DE19860255C2

DE19860255C2 - Verfahren zum Nachweis von Borna-Disease-Virus (BDV)-Infektionen

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Publication number: DE19860255C2
Application number: DE1998160255
Authority: DE
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-12-29
Filing date: 1998-12-24
Publication date: 2001-03-15
Anticipated expiration: 2018-12-25
Also published as: DE19860255A1

Description

Die Erfindung betrifft ein gegenüber Patentanmeldung 197 58 017 weiter ausgestaltetes Verfahren zum Nachweis von BDV- Infektionen.

Wie bereits in der Anmeldung 197 58 017 beschrieben, kommen BDV-Infektionen bei vielen Nutz- und Haustieren (Pferd, Schaf, Rind, Katze) und dem Menschen vor. BDV ist ein eingehülltes Vi rus von 90 nm Durchmesser mit einem Genom aus unsegmentierter einzelsträngiger RNA von negativer Polarität, das für 5 Gene kodiert (Größe des Genoms: 8,9 Kilobasen). Zu den verwandten Viren gehören z. B. Tollwutvirus und Masernvirus. Aufgrund gene tischer Besonderheiten (Vermehrung im Zellkern der Wirtszelle) ist BDV als der Prototyp einer eigenen Virusfamilie klassifi ziert (Bornaviridae). BDV hat eine besondere Präferenz zu den Nervenzellen im limbischen System des Gehirn, einer funktionel len Einheit, in der Verhalten, Emotionen und Gedächtnisleistun gen gesteuert werden. Es werden aber auch andere Zelltypen von BDV befallen.

Da das BDV-Virus schon gut untersucht und bereits vollständig sequenziert ist, sind übliche Antikörpertests bekannt. Bis 1993 gab es nur die Möglichkeit eines Antikörpertests im Serum.

Ein wichtiger Fortschritt, besonders für die Beurteilung krankheitsrelevanter Aktivierungen der BDV-Infektion, konnte durch die Entdeckung gemacht werden, daß PBMCs Virusproteine exprimieren, die man in den Zellen nach Aufschluß nachweisen kann. Diese Protein(AG)-Expression erwies sich im weiteren als der entscheidende Aktivitätsparameter. Er korrelierte gut mit klinischer Erkrankung (Mensch und Tier), war quantitativ meßbar und sehr wichtig zur Einschätzung des weiteren Verlaufs (Genesungschancen, Ansprechen von Antidepressiva etc.). Die AG- Bestimmung kann nicht durch den Nachweis von Virusnukleinsäure über die Amplifikation mit nested-RT-PCR in den PBMCs ersetzt werden, da hierdurch lediglich das Virus selbst nachgewiesen wird, jedoch nichts über dessen derzeitige oder mögliche zukünftige Aktivität entnommen werden kann.

Der AG-Marker ist in aller Regel auf einen Teil (2-3 Wochen) der akuten Krankheitsphase beschränkt und in der Rekonvaleszenz nicht mehr unbedingt nachweisbar. Die AK können im Anschluß je nach Stärke des Aktivierungsschubs intermittierend nachweisbar sein, sie können aber auch vollständig fehlen.

Dieser Stand der BDV-Diagnostik versagte vor allem in der Rekonvaleszenz, in dem symptomfreien Intervall (das Jahre dauern kann) eines Patienten (Mensch und Tier) und bei infizierten Individuen ohne bisherige Erkrankung, d. h. zusammengefaßt bei BDV-Infektionen im Latenzzustand. Beide Testparameter, AG und AK, können in der Latenzphase falsch- negativ anzeigen bei nach wie vor bestehender Infektion.

Aus der US 5 654 401 A, die sich grundsätzlich auf eine DNA- Anlayse des Borna-Virus' und in diesem Zusammenhang u. a. um die Herstellung rekombinanter BDV-Proteine bezieht, ist bereits ein Serumtest zum Nachweis von BDV-Viren bekannt, bei dem die Serumprobe in Kontakt mit einem insbesondere synthetischen oder rekombinanten BDV-Protein - also einem Antigen - gebracht wird, um so Antikörper nachweisen zu können. Dieser Test leidet jedoch unter den vorher bereits genannten Nachteilen, dass der Antikörpertiter allein den Infektionszustand nicht abbildet.

Weiterhin ist aus MEDLINE AN 97339570, Abstract zu: "Horimoto, T. et al., Journal of Clinical Microbiology, 1997, Bd. 35, Nr. 7, S. 1661-1666, ein enzymgebundener Immunoassay (RS-ELISA) bekannt, bei dem Antikörper über Anlagerung an BDV-p40-Antigen und anschließende enzymgestützte Auswertung nachgewiesen werden. Schließlich ist aus "Briese, T., et al. in Journal of Clinical Microbiology, 1995, Bd. 33, Nr. 2, S. 348-351 (über CA AN 122:157916 AB) ein entsprechender weiterer ELISA zum Nachweis von BDV-Antikörpern mit Hilfe dreier rekombinanter viraler Proteine (recp40, recp23 und recp18) bekannt. Auch die in diesen beiden Veröffentlichungen offenbarten Tests weisen jedoch jeweils ausschließlich freie Antikörper nach und sind alleine unzureichend, da sie nicht sicher eine Aussage über den Infektionszustand liefern können.

Der Patentanmeldung 197 58 017 lag daher die Aufgabe zugrunde, ein neues Nachweisverfahren für die Infektion zu entwickeln, so eine möglichst lückenlose Erfassung von BDV-Infektionen zu ermöglichen, die durch ihre Persistenz über sehr lange Zeiträume im Wechsel von akuten und latenten Phasen andauern können.

Ebenfalls sollte ein für einen solchen Nachweis verwendbarer diagnostischer Kit zur Verfügung gestellt werden.

Zur Lösung dieser Aufgabe war nach der Anmeldung 197 58 017 ein Verfahren zum Nachweis von Borna-Disease-Virus(BDV)-Infektion vorgesehen, bei welchem an einer zu untersuchenden Körperflüs sigkeitsprobe in der Körperflüssigkeit frei zirkulierende Im munkomplexe aus BDV-Antigenen und hieran angelagerten, spezifi schen Antikörpern durch einen geeigneten immunologischen Test nachgewiesen wurden. Die Erfindung basierte daher in einem we sentlichen Aspekt darauf, daß nachgewiesen werden konnte, daß in bestimmten Krankheitsphasen in Körperflüssigkeiten, z. B. im Blutserum, hohe Konzentrationen zirkulierender, aus BDV- Antigenen und vom Körper hierzu spezifisch gebildeten Antikör pern bestehender Immunkomplexe auftreten. Diese Immunkomplexe können insbesondere auch in Krankheitsphasen vorhanden sein, in denen Antigene und/oder Antikörper gerade nicht nachweisbar sind.

