの免疫複合体は特に抗原および／または抗体がまさに検出できない疾患段階でも存在することがある。
【００１４】
本発明の継続形成では、前記認識に基づき、永続的なＢＤＶ感染を実質的に遺漏なく把握するための完全に新しい診断コンセプトが提示される。それにより新たに見出されたパラメータＣＩＣがすでに公知のパラメータすなわち抗原（ＡＧ）および抗体（ＡＫ）と組合せて決定され、これが従来不可能であった永続的なＢＤＶ感染の種々の段階の把握を可能にする。それにより付加的に決定された抗原は、好ましくは“Ｎタンパク質”とも呼ばれるＢＤＶ核タンパク質ｐ４０（４０ｋＤａ相対分子量）および“Ｐタンパク質”とも呼ばれるＢＤＶ燐タンパク質ｐ２４（２４ｋＤａ相対分子量）である。この組合せによる方法は全部を含む試験システムを考慮しており、このシステムでは血漿中のＢＤＶ特異的な循環免疫複合体（ＣＩＣ）、白血球（ＰＢＭＣ）中ならびにプラスマ中のＢＤＶ特異的タンパク質（抗原、ＡＧ）および／または血漿中のＢＤＶ特異的抗体（ＡＫ）の決定から成る試験組合せが実施される。
【００１５】
好ましくは、被検体液試料は血液試料であり、３つのパラメータは全て約１０ｍｌのクエン酸塩添加血のただ１回の血液試料によって決定することができる。
【００１６】
この血液試料は以下のように処理することができる：
（ａ）血液試料から血漿分画を単離し、血漿、髄液または尿試料で互いに別々に以下の試験を実施する：
（１）ＢＤＶ抗原の抗原検出、
（２）ＢＤＶ特異的抗体の抗体検出、
（３）ＣＩＣ検出、好ましくは請求項５ないし９のいずれか１つによる；
（ｂ）血液試料から血漿分画および髄液分画を調製し、（ａ）（１）による試験を血液試料の場合に髄液分画および／または血漿分画で実施する。
【００１７】
本発明によって初めて多数の試験を利用し、ＣＩＣに診断用に、さらにまた感染経過の理解に重要な役割が与えられることを示すことができた。見出されたように、ＣＩＣは溶解性の、ＡＫ試験で検出可能のＢＤＶ抗体よりも著しく長く永続し、急性の臨床段階においてのみ発生する細胞性ＢＤＶ−ＡＧよりも長く永続する。ＣＩＣはより長い無症状の段階後、ＡＫ試験およびＡＧ試験が陰性を示し、ＡＧ遊離とこのＡＧ複合体ＡＫとによる過去の活性化段階への逆推論を許容する場合、まだ検出可能である。
【００１８】
必要がある場合はＡＫおよびＡＧと組合せて使用される診断上の試験パラメータとしてのＣＩＣの導入によって、本発明は事前に橋渡しできなかった診断上の間隙を埋める。
【００１９】
循環免疫複合体すなわち自由に移動するＡＧ−ＡＫ複合体の原理的な存在は、種々のシステム用に公知である。血清中のＡＫによるＡＧの自由複合体化およびその逆は、すでに種々の免疫学的試験のために活用されている。ＢＤＶ感染時のＣＩＣの存在、特に潜在的間欠期でも長く持続する高濃度のＣＩＣとそれに関係する診断上のＣＩＣの重要性は従来完全に知られていなかった。
【００２０】
内因性の情動障害およびＢＤＶ感染を有する数人の患者で、急性段階中でも毎週のコントロールによって例外なく著しく高いＣＩＣ濃度を検出可能であるが、しかしＰＢＭＣ中の自由ＡＫおよびＡＧはまったく測定できない。これらの患者は慣例的な診断によってはそもそも全く検出されなくなる。この感染経過では、高濃度で形成されるＰＢＭＣ中に形成されたＢＤＶ−ＡＧが即時にプラスマの中へ入り込み、ＣＩＣ中に存在するＡＫによって結合されると推定しなければならない。
【００２１】
本発明に記述したＣＩＣの決定および特にＣＩＣ、ＡＧおよびＡＫ決定から成る試験組合せは、このため永続的なＢＤＶ感染にその潜在期と活性化との間で変動する経過によって初めて適切に扱われ、それによって罹患した個体の診断上の世話のためにも健常人における潜在的感染の把握のためにも大きな意義を有する。
【００２２】
危険な患者の場合、ＣＩＣの強制的な決定はもはや急性の罹患に制約されないＢＤＶ診断を可能にする。健常人の場合の潜在的感染の調査は、少ないウィルス活性化のために理論的に木目細かなコントロールによってのみ可能であったが、実際上ほとんど実行できなかった。ＣＩＣ試験と試験組合せによって潜在的感染はより健全に見出すことができ、これは感染源および伝染機構が人間と動物の場合でまだ解明されていないので、疫学上の重要性がある。
【００２３】
本発明による方法の使用は人間と動物の場合のＢＤＶ感染の把握に適していて、臨床上の罹患に無関係に可能である。本発明による検出方法によって人間と種々の動物種のためのＢＤＶ特異的ＣＩＣを定量化することができる。
【００２４】
「検出」という用語は本発明の専門用語に従って常に、第一の定量的な検出も相対的なＣＩＣ濃度の定量的決定も力価の形態で可能であるように使用する。
【００２５】
循環免疫複合体の体液中の適切な免疫学上の試験もしくは適切な検出方法として本発明により以下の段階を有する方法を提案する：
（１）適切な方法で必要がある場合はそのために準備された保菌者のＦｃ部位上に、ＣＩＣ中に含有された抗原に特異的に結合するモノクロナール抗体またはポリクロナール抗体の固定；
（２）抗体と、ＣＩＣの存在を試験されるべき体液試料、好ましくは血漿試料の接触；
（３）段階（１）および（２）によって処理された試料と、種の体液試料が使用された該種の抗体に特異的である被験種、好ましくはヤギ抗種抗体の接触；
（４）適切な免疫学上の検出方法による二次抗体の量の検出および／または決定。
【００２６】
この場合、段階（１）で使用したＢＤＶに特異的な抗体は、好ましくは、たとえばマウスから得られたモノクロナールＢＤＶ特異的Ｎタンパク質および／またはＰタンパク質抗体である。
【００２７】
必要がある場合は適切な方法で準備した担体を吸着的に固定するプラスチック試験プレートまたは対応する試験小管にすることができ、このプレートまたは小管は好ましくは初めにＣＩＣ抗原特異的抗体が得られた種に対して特異的である二次抗体により可能な限り完全にコーティングされ、それに続くプレート準備段階でＣＩＣ抗原特異的抗体がこの二次抗体層の表面に取込まれる。
【００２８】
選択的にＣＩＣ抗原特異的抗体の固定はこの方法の段階（１）で、たとえばポリスチレン担体上にＣ１ｑから成る基層の取込みによって、抗体を適切に整列して確実にプレート上に固定することを可能にする適切な別の方法でも行なうことができる。このような基層の取込みは、一般にコストのかかるＣＩＣ特異的抗体をより節約して扱うことができることを生ぜしめる。
【００２９】
この方法の段階（４）による検出は、たとえば酵素結合した二次抗体を介して行なうことができ、これで適切な基質によって発色反応が誘発される。目下のところ有利な実施形態では二次抗体がアルカリ性のホスファターゼと結合され、アルカリ性のホスファターゼとパラ−ニトロフェニルリン酸塩との間で黄色の色素を生ぜしめる反応が利用されることによって、ｐ−ニトロフェニルリン酸塩で視覚的に可視化もしくは光学式検出器で読出可能にされる。
【００３０】
本発明に従った二次抗体として、抗原に特異的ではなく、別の抗体、すなわち「異種」として識別された他の種の抗体に特異的である抗体が挙げられる。
【００３１】
ＣＩＣの決定は、このＣＩＣが十分な濃度で存在するそれぞれの体液で行なうことができる。目下のところ有利な実施形態では、試験が好ましく行われる体液はクエン酸塩添加血から得られた血漿試料である。ただしそれらの中でも髄液も使用することができる。
【００３２】
試験組合せのためにＢＤＶ抗原およびＢＤＶ特異的抗体が必要になる。抗原源としてＢＤＶに感染した細胞を使用することができる。この試験は、単離された抗原の代りに（同質化された）抗原を含有する細胞懸濁液が直接使用される場合、妨害または偽和されない。例に引用した試験（「ＡＫ試験」参照）では、たとえばボルナ病で死亡したウマの１０％脳懸濁液を希釈して使用した。
【００３３】
本出願人はドイツ微生物および細胞培養集成に細胞株として成長し、永続的にＢＤＶで感染させた胎児ヒト稀突起神経膠細胞を異種ウィルスおよびマイコプラスマなしで寄託した。この寄託はブダペスト協定の条件に従って１９９７年１２月１２日に行われた；培養ＯＬＩＧＯ／ＴＬには名称および識別番号“ＤＳＭ ＡＣＣ ２３３４”が指定された。
【００３４】
この細胞株は本出願人のストックから由来する。胎児ヒトＯＬ細胞はＣＰＥなしに永続的にＢＤＶに感染している。約１１０の継代接種を通過したこの細胞株の内部名称は、ＯＬＩＧＯ／ＴＬ（もしくはＯＬ／ＴＬ）である。この細胞からいつでも本発明による使用に適した抗原を得ることができる。さらに、この細胞株によって別の細胞株 − たとえば動物細胞株も − 感染させることができる。力価は約１０３ＦＦＵ／ｍｌである。特にこの細胞は上記抗原ｐ４０およびｐ２４も含有する。
【００３５】
このようなタンパク質の細胞懸濁液またはそこから洗浄されたタンパク質を含有する細胞懸濁液によって、常時ＢＤＶ特異的モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体を自体公知の方法で産生することができる。目下のところマウスのモノクロナールＮ抗体およびＰ抗体が有利である。そのため、通例のように、マウスが感染もしくは免疫性にされ、そのＢ−細胞からハイブリドーマ培養が製造される。上澄液はＢＤＶ特異的に“着色”する抗体で連続的に試験される（スクリーニング）。抗体の獲得に関しては“Ｈ．Ｌｕｄｗｉｇら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）Ｓｕｐｐｌ．７：１１１−１１３”も参照。
【００３６】
さらに、本発明はＢＤＶ感染検出用の診断キットを包含する。このキットもしくはこの試験または検出システムはＢＤＶ特異的モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体、試料がＢＤＶ抗原またはＢＤＶ−ＣＩＣを含有することが推測される該試料と前記抗体の接触手段、ならびに蓄積された抗原または抗原抗体複合体（ＣＩＣ）の検出手段を含有する。選択肢として、このキットはＢＤＶ抗原でコーティングＢＤＶ特異的モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体、試料がＢＤＶ抗体を含有することが該試料から推測される場合、該試料とこの抗原コーティング抗体の接触手段、ならびにその場合に蓄積したＢＤＶ抗体の検出手段を含有する。
【００３７】
さらに、この診断キットはユニット上にまたはその中にＢＤＶ特異的抗体が不動化されて存在する該ユニットを包含してもよい。このようなユニットは一定の方法で準備した試験プレートまたは内部をコーティングした試験小管とすることができる。
【００３８】
有利な一不動化方法においてＢＤＶ特異的抗体は、モノクロナールまたはポリクロナールの、ある種Ｉから得られた抗体であり、これは該抗体がもう１つの種（種ＩＩ）から得られた種ＩＩ抗種Ｉ ＩｇＧによってコーティングされた担体上に、好ましくは試験プレートまたは試験小管の形態で取込まれ、それによって固定されていることによって不動化されている。
【００３９】
さらに好ましくは、種Ｉの抗体はポリクロナールまたはモノクロナールのマウス抗体、好ましくはＰタンパク質および／またはＮタンパク質特異的モノクロナールのマウス抗体であり、担体の吸着性のコーティングが抗マウスＩｇＧ、好ましくはヤギ抗マウスＩｇＧから成る。選択肢としてＢＤＶ特異的抗体はユニット上にまたはその中にポリスチレン結合Ｃ１ｑを介しても固定もしくは他の適切な方法で不動化することができる。
【００４０】
実施例
本発明の理解を容易にするため、以下、血液試料の処理から評価まで、試験組合せの技術的な詳細を説明する。この応用は個々の例によって解明する。これらの例は単に解明上の目的に利用する。もちろん本発明の原理は他の方法に置き換えることもできる。
【００４１】
第Ｉ部：被検試料の調製
ＢＤＶ感染について調査するためクエン酸塩添加血１０ｍｌが必要になる。その場合、０．１０６モルのクエン酸ナトリウム−２−水化物溶液９ｍｌの１ｍｌに静脈の発端者血液を加えて、よく混合する。推奨に値するのは既製のクエン酸塩小管、たとえばＳａｒｓｔｅｄｔの１０ｍｌモノベッテ９ＮＣの使用である。この試料は発送するまで調査実験室に４℃で保管しなければならない。冷却（期間１日〜最長３日まで）しないで速達による発送は、試料品質を損わない。
【００４２】
クエン酸塩添加血試料は密度勾配遠心分離によってプラスマ分画と細胞血液成分とに分離する。プラスマ分画はＣＩＣ、ＡＧおよびＡＫの試験に使用する。白血球（ＰＢＭＣ）の細胞分画は調製後ＡＧ試験に使用する。ＣＩＣに関してのみ試験される場合またはプラスマ試験のみを実施する場合、細胞分画を除くことができる。
【００４３】
各成分を分離するために、それぞれの動物種に応じて異なる密度のＦｉｃｏｌｌ分離溶液（バイオクロム）を使用する。
【００４４】
血液６ｍｌのために以下を必要とする：
【００４５】
Ｉ．１０ｍｌクエン酸塩添加血試料の分離プロトコル
（１）円錐形の１０ｍｌ使い捨て小管に対応する密度の３ｍｌ Ｆｉｃｏｌｌ分離溶液を満たし、その上に最大６ｍｌクエン酸塩添加血を入れる。
【００４６】
（２）試料を２０分間１０４９ｇ（２２００ｒｐｍ、Ｈｅｒａｅｕｓ Ｃｈｒｉｓｔ Ｍｉｎｉｆｕｇｅ）で遠心分離する（Ｆｉｃｏｌｌ＜１．０９０密度を有する全試料に）；密度１．０９０を有するＦｉｃｏｌｌで２０分間１２４９ｇ（２４００ｒｐｍ）で遠心分離する。
【００４７】
（３）プラスマ分画（上澄液）を注意して使い捨てパスツールピペットで取除く；同日の即時試験のために４℃で保管し、後の試験用には−２０℃で保管する。
【００４８】
（４）白血球分画はＦｉｃｏｌｌ表面にもしくはその上方に識別可能の環を形成し、他方（不要の）Ｆｉｃｏｌｌ中の赤血球はペレットとして存在する。プラスマの除去後、細胞環を使い捨てパスツールピペットで採取し、新しい円錐形の１０ｍｌプラスチック小管の中に移し、ＰＢＳを満たし、よく混合する。
【００４９】
（５）白血球（ＰＢＭＣ）を１０分間１９５２ｇ（３０００ｒｐｍ）で遠心分離する。上澄液を捨て、ペレットを最大０．５ｍｌ ＰＢＳ＝約１０倍に濃縮の中に取込む。溶液をねじキャップ付きの滅菌凍結小管（たとえばＮｕｎｃ、１．５ｍｌ）の中に移す。
【００５０】
（６）内部のＢＤＶ抗原の即時試験のために（下記参照）、ＰＢＳ中の細胞の保管を４℃で、後の試験の場合に最低−２０℃で、より良くは−７０℃で保管。
【００５１】
ＩＩ．試験システム
ＰＢＭＣおよび／または血漿中のＡＧおよびプラスマ中のＣＩＣならびにＡＫの試験のためにＥＩＡ（酵素免疫定量法）−ベース（固相定量法）の試験組合せを使用する。第１の両試験段階は３つの試験システム全てに等しい。従って試験プロトコルの形式における以下の説明は次のように分けられる：
（Ａ）試験プレートのコーティング（Ａ１およびＡ２）
（Ｂ、Ｃ、Ｄ）ＡＧ、ＣＩＣおよびＡＫ試験用プロトコル
【００５２】
ＥＩＡ用プロトコル（二重サンドイッチ型）
（Ａ）ＥＩＡプレートのコーティング用プロトコル
以下の反応用のプラスチック担体としてＭａｘｉ Ｓｏｒｐ Ｉｍｍｕｎｏモジュール（Ｎｕｎｃ（Ｒ）Ｍａｘｉ Ｓｏｒｐ Ｆ８、Ｃａｔ．Ｎｏ．４６９９４９）を使用する。１つのフレームの中に垂直に配置した８つの平らなプラスチック凹部を備えた１２モジュールを挿入し、正確に９６穴の微量滴定プレートの寸法を有する（ＥＩＡシステム用の標準）：
【００５３】
（Ａ１）凹部あたり０．１ｍｌのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ（Ｒ）ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃフラグメント、ヒト、ウシ、ウマ血清タンパク質（Ｄｉａｎｏｖａ（Ｒ）、Ｋａｔ．Ｎｒ．１１５−００５−０７１）に対して吸着し、結合緩衝液中で１：１０００（＝ミリメートルあたりタンパク質１．８μｇ）に希釈する；夜通し４℃でまたは２時間３７゜でインキュベート。
【００５４】
洗浄緩衝液中で３回洗浄（Ｄｙｎａｔｅｃｈ ９６穴プレート洗浄器）
（Ａ２）凹部あたり０．１ｍｌのＢＤＶ−Ｎタンパク質ｐ４０およびＢＤＶ−Ｐタンパク質ｐ２４に対するモノクロナール抗体（Ｗ１およびＫＦＵ２、参照文献：Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）Ｓｕｐｐｌ．７：１１１−１３３）（“捕捉”抗体として）、それぞれ希釈緩衝液中で１：５００に希釈。２時間３７℃でまたは夜通し４℃でインキュベート。