In Weiterbildung der Erfindung wurde, basierend auf der vorste henden Erkenntnis, ein völlig neues Diagnose-Konzept zur prak tisch lückenlosen Erfassung persistenter BDV-Infektionen vorge stellt. Hierbei wurde der neu entdeckte Parameter, der CIC, in Kombination mit bereits bekannten Parametern, nämlich Antigenen (AG) und Antikörpern (AK) bestimmt, was eine bisher nicht mög liche Erfassung verschiedener Phasen der persistenten BDV- Infektion ermöglichte. Die hierbei zusätzlich bestimmten Anti gene sind vorzugsweise das BDV-Nukleoprotein p40 (40 kDa rela tives Molekulargewicht), auch als "N-Protein" bezeichnet und das BDV-Phosphoprotein p24 (24 kDa relatives Molekulargewicht), auch als "P-Protein" bezeichnet. Das kombinierte Verfahren er gab nun ein komplettes Testsystem, bei dem eine Testkombinati on, bestehend aus der Bestimmung von BDV-spezifischen zirkulie renden Immunkomplexen (CIC) im Blutplasma, BDV-spezifischen Proteinen (Antigenen, AG) in weißen Blutzellen (PBMCs) und/oder BDV-spezifischen Antikörpern (AK) im Blutplasma durchgeführt wurde.

Überraschenderweise wurde nun zusätzlich gefunden, daß während bestimmter Krankheitsphasen auch im Blutplasma direkt, im Liqu or oder Urin, Antigen gefunden werden kann. Daraus läßt sich ableiten, daß das Virus zu bestimmten Zykluszeiten sehr viel an antigenen Proteinen produziert, so daß diese ins Plasma ausge tragen werden. Das Auftreten von AG im Plasma zeigt daher eine bestimmte frühe Aktivphase im Krankheitsverlauf an und ist da mit per se ein wesentlicher diagnostischer Parameter. Überra schend ist, daß während kurzer Phasen sogar hohe Antigentiter im Plasma auftreten, obwohl das Virus eine sehr niedrige Repli kationsrate hat.

Nach dieser Zusatzanmeldung ist vorgesehen, daß der Antigen nachweis an einer Blutplasmaprobe, Liquor oder Urin, durchge führt wird, vorzugsweise auf das BDV-Nukleoprotein p40 (40 kDa rel. Molekulargewicht, "N"-Protein) und/oder das BDV-Phospho protein p24 (24 kDa rel. Molekulargewicht, "P"-Protein). Den CICs kommt für die Diagnostik, aber auch zum Verständnis des Infektionsablaufs noch immer eine Schlüsselrolle zu, da sie, wie gefunden wurde, erheblich länger als lösliche, mit AK-Tests erfaßbare BDV-Antikörper und länger als das nur in der akuten klinischen Phase auftretende BDV-AG persistieren. CICs sind nach längeren symptomfreien Phasen immer noch nachweisbar, wenn AK-Test und AG-Test negativ ausfallen und lassen den Rückschluß auf zurückliegende Aktivierungsphasen mit AG-Freisetzung und dieses AG-komplexierende AK zu.

Durch die Einführung der CICs als diagnostischen Testparameter, der ggf. in Kombination mit AK und AG verwendet wird, schließt die Erfindung eine diagnostische Lücke, die zuvor nicht über brückt werden konnte. Die Nachweise können jedoch einzeln oder in Kombination durchgeführt werden.

Bei einigen Patienten mit endogenen Affektstörungen und BDV- Infektionen sind bei wöchentlichen Kontrollen auch in der aku ten Phase ausschließlich extrem hohe CIC-Konzentrationen, aber keine freien AK und kein AG in PBMCs meßbar. Diese Patienten würden bei der herkömmlichen Diagnostik überhaupt nicht erfaßt.

Bei diesem Infektionsverlauf muß vermutet werden, daß das in den PBMCs gebildete BDV-AG, das in hoher Konzentration gebildet wird, sofort ins Plasma übertritt und von den vorhandenen AK in CICs gebunden wird.

Die Bestimmung der CICs und insbesondere die Testkombination aus CIC-, AG- und AK-Bestimmung wird daher der persistenten BDV-Infektion mit ihrem zwischen Latenz und Aktivierung fluktu rierenden Verlauf erstmalig gerecht und hat damit große Bedeu tung sowohl für die diagnostische Betreuung erkrankter Indivi duen als auch für die Erfassung latenter Infektionen bei Gesun den.

Bei Risikopatienten erlaubt die obligate Bestimmunt der CICs eine nicht mehr auf die akute Erkrankung beschränkte BDV- Diagnostik. Die Untersuchung latenter Infektionen bei Gesunden war wegen der geringen Virusaktivität theoretisch nur in engma schigen Kontrollen möglich, in der Praxis aber kaum machbar. Mit dem CIC-Test und der Testkombination können latente Infek tionen gesunder aufgespürt werden, was von epidemiologischer Tragweite ist, da die Infektionsquellen und die Übertragungsme chanismen bei Mensch und Tier noch ungeklärt sind.

Der Antigentest an Blutplasmaproben ist allein beispielsweise geeignet als einfacher Test bei erneutem Auftreten von Krank heitssymptomen zu dienen.

Das Verfahren ist für die Erfassung von BDV-Infektionen bei Menschen und Tieren geeignet und unabhängig von der klinischen Erkrankung möglich.

Der Begriff "Nachweis" wird immer so verwendet, daß sowohl ein erster qualitativer Nachweis, wie auch eine quantitative Be stimmung der Parameter, wie z. B. der relativen CIC-Konzentra tionen in Form eines Titers möglich ist.

Als ein geeigneter, immunologischer Test bzw. ein geeignetes Verfahren zum Nachweis in Körperflüssigkeit zirkulierender Im munkomplexe wurde bereits bei der Hauptanmeldung ein Verfahren mit den folgenden Schritten vorgeschlagen:

1. Fixieren von monoklonalen oder polykonalen Antikörpern, die an die in den CICs enthaltenen Antigene spezifisch binden, über die Fc-Region in geeigneter Weise auf einem ggf. hierfür vorbereiteten Träger;
2. Inkontaktbringen einer Körperflüssigkeits-, vorzugsweise einer Blutplasmaprobe, die auf Anwesenheit von CICs ge testet werden soll, mit den Antikörpern;
3. Inkontaktbringen eines Sekundärantikörpers einer anderen als der getesteten Spezies, vorzugsweise eines Ziege- anti-Spezies-Antikörpers, der spezifisch ist auf Antikör per der Spezies, deren Körperflüssigkeitsprobe verwendet wurde, mit der nach Schritten (1) und (2) behandelten Probe;
4. Nachweis und/oder Bestimmung der Menge des Sekundäranti körpers durch ein geeignetes immunologisches Nachweisver fahren.

Hierbei sind die in Schritt (1) verwendeten Antikörper, vor zugsweise monoklonale BDV-spezifische N- und/oder P-Protein- Antikörper, die beispielsweise von der Maus gewonnen wurden.

Der gegebenenfalls in geeigneter Weise vorbereitete Träger kann eine ab sorptiv fixierende Kunststoff-Testplatte oder ein entsprechen des Teströhrchen sein, wobei diese Platte oder das Röhrchen vorzugsweise zunächst mit Sekundärantikörpern möglichst voll ständig belegt wird, die gegen die Spezies, von der die CIC- Antigen-spezifischen Antikörper gewonnen wurden, spezifisch sind, und in einem hierauf folgenden Schritt der Plattenvorbe reitung die CIC-Antigen-spezifischen Antikörper auf diese Se kundärantikörperschicht aufgebracht werden.

Alternativ kann die Fixierung der CIC-Antigen-spezifischen Antikörper in Schritt (1) des Verfahrens auch mit einem geeig neten anderen Verfahren erfolgen, mit dem es möglich ist, die Antikörper in geeigneter Ausrichtung sicher auf der Platte zu fixieren, z. B. durch Aufbringen einer Grundschicht aus C1q auf einen Polystyrolträger. Das Aufbringen einer solchen Grund schicht bewirkt generell, daß mit den kostbareren CIC-spezi fischen Antikörpern sparsamer umgegangen werden kann.

Der Nachweis gemäß Schritt (4) des Verfahrens kann beispiels weise über einen enzymgekoppelten Sekundärantikörper erfolgen, an dem mit einem geeigneten Substrat eine Farbreak tion ausgelöst wird. In der derzeit bevorzugten Ausführungsform wird der Sekundärantikörper mit alkalischer Phosphatase gekop pelt und mit p-Nitrophenylphosphat visuell sichtbar bzw. mit optischen Detektoren auslesbar gemacht, indem die Reaktion zwi schen der alkalischen Phosphatase und dem para-Nitrophenyl phosphat, die zu einem gelben Farbstoff führt, ausgenutzt wird.

Als Sekundärantikörper im Sinne der Erfindung wird ein Antikör per bezeichnet, der nicht für ein Antigen spezifisch ist, son dern für einen anderen Antikörper, d. h. einen als "fremd" er kannten Antikörper einer anderen Spezies.

Die Bestimmung der CICs kann in jeder Körperflüssigkeit erfol gen, in der diese CICs in hinlänglicher Konzentration vorkom men. In der derzeitig bevorzugten Ausführungsform ist die Kör perflüssigkeit, an der der Test vorzugsweise vorgenommen wird, eine aus Citratblut gewonnene Blutplasmaprobe. Es kann jedoch u. a. auch Liquor verwendet werden.

Für die Testkombination werden BDV-Antigene und BDV-spezifische Antikörper benötigt. Als Antigen-Quelle können mit BDV infi zierte Zellen dienen. Der Test wird nicht gestört oder ver fälscht, wenn anstelle isolierter Antigene (homogenisierte) an tigenhaltige Zellsuspensionen direkt verwendet werden. In einem in den Beispielen zitierten Test (siehe "AK-Test") wurde z. B. eine 10%ige Gehirnsuspension eines an der Borna'schen Krankheit verstorbenen Pferdes in Verdünnung verwendet.

Der Anmelder hat zur Hauptanmeldung bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen fetale menschliche Oligo dendrogliazellen fremdviren- und mykoplasmenfrei hinterlegt, die als Zellinie wachsen und persistent mit BDV infiziert sind. Diese Hinterlegung erfolgte nach den Bedingungen des Budapester Vertrags am 12.12.1997; der Kultur OLIGO/TL wurde die Be zeichnung und Identifikationsnummer "DSM ACC 2334'' zugewiesen. Die Zellinie stammt aus dem Bestand des Anmelders. Die fetalen menschlichen OL-Zellen sind ohne CPE persistent mit BDV infi ziert. Die interne Bezeichnung dieser Zellinie, die etwa 110 Passagen durchlaufen hat, ist OLIGO/TL (bzw. OL/TL). Aus diesen Zellen kann jederzeit Antigen, das für die Verwen dung gemäß der Erfindung geeignet ist, gewonnen werden. Außer dem können mit Hilfe dieser Zellinie andere Zellinien infiziert werden - beispielsweise auch Tierzellinien. Der Titer beträgt ca. 10³ FFU/ml. Insbesondere enthalten die Zellen auch die oben beschriebenen Antigene p40 und p24.

Mit Hilfe der Zellsuspension als solcher oder auch mit daraus gereinigten Proteinen können jederzeit BDV-spezifische, monoklo nale oder polyklonale Antikörper in an sich bekannter Weise produziert werden. Derzeitig bevorzugt werden monoklonale N- und P-Antikörper von der Maus. Dazu werden, wie üblich, Mäuse infiziert bzw. immunisiert und aus deren B-Zellen Hybridomakul turen hergestellt. Die Überstände werden auf Antikörper durch getestet (screening), die BDV-spezifisch "anfärben". Bezüglich der Gewinnung von Antikörpern siehe auch "H. Ludwig et al., Arch. Virol. (1993), Suppl. 7: 111-113".

BEISPIELE

Um das Verständnis der Erfindung zu erleichtern, werden im fol genden die technischen Einzelheiten der Testkombination be schrieben, von der Behandlung der Blutprobe bis zur Auswertung. Die Anwendung wird mit einzelnen Beispielen illustriert. Die Beispiele dienen rein illustrativen Zwecken. Selbstverständlich können die Prinzipien der Erfindung auch auf andere Weise umge setzt werden.

Teil I Aufbereitung des zu testenden Probenmaterials

Für die Untersuchung auf eine BDV-Infektion werden 10 ml Citratblut benötigt. Dabei werden zu 1 ml einer 0,106 molaren Natriumcitrat-2-hydrat-Lösung 9 ml venöses Probandenblut gege ben und gut gemischt. Empfehlenswert ist die Verwendung von fertigen Citratröhrchen, z. B. die 10 ml Monovette 9 NC von Sar stedt. Die Probe soll bis zum Versand an das Untersuchungslabo ratorium bei 4°C gelagert werden. Ein Versand per Eilzustellung ohne Kühlung (Dauer 1 bis maximal 3 Tage) beeinträchtigt die Probenqualität nicht.