【００５５】
その後、各プレートは４℃で少なくとも再使用４週前まで保管することができる。
【００５６】
（Ｂ）ＰＢＭＣ中のＢＤＶ抗原（ＡＧ）の決定プロトコル
準備：
− Ａ２までコーティングしたプレートの洗浄、洗浄緩衝液中で３回
− Ｉ．で単離したＰＢＭＣの超音波処理（２０サイクルｍｉｎ−１、４０ｍＡ）（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ Ｂ１５Ｐ；参照文献Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ（１９９６）１：２００−２１２）。
【００５７】
ＡＧ試験：
（Ｂ１）試料希釈：プレコーティングしたプレートの各凹部の中に希釈緩衝液０．１ｍｌをのせ、Ａで超音波処理したＰＢＭＣ（０．１ｍｌ）または血漿（０．１ｍｌ）を加え（＝１：２）、別の７段階でベース２（１：２５６まで）にさらに希釈する；夜通し４℃でインキュベート。
洗浄緩衝液中で３回洗浄
【００５８】
（Ｂ２）凹部あたりＢＤＶ特異的イエウサギ抗血清０．１ｍｌ（たとえばＧＣ１２、免疫蛍光力価１：１００００）（＝検出抗体）を対応する希釈比（１：１０００、ＩＦ力価より１０倍に濃縮）で希釈緩衝液の中へ；２時間３７℃でインキュベート。
洗浄緩衝液中で３回洗浄
【００５９】
（Ｂ３）凹部あたり０．１ｍｌのアルカリ性のホスファターゼと結合したＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ（Ｒ）ヤギ抗イエウサギＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的、ヒト血清タンパク質（Ｄｉａｎｏｖａ（Ｒ）、Ｋａｔ．Ｎｒ．１１１−０５５−０４６）に対して吸着（＝二次抗体）、抱合体希釈緩衝液中で１：３０００に希釈；１時間３７℃でインキュベート。
洗浄緩衝液中で３回洗浄
【００６０】
（Ｂ４）凹部あたり基質溶液０．１ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ ｐ−ニトロフェニルリン酸塩；Ｓｉｇｍａ、基質ペレットとして入手可能）を基質希釈緩衝液に；室温で５−１０分間、もしくは陽性検査で発色反応（無色から黄色へ反転）が現われるまでインキュベート。
【００６１】
（Ｂ５）凹部あたり阻止溶液０．０５ｍｌ（３モルＮａＯＨ溶液）を加える。
【００６２】
（Ｂ６）微量滴定プレート用マルチスキャン（たとえばＢＩＯ ＲＡＤ ２５５０ＥＩＡ ＲＥＡＤＥＲまたはＤｙｎａｔｅｃｈ）にて４０５ｎｍで測定；“ブランク”−非転換基質に対する測定。準定量評価で十分：（＋）＝弱陽性ないし最大４＋＝非常に強い陽性；＋／−は限度値を表し、第２回目の調査を必要とする。（例は応用の場合を参照）。
【００６３】
（Ｃ）血漿中のＢＤＶ特異的循環免疫複合体（ＣＩＣ）の決定プロトコル：
準備：
− Ａ２までコーティングしたプレートの洗浄、洗浄緩衝液中で３回。
【００６４】
ＣＩＣ試験：
（Ｃ１）試料希釈：希釈緩衝液０．１ｍｌをプレコーティングしたプレートの各凹部の中へ取る；Ａで：希釈緩衝液０．０９ｍｌを加え＋Ｉ．で調製した血漿０．０１ｍｌ（＝希釈１：２０）を、別の７段階でベース２（１：２５６０まで）にさらに希釈する；３７℃で１−２時間インキュベート（標準時間：３７℃で１時間）。
洗浄緩衝液中で３回洗浄
【００６５】
（Ｃ２）凹部あたり０．１ｍｌのアルカリ性のホスファターゼと結合したヤギ抗種（試料の種に対応）ＩｇＧ、Ｆｃフラグメント（同様にＤｉａｎｏｖａ（Ｒ）から入手可能）（＝二次抗体）、抱合体希釈緩衝液中で１：３０００に希釈；３７℃で１時間インキュベート。
洗浄緩衝液中で３回洗浄
【００６６】
（Ｃ３）凹部あたり基質溶液０．１ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ ｐ−ニトロフェニルリン酸塩；Ｓｉｇｍａ、基質ペレットとして入手可能）を基質希釈緩衝液の中へ；室温で５−１０分間もしくは陽性検査で発色反応（無色から黄色へ反転）が現われるまでインキュベート。
【００６７】
（Ｃ４）凹部あたり阻止溶液０．０５ｍｌ（３モルＮａＯＨ溶液）を加える。
【００６８】
（Ｃ５）微量滴定プレート用マルチスキャン（たとえばＢＩＯ ＲＡＤまたはＤｙｎａｔｅｃｈ）にて４０５ｎｍで測定；“ブランク”−非転換基質に対する測定。準定量評価で十分：（＋）から４＋まで（試験Ｂも参照）；しかし同様に最終点決定による力価表示も可能（例は応用参照）。
【００６９】
（Ｄ）血漿中のＢＤＶ特異的抗体（ＡＫ）の決定プロトコル：
準備：
− Ａ２までコーティングしたプレートの洗浄、洗浄緩衝液中で３回。
【００７０】
ＡＫ試験：
（Ｄ１）凹部あたりボルナ病で死亡したウマの１０％脳懸濁液０．１ｍｌ（＝検出抗原）を対応する希釈比（１：５０）で希釈緩衝液の中へ；選択肢として１９９７年１２月１２日にＮｒ ＤＳＭ ＡＣＣ２３３４でＤＳＭＺに寄託した永続的にボルナ病ウィルス株に感染した細胞株の細胞培養上澄液を希釈緩衝液中１：１００〜１：３００の間で希釈して使用することができる（ウィルス力価１０６ｆｆｕ／ｍｌ：１：３００で）。４℃で夜通しインキュベート（ｆｆｕ＝ｆｏｃｕｓ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）。
洗浄緩衝液中で３回洗浄
【００７１】
（Ｄ２）試料希釈：希釈緩衝液０．１ｍｌをプレコーティングしたプレートの各凹部の中へ取る；Ａで：希釈緩衝液０．０８ｍｌを加え＋Ｉ．で調製した血漿０．０２ｍｌ、前希釈１：５、（＝希釈１：５０）を、別の７段階でベース２（１：６４００まで）にさらに希釈する；３７℃で１時間インキュベート。
洗浄緩衝液中で３回洗浄
【００７２】
（Ｄ３）凹部あたり０．１ｍｌのアルカリ性のホスファターゼと結合したヤギ抗種（試料の種に対応）ＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的（Ｄｉａｎｏｖａ（Ｒ））（＝二次抗体）、抱合体希釈緩衝液中で１：３０００に希釈；３７℃で１時間インキュベート。
洗浄緩衝液中で３回洗浄
【００７３】
（Ｄ４）凹部あたり基質溶液０．１ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ ｐ−ニトロフェニルリン酸塩；Ｓｉｇｍａ、基質ペレットとして入手可能）を基質希釈緩衝液の中へ；室温で５−１０分間もしくは陽性検査で発色反応（無色から黄色へ反転）が現われるまでインキュベート。
【００７４】
（Ｄ５）凹部あたり阻止溶液０．０５ｍｌ（３モルＮａＯＨ溶液）を加える。
【００７５】
（Ｄ６）微量滴定プレート用マルチスキャン（たとえばＢＩＯ ＲＡＤまたはＤｙｎａｔｅｃｈ）にて４０５ｎｍで測定；“ブランク”−非転換基質に対する測定。評価方法は試験Ｃの通り。
【００７６】
ＩＩＩ．緩衝溶液
結合緩衝液：
原液Ａ：０．０２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ ２．７６ｇを１０００ｍｌ Ａ．ｂｉｄｅｓｔへ
【００７７】
原液Ｂ：０．０２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ ３．５６１ｇを１０００ｍｌ Ａ．ｂｉｄｅｓｔへ
【００７８】
使用溶液：
６５ｍｌ溶液Ａ＋４５ｍｌ溶液Ｂ＋１４．６ｇＮａＣｌを１０００ｍｌ Ａ．ｂｉｄｅｓｔ ｐＨ７．６へ
【００７９】
洗浄緩衝液：
ＮａＣｌ ４５ｇ（１０００ｍｌあたり９ｇ）
Ｔｗｅｅｎ２０ ２．５ｇ（１０００ｍｌあたり０．５ｇ）
ＮａＮ３ １．０ｇ（１０００ｍｌあたり０．１ｇ）
５０００ｍｌ Ａ．ｂｉｄｅｓｔへ
【００８０】
希釈緩衝液：
ＫＨ２ＰＯ４ ０．２ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ ２．９ｇ
ＮａＣｌ ８．０ｇ
ＫＣｌ ０．２ｇ
Ｔｗｅｅｎ２０ ０．５ｇ
ＮａＮ３ ０．２ｇ
１０００ｍｌ Ａ．ｂｉｄｅｓｔへ、ｐＨ７．２はコントロールもしくは調整しなければならない。
【００８１】
抱合体希釈緩衝液（ＴＢＳ−ＴＷＥＥＮ）：
ＴＲＩＳ ２．４ｇ
ＮａＣｌ ８．０ｇ
ＫＣｌ ０．２ｇ
Ｔｗｅｅｎ２０ ０．５ｇ
９００ｍｌ Ａ．ｂｉｄｅｓｔの中に溶解し、濃縮ＨＣＬでｐＨ８．０に調整し、次いで１０００ｍｌまで満たす。
【００８２】
基質希釈緩衝液（ジエタノールアミン緩衝液）：
ジエタノールアミン ９７ｍｌ
ＭｇＣｌ２ ０．１ｇ
ＮａＮ３ ０．２ｇ
８４３ｍｌ Ａ．ｂｉｄｅｓｔの中に溶解し、次いで６０ｍｌ １ Ｎ ＨＣＬを加え、ｐＨ９．８に調整する。
【００８３】
阻止溶液（３Ｍ ＮａＯＨ）：
ＮａＯＨ １２０ｇ
１０００ｍｌ Ａ．ｂｉｄｅｓｔへ
【００８４】
ＩＶ．市販の上記試験システム用の試薬の仕入先：
１．Ｆｉｃｏｌｌ（Ｒ）−分離溶媒：Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＫＧ、Ｄ−１２２４７ベルリン
２．クエン酸塩小管：Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｄ−５１５８８ニュンブレヒト
３．ＥＩＡ微量滴定−ストリップ（Ｍａｘｉ Ｓｏｒｐ Ｉｍｍｕｎｏモジュール）Ｆ−型：Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク
４．二次抗体用酵素抱合体：Ｄｉａｎｏｖａ、製造者：Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．、ウェスト グローブ、ペンシルベニア州、米国
５．ＥＩＡ−試験用洗浄装置：Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｕｌｔｒａｗａｓｈ ｐｌｕｓ；Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｓ．Ｉｎｃ．、キャンティリー、ヴァージニア州、米国
６．酵素抱合体用基質（アルカリ性ホスファターゼ用）：
Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、セントルイス、ミズーリ州、米国
７．ＫＣＬを除く緩衝液物質（ＩＩＩに）：Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｄ−６４２７１ダルムシュタット、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ、ＣＨ−９４７１ブフス
８．光度計（微量滴定プレート用）：ＢＩＯ ＲＡＤ Ｌａｂｓ．Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州、米国またはＤｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｓ．Ｉｎｄ．、キャンティリー、ヴァージニア州、米国
９．ＰＢＭＣの細胞単離用超音波装置：Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ、Ｂ１５ＪＰ、Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｃ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ、ダンバリー、コネティカット州、米国
【００８５】
Ｖ．ＢＤＶ特異的試薬
１．モノクロナール抗体：
試験Ｂ、Ｃ、Ｄ用のベースコーティング（段階Ａ２）として必要
１ａ）Ｗ１、ＢＤＶのＮタンパク質（ｐ４０）上の配列エピトープを識別する。結合部位は変わらない。すなわち宿主種すべてにわたって識別される。抗体は参照文献Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．（Ｓｕｐｐｌ）（１９９３）７：１１１−１３３に特徴づけられている。
【００８６】
１ｂ）ＫＦＵ２、ＢＤＶのＰタンパク質（ｐ２４）上の配列エピトープを識別する。結合部位は変わらない。すなわち宿主種すべてにわたって識別される。抗体は参照文献Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．（Ｓｕｐｐｌ）７：１１１−１３３（１９９３）に特徴づけられている。
【００８７】
２．イエウサギ抗血清（特異的検出抗体）：
段階Ｂ２における試験Ｂ（ＡＧ）のために必要
血清は実験的に感染させたイエウサギを使用することができる（参照文献Ｖ、１ａに同じ）。この血清は免疫蛍光試験で１：２０００の最小力価を有し、ウェスタンブロットでＢＤＶの少なくともＮおよびＰタンパク質（ｐ４０およびｐ２４）を識別しなければならない。ボルナウィルスは現在の研究水準によれば遺伝学的に非常に安定しているので、すなわち種々のウィルス株の中に僅かな配列差が見出されているだけなので、ポリクロナール抗血清は一般に異なる種のボルナウィルスのタンパク質を識別する。
【００８８】
これは、ヒト株が動物株で従来見出されていないアミノ酸レベルで重要な点突然変異を示すにもかかわらず、従来得られていた僅かなヒト株にも該当する（参照文献Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ（１９９６）１：２００−２１２；Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．（１９９６）４４：３３−４４）。
【００８９】
試験説明で挙げた血清ＧＣ１２および別の動物基準株Ｖによる感染によって得られた抗血清に加えて、種々のヒトＢＤＶ株による実験的な感染によって作られた特定のイエウサギ血清を使用し（参照文献Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ（１９９６）１：２００−２１２）、ウィルス性タンパク質の全スペクトルを識別することができる。
【００９０】
３．特定の抗原懸濁液
段階Ｄにおける試験Ｄ（ＡＫ試験）のために必要
ボルナ病で死亡したウマの脳懸濁液（１０％）は高濃度のウィルス性タンパク質（特にＮおよびＰタンパク質）を含有する。ＢＤＶ感染の結果として現われる致死性の進行性（ｐｒｏｇｒｅｄｉｅｎｔｅ）の神経学罹患は段階的に発生し自発的に減退する行動障害もしくは臨床的症状が現われずに経過するＢＤＶ感染に比べてまれである（参照文献：Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ（１９９７）Ｓｕｐｐｌ．１３：１６７−１８２）。いわゆる典型的なボルナ病と呼ばれる脳炎は、おそらくコントロールがきかなくなったウィルス産生に起因する。脳内のウィルス力価は１０５〜１０６ＦＦＵ／ｍｌに達し、それにより実験的に感染した実験室動物の範囲にある（参照文献：Ｐｒｏｇ．ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ（１９８８）３５：１０７−１５１）。
【００９１】
抗原懸濁液として直接ウィルスおよび抗原力価が決定された一定の脳懸濁液を使用することができる。上記構造におけるＡＫ試験のために、永続的にＢＤＶ（動物および人間株）に感染した細胞株から成る懸濁液も使用可能である。後者は特に標準化目的に適している。使用可能の細胞株はブダペスト協定に基づき番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２３３４のもとにＤＳＭＺに寄託されている（寄託日１９９７年１２月１２日）。
一定の抗原溶液は陽性検査として試験Ｂ（ＡＧ試験）に使用可能である。
【００９２】
ＶＩ．本発明に記載された試験組合せの試験原理の簡単な説明
試験組合せはただ１つの血液試料中の３種類の感染上重要なＢＤＶ試験パラメータ、すなわち抗原（ＡＧ、試験Ｂ）、循環免疫複合体（ＣＩＣ、試験Ｃ）および抗体（ＡＫ、試験Ｄ）のための三重試験として考案されている。これらの試験は、たとえば全く特定の予測された疾患段階の検査のために、それぞれ個別的に実施することもできる。これらの試験は固相定量法として構成されていて、光度測定により評価される。試験反応および経過は今日実験室標準である微量滴定システムで行なう。
【００９３】
ベースコーティングとして説明したＡ部は３つもしくは４つの試験に全て等しく利用される。ベースコーティングはこの試験組合せの核心部であり、高いＢＤＶ特異性に対して責任を負う。これはボルナウィルスのＮおよびＰタンパク質（ｐ４０、ｐ２４）の典型的なエピトープに向けられた２つのモノクロナール抗体から成るセットにより作られる。この“捕捉”抗体の非常に効果的な使用は抗マウス抗体によるプレコーティングによって達成される。このプレコーティングが無い場合、特異的モノクロナール抗体のアフィニティクロマトグラフィの洗浄が必要である。ＡＧ検出用の試験ＢではＰＢＭＣまたは血漿中に（自由に）存在するｐ４０およびｐ２４タンパク質が“捕捉”抗体によって結合される。同様にＢＤＶ特異的であるイエウサギのポリクロナール検出抗体により、結合した抗原は試料から識別され、酵素結合指示薬系を介して可視化される。このいわゆる“二重サンドイッチ方式”は多量の細胞タンパク質中の少量のＢＤＶ抗原を２種類の抗体系への特異的結合によって検出可能になるという長所を有する。
【００９４】
ＣＩＣ検出用の試験Ｃではプラスマ中に存在するＢＤＶ免疫複合体の抗原部が「捕捉」−抗体によって結合される。免疫複合体の抗体部は次の反応段階で酵素標識された抗−抗体（二次抗体）と結合し、これは指示薬系を介して可視化される。この実際上当惑させる簡単な試験構造により、ＢＤＶ特異的であり、それにより診断的に重要であるＣＩＣだけが可視化される。この試験は本発明の核心部であり、従来存在していた診断上の間隙を埋める。ＢＤＶ特異的ＣＩＣは本発明者によって見出され、その検出が開発された。
【００９５】
ＡＫ検出用の試験Ｄではプラスマ中に存在する（自由な）ｐ４０およびｐ２４に抗するＢＤＶ抗体が、あらかじめ“捕捉”−抗体によって結合された検出抗原溶液を介して決定される。特異的に結合した抗体は、酵素標識された抗−抗体（二次抗体）、指示薬系を介して可視化される。試験構造は検出抗原溶液として洗浄されていない感染した脳または細胞培養懸濁液を、特異性を失わずに使用できるという長所を有する。この特異性は“捕捉”−抗体によって保証される。
【００９６】
他のより簡単なＥＩＡ−ベースに対するＡＫ試験のために、固相としてプラスチック担体に結合されなければならない常に洗浄された抗原溶液が必要になるであろう。これらの試験はたしかに実施においてより短くなるが、抗原洗浄によって労力およびコストがかかる。
【００９７】
標準ＢＤＶ抗体試験として他の場所で現在間接免疫蛍光試験が実施されている（参照文献：Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９２）３６：３０９−３１５）。この試験は新しいシステムに比べ、結果が定量的および定性的に他の実験室と比較することができるという長所を有する（Ｒｅｖｉｅｗ：ＣＴＭＩ（１９９５）１９０：１０３−１３０）。免疫蛍光力価は一般にＥＩＡ力価よりも低い。第ＶＩＩ部に示した縦断面調査では、血清学的な基礎に基づいてのみ調査された別の結果との比較可能性を保証するために、抗体が免疫蛍光によって決定された。試験組合せに示したＥＩＡベースのＡＫ試験はより高い感受性によって抗体の検出方法を改善するが、最終結果で序文に記載した低い力価および検出限界を下回る低下では何も変化しない。このため従来の方法で欠けているＡＫ検出はＢＤＶ感染を除外しない。自由抗体の一過性だけの発生はＣＩＣ形成によって説明可能である。
【００９８】
４つの試験パラメータに基づき以下の診断コンセプトが生じる：
ＣＡＧ：ＰＢＭＣからの抗原試験はウィルス増殖用の急性マーカーとして適している。ｃＡＧは疾患段階の短い間だけ測定可能である。
【００９９】
ｐＡＧ：プラスマ中で実験された抗原はウィルス増殖の結果として細胞中に発生する。一般にｃＡＧより少し遅く現われ、さらにまた多くは該ｃＡＧと同時に現われ、しばしば数週間で検出可能である。ｐＡＧは同様に疾患段階中の急性マーカーである。ただし該急性マーカーの検出可能性は抗体およびそれに続くＣＩＣ形成の速さに依存する。経過調査（毎週）では、個々の試料でｐＡＧのみが陽性に測定されることが確認された（たとえば１週目；ｐＡＧのみ、２週目：ｐＡＧ＋ＣＩＣなど）。
【０１００】
ＣＩＣ：循環免疫複合体は非常に良好な感染マーカーおよび治療コントロールマーカーである。抗ウィルス性の治療下で長期的にＣＩＣの消滅が観察され、もしくは新規形成が全く観察されなかった。ＣＩＣの半減期は理論的に４週間になる；ただしＣＩＣは急性疾患発生後４週間でもしばしばまだ検出可能である。治療しない場合、ＣＩＣの代謝レベルは一般に維持されたままになる。ＣＩＣの測定は、そのため潜在的感染のスクリーニングとして健常人にも適している。
【０１０１】
ＡＫ（Ａｂ）：抗体は常にまず抗原によって刺激されて発生する。急性段階で抗体力価は、抗体が免疫複合体中で結合されるので、低いかまたは検出できない。抗体は回復期でより良く検出可能である。（注釈：以前に第三者側から刊行されたデータが常に著しく非感受的である免疫蛍光試験（ＩＦ）に係わるため、その結果、時々抗体が検出可能であったことについて指摘する）。
【０１０２】
以下の応用例では、感染の状態が連続的に（特に疾患段階で）変化し、永続的なウィルス感染のこの型にとって（活性化段階中の低い増殖率により）診断的に複数のパラメータの検出が好適であることを示す。
【０１０３】
ＶＩＩ．本発明の応用例
以下、ヒトの領域から３つの症例と、動物の領域から２つの症例とを示す。これらの例は、特に７か月までの長い観察期間が平均を超える大きい試料数（１つの個体から２３まで）によって調査することができたため、複数から選択された。
【０１０４】
ヒト患者１：（原始細胞：Ｄ．Ｒ．）
− 性別：男性
− 年齢：５９歳
− 臨床的診断：再発性大鬱病性障害（ｒＭＤＤ＝ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｍａｊｏｒ ｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、さらに神経性の関与
− 調査：急性の抑鬱状態の症状発現
− 観察期間：２７週間（約７か月、１９９６年５月〜１１月）
− 試料数：２３、その中の１３は毎週間隔で
− 概要試験結果：
抗原：４／２３
ＣＩＣ：２３／２３
抗体：０／２３
経過詳細：表１
【０１０５】
ヒト患者２：（原始細胞：Ｇ．Ｒ．）
− 性別：女性
− 年齢：７６歳
− 臨床的診断：ｒＭＤＤ
− 調査：急性の抑鬱状態の段階
− 観察期間：２１週間（約５か月、１９９６年６月〜１１月）
− 試料数：１８（その中の１４は毎週間隔で）
− 概要試験結果：
抗原：４／１８
ＣＩＣ：１７／１８
抗体：３／１８
経過詳細：表２
【０１０６】
ヒト患者３：（原始細胞：Ａ．Ｊ．）
− 性別：男性
− 年齢：６３歳
− 臨床的診断：ｒＭＤＤ
− 調査：急性の抑鬱状態の症状発現
− 観察期間：６週間（１９９６年８月〜９月）
− 試料数：７、毎週
− 概要試験結果：
抗原：１／７
ＣＩＣ：４／７（２試料＋／−）
抗体：１／７
経過詳細：表３
【０１０７】
ウマ患者１：（Ａ．Ｓ．、ノルトラインヴェストファーレン州から）
− 性別：オス、ヴァルラッハ、ハノーファラナー
− 年齢：１１歳
− 臨床的診断：ボルナ病、感情鈍麻、嗜眠状態、本能欠失、食挙動変化の重度の症状発現；自然治癒（Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ（１９９３）Ｓｕｐｐｌ １３、ｉｎ ｐｒｅｓｓ）
− 調査：急性疾患段階でおよび回復後
開始：疾患開始後３週間
− 観察期間：２８週間（７か月、１９９５年６月〜１９９６年１月まで）
− 試料数：８（６完全調査）
− 概要試験結果：
抗原：４／６
ＣＩＣ：４／６
抗体：５／６
経過詳細：表４
【０１０８】
ウマ患者２：（Ｆ．Ｄ．）バイエルン州から
− 性別：オス、バイエルンヴァルラッハ
− 年齢：１５歳
− 臨床的診断：ボルナ病、重度の神経学的経過形態；安楽死（１９９６年８月）；
第１症状発現１９９４年に、これは自然治癒
− 観察期間：１４週間（１９９６年５月〜８月まで）
− 試料数：３血液試料、１髄液試料
− 概要試験結果：
血液：抗原：２／３
ＣＩＣ：３／３
抗体：０／３
髄液：ＡＧ：所見＋／０
ＣＩＣ：１／１
抗体：０／１
経過詳細：表５
【０１０９】
選択した症例中のヒト患者の年齢分布は非典型的である。全年齢グループから対応する経過がある。これらの経過は、急性疾患段階で調査して、再発性（ｒＭＤＤまたは分極罹患）の情動罹患にとり典型的である。
【０１１０】
無症状の間欠期には一般にＣＩＣの濃度が低いままであり、他方ＰＢＭＣ中の抗原および抗体はもはや検出できない。ＣＩＣの永続性の期間および力価高さは先行するＢＤＶ感染の活性化段階の強度に依存する。我々のこれまでの調査にれば、ＣＩＣは少なくとも３か月継続する（疾患症状発現後）。非常に長い無症状の間欠期（たとえば数年）の場合、まったく体系的な調査がない。個々の調査から、我々はＣＩＣも消滅することがあることを知っている。長い健康の間欠期後の新たな抑鬱状態の症状発現の開始には、３つのパラメータの全ての状態が開始調査で陰性になることがある。従って確実にＢＤＶ感染を排除できるようにするため、ただ１回の調査だけでは十分ではない。むしろ少なくとも疾患症状発現の最初３分の１で第２の調査が必要である。感染がある場合、一般にその場合は少なくともＣＩＣがまだ陰性ＡＧもしくはＡＫ所見で見出される。
【０１１１】
これは実際上、ＢＤＶ感染が時間的間隔を考慮する場合本発明に示したＣＩＣおよびＡＧとＡＫを併せて考慮する新しい三重試験によって、十分な安全性で識別できることを意味する。
【０１１２】
ウマ患者症例は、罹患した感染動物を考慮する。健康な無症状の感染保菌者はしばしばＣＩＣによってのみ検出可能である。健康なストック中の調査例はＸ．以下に記載した。
【０１１３】
第ＶＩＩ部の症例開示の詳細：
【０１１４】
注釈：
ヒト患者１は、該ヒト患者が少ない患者に含まれる限りでの特殊症例を表し、該患者では急性疾患段階において毎週の検査でほぼもっぱら非常に高いＣＩＣ濃度になるが、しかしＰＢＭＣ中には自由抗体を全く検出できず、ごくまれにＡＧが検出可能であった（序文も参照）。我々は、ＰＢＭＣ中に形成されたＢＤＶ−ＡＧが即時にプラスマの中へ入り込み、ＣＩＣ中に存在する抗体によって結合されることを想定する。このような患者は従来の試験方法によってはＣＩＣを考慮せずに実質的に検出できないであろう。
【０１１５】
我々は最初の１１試験週間をＣ以下に記載した慣例的な試験バージョンで調査しただけでなく、各々１つだけモノクロナール“捕捉”−抗体の使用により（試験段階Ａ２）それぞれｐ４０またはｐ２４により形成されたＣＩＣの量を決定した。補充表ではｐ４０−ＣＩＣおよびｐ２４−ＣＩＣの量が明らかに変化し、時間的な濃度特性が識別可能になることが明らかである。これらのデータはＣＩＣ検出の非常に高い特異性に関する付加的な証拠としても提供される。すなわちＡ２（“捕捉”−ＡＫの選択）でそれぞれのプレコーティングに応じて、ＣＩＣは個々のウィルスタンパク質に関しても決定することができる。
【０１１６】
【０１１７】
【０１１８】
注釈：
個々に示した疾患経過における感染パラメータの経過は、類似の形態で感染した多数の患者にも当てはまる。急性マーカー“ＰＢＭＣ中のＡＧ”はピーク値の形態で検出可能であるが、数週間にわたるプラトーとしては検出できない。しかしＣＩＣ測定は、抗原が連続的に一団で形成され、細胞からの抽出後に抗体によって複合体化されることを示す。従って自由抗体は散在的だけでも全間欠期において検出可能である。
【０１１９】
【０１２０】
注釈：
最初の４試験週間でＰＢＭＣ中のＡＧ、ＣＩＣおよび抗体を検出することができた。最も信頼できるパラメータは再びＣＩＣの形態で可視化できた。この例は、比較的低くかつ短い抗原産生の場合でもＣＩＣが検出可能であることを示しているが、ただしその場合は低濃度でのみ検出可能である。
【０１２１】
【０１２２】
注釈：
このウマは異常に重くかつ長期の罹患段階を通過したが、それにもかかわらず完全治癒には至らなかった。ただし陽性抗体試験の頻度はむしろ非典型的であり、これはおそらくＰＢＭＣ中の非常に強い抗原産生（まれにこのように高い）に起因している。疾患段階がより短い場合、抗体は一般に同様に散在的であり、抑鬱状態のヒト患者の場合のように低い力価で検出可能である。
【０１２３】
【０１２４】
注釈：
このウマはボルナ病で死亡もしくは安楽死させる必要があった。急性疾患段階では、それにもかかわらずプラスマ中に自由抗体を検出することができなかった。この感染は重度の疾病にもかかわらず血清学的な方法によってだけでは検証できなかったであろう。このウマの場合、過度のＣＩＣ力価およびＰＢＭＣ中のＡＧが見出されている。これは、最終的にコントロール不能に陥らざるを得ないウィルス感染の強い活性化段階を示している（髄液も陽性であった）。
非常に高いＣＩＣ力価は、ヒト患者の場合のように、ＢＤＶ感染したウマの場合もむしろまれである。
【０１２５】
ＡＧおよびＣＩＣ試験の評価方法：
一般に相対的なパラメータ濃度を表す準定量的な評価が力価表示に優先されるべきである。各パラメータは、試料あたり８段階の希釈系列で測定される。希釈と平行に減少する絶滅は力価評価で付加的な安全性を与える。該絶滅は考慮してよいが、しかし最終点力価決定のために考慮してはならない。
【０１２６】
評価ＡＧ試験：
決定のために細胞懸濁液または血漿試料を１：２以上で希釈する。
【０１２７】
陰性コントロールは一般に０．０５〜＜０．１絶滅である。
＋／−限度値 ０．１−０．１２ １：２０および透明の希釈系列の場合
（＋）弱陽性＞０．１２〜０．１５ １：２０および透明の希釈系列の場合
＋陽性＞０．１５−０．２５ １：２０の場合
＋＋やや陽性＞０．２５−０．４５ １：２０の場合
＋＋＋強陽性＞０．４５−１．０ １：２０の場合
＋＋＋＋非常に強陽性＞１．０およびそれ以上 １：２０の場合
【０１２８】
殆どのＣＩＣ値は平均の絶滅範囲にある。陽性評価のために常に希釈依存性の絶滅減少を検出できなければならない。限度値の試験は非常にまれである。なぜならバックグラウンド発色がまったく発生しないからである。前記絶滅範囲は基準値とみなす。
【０１２９】
評価ＡＫ試験（ＥＩＡ、試験Ｄ）
決定のためにプラスマは１：５０以上で希釈する。
陰性コントロールは一般にＣＩＣおよびＡＧ試験の場合より少し高くなる（僅かにバックグラウンド発色）：０．１〜＜０．２絶滅。
＋／−限度値０．２〜０．３ １：５０および１：１００の場合、次いで減退
（＋）弱陽性＞０．３〜０．４ １：５０の場合、透明の希釈系列
＋陽性＞０．４−０．６ １：５０の場合
＋＋やや陽性＞０．６−０．８ １：５０の場合
＋＋＋強陽性＞０．８およびそれ以上 １：５０の場合
【０１３０】
陽性評価のために常に希釈依存性の絶滅減少が検出可能でなければならない。陰性コントロールのベース絶滅は＞０．２であってはならない。
【０１３１】
ＡＫ試験の評価のために、他の実験室の試験との比較が行われるような場合、準定量的な評価を優先する。ＡＫ試験のための例はＩＸ以下に記載する。
【０１３２】
ＶＩＩＩ．試験組合せによるＢＤＶ感染の現状の評価
ＰＢＭＣ（同様に血漿）中のＡＧ検出は急性の活性化過程のためのパラメータである。ＣＩＣパラメータは経過調査で以前の間欠期を評価する。ＣＩＣ値がこの間欠期に上昇する場合、これはウィルス抗原が形成されていて、試験時点ですでに複合体の形態で存在することを意味する。自由抗体が検出可能かどうかは、抗原産生との関係で抗体産生によって決定される。抗体産生がまさに初めて活性化一団によって新たに開始された場合、殆ど自由抗体は検出できないが、それに対しＣＩＣは検出可能である。後の時点で抗原産生が減少する場合、自由抗体の検出の機会が増大する（同時のＣＩＣ検出ありまたはなし）。
この関係を考慮する三重試験の解釈は臨床的な経過の評価に非常に役立つ。
【０１３３】
以下の試験配列は今日の水準に従って可能である：
１．ＡＧ陰性 ＣＩＣ陰性 ＡＫ陽性
感染はあるが、非活動的であり、急性でも最後の週でもない。
２．ＡＧ陽性 ＣＩＣ陰性 ＡＫ陰性
感染は調査時点までにまさに完全に急性に活性化しているが、以前は活性化していない。