Die Citratblutprobe wird mit einer Dichtegradienten-Zentri fugation in die Plasmafraktion und die zellulären Blutbestand teile getrennt. Die Plasmafraktion wird zur Testung von CIC und AK verwendet.

Die Zellfraktion der weißen Blutzellen (PBMCs) kann nach Aufbe reitung zur AG-Testung verwendet werden. Wenn nur Tests mit Plasma durchgeführt werden sollen, kann der Rest verworfen wer den.

Für die Trennung der Bestandteile wird je nach Tierspezies eine Ficoll-Trennlösung (Biochrom) unterschiedlicher Dichte verwen det.

Für 6 ml Blut werden benötigt:
Mensch 3 ml Ficoll mit Dichte 1,077;
Pferd 3 ml Ficoll mit Dichte 1,090;
Rind 2 ml Ficoll mit Dichte 1,077 + 1 ml Ficoll mit Dichte 1,068;
Katze 2,8 ml Ficoll mit Dichte 1,077 + 0,2 ml PBS pH 7,2;
Hund 2,8 ml Ficoll mit Dichte 1,077 + 0,2 ml PBS pH 7,2;
Kaninchen 2,8 ml Ficoll mit Dichte 1,077 + 0,2 ml PBS pH 7,2.

I. Protokoll zur Trennung einer 10-ml-Citratblutprobe

1. Konische 10-ml-Einwegröhrchen mit 3 ml Ficoll-Trennlösung der entsprechenden Dichte füllen und mit maximal 6 ml Citrat blut überschichten.
2. Probe für 20 min bei 1049 g (2200 Upm, Heraeus Christ Mini fuge) zentrifugieren (für alle Proben mit Ficoll < 1,090 Dich te); bei Ficoll mit 1,090 Dichte für 20 min bei 1249 g (2400 Upm) zentrifugieren.
3. Plasma-Fraktion (Überstand) vorsichtig mit Einweg-Pasteur pipette abnehmen; für die Soforttestung am selben Tag bei 4°C lagern, für eine spätere Testung bei -20°C lagern.
4. Die Leukozytenfraktion bildet einen erkennbaren Ring auf bzw., über dem Ficoll, während die (nicht benötigte) Erythro zytenfraktion im Ficoll als Pellet vorliegt. Nach dem Abnehmen des Plasmas, Zellring mit Einwegpasteurpipette aufnehmen und in ein neues konisches 10-ml-Plastikröhrchen überführen, mit PBS auffüllen und gut mischen.
5. Weiße Blutzellen (PBMCs) für 10 min bei 1952 g (3000 Upm) zentrifugieren. Überstand verwerfen und Pellet in maximal 0,5 ml PBS = Konzentrierung ca. 10f aufnehmen. Lösung in sterile Tiefgefrierröhrchen (z. B. Nunc, 1,5 ml) mit Schraubver schluß überführen.
6. Für die sofortige Testung interner BDV-Antigene (s. unten), Lagerung der Zellen in PBS bei 4°C, bei späterer Testung Lage rung bei mindestens -20°C, besser bei -70°C.

II. Testsysteme

Für die Testung von AG in PBMCs und/oder im Blutplasma und CIC sowie AK im Plasma wird eine Testkombination von EIA (enzyme immune assay) - Basis (Festphasen-Assay) verwendet. Die ersten beiden Testschritte sind für alle drei Testsysteme gleich. Die nachfolgende Beschreibung in Form von Testprotokollen teilt sich daher auf in:

A) Beschichtung der Testplatten (A1 und A2);
B) Protokoll für AG-, CIC- und AK-Test.

Protokoll für EIA (Doppel-Sandwich-Typ) (A) Protokoll zur Beschichtung der EIA-Platten

Es werden als Plastikträger für die nachfolgenden Reaktionen Maxi-Sorp-Immuno-Module (Nunc® Maxi Sorp F8, Cat. No. 469949) verwendet. In einen Rahmen passen 12 Module mit 8 senkrecht an geordneten, flachen Plastikvertiefungen hinein und haben exakt die Maße einer 96-Loch-Mikrotiterplatte (Standardmaß für EIA- Systeme):

1. 0,1 ml pro Vertiefung von AffiniPure® Ziege-anti-Maus-IgG, Fc-Fragment, absorbiert gegen Human, Rind, Pferd Serumpro teine (Dianova®, Kat. Nr. 115-005-071), verdünnt 1 : 1000 (= 1,8 Mikrogramm Protein pro Milliliter) in Kopplungspuffer; Inkuba tion über Nacht bei 4°C oder 2 h bei 37°.
Waschen 3 × in Waschpuffer (Dynatech 96-Loch Platten-Washer).
2. 0,1 ml pro Vertiefung von monoklonalen Antikörpern gegen das BDV-N-Protein p40 und das BDV-P-Protein p24 (W1 und KFU2, ref.: Arch. Virol. (1993) Suppl. 7: 111-133) (als "Catch"- Antikörper), jeweils verdünnt 1 : 500 in Verdünnungspuffer. Inku bation für 2 h bei 37°C oder über Nacht bei 4°C.

Die Platten können danach bei 4°C mindestens bis zu 4 Wochen vor Weiterbenutzung gelagert werden.

(B) Protokoll für die Bestimmung von BDV-Antigenen (AG) in PBMCs Vorbereitung

- Waschen der bis A2 beschichteten Platten, 3 × in Waschpuffer.
- Ultraschall-Behandlung (20 Zyklen min^-1, 40 mA) (Branson Sonifier B15P; ref. Mol. Psychiatry (1996) 1: 200-212) der in I. isolierten PBMCs.

AG-Test

1. Probenverdünnung: 0,1 ml Verdünnungspuffer in jede Vertie fung der vorbeschichteten Platten vorlegen, in A ultrabeschall te PBMCs (0,1 ml) oder Blutplasma (0,1 ml) zugeben (= 1 : 2) und weitere 7 Stufen zur Basis 2 (bis 1 : 256) weiterverdünnen; Inku bation über Nacht bei 4°C.
Waschen 3 × in Waschpuffer.
2. 0,1 ml pro Vertiefung BDV-spezifisches Kaninchen-Antiserum (z. B. GC 12, Immunfluoreszenztiter 1 : 10000) (= Detektions- Antikörper) in entsprechender Verdünnung (1 : 1000, 10fach kon zentrierter als IF-Titer) in Verdünnungspuffer; Inkubation 2 h bei 37°C.
Waschen 3 × in Waschpuffer.
3. 0,1 ml pro Vertiefung von mit alkalischer Phosphatase ge koppeltem Affini Pure® Ziege-anti-Kaninchen-IgG, Fc-Fragment spezifisch, absorbiert gegen Human Serumproteine (Dianova®, Kat. Nr. 111-055-046) (= Sekundär-Antikörper), verdünnt 1 : 3000 in Konjugatverdünnungspuffer; Inkubation für 1 h bei 37°C.
Waschen 3 × in Waschpuffer.
4. 0,1 ml pro Vertiefung der Substratlösung (1 mg/ml p-Nitro phenylphosphat; Sigma, erhältlich als Substrat-Tabletten) in Substratverdünnungspuffer; Inkubation 5-10 min bei Raumtempera tur, bzw. bis zur Entwicklung der Farbreaktion (Umschlag von farblos nach gelb) in der Positivkontrolle.
5. 0,05 ml pro Vertiefung der Stoplösung (3 molare NaOH- Lösung) zugeben
6. Messung bei 405 nm in einem Multiscan für Mikrotiterplat ten (z. B. BIO RAD 2550 EIA READER oder Dynatech); "Blank"- Messung gegen nicht umgesetztes Substrat. Semiquantitative Aus wertung ausreichend: (+) = schwach positiv bis maximal 4+ = sehr stark positiv; +/- bedeutet grenzwertig und erfordert eine zweite Untersuchung (Beispiel s. bei Anwendung).

(C) Protokoll für die Bestimmung von BDV-spezifischen, zirkulie renden Immunkomplexen (CIC) im Blutplasma Vorbereitung

- Waschen der bis A2 beschichteten Platten, 3 × in Waschpuffer.

CIC-Test

1. Probenverdünnung: 0,1 ml Verdünnungspuffer in jede Vertie fung der vorbeschichteten Platten vorlegen; in A: 0,09 ml Ver dünnungspuffer zufügen +0,01 ml des in I. präparierten Blut plasmas (= Verdünnung 1 : 20), weitere 7 Stufen zur Basis 2 (bis 1 : 2560) weiterverdünnen; Inkubation für 1-2 h bei 37°C (Standardzeit: 1 h bei 37°C).
Waschen 3 × mit Waschpuffer.
2. 0,1 ml pro Vertiefung von mit alkalischer Phosphatase ge koppeltem Ziege-anti-Spezies (entsprechend der Spezies der Pro be) IgG, Fc-Fragment (ebenfalls erhältlich von Dianova®) (= Sekundär-Antikörper), verdünnt 1 : 3000 in Konjugatverdünnungs puffer; Inkubation für 1 h bei 37°C.
Waschen 3 × in Waschpuffer.
3. 0,1 ml pro Vertiefung der Substratlösung (1 mg/ml p-Nitro phenylphosphat; Sigma, erhältlich als Substrat-Tabletten) in Substratverdünnungspuffer; Inkubation 5-10 min bei Raumtempe ratur, bzw. bis zur Entwicklung der Farbreaktion (Umschlag von farblos nach gelb) in der Positivkontrolle
4. 0,05 ml pro Vertiefung der Stoplösung (3 molare NaOH- Lösung) zugeben.
5. Messung bei 405 nm in einem Multiscan für Mikrotiterplat ten (z. B. BIO RAD oder Dynatech); "Blank"-Messung gegen nicht umgesetztes Substrat. Semiquantitative Auswertung ausreichend von (+) bis 4+ (vgl. auch Test B); Titerangaben mit Endpunktbe stimmung aber ebenfalls möglich (Beispiele s. Anwendung).

(D) Protokoll für die Bestimmung von BDV-spezifischen Antikör pern (AK) im Blutplasma Vorbereitung

- Waschen der bis A2 beschichteten Platten, 3 × in Waschpuffer.

AK-Test

1. 0,1 ml pro Vertiefung von einer 10%igen Gehirnsuspension (= Detektions-Antigen) eines an der Borna'schen Krankheit ver storbenen Pferdes, in entsprechender Verdünnung (1 : 50) in Ver dünnungspuffer; alternativ kann Zellkulturüberstand der am 12.12.1997 unter Nr. DSM ACC2334 bei der DSMZ hinterlegten per sistent mit einem Borna-Disease-Virusstamm infizierten Zellinie verdünnt zwischen 1 : 100 und 1 : 300 in Verdünnungspuffer, verwen det werden (bei Virustiter 10⁶ ffu/ml: 1 : 300). Inkubation über Nacht bei 4°C. (ffu = focus forming units).
Waschen 3 × in Waschpuffer
2. Probenverdünnung: 0,1 ml Verdünnungspuffer in jede Vertie fung der vorbeschichteten Platten vorlegen, in A: 0,08 ml Ver dünnungspuffer zufügen +0,02 ml des in I. präparierten Blut plasmas, vorverdünnt 1 : 5, (= Verdünnung 1 : 50), weitere 7 Stufen zur Basis 2 (bis 1 : 6400) weiterverdünnen; Inkubation für 1 h bei 37°C.
Waschen 3 × mit Waschpuffer.
3. 0,1 ml pro Vertiefung von mit alkalischer Phosphatase ge koppeltem Ziege-anti-Spezies (entsprechend der Spezies der Pro be) IgG, Fc-Fragment-spezifisch (Dianova®) (= Sekundär- Antikörper), verdünnt 1 : 3000 in Konjugatverdünnungspuffer; In kubation für 1 h bei 37°C.
Waschen 3 × in Waschpuffer.
4. 0,1 ml pro Vertiefung der Substratlösung (1 mg/ml p-Nitro phenylphosphat; Sigma, erhältlich als Substrat-Tabletten) in Substratverdünnungspuffer; Inkubation 5-10 min bei Raumtempe ratur, bzw. bis zur Entwicklung der Farbreaktion (Umschlag von farblos nach gelb) in der Positivkontrolle.
5. 0,05 ml pro Vertiefung der Stoplösung (3 molare NaOH- Lösung) zugeben.
6. Messung bei 405 nm in einem Multiscan für Mikrotiterplat ten (z. B. BIO RAD oder Dynatech); "Blank"-Messung gegen nicht umgesetztes Substrat. Auswertungsmöglichkeiten wie Test C.

III. Pufferlösungen Kopplungspuffer

Stammlösung A: 0,02 M NaH₂

PO₄

. H₂

O 2,76 g ad 1000 ml A. bidest.
Stammlösung B: 0,02 M Na₂

HPO₄

. 2H₂

O 3,561 g ad 1000 ml A. bidest.
Gebrauchslösung:
65 ml Lösung A + 45 ml Lösung B + 14,6 g NaCl ad 1000 ml A. bidest pH 7,6.