３．ＡＧ陽性 ＣＩＣ陽性 ＡＫ陰性または陽性
感染があり、活性化開始はすでに数週間前であるが、活性化は調査時点でまだ急性である。
４．ＡＧ陰性 ＣＩＣ陽性 ＡＫ陰性または陽性
感染があり、活性化開始はすでに数週間前であり、場合によっては数か月前である（それぞれの調査間欠期による）。活性化は調査時点の直前でもはやない。初回調査の場合、：“感染がある”という明言だけを行なうことができる。
５．ＡＧ陰性 ＣＩＣ陰性 ＡＫ陰性
ＢＤＶ感染の徴候なし。急性疾患段階で２つの完全な陰性試験の場合、感染を除外することができる。
【０１３４】
少なくとも２つの完全な陰性試験（間隔４〜６週間）は治療コントロールとしても抗ウィルス性の治療の終了前（Ｌａｎｃｅｔ（１９９７）３４９：１７８−１７９）に要求される。
【０１３５】
従来の調査は、ＣＩＣが抗ウィルス性の治療効果の評価に非常に感受性のあるマーカーであることを示している。該マーカーはすでに実施された臨床的な回復後の最後のパラメータとしてまだしばしば検出可能であるが、治療の継続により後に消滅する。
【０１３６】
ＩＸ．ＣＩＣおよびＡＧと平行の、ＡＫ試験の例
疾患段階中のウィルスパラメータの進展が実験的に示された症例説明の場合と異なり、ここでは強陽性のヒト試料（１４３７）と弱陽性（ＡＧにとっては完全に陰性の）試料（８９０）とが完全な希釈系列で表わされなければならない。両試料は米国から由来し、４日間を要する輸送後同一の試験項目で４／９４で試験された。
【０１３７】
【０１３８】
【０１３９】
【０１４０】
（上述のように、“バックグラウンド”レベルは０．２００までより高くすることができる）。
【０１４１】
【０１４２】
【０１４３】
注釈：
試料１４３７はＰＢＭＣ中で異常に高い抗原発現を示した。平均ではこの値が明らかにより低くなる。試料１４３７では配列３（ＶＩＩＩ、評価参照）が当てはまる。すなわちＡＧ陽性、ＣＩＣ陽性およびＡＫ陽性である。感染の活性化段階は急性であるが、すでに数時間経っている。さらに注目すべきことは、標準免疫蛍光試験がまさにまだ検出可能の１：１０の力価を生じたのに対し、三重試験セットのＡＫ試験はより高い感受性に基づき明らかに陽性のＡＫ結果をもたらした。
【０１４４】
試料８９０はＰＢＭＣ中の抗原試験で完全に陰性であった。免疫蛍光による標準抗体試験は同様に陰性であった。この両方のパラメータによっては潜在的感染は識別できなかったであろう。両方の抗原および対応するＡＫ試験（三重セット）のためのＣＩＣ試験は限度値であった。すなわち感染の疑いがあった。このような場合には、上述のように個々の抗原のための試験の応用が解明の機会を提供する。それ以外このような場合には、明確な結果に到達するため、別の継続試料を調査する必要がある。試料８９０にはＶＩＩＩ（評価）における配列４（もしくは５）が当てはまる。
【０１４５】
Ｘ．無症状のウマ在高の感染検出
１９９５年８月〜１０月まで３３のタネウマ飼育場からの２２２頭の健康な全血培養ウマがＢＤＶについて調査された。この場合、三重組合せからＡＧ試験およびＣＩＣ試験が使用された。抗体は標準免疫蛍光試験によって調査された。タネウマ飼育場あたりの調査したウマの平均の数はａ６．７＋−５．１であった。
【０１４６】
我々は１００％浸潤を３３のタネウマ飼育場のうち１４で見出した（＝４２．４％）。活性化された感染の徴候としてのＰＢＭＣ中のＡＧは、２２１頭のウマのうち３８頭だけであった（＝１７．２％）。ＡＫ（ＩＦ試験）は２２２頭のうち６８頭（＝３０．６％）に検出された。両方の百分率は健康な在高の中の他の調査に相当する。しかし実際の浸潤はＣＩＣ試験によって初めて明らかになる。我々は陽性ＣＩＣを２１９頭のウマのうち１５６頭に見出した（＝７１．２％）。ウマの４分１強（２６．２％）でＣＩＣがただ１つの感染マーカーであった（２２１頭の動物のうち５８頭）。すなわち各々４頭に１頭の健康な動物は潜在的に感染していたが、ＣＩＣパラメータを介してのみ検出することができた。
【０１４７】
以下、このグループから４つのタネウマ飼育場から６頭の動物の例でＣＩＣ値の完全な滴定による調査結果をまとめる。
【０１４８】
【０１４９】
【０１５０】
【０１５１】
【０１５２】
【０１５３】
【０１５４】
注釈：
例１に高陽性および低陽性のＣＩＣ結果を対比する。２５歳のオスウマ１ｂ（Ｎｒ．５２９）の高齢にかかわらず、ＣＩＣ値は必ずしも高くなっていない。
【０１５５】
例２は比較可能年齢で同一のタネウマ飼育場から２頭のメスウマを示す。メスウマ２ａ（４９５）は感染していて、平均のＣＩＣ値を有していた。メスウマ２ｂ（８４９６）は、それに対しＣＩＣ陰性であって、感染していなかった。
【０１５６】
例３に異なる年齢グループから同じタネウマ飼育場からの２頭の高陽性の動物を示す（２３歳および９歳）。より若い動物は非常に高いＣＩＣ値を有していた。
【０１５７】
全ての動物に対し、以前にも調査時点でも罹患していなかった高価な飼育ウマであることが等しく当てはまる。
【０１５８】
本発明はすでに公知のパラメータすなわち白血球中の抗原（ＡＧ）およびプラスマ中の抗体（ＡＫ）と、新たに見出された血漿中の試験パラメータ“循環免疫複合体”（ＣＩＣ）の組合せによって初めて種を包含する（ほぼ）遺漏のないＢＤＶ感染の種々の段階の検出を可能にする。３つのパラメータは、全てただ１つの血液試料によって決定することができる。本発明に初めて記述された、唯一の長期に永続する感染マーカーとしてＢＤＶ特異的ＣＩＣの検出は、健康な保菌者の検出（潜在的感染）も罹患した個体における感染経過および治療効果の評価をも可能にする。その場合、体液中の被検体液試料で自由循環免疫複合体がＢＤＶ抗原とそれに蓄積された特異的抗体とから適切な免疫学的試験によって検出される。
【０１５９】
以下、さらにもう１つの例を図面を利用して説明する。
【０１６０】
図１、図２、図４および図５に、感染状態が（特に疾患段階で）どのように連続的に変化し、永続的ウィルス感染のこの型にとり（活性化段階中の低増殖率により）診断的に複数のパラメータの検出が好適であることを概略的に示す。記載されているのは、それぞれ“数週間”にわたる４０５ｎｍでの絶滅である（調査経過）。各図面は以下の経過を示す：
ＣＩＣ−循環免疫複合体
ｃＡｇ−細胞抗原
ｐＡｇ−プラスマ中の抗原
Ａｂ−抗体（ＥＩＡ）
【０１６１】
図１はヒト患者１（原始細胞Ｄ．Ｒ．）、入院による臨床的世話中の年齢５９歳のｒＭＤＤ患者のデータを示す（抗原抑鬱薬による治療、非抗ウィルス性）。調査期間は約３か月であった（１８週間）。試験システム：ＥＩＡ；希釈：ｃＡＧ１：２、ＣＩＣ１：２０、ｐＡＧ１：２、１：１００以上；排除限度０．１試料源：ｃＡＧ用：ｃＡＧ用に超音波処理したＰＢＭＣ、その他対応するプラスマ試料。
【０１６２】
図２は３０歳のＯＣＤ患者のための図１に対応する線図を示す（ＯＣＤ＝ｏｂｓｅｓｓｉｖｅ ｃｏｍｐｕｌｓｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ入院による臨床的処置中）。ＢＤＶ感染はこの患者の場合、抑鬱状態の患者の場合と同様に重要な役割を演ずる。両患者グループ − 抑鬱状態もＯＣＤ患者も − セロトニンコントロールされた過程を妨げられることがある。これは、ＢＤＶウィルスが機能的に一定の位置を脳内と神経節に係合するので、それと関連していると思われる。図１および図２は互いに類似のパラメータ推移を示す。
【０１６３】
図３は動物の分野から、しかも２頭のボルナ病のウマからの２例を示す。ここではそれぞれ試料を１つだけ調査した。ｐＡＧ（自由プラスマ抗原）およびＡｂ（＝自由プラスマ抗体（ＡＫ）、ＥＩＡで測定）とＣＩＣの関係を良く識別できる。試料４３１１は１９９７年３月に（疑いのある）臨床診断に基づき“ボルナ病”が調査された北ドイツ（原始細胞Ｇ．）産のウマから得られた。ＩＦ抗体力価は１：４０であった。試料５２３１は、１９９７年５月に臨床診断に基づきボルナ病が調査された南ドイツ（原始細胞Ｄ．）産のウマから得られた。ＩＦ抗体試験は陰性であった。このウマは２か月前に、１９９７年３月に罹患し、感情鈍麻および嗜眠状態を示した。５月にまだ残っていた症状は首振りと硬直した歩みであった（ＥＩＡの測定パラメータ：希釈ｃＡＧ１：２、ＣＩＣ １：２０、ｐＡＧ１：２、１：１００以上、排除限度＝０．１、試料基礎：ｃＡｇ：超音波処理したＰＢＭＣ、その他は対応するプラスマ試料）。
【０１６４】
各図の基礎におくデータは以下の表形式で表す：
【表１】
【０１６５】
【表２】
【０１６６】
【表３】
【０１６７】
最後に図４ａ〜４ｄは種々の希釈によるＣＳＦ試料の種々の結果を示す。図ａ）〜ｃ）は情動障害における高い陽性の抗原マーカーと、ｄ）は精神分裂病における陰性の試験結果とを示す。
【０１６８】
高い値は急性抑鬱状態中の脳内の一過性の激しいウィルス増殖を表す。
【０１６９】
各図面の詳細：
図ａ：患者３６のＣＳＦ試料 − 大鬱病性障害、第２症状発現、女性、５８歳。
【０１７０】
図ｂ：患者１３７のＣＳＦ試料 − 大鬱病性障害、第２症状発現、女性、２９歳。
【０１７１】
図ｄ：ＣＳＦ試料 患者２７：精神分裂病、偏執症性型、慢性、男性、３９歳；
患者６２：精神分裂病、偏執症性型、非特異的、女性、３７歳；
患者１３０：精神分裂病、偏執症性型、準慢性、女性、２０歳
【０１７２】
ＸＩ．まとめ
ボルナ病ウィルス（ＢＤＶ）は被包化陰性鎖ＲＮＡウィルスの新しいファミリのプロトタイプとみなされる。ＢＤＶは神経細胞、さらにまた大脳中の非神経細胞および細胞を破壊しない身体に感染する。ＢＤＶ感染は永続的である。該ＢＤＶ感染は人間および多くの家畜および有用動物に現われる。ヒトＢＤＶ感染は高い確率で段階的な情動障害に関与していて、動物の場合、ＢＤＶは段階的な行動障害を引起こす。個体の危険因子は潜在的感染の活性化の頻度とそれにより罹患危険性とを決定する。無症状の保菌者はそれぞれの種の中に存在する。診断はウィルスの低増殖率と長い潜在的段階とによって困難になる。
【０１７３】
本発明は、すでに公知のパラメータ、白血球または血漿中のＡＧおよびプラスマ中のＡＫと、新たに見出された試験パラメータ、血漿中のＣＩＣの組合せによって人間および動物におけるボルナ病ウィルス（ＢＤＶ）による感染のほぼ遺漏のない検出を可能にする。３つのパラメータは全てただ１つの血液試料（１０ｍｌクエン酸塩添加血）によって決定することができる。
【０１７４】
本発明で初めて記述された、ただ１つの長期的に永続する感染マーカーとしてのＢＤＶ特異的ＣＩＣの検出は、健康な保菌者の検出（潜在的感染）も罹患した個体における感染経過および治療効果の評価をも可能にする。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒト患者１（原始細胞Ｄ．Ｒ．）、入院による臨床的世話中の年齢５９歳のｒＭＤＤ患者のデータを示すグラフである。
【図２】図２は、３０歳のＯＣＤ患者についての図１に対応するグラフである（ＯＣＤ＝ｏｂｓｅｓｓｉｖｅ ｃｏｍｐｕｌｓｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ入院による臨床的処置中）。
【図３】図３は動物の分野から、２頭のボルナ病のウマの２例を示すグラフである。
【図４ａ】図４ａは、ＣＳＦ試料についての種々の結果を示すグラフである。
【図４ｂ】図４ｂは、ＣＳＦ試料についての種々の結果を示すグラフである。
【図４ｃ】図４ｃは、ＣＳＦ試料についての種々の結果を示すグラフである。
【図４ｄ】図４ｄは、ＣＳＦ試料についての種々の結果を示すグラフである。
本発明は、体液中の循環免疫複合体（ＣＩＣ）の検出を介したＢＤＶ感染の検出方法、一般のＣＩＣおよび特にＢＤＶ特異的ＣＩＣの検出方法、ならびにこれらの検出方法に適した診断キットに関する。
【０００２】
ＢＤＶ感染は多くの有用動物および家畜（ウマ、ヒツジ、ウシ、ネコ）および人間に見出される。ＢＤＶは５個の遺伝子をコードする陰性の極性の非セグメント化一本鎖ＲＮＡから成るゲノムを有する直径９０ｎｍの被包化ウィルスである（ゲノムのサイズ：８．９キロベース）。同種のウィルスには、たとえば狂犬病ウィルスおよび麻疹ウィルスが含まれる。遺伝子の特殊性（宿主細胞の細胞核中の増殖）に基づき、ＢＤＶはプロトタイプとして独自のウィルスファミリに分類されている（ボルナヴィリダエ）。ＢＤＶは大脳辺縁系中の神経細胞、行動、情動および記憶力がコントロールされる機能単位に対して特別の選好を有する。さらにまた、他のＢＤＶの細胞型も発生する。診断上特に重要なのは末梢血単核白血球細胞（ＰＢＭＣ）である。
【０００３】
ＢＤＶは宿主（インビボ）中でも細胞培養（インビトロ）中でも宿主細胞を破壊しない（細胞病原性の効果なし）。ＢＤＶの第一の病原性の効果は、感染した脳細胞中の機能障害に基づいており、これはおそらく神経伝達物質受容体によって誘発される。動物実験に基づくデータからグルタミン酸受容体の（不可逆性の）細胞内皮系遮断に対する暗示がある。正確な機構および受容体型はまだ知られていない。
【０００４】
ＢＤＶ感染は動物において主症状の感情鈍麻、注意力喪失および運動平衡障害を伴う段階状の行動障害に結びついている。人間の場合、再発性の内因性情動障害を有する患者から感染性のヒトボルナウィルスの単離後、前記機能障害および場合によって他の大脳機能障害への関与は非常に蓋然性がある（同様におそらく神経伝達物質機能に関しても）。躁鬱病の形態を含む内因性の再発性抑鬱状態は１〜５％で重要な精神医学的疾患に属し、さらにまた該当者にとり侵害の重度によって社会にとっても社会経済的な視点から重要な健康上の問題である。
【０００５】
ＢＤＶ感染は動物および人間において、おそらく生涯永続する。感染源はまだ完全に知られていない。感染経過は潜在的かつ活動的な段階を特徴とする。活動的な段階中に、臨床上の症状が現われることがある。動物（最もよく調査されているのはウマである）の場合、多くの感染は疾患が無い（無症候性の保菌者）。その数は罹患が登録されたウマ在高の５０％にまでなることがある。激しい疾患に結び付く感染の活動的段階の危険性は発生学上の因子および個体の遺伝的負荷（ストレス因子、免疫抑制）に左右される。
【０００６】
人間の場合、おそらく情動障害への素因を持たない健康な感染者にとって一般的な罹患の危険性はないであろう。逆に、すでに症状発現性の情動障害を有する、情動障害の進展に対して先天的な素因を有する人物の場合、および該人物のまだ健康な一親等の血縁者の場合、狭義の意味でＢＤＶ感染によって増加した罹患の危険性が与えられている。
【０００７】
無症候性の保菌者の場合（疫学上の理由から）も罹患者で感染段階をコントロールするためにも、ＢＤＶ感染の把握に向けて論争の余地の無い信頼できる診断システムに対する需要の増加がある。
【０００８】
ＢＤＶウィルスはすでに良く調査されていて、すでに完全に配列決定されているので、慣例的な抗体試験が知られている。１９９３年までは血清中の抗体試験の可能性だけがあった。抗体は一般にＢＤＶ核タンパク質ｐ４０（４０ｋＤａ相対分子量）および燐タンパク質ｐ２４（２４ｋＤａ）に合せている。これらの抗体はウィルスを中性にしない。やがて特異的抗体の欠失はＢＤＶ感染を排除しないことが明らかになった。これは、抗体が感染者の血清中に永続しない（または非常に長く）永続しないことを意味する。さらに人間および動物で自然感染によって達成されたＡＫ濃度（力価）は元々ごく僅かであり、より無感覚な試験システムによっては常に検出可能ではない。
【０００９】
特にＢＤＶ感染の疾患で重要な活性化を評価するための重要な進歩は、ＰＢＭＣが単離によって細胞中に検出できるウィルスタンパク質を表現するという発見によって行なうことができた。これらのタンパク質は時々プラスマ中にも見出される。タンパク質（ＡＧ）形質発現は重要な活性化パラメータであることが証明された。この活性化は良好に臨床的な罹患と相関関係があり（人間および動物）、定量的に測定可能であり、別の経過（予後回復の機会、抗鬱剤の要求など）の評価に非常に重要である。ＡＧ決定は、それによって単にウィルス自体を検出するが、該ウィルスの現在のまたは予想される将来の活性化に関して何も読取ることができないので、ＰＢＭＣ中のネステッドＲＴ−ＰＣＲによる増幅を介したウィルス核酸の検出に置き換えることができない。
【００１０】
ＡＧマーカーは全般的に急性の疾患段階の一部（２−３週）に制限されていて、回復期にはもはや検出できない。ＡＫはそれに続き活性化促進のそれぞれの強度に応じて間欠的に検出可能にすることができ、さらにまた該ＡＫは完全に欠失することもある。
【００１１】
このようなＢＤＶ診断の現在の状態は特に回復期において患者（人間および動物）の無症状の間欠期（これは数年かかることがある）で、および既往罹患のない感染した個体で、すなわち要約すれば潜在的状態におけるＢＤＶ感染で機能を発揮していない。この両試験パラメータＡＧおよびＡＫは、潜在的段階で依然として存在する感染の場合に偽陰性に検出されることがある。
【００１２】
従って本発明の課題は、ＢＤＶ感染の永続性によって急性のおよび潜在的な段階の変化中に非常に長い期間にわたり持続することがある該ＢＤＶ感染の可能な限り完全な把握を可能にするために、感染に対する新規の検出方法を開発することにある。同様にこのような検出のために使用可能の診断キットを提供することである。
【００１３】
この課題を解決するために本発明によりボルナ病ウィルス（ＢＤＶ）感染の検出方法が考慮されていて、この方法では体液中の被検体液試料で自由に循環するＢＤＶ抗原とそれに蓄積した特異的抗体とから成る免疫複合体が適切な免疫学的試験によって検出される。従って本発明は特定の疾患段階において体液中で、たとえば血清中で、高い濃度で循環するＢＤＶ抗原と身体によってそのために特異的に形成された抗体とから成る免疫複合体が発生することを検出できたという重要な観点に基づく。これらの免疫複合体は特に抗原および／または抗体がまさに検出できない疾患段階でも存在することがある。
【００１４】
本発明の継続形成では、前記認識に基づき、永続的なＢＤＶ感染を実質的に遺漏なく把握するための完全に新しい診断コンセプトが提示される。それにより新たに見出されたパラメータＣＩＣがすでに公知のパラメータすなわち抗原（ＡＧ）および抗体（ＡＫ）と組合せて決定され、これが従来不可能であった永続的なＢＤＶ感染の種々の段階の把握を可能にする。それにより付加的に決定された抗原は、好ましくは“Ｎタンパク質”とも呼ばれるＢＤＶ核タンパク質ｐ４０（４０ｋＤａ相対分子量）および“Ｐタンパク質”とも呼ばれるＢＤＶ燐タンパク質ｐ２４（２４ｋＤａ相対分子量）である。この組合せによる方法は全部を含む試験システムを考慮しており、このシステムでは血漿中のＢＤＶ特異的な循環免疫複合体（ＣＩＣ）、白血球（ＰＢＭＣ）中ならびにプラスマ中のＢＤＶ特異的タンパク質（抗原、ＡＧ）および／または血漿中のＢＤＶ特異的抗体（ＡＫ）の決定から成る試験組合せが実施される。
【００１５】
好ましくは、被検体液試料は血液試料であり、３つのパラメータは全て約１０ｍｌのクエン酸塩添加血のただ１回の血液試料によって決定することができる。
【００１６】
この血液試料は以下のように処理することができる：
（ａ）血液試料から血漿分画を単離し、血漿、髄液または尿試料で互いに別々に以下の試験を実施する：
（１）ＢＤＶ抗原の抗原検出、
（２）ＢＤＶ特異的抗体の抗体検出、
（３）ＣＩＣ検出、好ましくは請求項５ないし９のいずれか１つによる；
（ｂ）血液試料から血漿分画および髄液分画を調製し、（ａ）（１）による試験を血液試料の場合に髄液分画および／または血漿分画で実施する。
【００１７】
本発明によって初めて多数の試験を利用し、ＣＩＣに診断用に、さらにまた感染経過の理解に重要な役割が与えられることを示すことができた。見出されたように、ＣＩＣは溶解性の、ＡＫ試験で検出可能のＢＤＶ抗体よりも著しく長く永続し、急性の臨床段階においてのみ発生する細胞性ＢＤＶ−ＡＧよりも長く永続する。ＣＩＣはより長い無症状の段階後、ＡＫ試験およびＡＧ試験が陰性を示し、ＡＧ遊離とこのＡＧ複合体ＡＫとによる過去の活性化段階への逆推論を許容する場合、まだ検出可能である。
【００１８】
必要がある場合はＡＫおよびＡＧと組合せて使用される診断上の試験パラメータとしてのＣＩＣの導入によって、本発明は事前に橋渡しできなかった診断上の間隙を埋める。
【００１９】
循環免疫複合体すなわち自由に移動するＡＧ−ＡＫ複合体の原理的な存在は、種々のシステム用に公知である。血清中のＡＫによるＡＧの自由複合体化およびその逆は、すでに種々の免疫学的試験のために活用されている。ＢＤＶ感染時のＣＩＣの存在、特に潜在的間欠期でも長く持続する高濃度のＣＩＣとそれに関係する診断上のＣＩＣの重要性は従来完全に知られていなかった。
【００２０】
内因性の情動障害およびＢＤＶ感染を有する数人の患者で、急性段階中でも毎週のコントロールによって例外なく著しく高いＣＩＣ濃度を検出可能であるが、しかしＰＢＭＣ中の自由ＡＫおよびＡＧはまったく測定できない。これらの患者は慣例的な診断によってはそもそも全く検出されなくなる。この感染経過では、高濃度で形成されるＰＢＭＣ中に形成されたＢＤＶ−ＡＧが即時にプラスマの中へ入り込み、ＣＩＣ中に存在するＡＫによって結合されると推定しなければならない。
【００２１】
本発明に記述したＣＩＣの決定および特にＣＩＣ、ＡＧおよびＡＫ決定から成る試験組合せは、このため永続的なＢＤＶ感染にその潜在期と活性化との間で変動する経過によって初めて適切に扱われ、それによって罹患した個体の診断上の世話のためにも健常人における潜在的感染の把握のためにも大きな意義を有する。
【００２２】
危険な患者の場合、ＣＩＣの強制的な決定はもはや急性の罹患に制約されないＢＤＶ診断を可能にする。健常人の場合の潜在的感染の調査は、少ないウィルス活性化のために理論的に木目細かなコントロールによってのみ可能であったが、実際上ほとんど実行できなかった。ＣＩＣ試験と試験組合せによって潜在的感染はより健全に見出すことができ、これは感染源および伝染機構が人間と動物の場合でまだ解明されていないので、疫学上の重要性がある。
【００２３】
本発明による方法の使用は人間と動物の場合のＢＤＶ感染の把握に適していて、臨床上の罹患に無関係に可能である。本発明による検出方法によって人間と種々の動物種のためのＢＤＶ特異的ＣＩＣを定量化することができる。
【００２４】
「検出」という用語は本発明の専門用語に従って常に、第一の定量的な検出も相対的なＣＩＣ濃度の定量的決定も力価の形態で可能であるように使用する。
【００２５】
循環免疫複合体の体液中の適切な免疫学上の試験もしくは適切な検出方法として本発明により以下の段階を有する方法を提案する：
（１）適切な方法で必要がある場合はそのために準備された保菌者のＦｃ部位上に、ＣＩＣ中に含有された抗原に特異的に結合するモノクロナール抗体またはポリクロナール抗体の固定；
（２）抗体と、ＣＩＣの存在を試験されるべき体液試料、好ましくは血漿試料の接触；
（３）段階（１）および（２）によって処理された試料と、種の体液試料が使用された該種の抗体に特異的である被験種、好ましくはヤギ抗種抗体の接触；
（４）適切な免疫学上の検出方法による二次抗体の量の検出および／または決定。
【００２６】
この場合、段階（１）で使用したＢＤＶに特異的な抗体は、好ましくは、たとえばマウスから得られたモノクロナールＢＤＶ特異的Ｎタンパク質および／またはＰタンパク質抗体である。
【００２７】
必要がある場合は適切な方法で準備した担体を吸着的に固定するプラスチック試験プレートまたは対応する試験小管にすることができ、このプレートまたは小管は好ましくは初めにＣＩＣ抗原特異的抗体が得られた種に対して特異的である二次抗体により可能な限り完全にコーティングされ、それに続くプレート準備段階でＣＩＣ抗原特異的抗体がこの二次抗体層の表面に取込まれる。
【００２８】
選択的にＣＩＣ抗原特異的抗体の固定はこの方法の段階（１）で、たとえばポリスチレン担体上にＣ１ｑから成る基層の取込みによって、抗体を適切に整列して確実にプレート上に固定することを可能にする適切な別の方法でも行なうことができる。このような基層の取込みは、一般にコストのかかるＣＩＣ特異的抗体をより節約して扱うことができることを生ぜしめる。
【００２９】
この方法の段階（４）による検出は、たとえば酵素結合した二次抗体を介して行なうことができ、これで適切な基質によって発色反応が誘発される。目下のところ有利な実施形態では二次抗体がアルカリ性のホスファターゼと結合され、アルカリ性のホスファターゼとパラ−ニトロフェニルリン酸塩との間で黄色の色素を生ぜしめる反応が利用されることによって、ｐ−ニトロフェニルリン酸塩で視覚的に可視化もしくは光学式検出器で読出可能にされる。
【００３０】
本発明に従った二次抗体として、抗原に特異的ではなく、別の抗体、すなわち「異種」として識別された他の種の抗体に特異的である抗体が挙げられる。
【００３１】
ＣＩＣの決定は、このＣＩＣが十分な濃度で存在するそれぞれの体液で行なうことができる。目下のところ有利な実施形態では、試験が好ましく行われる体液はクエン酸塩添加血から得られた血漿試料である。ただしそれらの中でも髄液も使用することができる。
【００３２】
試験組合せのためにＢＤＶ抗原およびＢＤＶ特異的抗体が必要になる。抗原源としてＢＤＶに感染した細胞を使用することができる。この試験は、単離された抗原の代りに（同質化された）抗原を含有する細胞懸濁液が直接使用される場合、妨害または偽和されない。例に引用した試験（「ＡＫ試験」参照）では、たとえばボルナ病で死亡したウマの１０％脳懸濁液を希釈して使用した。
【００３３】
本出願人はドイツ微生物および細胞培養集成に細胞株として成長し、永続的にＢＤＶで感染させた胎児ヒト稀突起神経膠細胞を異種ウィルスおよびマイコプラスマなしで寄託した。この寄託はブダペスト協定の条件に従って１９９７年１２月１２日に行われた；培養ＯＬＩＧＯ／ＴＬには名称および識別番号“ＤＳＭ ＡＣＣ ２３３４”が指定された。
【００３４】
この細胞株は本出願人のストックから由来する。胎児ヒトＯＬ細胞はＣＰＥなしに永続的にＢＤＶに感染している。約１１０の継代接種を通過したこの細胞株の内部名称は、ＯＬＩＧＯ／ＴＬ（もしくはＯＬ／ＴＬ）である。この細胞からいつでも本発明による使用に適した抗原を得ることができる。さらに、この細胞株によって別の細胞株 − たとえば動物細胞株も − 感染させることができる。力価は約１０３ＦＦＵ／ｍｌである。特にこの細胞は上記抗原ｐ４０およびｐ２４も含有する。
【００３５】
このようなタンパク質の細胞懸濁液またはそこから洗浄されたタンパク質を含有する細胞懸濁液によって、常時ＢＤＶ特異的モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体を自体公知の方法で産生することができる。目下のところマウスのモノクロナールＮ抗体およびＰ抗体が有利である。そのため、通例のように、マウスが感染もしくは免疫性にされ、そのＢ−細胞からハイブリドーマ培養が製造される。上澄液はＢＤＶ特異的に“着色”する抗体で連続的に試験される（スクリーニング）。抗体の獲得に関しては“Ｈ．Ｌｕｄｗｉｇら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）Ｓｕｐｐｌ．７：１１１−１１３”も参照。
【００３６】
さらに、本発明はＢＤＶ感染検出用の診断キットを包含する。このキットもしくはこの試験または検出システムはＢＤＶ特異的モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体、試料がＢＤＶ抗原またはＢＤＶ−ＣＩＣを含有することが推測される該試料と前記抗体の接触手段、ならびに蓄積された抗原または抗原抗体複合体（ＣＩＣ）の検出手段を含有する。選択肢として、このキットはＢＤＶ抗原でコーティングＢＤＶ特異的モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体、試料がＢＤＶ抗体を含有することが該試料から推測される場合、該試料とこの抗原コーティング抗体の接触手段、ならびにその場合に蓄積したＢＤＶ抗体の検出手段を含有する。
【００３７】
さらに、この診断キットはユニット上にまたはその中にＢＤＶ特異的抗体が不動化されて存在する該ユニットを包含してもよい。このようなユニットは一定の方法で準備した試験プレートまたは内部をコーティングした試験小管とすることができる。
【００３８】
有利な一不動化方法においてＢＤＶ特異的抗体は、モノクロナールまたはポリクロナールの、ある種Ｉから得られた抗体であり、これは該抗体がもう１つの種（種ＩＩ）から得られた種ＩＩ抗種Ｉ ＩｇＧによってコーティングされた担体上に、好ましくは試験プレートまたは試験小管の形態で取込まれ、それによって固定されていることによって不動化されている。
【００３９】
さらに好ましくは、種Ｉの抗体はポリクロナールまたはモノクロナールのマウス抗体、好ましくはＰタンパク質および／またはＮタンパク質特異的モノクロナールのマウス抗体であり、担体の吸着性のコーティングが抗マウスＩｇＧ、好ましくはヤギ抗マウスＩｇＧから成る。選択肢としてＢＤＶ特異的抗体はユニット上にまたはその中にポリスチレン結合Ｃ１ｑを介しても固定もしくは他の適切な方法で不動化することができる。
【００４０】
実施例
本発明の理解を容易にするため、以下、血液試料の処理から評価まで、試験組合せの技術的な詳細を説明する。この応用は個々の例によって解明する。これらの例は単に解明上の目的に利用する。もちろん本発明の原理は他の方法に置き換えることもできる。
【００４１】
第Ｉ部：被検試料の調製
ＢＤＶ感染について調査するためクエン酸塩添加血１０ｍｌが必要になる。その場合、０．１０６モルのクエン酸ナトリウム−２−水化物溶液９ｍｌの１ｍｌに静脈の発端者血液を加えて、よく混合する。推奨に値するのは既製のクエン酸塩小管、たとえばＳａｒｓｔｅｄｔの１０ｍｌモノベッテ９ＮＣの使用である。この試料は発送するまで調査実験室に４℃で保管しなければならない。冷却（期間１日〜最長３日まで）しないで速達による発送は、試料品質を損わない。
【００４２】
クエン酸塩添加血試料は密度勾配遠心分離によってプラスマ分画と細胞血液成分とに分離する。プラスマ分画はＣＩＣ、ＡＧおよびＡＫの試験に使用する。白血球（ＰＢＭＣ）の細胞分画は調製後ＡＧ試験に使用する。ＣＩＣに関してのみ試験される場合またはプラスマ試験のみを実施する場合、細胞分画を除くことができる。
【００４３】
各成分を分離するために、それぞれの動物種に応じて異なる密度のＦｉｃｏｌｌ分離溶液（バイオクロム）を使用する。
【００４４】
血液６ｍｌのために以下を必要とする：
Ｉ．１０ｍｌクエン酸塩添加血試料の分離プロトコル
（１）円錐形の１０ｍｌ使い捨て小管に対応する密度の３ｍｌ Ｆｉｃｏｌｌ分離溶液を満たし、その上に最大６ｍｌクエン酸塩添加血を入れる。
【００４６】
（２）試料を２０分間１０４９ｇ（２２００ｒｐｍ、Ｈｅｒａｅｕｓ Ｃｈｒｉｓｔ Ｍｉｎｉｆｕｇｅ）で遠心分離する（Ｆｉｃｏｌｌ＜１．０９０密度を有する全試料に）；密度１．０９０を有するＦｉｃｏｌｌで２０分間１２４９ｇ（２４００ｒｐｍ）で遠心分離する。
【００４７】
（３）プラスマ分画（上澄液）を注意して使い捨てパスツールピペットで取除く；同日の即時試験のために４℃で保管し、後の試験用には−２０℃で保管する。
【００４８】
（４）白血球分画はＦｉｃｏｌｌ表面にもしくはその上方に識別可能の環を形成し、他方（不要の）Ｆｉｃｏｌｌ中の赤血球はペレットとして存在する。プラスマの除去後、細胞環を使い捨てパスツールピペットで採取し、新しい円錐形の１０ｍｌプラスチック小管の中に移し、ＰＢＳを満たし、よく混合する。
【００４９】
（５）白血球（ＰＢＭＣ）を１０分間１９５２ｇ（３０００ｒｐｍ）で遠心分離する。上澄液を捨て、ペレットを最大０．５ｍｌ ＰＢＳ＝約１０倍に濃縮の中に取込む。溶液をねじキャップ付きの滅菌凍結小管（たとえばＮｕｎｃ、１．５ｍｌ）の中に移す。
【００５０】
（６）内部のＢＤＶ抗原の即時試験のために（下記参照）、ＰＢＳ中の細胞の保管を４℃で、後の試験の場合に最低−２０℃で、より良くは−７０℃で保管。
【００５１】
ＩＩ．試験システム
ＰＢＭＣおよび／または血漿中のＡＧおよびプラスマ中のＣＩＣならびにＡＫの試験のためにＥＩＡ（酵素免疫定量法）−ベース（固相定量法）の試験組合せを使用する。第１の両試験段階は３つの試験システム全てに等しい。従って試験プロトコルの形式における以下の説明は次のように分けられる：
（Ａ）試験プレートのコーティング（Ａ１およびＡ２）