Waschpuffer

NaCl	45 g (9 g pro 1000 ml)
Tween 20	2,5 g (0,5 g pro 1000 ml)
NaN₃	1,0 g (0,1 g pro 1000 ml)

ad 5000 ml A. bidest

Verdünnungspuffer

KH₂PO₄	0,2 g
Na₂HPO₄ . 12H₂O	2,9 g
NaCl	8,0 g
KCl	0,2 g
Tween 20	0,5 g
NaN₃	0,2 g

ad 1000 ml A. bidest, pH 7,2 muß kontrolliert bzw. eingestellt werden.

Konjugatverdünnungspuffer (TBS-TWEEN)

TRIS	2,4 g
NaCl	8,0 g
KCl	0,2 g
Tween 20	0,5 g

In 900 ml A. bidest lösen, mit konz. HCL auf pH 8,0 einstellen, dann auf 1000 ml auffüllen.

Substratverdünnungspuffer (DIÄTHANOLAMINPUFFER)

Diäthanolamin	97 ml
MgCl₂	0,1 g
NaN₃	0,2 g

In 843 ml A. bidest lösen, dann 60 ml 1 N HCL zugeben, pH 9,8 einstellen.

Stoplösung (3 M NaOH)

NaOH

120 g

Od 1000 ml A. bidest

IV. Bezugsquellen kommerziell erhältlicher Reagenzien für die beschriebenen Testsysteme

1. Ficoll®-Trennmedien: Biochrom KG, D-12247 Berlin.
2. Citratröhrchen: Sarstedt, D-51588 Nümbrecht.
3. EIA Mikrotiter-Strips (Maxi Sorp Immuno Module) F-Form: Nunc, Roskilde, Dänemark.
4. Enzymkonjugate für Sekundär-Antikörper: Dianova, Hersteller: Jackson Immuno Research Labs Inc., West Grove, PA, USA.
5. Waschgerät für EIA-Teste: Dynatech Ultrawash plus; Dynatech Labs. Inc. Chantilly, VA, USA.
6. Substrat für Enzym-Konjugate (für alkalische Phosphatase): Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA.
7. Puffersubstanzen (in III) außer KCL: Merck KGaA, D-64271 Darmstadt; Fluka Chemie AG, CH-9471 Buchs.
8. Photometer (für Mikrotiterplatten): BIO RAD Labs. Hercules, Ca, USA oder Dynatech Labs Ind., Chantilly, VA, USA.
9. Ultraschallgerät zum Zellaufschluß der PBMCs: Branson Soni fier, B15JP, Branson Sonic Power Company, Danbury, CT, USA.

V. BDV-spezifische Reagenzien 1. Monoklonale Antikörper: benötigt als Basisbeschichtung (Schritt A2) für Tests B, C, D

1. W1, erkennt ein sequentielles Epitop auf dem N-Protein (p40) von BDV. Die Bindungsstelle ist konserviert, d. h. wird wirtsspezies-übergreifend erkannt. Der Antikörper ist in der Referenz Arch. Virol. (Suppl) (1993) 7: 111-133 charakterisiert.
2. KFU 2, erkennt ein sequentielles Epitop auf dem P-Protein (p24) von BDV. Die Bindungsstelle ist konserviert, d. h. wird wirtsspezies-übergreifend erkannt. Der Antikörper ist in der Referenz Arch. Virol. (Suppl) 7: 111-133 (1993) charakterisiert.

2. Kaninchen-Antiseren (spezifische Detektionsantikörper): benötigt für Test B (AG) in Schritt B2

Es können Seren experimentell infizierter Kaninchen verwendet werden (Ref. wie unter V, 1a). Sie müssen einen Mindesttiter von 1 : 2000 im Immunfluoreszenztest haben und im Western-Blot mindestens das N- und P-Protein von BDV (p40 und p24) erkennen. Da Bornaviren nach dem jetzigen Forschungsstand genetisch sehr stabil sind, d. h. nur geringe Sequenzunterschiede in verschie denen Virusstämmen gefunden wurden, erkennen polyklonale Anti seren in der Regel die Proteine von Bornaviren verschiedener Spezies.

Dies gilt auch für die bisher erhaltenen wenigen Humanstämme (Ref. Mol. Psychiatry (1996) 1: 200-212; Virus Res. (1996) 44: 33-44.), obwohl die Humanstämme auf Aminosäure-Ebene relevante Punktmutationen zeigen, die bei Tierstämmen bisher nicht gefun den wurden.

Zusätzlich zu dem in der Testbeschreibung genannten Serum GC12 und weiteren, durch Infektion mit Tierreferenzstamm V erhalte nen Antiseren können definierte Kaninchenseren verwendet wer den, die durch experimentelle Infektion mit den verschiedenen humanen BDV-Stämmen erzeugt worden sind (Ref. Mol. Psychiatry (1996) 1: 200-212) und das gesamte Spektrum viraler Proteine er kennen.

3. Definierte Antigen-Suspensionen: benötigt für Test D (AK-Test) in Schritt D

Gehirnsuspensionen (10%ig) an der Borna'schen Krankheit ver storbener Pferde enthalten eine hohe Konzentration viraler Pro teine (insbesondere N- und P-Protein). Eine als Folge der BDV- Infektion sich entwickelnde progrediente, neurologische Erkran kung mit Todesfolge ist selten im Vergleich zu phasisch auftre tenden, spontan remittierenden Verhaltensstörungen bzw. zu sub klinisch verlaufenden BDV-Infektionen (Ref.: Arch. Virol (1997) Suppl. 13: 167-182). Die als sog. klassische Borna'sche Krank heit bezeichnete Enzephalitis wird wahrscheinlich durch eine außer Kontrolle geratene Virusproduktion verursacht. Die Viru stiter im Gehirn erreichen 10⁵ bis 10⁶ FFU/ml und liegen damit im Bereich experimentell infizierter Labortiere (Ref.: Prog. med. Virol. (1988) 35: 107-151).

Als Antigen-Suspensionen können direkt definierte Gehirnsuspen sionen eingesetzt werden, zu denen der Virus- und Antigentiter bestimmt wurde. Für den AK-Test in dem beschriebenen Aufbau sind auch Suspensionen aus persistent mit BDV (Tier- und Men schenstämme) infizierten Zell-Linien verwendbar. Letztere eig nen sich besonders für Standardisierungszwecke. Verwendbare Zell-Linien sind gemäß dem Budapester Vertrag unter Nummer DSM ACC 2334 bei der DSMZ hinterlegt (Hinterlegungsdatum 12.12.97).

Definierte Antigen-Lösungen sind für Test B (AG-Test) als Posi tivkontrolle einsetzbar.