（Ｂ、Ｃ、Ｄ）ＡＧ、ＣＩＣおよびＡＫ試験用プロトコル
【００５２】
ＥＩＡ用プロトコル（二重サンドイッチ型）
（Ａ）ＥＩＡプレートのコーティング用プロトコル
以下の反応用のプラスチック担体としてＭａｘｉ Ｓｏｒｐ Ｉｍｍｕｎｏモジュール（Ｎｕｎｃ（Ｒ）Ｍａｘｉ Ｓｏｒｐ Ｆ８、Ｃａｔ．Ｎｏ．４６９９４９）を使用する。１つのフレームの中に垂直に配置した８つの平らなプラスチック凹部を備えた１２モジュールを挿入し、正確に９６穴の微量滴定プレートの寸法を有する（ＥＩＡシステム用の標準）：
【００５３】
（Ａ１）凹部あたり０．１ｍｌのＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ（Ｒ）ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃフラグメント、ヒト、ウシ、ウマ血清タンパク質（Ｄｉａｎｏｖａ（Ｒ）、Ｋａｔ．Ｎｒ．１１５−００５−０７１）に対して吸着し、結合緩衝液中で１：１０００（＝ミリメートルあたりタンパク質１．８μｇ）に希釈する；夜通し４℃でまたは２時間３７゜でインキュベート。
【００５４】
洗浄緩衝液中で３回洗浄（Ｄｙｎａｔｅｃｈ ９６穴プレート洗浄器）
（Ａ２）凹部あたり０．１ｍｌのＢＤＶ−Ｎタンパク質ｐ４０およびＢＤＶ−Ｐタンパク質ｐ２４に対するモノクロナール抗体（Ｗ１およびＫＦＵ２、参照文献：Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）Ｓｕｐｐｌ．７：１１１−１３３）（“捕捉”抗体として）、それぞれ希釈緩衝液中で１：５００に希釈。２時間３７℃でまたは夜通し４℃でインキュベート。
【００５５】
その後、各プレートは４℃で少なくとも再使用４週前まで保管することができる。
【００５６】
（Ｂ）ＰＢＭＣ中のＢＤＶ抗原（ＡＧ）の決定プロトコル
準備：
− Ａ２までコーティングしたプレートの洗浄、洗浄緩衝液中で３回
− Ｉ．で単離したＰＢＭＣの超音波処理（２０サイクルｍｉｎ−１、４０ｍＡ）（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ Ｂ１５Ｐ；参照文献Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ（１９９６）１：２００−２１２）。
【００５７】
ＡＧ試験：
（Ｂ１）試料希釈：プレコーティングしたプレートの各凹部の中に希釈緩衝液０．１ｍｌをのせ、Ａで超音波処理したＰＢＭＣ（０．１ｍｌ）または血漿（０．１ｍｌ）を加え（＝１：２）、別の７段階でベース２（１：２５６まで）にさらに希釈する；夜通し４℃でインキュベート。
洗浄緩衝液中で３回洗浄
【００５８】
（Ｂ２）凹部あたりＢＤＶ特異的イエウサギ抗血清０．１ｍｌ（たとえばＧＣ１２、免疫蛍光力価１：１００００）（＝検出抗体）を対応する希釈比（１：１０００、ＩＦ力価より１０倍に濃縮）で希釈緩衝液の中へ；２時間３７℃でインキュベート。
洗浄緩衝液中で３回洗浄
【００５９】
（Ｂ３）凹部あたり０．１ｍｌのアルカリ性のホスファターゼと結合したＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ（Ｒ）ヤギ抗イエウサギＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的、ヒト血清タンパク質（Ｄｉａｎｏｖａ（Ｒ）、Ｋａｔ．Ｎｒ．１１１−０５５−０４６）に対して吸着（＝二次抗体）、抱合体希釈緩衝液中で１：３０００に希釈；１時間３７℃でインキュベート。
洗浄緩衝液中で３回洗浄
【００６０】
（Ｂ４）凹部あたり基質溶液０．１ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ ｐ−ニトロフェニルリン酸塩；Ｓｉｇｍａ、基質ペレットとして入手可能）を基質希釈緩衝液に；室温で５−１０分間、もしくは陽性検査で発色反応（無色から黄色へ反転）が現われるまでインキュベート。
【００６１】
（Ｂ５）凹部あたり阻止溶液０．０５ｍｌ（３モルＮａＯＨ溶液）を加える。
【００６２】
（Ｂ６）微量滴定プレート用マルチスキャン（たとえばＢＩＯ ＲＡＤ ２５５０ＥＩＡ ＲＥＡＤＥＲまたはＤｙｎａｔｅｃｈ）にて４０５ｎｍで測定；“ブランク”−非転換基質に対する測定。準定量評価で十分：（＋）＝弱陽性ないし最大４＋＝非常に強い陽性；＋／−は限度値を表し、第２回目の調査を必要とする。（例は応用の場合を参照）。
【００６３】
（Ｃ）血漿中のＢＤＶ特異的循環免疫複合体（ＣＩＣ）の決定プロトコル：
準備：
− Ａ２までコーティングしたプレートの洗浄、洗浄緩衝液中で３回。
【００６４】
ＣＩＣ試験：
（Ｃ１）試料希釈：希釈緩衝液０．１ｍｌをプレコーティングしたプレートの各凹部の中へ取る；Ａで：希釈緩衝液０．０９ｍｌを加え＋Ｉ．で調製した血漿０．０１ｍｌ（＝希釈１：２０）を、別の７段階でベース２（１：２５６０まで）にさらに希釈する；３７℃で１−２時間インキュベート（標準時間：３７℃で１時間）。
洗浄緩衝液中で３回洗浄
【００６５】
（Ｃ２）凹部あたり０．１ｍｌのアルカリ性のホスファターゼと結合したヤギ抗種（試料の種に対応）ＩｇＧ、Ｆｃフラグメント（同様にＤｉａｎｏｖａ（Ｒ）から入手可能）（＝二次抗体）、抱合体希釈緩衝液中で１：３０００に希釈；３７℃で１時間インキュベート。
洗浄緩衝液中で３回洗浄
【００６６】
（Ｃ３）凹部あたり基質溶液０．１ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ ｐ−ニトロフェニルリン酸塩；Ｓｉｇｍａ、基質ペレットとして入手可能）を基質希釈緩衝液の中へ；室温で５−１０分間もしくは陽性検査で発色反応（無色から黄色へ反転）が現われるまでインキュベート。
【００６７】
（Ｃ４）凹部あたり阻止溶液０．０５ｍｌ（３モルＮａＯＨ溶液）を加える。
【００６８】
（Ｃ５）微量滴定プレート用マルチスキャン（たとえばＢＩＯ ＲＡＤまたはＤｙｎａｔｅｃｈ）にて４０５ｎｍで測定；“ブランク”−非転換基質に対する測定。準定量評価で十分：（＋）から４＋まで（試験Ｂも参照）；しかし同様に最終点決定による力価表示も可能（例は応用参照）。
【００６９】
（Ｄ）血漿中のＢＤＶ特異的抗体（ＡＫ）の決定プロトコル：
準備：
− Ａ２までコーティングしたプレートの洗浄、洗浄緩衝液中で３回。
【００７０】
ＡＫ試験：
（Ｄ１）凹部あたりボルナ病で死亡したウマの１０％脳懸濁液０．１ｍｌ（＝検出抗原）を対応する希釈比（１：５０）で希釈緩衝液の中へ；選択肢として１９９７年１２月１２日にＮｒ ＤＳＭ ＡＣＣ２３３４でＤＳＭＺに寄託した永続的にボルナ病ウィルス株に感染した細胞株の細胞培養上澄液を希釈緩衝液中１：１００〜１：３００の間で希釈して使用することができる（ウィルス力価１０６ｆｆｕ／ｍｌ：１：３００で）。４℃で夜通しインキュベート（ｆｆｕ＝ｆｏｃｕｓ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）。
洗浄緩衝液中で３回洗浄
【００７１】
（Ｄ２）試料希釈：希釈緩衝液０．１ｍｌをプレコーティングしたプレートの各凹部の中へ取る；Ａで：希釈緩衝液０．０８ｍｌを加え＋Ｉ．で調製した血漿０．０２ｍｌ、前希釈１：５、（＝希釈１：５０）を、別の７段階でベース２（１：６４００まで）にさらに希釈する；３７℃で１時間インキュベート。
洗浄緩衝液中で３回洗浄
【００７２】
（Ｄ３）凹部あたり０．１ｍｌのアルカリ性のホスファターゼと結合したヤギ抗種（試料の種に対応）ＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的（Ｄｉａｎｏｖａ（Ｒ））（＝二次抗体）、抱合体希釈緩衝液中で１：３０００に希釈；３７℃で１時間インキュベート。
洗浄緩衝液中で３回洗浄
【００７３】
（Ｄ４）凹部あたり基質溶液０．１ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ ｐ−ニトロフェニルリン酸塩；Ｓｉｇｍａ、基質ペレットとして入手可能）を基質希釈緩衝液の中へ；室温で５−１０分間もしくは陽性検査で発色反応（無色から黄色へ反転）が現われるまでインキュベート。
【００７４】
（Ｄ５）凹部あたり阻止溶液０．０５ｍｌ（３モルＮａＯＨ溶液）を加える。
【００７５】
（Ｄ６）微量滴定プレート用マルチスキャン（たとえばＢＩＯ ＲＡＤまたはＤｙｎａｔｅｃｈ）にて４０５ｎｍで測定；“ブランク”−非転換基質に対する測定。評価方法は試験Ｃの通り。
【００７６】
ＩＩＩ．緩衝溶液
結合緩衝液：
原液Ａ：０．０２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ ２．７６ｇを１０００ｍｌ Ａ．ｂｉｄｅｓｔへ
【００７７】
原液Ｂ：０．０２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ ３．５６１ｇを１０００ｍｌ Ａ．ｂｉｄｅｓｔへ
【００７８】
使用溶液：
６５ｍｌ溶液Ａ＋４５ｍｌ溶液Ｂ＋１４．６ｇＮａＣｌを１０００ｍｌ Ａ．ｂｉｄｅｓｔ ｐＨ７．６へ
【００７９】
洗浄緩衝液：
ＮａＣｌ ４５ｇ（１０００ｍｌあたり９ｇ）
Ｔｗｅｅｎ２０ ２．５ｇ（１０００ｍｌあたり０．５ｇ）
ＮａＮ３ １．０ｇ（１０００ｍｌあたり０．１ｇ）
５０００ｍｌ Ａ．ｂｉｄｅｓｔへ
【００８０】
希釈緩衝液：
ＫＨ２ＰＯ４ ０．２ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ ２．９ｇ
ＮａＣｌ ８．０ｇ
ＫＣｌ ０．２ｇ
Ｔｗｅｅｎ２０ ０．５ｇ
ＮａＮ３ ０．２ｇ
１０００ｍｌ Ａ．ｂｉｄｅｓｔへ、ｐＨ７．２はコントロールもしくは調整しなければならない。
【００８１】
抱合体希釈緩衝液（ＴＢＳ−ＴＷＥＥＮ）：
ＴＲＩＳ ２．４ｇ
ＮａＣｌ ８．０ｇ
ＫＣｌ ０．２ｇ
Ｔｗｅｅｎ２０ ０．５ｇ
９００ｍｌ Ａ．ｂｉｄｅｓｔの中に溶解し、濃縮ＨＣＬでｐＨ８．０に調整し、次いで１０００ｍｌまで満たす。
【００８２】
基質希釈緩衝液（ジエタノールアミン緩衝液）：
ジエタノールアミン ９７ｍｌ
ＭｇＣｌ２ ０．１ｇ
ＮａＮ３ ０．２ｇ
８４３ｍｌ Ａ．ｂｉｄｅｓｔの中に溶解し、次いで６０ｍｌ １ Ｎ ＨＣＬを加え、ｐＨ９．８に調整する。
【００８３】
阻止溶液（３Ｍ ＮａＯＨ）：
ＮａＯＨ １２０ｇ
１０００ｍｌ Ａ．ｂｉｄｅｓｔへ
【００８４】
ＩＶ．市販の上記試験システム用の試薬の仕入先：
１．Ｆｉｃｏｌｌ（Ｒ）−分離溶媒：Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＫＧ、Ｄ−１２２４７ベルリン
２．クエン酸塩小管：Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｄ−５１５８８ニュンブレヒト
３．ＥＩＡ微量滴定−ストリップ（Ｍａｘｉ Ｓｏｒｐ Ｉｍｍｕｎｏモジュール）Ｆ−型：Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク
４．二次抗体用酵素抱合体：Ｄｉａｎｏｖａ、製造者：Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．、ウェスト グローブ、ペンシルベニア州、米国
５．ＥＩＡ−試験用洗浄装置：Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｕｌｔｒａｗａｓｈ ｐｌｕｓ；Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｓ．Ｉｎｃ．、キャンティリー、ヴァージニア州、米国
６．酵素抱合体用基質（アルカリ性ホスファターゼ用）：
Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、セントルイス、ミズーリ州、米国
７．ＫＣＬを除く緩衝液物質（ＩＩＩに）：Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｄ−６４２７１ダルムシュタット、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ、ＣＨ−９４７１ブフス
８．光度計（微量滴定プレート用）：ＢＩＯ ＲＡＤ Ｌａｂｓ．Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州、米国またはＤｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｓ．Ｉｎｄ．、キャンティリー、ヴァージニア州、米国
９．ＰＢＭＣの細胞単離用超音波装置：Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ、Ｂ１５ＪＰ、Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｃ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ、ダンバリー、コネティカット州、米国
【００８５】
Ｖ．ＢＤＶ特異的試薬
１．モノクロナール抗体：
試験Ｂ、Ｃ、Ｄ用のベースコーティング（段階Ａ２）として必要
１ａ）Ｗ１、ＢＤＶのＮタンパク質（ｐ４０）上の配列エピトープを識別する。結合部位は変わらない。すなわち宿主種すべてにわたって識別される。抗体は参照文献Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．（Ｓｕｐｐｌ）（１９９３）７：１１１−１３３に特徴づけられている。
【００８６】
１ｂ）ＫＦＵ２、ＢＤＶのＰタンパク質（ｐ２４）上の配列エピトープを識別する。結合部位は変わらない。すなわち宿主種すべてにわたって識別される。抗体は参照文献Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．（Ｓｕｐｐｌ）７：１１１−１３３（１９９３）に特徴づけられている。
【００８７】
２．イエウサギ抗血清（特異的検出抗体）：
段階Ｂ２における試験Ｂ（ＡＧ）のために必要
血清は実験的に感染させたイエウサギを使用することができる（参照文献Ｖ、１ａに同じ）。この血清は免疫蛍光試験で１：２０００の最小力価を有し、ウェスタンブロットでＢＤＶの少なくともＮおよびＰタンパク質（ｐ４０およびｐ２４）を識別しなければならない。ボルナウィルスは現在の研究水準によれば遺伝学的に非常に安定しているので、すなわち種々のウィルス株の中に僅かな配列差が見出されているだけなので、ポリクロナール抗血清は一般に異なる種のボルナウィルスのタンパク質を識別する。
【００８８】
これは、ヒト株が動物株で従来見出されていないアミノ酸レベルで重要な点突然変異を示すにもかかわらず、従来得られていた僅かなヒト株にも該当する（参照文献Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ（１９９６）１：２００−２１２；Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．（１９９６）４４：３３−４４）。
【００８９】
試験説明で挙げた血清ＧＣ１２および別の動物基準株Ｖによる感染によって得られた抗血清に加えて、種々のヒトＢＤＶ株による実験的な感染によって作られた特定のイエウサギ血清を使用し（参照文献Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ（１９９６）１：２００−２１２）、ウィルス性タンパク質の全スペクトルを識別することができる。
【００９０】
３．特定の抗原懸濁液
段階Ｄにおける試験Ｄ（ＡＫ試験）のために必要
ボルナ病で死亡したウマの脳懸濁液（１０％）は高濃度のウィルス性タンパク質（特にＮおよびＰタンパク質）を含有する。ＢＤＶ感染の結果として現われる致死性の進行性（ｐｒｏｇｒｅｄｉｅｎｔｅ）の神経学罹患は段階的に発生し自発的に減退する行動障害もしくは臨床的症状が現われずに経過するＢＤＶ感染に比べてまれである（参照文献：Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ（１９９７）Ｓｕｐｐｌ．１３：１６７−１８２）。いわゆる典型的なボルナ病と呼ばれる脳炎は、おそらくコントロールがきかなくなったウィルス産生に起因する。脳内のウィルス力価は１０５〜１０６ＦＦＵ／ｍｌに達し、それにより実験的に感染した実験室動物の範囲にある（参照文献：Ｐｒｏｇ．ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ（１９８８）３５：１０７−１５１）。
【００９１】
抗原懸濁液として直接ウィルスおよび抗原力価が決定された一定の脳懸濁液を使用することができる。上記構造におけるＡＫ試験のために、永続的にＢＤＶ（動物および人間株）に感染した細胞株から成る懸濁液も使用可能である。後者は特に標準化目的に適している。使用可能の細胞株はブダペスト協定に基づき番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２３３４のもとにＤＳＭＺに寄託されている（寄託日１９９７年１２月１２日）。
一定の抗原溶液は陽性検査として試験Ｂ（ＡＧ試験）に使用可能である。
【００９２】
ＶＩ．本発明に記載された試験組合せの試験原理の簡単な説明
試験組合せはただ１つの血液試料中の３種類の感染上重要なＢＤＶ試験パラメータ、すなわち抗原（ＡＧ、試験Ｂ）、循環免疫複合体（ＣＩＣ、試験Ｃ）および抗体（ＡＫ、試験Ｄ）のための三重試験として考案されている。これらの試験は、たとえば全く特定の予測された疾患段階の検査のために、それぞれ個別的に実施することもできる。これらの試験は固相定量法として構成されていて、光度測定により評価される。試験反応および経過は今日実験室標準である微量滴定システムで行なう。
【００９３】
ベースコーティングとして説明したＡ部は３つもしくは４つの試験に全て等しく利用される。ベースコーティングはこの試験組合せの核心部であり、高いＢＤＶ特異性に対して責任を負う。これはボルナウィルスのＮおよびＰタンパク質（ｐ４０、ｐ２４）の典型的なエピトープに向けられた２つのモノクロナール抗体から成るセットにより作られる。この“捕捉”抗体の非常に効果的な使用は抗マウス抗体によるプレコーティングによって達成される。このプレコーティングが無い場合、特異的モノクロナール抗体のアフィニティクロマトグラフィの洗浄が必要である。ＡＧ検出用の試験ＢではＰＢＭＣまたは血漿中に（自由に）存在するｐ４０およびｐ２４タンパク質が“捕捉”抗体によって結合される。同様にＢＤＶ特異的であるイエウサギのポリクロナール検出抗体により、結合した抗原は試料から識別され、酵素結合指示薬系を介して可視化される。このいわゆる“二重サンドイッチ方式”は多量の細胞タンパク質中の少量のＢＤＶ抗原を２種類の抗体系への特異的結合によって検出可能になるという長所を有する。
【００９４】
ＣＩＣ検出用の試験Ｃではプラスマ中に存在するＢＤＶ免疫複合体の抗原部が「捕捉」−抗体によって結合される。免疫複合体の抗体部は次の反応段階で酵素標識された抗−抗体（二次抗体）と結合し、これは指示薬系を介して可視化される。この実際上当惑させる簡単な試験構造により、ＢＤＶ特異的であり、それにより診断的に重要であるＣＩＣだけが可視化される。この試験は本発明の核心部であり、従来存在していた診断上の間隙を埋める。ＢＤＶ特異的ＣＩＣは本発明者によって見出され、その検出が開発された。
【００９５】
ＡＫ検出用の試験Ｄではプラスマ中に存在する（自由な）ｐ４０およびｐ２４に抗するＢＤＶ抗体が、あらかじめ“捕捉”−抗体によって結合された検出抗原溶液を介して決定される。特異的に結合した抗体は、酵素標識された抗−抗体（二次抗体）、指示薬系を介して可視化される。試験構造は検出抗原溶液として洗浄されていない感染した脳または細胞培養懸濁液を、特異性を失わずに使用できるという長所を有する。この特異性は“捕捉”−抗体によって保証される。
【００９６】
他のより簡単なＥＩＡ−ベースに対するＡＫ試験のために、固相としてプラスチック担体に結合されなければならない常に洗浄された抗原溶液が必要になるであろう。これらの試験はたしかに実施においてより短くなるが、抗原洗浄によって労力およびコストがかかる。
【００９７】
標準ＢＤＶ抗体試験として他の場所で現在間接免疫蛍光試験が実施されている（参照文献：Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９２）３６：３０９−３１５）。この試験は新しいシステムに比べ、結果が定量的および定性的に他の実験室と比較することができるという長所を有する（Ｒｅｖｉｅｗ：ＣＴＭＩ（１９９５）１９０：１０３−１３０）。免疫蛍光力価は一般にＥＩＡ力価よりも低い。第ＶＩＩ部に示した縦断面調査では、血清学的な基礎に基づいてのみ調査された別の結果との比較可能性を保証するために、抗体が免疫蛍光によって決定された。試験組合せに示したＥＩＡベースのＡＫ試験はより高い感受性によって抗体の検出方法を改善するが、最終結果で序文に記載した低い力価および検出限界を下回る低下では何も変化しない。このため従来の方法で欠けているＡＫ検出はＢＤＶ感染を除外しない。自由抗体の一過性だけの発生はＣＩＣ形成によって説明可能である。
【００９８】
４つの試験パラメータに基づき以下の診断コンセプトが生じる：
ＣＡＧ：ＰＢＭＣからの抗原試験はウィルス増殖用の急性マーカーとして適している。ｃＡＧは疾患段階の短い間だけ測定可能である。
【００９９】
ｐＡＧ：プラスマ中で実験された抗原はウィルス増殖の結果として細胞中に発生する。一般にｃＡＧより少し遅く現われ、さらにまた多くは該ｃＡＧと同時に現われ、しばしば数週間で検出可能である。ｐＡＧは同様に疾患段階中の急性マーカーである。ただし該急性マーカーの検出可能性は抗体およびそれに続くＣＩＣ形成の速さに依存する。経過調査（毎週）では、個々の試料でｐＡＧのみが陽性に測定されることが確認された（たとえば１週目；ｐＡＧのみ、２週目：ｐＡＧ＋ＣＩＣなど）。
【０１００】
ＣＩＣ：循環免疫複合体は非常に良好な感染マーカーおよび治療コントロールマーカーである。抗ウィルス性の治療下で長期的にＣＩＣの消滅が観察され、もしくは新規形成が全く観察されなかった。ＣＩＣの半減期は理論的に４週間になる；ただしＣＩＣは急性疾患発生後４週間でもしばしばまだ検出可能である。治療しない場合、ＣＩＣの代謝レベルは一般に維持されたままになる。ＣＩＣの測定は、そのため潜在的感染のスクリーニングとして健常人にも適している。
【０１０１】
ＡＫ（Ａｂ）：抗体は常にまず抗原によって刺激されて発生する。急性段階で抗体力価は、抗体が免疫複合体中で結合されるので、低いかまたは検出できない。抗体は回復期でより良く検出可能である。（注釈：以前に第三者側から刊行されたデータが常に著しく非感受的である免疫蛍光試験（ＩＦ）に係わるため、その結果、時々抗体が検出可能であったことについて指摘する）。
【０１０２】
以下の応用例では、感染の状態が連続的に（特に疾患段階で）変化し、永続的なウィルス感染のこの型にとって（活性化段階中の低い増殖率により）診断的に複数のパラメータの検出が好適であることを示す。
【０１０３】
ＶＩＩ．本発明の応用例
以下、ヒトの領域から３つの症例と、動物の領域から２つの症例とを示す。これらの例は、特に７か月までの長い観察期間が平均を超える大きい試料数（１つの個体から２３まで）によって調査することができたため、複数から選択された。
【０１０４】
ヒト患者１：（原始細胞：Ｄ．Ｒ．）
− 性別：男性
− 年齢：５９歳
− 臨床的診断：再発性大鬱病性障害（ｒＭＤＤ＝ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｍａｊｏｒ ｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、さらに神経性の関与
− 調査：急性の抑鬱状態の症状発現
− 観察期間：２７週間（約７か月、１９９６年５月〜１１月）
− 試料数：２３、その中の１３は毎週間隔で
− 概要試験結果：
抗原：４／２３
ＣＩＣ：２３／２３
抗体：０／２３
経過詳細：表１
【０１０５】
ヒト患者２：（原始細胞：Ｇ．Ｒ．）
− 性別：女性
− 年齢：７６歳
− 臨床的診断：ｒＭＤＤ
− 調査：急性の抑鬱状態の段階
− 観察期間：２１週間（約５か月、１９９６年６月〜１１月）
− 試料数：１８（その中の１４は毎週間隔で）
− 概要試験結果：
抗原：４／１８
ＣＩＣ：１７／１８
抗体：３／１８
経過詳細：表２
【０１０６】
ヒト患者３：（原始細胞：Ａ．Ｊ．）
− 性別：男性
− 年齢：６３歳
− 臨床的診断：ｒＭＤＤ
− 調査：急性の抑鬱状態の症状発現
− 観察期間：６週間（１９９６年８月〜９月）
− 試料数：７、毎週
− 概要試験結果：
抗原：１／７
ＣＩＣ：４／７（２試料＋／−）
抗体：１／７
経過詳細：表３
【０１０７】
ウマ患者１：（Ａ．Ｓ．、ノルトラインヴェストファーレン州から）
− 性別：オス、ヴァルラッハ、ハノーファラナー
− 年齢：１１歳
− 臨床的診断：ボルナ病、感情鈍麻、嗜眠状態、本能欠失、食挙動変化の重度の症状発現；自然治癒（Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ（１９９３）Ｓｕｐｐｌ １３、ｉｎ ｐｒｅｓｓ）
− 調査：急性疾患段階でおよび回復後
開始：疾患開始後３週間
− 観察期間：２８週間（７か月、１９９５年６月〜１９９６年１月まで）
− 試料数：８（６完全調査）
− 概要試験結果：
抗原：４／６
ＣＩＣ：４／６
抗体：５／６
経過詳細：表４
【０１０８】
ウマ患者２：（Ｆ．Ｄ．）バイエルン州から
− 性別：オス、バイエルンヴァルラッハ
− 年齢：１５歳
− 臨床的診断：ボルナ病、重度の神経学的経過形態；安楽死（１９９６年８月）；
第１症状発現１９９４年に、これは自然治癒
− 観察期間：１４週間（１９９６年５月〜８月まで）
− 試料数：３血液試料、１髄液試料
− 概要試験結果：
血液：抗原：２／３
ＣＩＣ：３／３
抗体：０／３
髄液：ＡＧ：所見＋／０
ＣＩＣ：１／１
抗体：０／１
経過詳細：表５
【０１０９】
選択した症例中のヒト患者の年齢分布は非典型的である。全年齢グループから対応する経過がある。これらの経過は、急性疾患段階で調査して、再発性（ｒＭＤＤまたは分極罹患）の情動罹患にとり典型的である。
【０１１０】
無症状の間欠期には一般にＣＩＣの濃度が低いままであり、他方ＰＢＭＣ中の抗原および抗体はもはや検出できない。ＣＩＣの永続性の期間および力価高さは先行するＢＤＶ感染の活性化段階の強度に依存する。我々のこれまでの調査にれば、ＣＩＣは少なくとも３か月継続する（疾患症状発現後）。非常に長い無症状の間欠期（たとえば数年）の場合、まったく体系的な調査がない。個々の調査から、我々はＣＩＣも消滅することがあることを知っている。長い健康の間欠期後の新たな抑鬱状態の症状発現の開始には、３つのパラメータの全ての状態が開始調査で陰性になることがある。従って確実にＢＤＶ感染を排除できるようにするため、ただ１回の調査だけでは十分ではない。むしろ少なくとも疾患症状発現の最初３分の１で第２の調査が必要である。感染がある場合、一般にその場合は少なくともＣＩＣがまだ陰性ＡＧもしくはＡＫ所見で見出される。
【０１１１】
これは実際上、ＢＤＶ感染が時間的間隔を考慮する場合本発明に示したＣＩＣおよびＡＧとＡＫを併せて考慮する新しい三重試験によって、十分な安全性で識別できることを意味する。
【０１１２】
ウマ患者症例は、罹患した感染動物を考慮する。健康な無症状の感染保菌者はしばしばＣＩＣによってのみ検出可能である。健康なストック中の調査例はＸ．以下に記載した。
【０１１３】
第ＶＩＩ部の症例開示の詳細：
注釈：
ヒト患者１は、該ヒト患者が少ない患者に含まれる限りでの特殊症例を表し、該患者では急性疾患段階において毎週の検査でほぼもっぱら非常に高いＣＩＣ濃度になるが、しかしＰＢＭＣ中には自由抗体を全く検出できず、ごくまれにＡＧが検出可能であった（序文も参照）。我々は、ＰＢＭＣ中に形成されたＢＤＶ−ＡＧが即時にプラスマの中へ入り込み、ＣＩＣ中に存在する抗体によって結合されることを想定する。このような患者は従来の試験方法によってはＣＩＣを考慮せずに実質的に検出できないであろう。
【０１１５】
我々は最初の１１試験週間をＣ以下に記載した慣例的な試験バージョンで調査しただけでなく、各々１つだけモノクロナール“捕捉”−抗体の使用により（試験段階Ａ２）それぞれｐ４０またはｐ２４により形成されたＣＩＣの量を決定した。補充表ではｐ４０−ＣＩＣおよびｐ２４−ＣＩＣの量が明らかに変化し、時間的な濃度特性が識別可能になることが明らかである。これらのデータはＣＩＣ検出の非常に高い特異性に関する付加的な証拠としても提供される。すなわちＡ２（“捕捉”−ＡＫの選択）でそれぞれのプレコーティングに応じて、ＣＩＣは個々のウィルスタンパク質に関しても決定することができる。
【０１１６】
注釈：
個々に示した疾患経過における感染パラメータの経過は、類似の形態で感染した多数の患者にも当てはまる。急性マーカー“ＰＢＭＣ中のＡＧ”はピーク値の形態で検出可能であるが、数週間にわたるプラトーとしては検出できない。しかしＣＩＣ測定は、抗原が連続的に一団で形成され、細胞からの抽出後に抗体によって複合体化されることを示す。従って自由抗体は散在的だけでも全間欠期において検出可能である。
【０１１９】
注釈：
最初の４試験週間でＰＢＭＣ中のＡＧ、ＣＩＣおよび抗体を検出することができた。最も信頼できるパラメータは再びＣＩＣの形態で可視化できた。この例は、比較的低くかつ短い抗原産生の場合でもＣＩＣが検出可能であることを示しているが、ただしその場合は低濃度でのみ検出可能である。
【０１２１】
注釈：
このウマは異常に重くかつ長期の罹患段階を通過したが、それにもかかわらず完全治癒には至らなかった。ただし陽性抗体試験の頻度はむしろ非典型的であり、これはおそらくＰＢＭＣ中の非常に強い抗原産生（まれにこのように高い）に起因している。疾患段階がより短い場合、抗体は一般に同様に散在的であり、抑鬱状態のヒト患者の場合のように低い力価で検出可能である。
【０１２３】
注釈：
このウマはボルナ病で死亡もしくは安楽死させる必要があった。急性疾患段階では、それにもかかわらずプラスマ中に自由抗体を検出することができなかった。この感染は重度の疾病にもかかわらず血清学的な方法によってだけでは検証できなかったであろう。このウマの場合、過度のＣＩＣ力価およびＰＢＭＣ中のＡＧが見出されている。これは、最終的にコントロール不能に陥らざるを得ないウィルス感染の強い活性化段階を示している（髄液も陽性であった）。
非常に高いＣＩＣ力価は、ヒト患者の場合のように、ＢＤＶ感染したウマの場合もむしろまれである。
【０１２５】
ＡＧおよびＣＩＣ試験の評価方法：
一般に相対的なパラメータ濃度を表す準定量的な評価が力価表示に優先されるべきである。各パラメータは、試料あたり８段階の希釈系列で測定される。希釈と平行に減少する絶滅は力価評価で付加的な安全性を与える。該絶滅は考慮してよいが、しかし最終点力価決定のために考慮してはならない。
【０１２６】
評価ＡＧ試験：
決定のために細胞懸濁液または血漿試料を１：２以上で希釈する。
【０１２７】
陰性コントロールは一般に０．０５〜＜０．１絶滅である。
＋／−限度値 ０．１−０．１２ １：２０および透明の希釈系列の場合
（＋）弱陽性＞０．１２〜０．１５ １：２０および透明の希釈系列の場合
＋陽性＞０．１５−０．２５ １：２０の場合
＋＋やや陽性＞０．２５−０．４５ １：２０の場合
＋＋＋強陽性＞０．４５−１．０ １：２０の場合
＋＋＋＋非常に強陽性＞１．０およびそれ以上 １：２０の場合
【０１２８】
殆どのＣＩＣ値は平均の絶滅範囲にある。陽性評価のために常に希釈依存性の絶滅減少を検出できなければならない。限度値の試験は非常にまれである。なぜならバックグラウンド発色がまったく発生しないからである。前記絶滅範囲は基準値とみなす。
【０１２９】
評価ＡＫ試験（ＥＩＡ、試験Ｄ）
決定のためにプラスマは１：５０以上で希釈する。
陰性コントロールは一般にＣＩＣおよびＡＧ試験の場合より少し高くなる（僅かにバックグラウンド発色）：０．１〜＜０．２絶滅。
＋／−限度値０．２〜０．３ １：５０および１：１００の場合、次いで減退
（＋）弱陽性＞０．３〜０．４ １：５０の場合、透明の希釈系列
＋陽性＞０．４−０．６ １：５０の場合
＋＋やや陽性＞０．６−０．８ １：５０の場合
＋＋＋強陽性＞０．８およびそれ以上 １：５０の場合