VI. Kurzbeschreibung der Testprinzipien der in der Erfindung beschriebenen Testkombination

Die Testkombination ist als Tripeltest für drei verschiedene infektionsrelevante BDV-Testparameter, nämlich Antigen (AG, Test B), zirkulierende Immunkomplexe (CIC, Test C) und Antikör per (AK, Test D) in einer einzigen Blutprobe konzipiert. Die Tests können auch jeweils einzeln durchgeführt werden, bei spielsweise zur Überprüfung ganz bestimmter vermuteter Krank heitsphasen. Die Teste sind als Festphasenassay aufgebaut und werden photometrisch ausgewertet. Die Testreaktionen und Abläu fe finden in Mikrotitersystemen statt, die heute Laborstandard sind.

Der als Basisbeschichtung beschriebene Teil A wird für alle drei bzw. vier Teste gleichermaßen genutzt. Die Basisbeschich tung ist ein Kernstück der Testkombination und ist für die hohe BDV-Spezifität verantwortlich. Diese wird durch ein Set aus zwei monoklonalen Antikörpern erzeugt, die gegen konservierte Epitope des N- und P-Protein von Bornavirus (p40, p24) gerich tet sind. Ein sehr effizienter Einsatz dieser "Catch"- Antikörper wird durch eine Vorbeschichtung mit einem Anti-Maus- Antikörper erzielt. Ohne diese Vorbeschichtung ist eine affini tätschromatographische Reinigung der spezifischen monoklonalen Antikörper notwendig. Im Test B für den AG-Nachweis werden in den PBMCs oder im Blutplasma (frei) vorhandene p40- und p24-Pro teine von den "Catch"-Antikörpern gebunden. Mit polyklonalen Detektions-Antikörpern vom Kaninchen, die ebenfalls BDV- spezifisch sind, wird das gebundene Antigen aus der Probe er kannt und über das Enzym-gekoppelte Indikatorsystem sichtbar gemacht. Dieses sogenannte "double-Sandwich"-Prinzip hat den Vorteil, daß geringe Mengen von BDV-Antigen in einer großen Menge zellulärer Proteine, durch spezifische Bindung an zwei verschiedene Antikörpersysteme, nachweisbar werden.

Im Test C für den CIC-Nachweis wird der Antigenteil von im Plasma vorhandenen BDV-Immunkomplexen von den "Catch"- Antikörpern gebunden. Der Antikörperteil des Immunkomplexes wird in dem nächsten Reaktionsschritt mit einem Enzym markierten Anti-Antikörper (Sekundär-Antikörper) gebunden und dies über das Indikatorsystem sichtbar gemacht. Mit diesem in der Praxis verblüffend einfachen Testaufbau werden nur CICs sichtbar, die BDV-spezifisch und damit diagnostisch relevant sind. Dieser Test ist das Kernstück der Erfindung und schließt die bisher vorhandene diagnostische Lücke. BDV-spezifische CICs wurden von den Erfindern entdeckt und ihr Nachweis entwickelt.

Im Test D für den AK-Nachweis werden im Plasma vorhandene (freie) BDV-Antikörper gegen p40 und p24 über eine Detektions- Antigenlösung bestimmt, die zuvor von den "Catch"-Antikörpern gebunden wurde. Die spezifisch gebundenen Antikörper werden über Enzym-markierte Anti-Antikörper (Sekundärantikörper), das Indikatorsystem, sichtbar gemacht. Der Testaufbau hat den Vor teil, daß als Detektions-Antigenlösung ungereinigte infizierte Gehirn- oder Zellkultursuspensionen verwendet werden können, ohne an Spezifität zu verlieren. Die Spezifität wird durch die "Catch"-Antikörper gewährleistet.

Für andere einfachere AK-Tests auf EIA-Basis wird immer gerei nigte Antigenlösung erforderlich sein, die als Festphase an den Plastikträger gebunden werden muß. Diese Teste sind zwar kürzer in der Durchführung, aber durch die Antigenreinigung aufwendig und kostspielig.

Als Standard-BDV-Antikörpertest wird anderenorts gegenwärtig der indirekte Immunofluoreszenztest durchgeführt (Ref.: J. Med. Virol. (1992) 36: 309-315). Der Test hat gegenüber neuen Systemen den Vorteil, daß die Ergebnisse quantitativ und quali tativ mit anderen Laboratorien verglichen werden können (Review: CTMI (1995) 190: 103-130). Immunfluoreszenztiter sind in der Regel niedriger als EIA-Titer. In den in Sektion VII dargestellten Längsschnittuntersuchungen wurden die Antikörper mit Immunfluoreszenz bestimmt, um Vergleichbarkeit zu gewähr leisten mit nur auf serologischer Basis erhobenen Ergebnissen anderer.

Der in Testkombination dargestellte AK-Test auf EIA-Basis ver bessert die Nachweismöglichkeit der Antikörper wegen höherer Sensivität, ändert aber im Endergebnis nichts an den in der Einführung beschriebenen niedrigen Titern und dem Absinken un ter die Nachweisgrenze. Deswegen schließt ein fehlender AK- Nachweis mit herkömmlichen Methoden eine BDV-Infektion nicht aus. Das nur vorübergehende Auftreten freier Antikörper ist durch die CIC-Bildung erklärbar.

Aufgrund der vier Testparameter ergibt sich folgendes Diagnose konzept:

cAG: Der Antigentest aus PBMCs ist geeignet als Akutmarker für die Virusvermehrung. cAG ist nur kurz während der Krankheits phase meßbar.

pAG: Das ins Plasma exprimierte Antigen tritt als Ergebnis der Virusvermehrung in den Zellen auf. Es erscheint im allgemeinen etwas später als cAG, manchmal aber auch mit diesem gleichzei tig, und ist oft einige Wochen nachweisbar. pAG ist ebenfalls ein Akutmarker während der Krankheitsphase. Seine Nachweisbar keit ist jedoch von der Schnelligkeit der Antikörper- und an schließenden CIC-Bildung abhängig. Bei Verlaufsuntersuchungen (wöchentlich) wurde festgestellt, daß bei einzelnen Proben nur pAG positiv gemessen wird (z. B. Woche 1; nur pAG, Woche 2: pAG + CIC etc.).

CIC: Die zirkulierenden Immunkomplexe sind sehr gute Infekti onsmarker und Therapie-Kontrollmarker. Unter antiviraler Thera pie ist langfristig ein Verschwinden der CICs bzw. keine Neu bildung zu beobachten. Die Halbwertzeit der CICs beträgt theo retisch vier Wochen; CICs sind jedoch oft viele Wochen nach dem akuten Krankheitsgeschehen noch nachweisbar. Ohne Therapie bleibt ein wechselnder Level an CICs i. d. R. erhalten. Die Mes sung der CICs ist als Screening latenter Infektionen daher auch bei Gesunden geeignet.

AK (Ab): Antikörper treten stets erst stimuliert durch die An tigene auf. In der akuten Phase ist der Antikörpertiter niedrig oder nicht nachweisbar, da die Antikörper in den Immunkomplexen gebunden werden. Besser nachweisbar sind die Antikörper in der Rekonvaleszenzzeit. (Anmerkung: Es wird darauf hingewiesen, daß die früher von dritter Seite publizierten Daten sich immer auf den Immunfluoreszenztest (IF) beziehen, der erheblich unemp findlicher ist, so daß nur ab und zu Antikörper nachweisbar wa ren.

In den Fig. 1, 2, 4 und 5 wird schematisch gezeigt, wie sich der Zustand der Infektion (besonders in der Krankheitsphase) dauernd verändert und daß für diesen Typus einer persistieren den Virusinfektion (mit niedriger Replikationsrate während der Aktivierungsphasen) diagnostisch eine Erfassung mehrerer Para meter optimal ist. Aufgetragen ist jeweils die Extinktion bei 405 nm über "Wochen" (Untersuchungsverlauf). Die Abbildungen zeigen den Verlauf für:
CIC - zirkulierende Immunkomplexe,
cAg - zelluläres Antigen,
pAg - Antigen im Plasma,
Ab - Antikörper (EIA).

Fig. 1 zeigt die Daten des Humanpatienten 1 (Initialen D. R.), eines rMDD-Patienten im Alter von 59 Jahren während stationärer klinischer Betreuung (Behandlung mit Antigendepressiva, nicht antiviral). Der Untersuchungszeitraum betrug ca. 3 Monate (18 Wochen). Testsystem: EIA; Verdünnung: cAG 1 : 2, CIC 1 : 20, pAG 1 : 2, Ab 1 : 100; Ausschlußgrenze 0,1 Probenursprung: für cAG: für cAG ultrabeschallte PBMCs, sonst entsprechende Plasmaproben.

Fig. 2 zeigt ein Fig. 1 entsprechendes Diagramm für einen 30- jährigen OCD-Patienten (OCD = obsessive compulsive disorder) während stationärer klinischer Behandlung). Die BDV-Infektion spielt bei diesen Patienten ebenso wie bei den depressiven Pa tienten eine nicht unerhebliche Rolle. Bei beiden Patienten gruppen - depressiven wie OCD-Patienten - können serotoninge steuerte Vorgänge gestört sein. Dies könnte damit zusammenhän gen, da das BDV-Virus funktionell bestimmte Positionen im Gehirn und an den Nervenknoten angreift. Fig. 1 und 2 zeigen unter einander ähnliche Parameterentwicklungen.

Fig. 3 zeigt 2 Beispiele aus dem Tierbereich, und zwar zwei Bornakranke Pferde. Hier wurde jeweils nur eine Probe unter sucht. Gut zu erkennen ist das Verhältnis von CIC zu pAG (freies Plasmaantigen) und Ab (= freie Plasmaantikörper (AK), gemessen mit EIA). Probe 4311 wurde von einem Pferd aus Nord deutschland (Initiale G.) gewonnen, das im März 1997 aufgrund der (fraglichen) klinischen Diagnose "Bornakrankheit) unter sucht worden war. Der IF-Antikörpertiter betrug 1 : 40. Probe 5231 wurde von einem Pferd aus Süddeutschland (Initiale D.) ge wonnen, das im Mai 1997 aufgrund der klinischen Diagnose Bor na'sche Krankheit untersucht worden war. Der IF-Antikörpertest war negativ. Das Pferd war zwei Monate vorher, im März 1997, erkrankt und zeigte Apathie und Somnolenz. Im Mai noch verblie bene Symptome waren Kopfschütteln und steifer Gang (Meßpara meter zu EIA: Verdünnung cAG 1 : 2, CIC 1 : 20, pAG 1 : 2, Ab 1 : 100, Ausschlußgrenze = 0,1, Probengrundlage: cAg: ultrabeschallte PBMCs, sonst entsprechende Plasmaproben).

Die den Abbildungen zugrundeliegenden Daten werden im folgenden in Tabellenform wiedergegeben:

Tabelle 1 (zu Fig. 1)

Tabelle 2 (zu Fig. 2)

Tabelle 3 (zu Fig. 3)

Fig. 4a) bis d) schließlich zeigt verschiedene Ergebnisse an CSF-Proben in verschiedener Verdünnung. Die Abb. a) bis c) zeigen hohe positive Antigenmarker bei Affektstörungen und d) negative Testergebnisse bei Schizophrenen.

Die hohen Werte sprechen für eine vorübergehend starke Virus vermehrung im Gehirn während der akuten Depression.

Zu den Figuren im einzelnen:

Fig. a: CSF-Probe von Patient 36 - major depressive disorder, zweite Episode, weiblich, 58 Jahre.

Fig. b: CSF-Probe Patient 137 - major depressive disorder, zweite Episode, weiblich, 29 Jahre.

Fig. d: CSF-Proben Patient 27: Schizophrenie, paranoider Ty pus, chronisch, männlich, 39 Jahre; Patient 62: Schizophrenie, paranoider Typus; unspezifisch, weiblich, 37 Jahre; Patient 130: Schizophrenie, paranoider Typus, subchronisch, weiblich, 20 Jahre.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Borna-Disease-Virus(BDV)- Infektionen gemäß Patentanmeldung 197 58 017, bei welchem an einer zu untersuchenden Körperflüssigkeitsprobe ein BDV-Anti gennachweis durchgeführt wird, dadurch gekennzeichnet, daß der Antigen-Nachweis an einer Blutplasmaprobe, Liquor oder Urin durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei dem BDV-Antigennachweis das BDV-Nukleoprotein p40 (40 kDa rela tives Molekulargewicht, "N-Protein") und/oder das BDV-Phospho protein p24 (24 kDA rel. Molekulargewicht, "P-Protein") nachwie sen werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur praktisch lückenlosen Erfassung persistenter BDV- Infektionen zusätzlich gemäß der in der Patentantmeldung 197 58 017 beschriebenen Weise ein Nachweis auf frei zirkulierende Immunkomplexe aus BDV-Antigenen und hieran angelagerten spezi fischen Antikörpern und/oder auf BDV-spezifische Antikörper durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Nachweise sämtlich an Blutplasmafraktionen durchge führt werden.