【０１３０】
陽性評価のために常に希釈依存性の絶滅減少が検出可能でなければならない。陰性コントロールのベース絶滅は＞０．２であってはならない。
【０１３１】
ＡＫ試験の評価のために、他の実験室の試験との比較が行われるような場合、準定量的な評価を優先する。ＡＫ試験のための例はＩＸ以下に記載する。
【０１３２】
ＶＩＩＩ．試験組合せによるＢＤＶ感染の現状の評価
ＰＢＭＣ（同様に血漿）中のＡＧ検出は急性の活性化過程のためのパラメータである。ＣＩＣパラメータは経過調査で以前の間欠期を評価する。ＣＩＣ値がこの間欠期に上昇する場合、これはウィルス抗原が形成されていて、試験時点ですでに複合体の形態で存在することを意味する。自由抗体が検出可能かどうかは、抗原産生との関係で抗体産生によって決定される。抗体産生がまさに初めて活性化一団によって新たに開始された場合、殆ど自由抗体は検出できないが、それに対しＣＩＣは検出可能である。後の時点で抗原産生が減少する場合、自由抗体の検出の機会が増大する（同時のＣＩＣ検出ありまたはなし）。
この関係を考慮する三重試験の解釈は臨床的な経過の評価に非常に役立つ。
【０１３３】
以下の試験配列は今日の水準に従って可能である：
１．ＡＧ陰性 ＣＩＣ陰性 ＡＫ陽性
感染はあるが、非活動的であり、急性でも最後の週でもない。
２．ＡＧ陽性 ＣＩＣ陰性 ＡＫ陰性
感染は調査時点までにまさに完全に急性に活性化しているが、以前は活性化していない。
３．ＡＧ陽性 ＣＩＣ陽性 ＡＫ陰性または陽性
感染があり、活性化開始はすでに数週間前であるが、活性化は調査時点でまだ急性である。
４．ＡＧ陰性 ＣＩＣ陽性 ＡＫ陰性または陽性
感染があり、活性化開始はすでに数週間前であり、場合によっては数か月前である（それぞれの調査間欠期による）。活性化は調査時点の直前でもはやない。初回調査の場合、：“感染がある”という明言だけを行なうことができる。
５．ＡＧ陰性 ＣＩＣ陰性 ＡＫ陰性
ＢＤＶ感染の徴候なし。急性疾患段階で２つの完全な陰性試験の場合、感染を除外することができる。
【０１３４】
少なくとも２つの完全な陰性試験（間隔４〜６週間）は治療コントロールとしても抗ウィルス性の治療の終了前（Ｌａｎｃｅｔ（１９９７）３４９：１７８−１７９）に要求される。
【０１３５】
従来の調査は、ＣＩＣが抗ウィルス性の治療効果の評価に非常に感受性のあるマーカーであることを示している。該マーカーはすでに実施された臨床的な回復後の最後のパラメータとしてまだしばしば検出可能であるが、治療の継続により後に消滅する。
【０１３６】
ＩＸ．ＣＩＣおよびＡＧと平行の、ＡＫ試験の例
疾患段階中のウィルスパラメータの進展が実験的に示された症例説明の場合と異なり、ここでは強陽性のヒト試料（１４３７）と弱陽性（ＡＧにとっては完全に陰性の）試料（８９０）とが完全な希釈系列で表わされなければならない。両試料は米国から由来し、４日間を要する輸送後同一の試験項目で４／９４で試験された。
【０１３７】
【０１４１】
注釈：
試料１４３７はＰＢＭＣ中で異常に高い抗原発現を示した。平均ではこの値が明らかにより低くなる。試料１４３７では配列３（ＶＩＩＩ、評価参照）が当てはまる。すなわちＡＧ陽性、ＣＩＣ陽性およびＡＫ陽性である。感染の活性化段階は急性であるが、すでに数時間経っている。さらに注目すべきことは、標準免疫蛍光試験がまさにまだ検出可能の１：１０の力価を生じたのに対し、三重試験セットのＡＫ試験はより高い感受性に基づき明らかに陽性のＡＫ結果をもたらした。
【０１４４】
試料８９０はＰＢＭＣ中の抗原試験で完全に陰性であった。免疫蛍光による標準抗体試験は同様に陰性であった。この両方のパラメータによっては潜在的感染は識別できなかったであろう。両方の抗原および対応するＡＫ試験（三重セット）のためのＣＩＣ試験は限度値であった。すなわち感染の疑いがあった。このような場合には、上述のように個々の抗原のための試験の応用が解明の機会を提供する。それ以外このような場合には、明確な結果に到達するため、別の継続試料を調査する必要がある。試料８９０にはＶＩＩＩ（評価）における配列４（もしくは５）が当てはまる。
【０１４５】
Ｘ．無症状のウマ在高の感染検出
１９９５年８月〜１０月まで３３のタネウマ飼育場からの２２２頭の健康な全血培養ウマがＢＤＶについて調査された。この場合、三重組合せからＡＧ試験およびＣＩＣ試験が使用された。抗体は標準免疫蛍光試験によって調査された。タネウマ飼育場あたりの調査したウマの平均の数はａ６．７＋−５．１であった。
【０１４６】
我々は１００％浸潤を３３のタネウマ飼育場のうち１４で見出した（＝４２．４％）。活性化された感染の徴候としてのＰＢＭＣ中のＡＧは、２２１頭のウマのうち３８頭だけであった（＝１７．２％）。ＡＫ（ＩＦ試験）は２２２頭のうち６８頭（＝３０．６％）に検出された。両方の百分率は健康な在高の中の他の調査に相当する。しかし実際の浸潤はＣＩＣ試験によって初めて明らかになる。我々は陽性ＣＩＣを２１９頭のウマのうち１５６頭に見出した（＝７１．２％）。ウマの４分１強（２６．２％）でＣＩＣがただ１つの感染マーカーであった（２２１頭の動物のうち５８頭）。すなわち各々４頭に１頭の健康な動物は潜在的に感染していたが、ＣＩＣパラメータを介してのみ検出することができた。
【０１４７】
以下、このグループから４つのタネウマ飼育場から６頭の動物の例でＣＩＣ値の完全な滴定による調査結果をまとめる。
【０１４８】
注釈：
例１に高陽性および低陽性のＣＩＣ結果を対比する。２５歳のオスウマ１ｂ（Ｎｒ．５２９）の高齢にかかわらず、ＣＩＣ値は必ずしも高くなっていない。
【０１５５】
例２は比較可能年齢で同一のタネウマ飼育場から２頭のメスウマを示す。メスウマ２ａ（４９５）は感染していて、平均のＣＩＣ値を有していた。メスウマ２ｂ（８４９６）は、それに対しＣＩＣ陰性であって、感染していなかった。
【０１５６】
例３に異なる年齢グループから同じタネウマ飼育場からの２頭の高陽性の動物を示す（２３歳および９歳）。より若い動物は非常に高いＣＩＣ値を有していた。
【０１５７】
全ての動物に対し、以前にも調査時点でも罹患していなかった高価な飼育ウマであることが等しく当てはまる。
【０１５８】
本発明はすでに公知のパラメータすなわち白血球中の抗原（ＡＧ）およびプラスマ中の抗体（ＡＫ）と、新たに見出された血漿中の試験パラメータ“循環免疫複合体”（ＣＩＣ）の組合せによって初めて種を包含する（ほぼ）遺漏のないＢＤＶ感染の種々の段階の検出を可能にする。３つのパラメータは、全てただ１つの血液試料によって決定することができる。本発明に初めて記述された、唯一の長期に永続する感染マーカーとしてＢＤＶ特異的ＣＩＣの検出は、健康な保菌者の検出（潜在的感染）も罹患した個体における感染経過および治療効果の評価をも可能にする。その場合、体液中の被検体液試料で自由循環免疫複合体がＢＤＶ抗原とそれに蓄積された特異的抗体とから適切な免疫学的試験によって検出される。
【０１５９】
以下、さらにもう１つの例を図面を利用して説明する。
【０１６０】
図１、図２、図４および図５に、感染状態が（特に疾患段階で）どのように連続的に変化し、永続的ウィルス感染のこの型にとり（活性化段階中の低増殖率により）診断的に複数のパラメータの検出が好適であることを概略的に示す。記載されているのは、それぞれ“数週間”にわたる４０５ｎｍでの絶滅である（調査経過）。各図面は以下の経過を示す：
ＣＩＣ−循環免疫複合体
ｃＡｇ−細胞抗原
ｐＡｇ−プラスマ中の抗原
Ａｂ−抗体（ＥＩＡ）
【０１６１】
図１はヒト患者１（原始細胞Ｄ．Ｒ．）、入院による臨床的世話中の年齢５９歳のｒＭＤＤ患者のデータを示す（抗原抑鬱薬による治療、非抗ウィルス性）。調査期間は約３か月であった（１８週間）。試験システム：ＥＩＡ；希釈：ｃＡＧ１：２、ＣＩＣ１：２０、ｐＡＧ１：２、１：１００以上；排除限度０．１試料源：ｃＡＧ用：ｃＡＧ用に超音波処理したＰＢＭＣ、その他対応するプラスマ試料。
【０１６２】
図２は３０歳のＯＣＤ患者のための図１に対応する線図を示す（ＯＣＤ＝ｏｂｓｅｓｓｉｖｅ ｃｏｍｐｕｌｓｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ入院による臨床的処置中）。ＢＤＶ感染はこの患者の場合、抑鬱状態の患者の場合と同様に重要な役割を演ずる。両患者グループ − 抑鬱状態もＯＣＤ患者も − セロトニンコントロールされた過程を妨げられることがある。これは、ＢＤＶウィルスが機能的に一定の位置を脳内と神経節に係合するので、それと関連していると思われる。図１および図２は互いに類似のパラメータ推移を示す。
【０１６３】
図３は動物の分野から、しかも２頭のボルナ病のウマからの２例を示す。ここではそれぞれ試料を１つだけ調査した。ｐＡＧ（自由プラスマ抗原）およびＡｂ（＝自由プラスマ抗体（ＡＫ）、ＥＩＡで測定）とＣＩＣの関係を良く識別できる。試料４３１１は１９９７年３月に（疑いのある）臨床診断に基づき“ボルナ病”が調査された北ドイツ（原始細胞Ｇ．）産のウマから得られた。ＩＦ抗体力価は１：４０であった。試料５２３１は、１９９７年５月に臨床診断に基づきボルナ病が調査された南ドイツ（原始細胞Ｄ．）産のウマから得られた。ＩＦ抗体試験は陰性であった。このウマは２か月前に、１９９７年３月に罹患し、感情鈍麻および嗜眠状態を示した。５月にまだ残っていた症状は首振りと硬直した歩みであった（ＥＩＡの測定パラメータ：希釈ｃＡＧ１：２、ＣＩＣ １：２０、ｐＡＧ１：２、１：１００以上、排除限度＝０．１、試料基礎：ｃＡｇ：超音波処理したＰＢＭＣ、その他は対応するプラスマ試料）。
【０１６４】
各図の基礎におくデータは以下の表形式で表す：
【表１】
【表２】
【表３】
最後に図４ａ〜４ｄは種々の希釈によるＣＳＦ試料の種々の結果を示す。図ａ）〜ｃ）は情動障害における高い陽性の抗原マーカーと、ｄ）は精神分裂病における陰性の試験結果とを示す。
【０１６８】
高い値は急性抑鬱状態中の脳内の一過性の激しいウィルス増殖を表す。
【０１６９】
各図面の詳細：
図ａ：患者３６のＣＳＦ試料 − 大鬱病性障害、第２症状発現、女性、５８歳。
【０１７０】
図ｂ：患者１３７のＣＳＦ試料 − 大鬱病性障害、第２症状発現、女性、２９歳。
【０１７１】
図ｄ：ＣＳＦ試料 患者２７：精神分裂病、偏執症性型、慢性、男性、３９歳；
患者６２：精神分裂病、偏執症性型、非特異的、女性、３７歳；
患者１３０：精神分裂病、偏執症性型、準慢性、女性、２０歳
【０１７２】
ＸＩ．まとめ
ボルナ病ウィルス（ＢＤＶ）は被包化陰性鎖ＲＮＡウィルスの新しいファミリのプロトタイプとみなされる。ＢＤＶは神経細胞、さらにまた大脳中の非神経細胞および細胞を破壊しない身体に感染する。ＢＤＶ感染は永続的である。該ＢＤＶ感染は人間および多くの家畜および有用動物に現われる。ヒトＢＤＶ感染は高い確率で段階的な情動障害に関与していて、動物の場合、ＢＤＶは段階的な行動障害を引起こす。個体の危険因子は潜在的感染の活性化の頻度とそれにより罹患危険性とを決定する。無症状の保菌者はそれぞれの種の中に存在する。診断はウィルスの低増殖率と長い潜在的段階とによって困難になる。
【０１７３】
本発明は、すでに公知のパラメータ、白血球または血漿中のＡＧおよびプラスマ中のＡＫと、新たに見出された試験パラメータ、血漿中のＣＩＣの組合せによって人間および動物におけるボルナ病ウィルス（ＢＤＶ）による感染のほぼ遺漏のない検出を可能にする。３つのパラメータは全てただ１つの血液試料（１０ｍｌクエン酸塩添加血）によって決定することができる。
【０１７４】
本発明で初めて記述された、ただ１つの長期的に永続する感染マーカーとしてのＢＤＶ特異的ＣＩＣの検出は、健康な保菌者の検出（潜在的感染）も罹患した個体における感染経過および治療効果の評価をも可能にする。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒト患者１（原始細胞Ｄ．Ｒ．）、入院による臨床的世話中の年齢５９歳のｒＭＤＤ患者のデータを示すグラフである。
【図２】図２は、３０歳のＯＣＤ患者についての図１に対応するグラフである（ＯＣＤ＝ｏｂｓｅｓｓｉｖｅ ｃｏｍｐｕｌｓｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ入院による臨床的処置中）。
【図３】図３は動物の分野から、２頭のボルナ病のウマの２例を示すグラフである。
【図４ａ】図４ａは、ＣＳＦ試料についての種々の結果を示すグラフである。
【図４ｂ】図４ｂは、ＣＳＦ試料についての種々の結果を示すグラフである。
【図４ｃ】図４ｃは、ＣＳＦ試料についての種々の結果を示すグラフである。
【図４ｄ】図４ｄは、ＣＳＦ試料についての種々の結果を示すグラフである。
Claims (14)
- ボルナ病ウィルス（ＢＤＶ）感染の検出方法であって、体液中の被検体液試料でＢＤＶ抗原とそれに蓄積した特異的抗体とから成る自由循環免疫複合体が免疫学的試験によって検出されることを特徴とする方法。
- 請求項１に記載の方法であって、永続的ＢＤＶ感染を実質的に遺漏なく把握するために、付加的に、好ましくはＢＤＶ核タンパク質ｐ４０（４０ｋＤａ相対分子量、“Ｎタンパク質”）および／またはＢＤＶ燐タンパク質ｐ２４（２４ｋＤＡ相対分子量、“Ｐタンパク質”）のＢＤＶ抗原検出および／またはＢＤＶ特異的抗体の抗体検出が実施される方法。
- 請求項１または２による方法であって、前記体液試料が血液、尿、または髄液試料であることと、以下の（ａ）および（ｂ）の処理を行い、
（ａ）血液試料から血漿分画を単離し、血漿、髄液または尿試料で互いに別々に以下の試験を実施する：
（１）ＢＤＶ抗原の抗原検出、
（２）ＢＤＶ特異的抗体の抗体検出、
（３）ＣＩＣ検出；
（ｂ）血液試料から血漿分画および髄液分画を調製する：
前記（ａ）（１）による試験を、血液試料の場合には髄液分画および／または血漿分画で実施することとを特徴とする方法。 - 請求項３に記載の方法であって、前記被検体液試料が血液試料であり、全ての調査が１つの血漿試料で実施される方法。
- ＢＤＶに特異的な循環免疫複合体（ＣＩＣ）の体液中の検出方法であって、以下の段階を実施する方法：
（１）そのために準備した担体に、保菌者のＦｃ部位を介して、ＣＩＣ中に含有された抗原に特異的に結合するＢＤＶ特異的なモノクロナール抗体またはポリクロナール抗体を固定すること；
（２）前記固定された抗体を、ＣＩＣの存在を試験されるべき体液試料と接触させること；
（３）段階（１）および（２）によって処理された試料と、体液試料が使用された被検種の抗体に特異的であり且つ被験種とは異なる種の二次抗体、好ましくはヤギ抗種抗体とを接触させること；
（４）免疫学上の検出方法による二次抗体の量の検出および／または決定を行うこと。 - 請求項５に記載の方法であって、前記体液試料が血漿試料である方法。
- 請求項５に記載の方法であって、前記二次抗体がヤギ抗体である方法。
- 請求項５に記載の方法であって、段階（１）で使用したＢＤＶに特異的なモノクロナール抗体がＮタンパク質および／またはＰタンパク質抗体である方法。
- 請求項５〜８の何れか１項に記載の方法であって、前記担体が吸着的に固定するプラスチック試験プレートであり、このプレートが初めにＣＩＣ抗原特異的抗体が得られた種に対して特異的である二次抗体により可能な限り完全にコーティングされ、それに続きＣＩＣ抗原特異的抗体がこの二次抗体層の表面に取込まれる方法。
- 請求項５〜８の何れか１項に記載の方法であって、ＣＩＣ抗原特異的抗体の固定が、この方法の段階（１）でポリスチレン固定されたＣ１ｑで行われる方法。
- 請求項５〜１０の何れか１項に記載の方法であって、前記の段階（４）による二次抗体の検出が、ＥＩＡ法を介して行われる方法。
- 請求項１１に記載の方法であって、前記二次抗体の検出は、該二次抗体がアルカリ性ホスファターゼと結合され、ｐ−ニトロフェニルリン酸塩による発色反応を利用して視覚的に可視化または光学式検出器で読出し可能にされるようにして行われ る方法。
- 請求項５〜１０の何れか１項に記載の方法であって、前記の段階（４）による二次抗体の検出が、ＲＩＡ法を介して行われる方法。
- 請求項３に記載の方法であって、段階（３）のＣＩＣ検出が、請求項５〜１３の何れか１項に記載の方法によって行われる方法。
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