JP2020148580A - 添加剤によるｄダイマー測定での偽高値の抑制 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明の目的は、Ｄダイマー測定における不溶物由来の非特異反応を抑制し、乖離値発生確率を低減させる方法を提供することである。【解決手段】試料中のＤダイマーを測定する免疫学的測定方法において、Ｄダイマーと抗Ｄダイマー抗体とが反応する際に、乳タンパク質又はエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを共存させることを特徴とする前記測定方法。【選択図】 なし
Description
本発明は、試料中のＤダイマーを測定する免疫学的測定方法に関するものである。
抗原抗体反応を利用する免疫学的測定法は、測定対象物の分析、測定、定量、検出などとして利用されており特に臨床検査薬として広く医療現場で使用されている。例えば、フィブリンがプラスミンによって分解される際の生成物であるＤダイマーは、免疫学的測定法により定量することで、血栓症が疑われる患者の評価に利用されている。
しかし、凝固・線溶障害の患者検体はフィブリン等の不溶物が析出しやすく、乖離値が発生することがあった。このような問題はカットオフ値を基準にして診断を行うことが多いＤダイマー測定では致命的であった。
本発明の目的は、Ｄダイマー測定における不溶物由来の非特異反応を抑制し、乖離値の発生確率を低減させる方法を提供することである。
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、乳タンパク質又はエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを添加することで不溶物由来の非特異反応が抑制されることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下のとおりである。
試料中のＤダイマーを測定する免疫学的測定方法において、Ｄダイマーと抗Ｄダイマー抗体とが反応する際に、乳タンパク質又はエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを共存させることを特徴とする。
試料中のＤダイマーを測定する免疫学的測定方法において、Ｄダイマーと抗Ｄダイマー抗体とが反応する際に、乳タンパク質又はエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを共存させることを特徴とする。
以下、本発明を詳細に説明する。
乳タンパク質としては、牛乳由来などの各種カゼイン、カゼインナトリウム、ブロックエース（雪印メグミルク株式会社）などが挙げられるが、ブロックエースが好ましい。濃度範囲としては、０．００１〜１０％（重量／容量）が好ましく、０．０１〜６％（重量／容量）がより好ましい。
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムは、濃度範囲を０．０１〜４００ｍＭとすることが好ましく、０．１〜２００ｍＭとすることがより好ましい。
乳タンパク質又はエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを共存させるとは、単に抗Ｄダイマー抗体を主成分とする試薬に、乳タンパク質又はエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムが含まれていればよい。
抗Ｄダイマー抗体は、サンドイッチ法や競合法に必要な固相担体と酵素標識抗体の２種類を使用することが好ましい。固相抗体は、ビーズや微粒子などの固相担体に固定化した抗体であって、抗原抗体反応を行う溶液に不溶性のものが好ましいが、固相に直接抗体が結合していない、アビジン−酵素複合体を結合するためのビオチンを結合した抗体で可溶性のものであってもよい。
酵素標識抗体は、酵素を結合した抗体で、抗原抗体反応を行う溶液に可溶性のものが好ましいが、酵素を直接抗体に結合していない、アビジン−酵素複合体を結合するためのビオチンを結合した抗体で可溶性のものであってもよい。
抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、抗体を産生する実際上任意の動物種、例えばウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、マウスまたはラットなど由来の抗体が使用できる。抗体の形態には完全抗体や、それを酵素処理や化学処理により切断したＦ（ａｂ’）２ やＦａｂ’等のような抗体断片であってもよい。
固相担体としては、ビーズや微粒子を使用することできる。特に微粒子が好ましく、ガラス、金属、セラミツクス等の無機物であってもよく、また高分子ポリマー等の有機物であってもよい。また、それらの微粒子は磁性体を含むものであってもよい。微粒子の平均粒子径は０．１から５０μｍが好ましく、さらには１から１０μｍが好ましい。
酵素標識抗体の酵素は特に限定されるものではないが、例えばアルカリ性ホスファターゼ、パーオキシダーゼ等が挙げられる。
抗Ｄダイマー抗体（固相抗体を含む）に、ウシ血清アルブミン、コラーゲンペプチド等の蛋白質を０．１〜２０％（重量／容量）、好ましくは１〜１０％（重量／容量）添加し、さらに乳タンパク質又はエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを添加し、凍結乾燥することで本発明に用いる抗Ｄダイマー抗体を主成分とした免疫反応試薬を得ることができる。
また、凍結乾燥時に糖、緩衝液や塩類を共存させてもよく、それらは特に限定されるものではないが、糖であればスクロース、マンニトール、トレハロースやイノシトール等、緩衝液であればＴｒｉｓ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ等、塩類であれば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛等を使用することができる。なお、凍結乾燥時にはこれら以外にも、必要に応じて他の試薬成分等を共存させることもできる。
本発明によれば、Ｄダイマー測定における不溶物由来の非特異反応を抑制し、乖離値の発生確率を低減させることができる。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本実施例により限定されるものではない。
免疫測定装置として全自動エンザイムイムノアッセイ装置（ＡＩＡ−ＣＬ２４００、東ソー社製）を用いて、固相抗体及び酵素標識抗体による２ステップサンドイッチ法により、遠心で不溶物を取り除いたクエン酸血漿サンプルを連続で５回測定し、アルカリ性ホスファターゼの基質である化学発光基質の発光強度を測定した。続いて未遠心のクエン酸血漿サンプルを連続で２０回測定した。なお、固相抗体及び酵素標識抗体は後述したようにして調製した。
（実施例１）
固相抗体の調製
抗Ｄダイマー抗体固定化磁性微粒子をウシ血清アルブミン、スクロースを含むＭＯＰＳＯ緩衝液に加え、さらに３％（重量／容量）ブロックエースを加え凍結乾燥を行った。
酵素標識抗体の調製
アルカリ性ホスファターゼ標識抗Ｄダイマー抗体をウシ血清アルブミン、スクロース、塩化マグネシウム、塩化亜鉛を含むＭＯＰＳＯ緩衝液に加えて凍結乾燥を行った。
測定結果を表１に示す。
固相抗体の調製
抗Ｄダイマー抗体固定化磁性微粒子をウシ血清アルブミン、スクロースを含むＭＯＰＳＯ緩衝液に加え、さらに３％（重量／容量）ブロックエースを加え凍結乾燥を行った。
酵素標識抗体の調製
アルカリ性ホスファターゼ標識抗Ｄダイマー抗体をウシ血清アルブミン、スクロース、塩化マグネシウム、塩化亜鉛を含むＭＯＰＳＯ緩衝液に加えて凍結乾燥を行った。
測定結果を表１に示す。
（実施例２）
固相抗体の調製
抗Ｄダイマー抗体固定化磁性微粒子をウシ血清アルブミン、スクロースを含むＭＯＰＳＯ緩衝液に加え、さらに１００ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを加え凍結乾燥を行った。
酵素標識抗体の調製
アルカリ性ホスファターゼ標識抗Ｄダイマー抗体をウシ血清アルブミン、スクロース、塩化マグネシウム、塩化亜鉛を含むＭＯＰＳＯ緩衝液に加えて凍結乾燥を行った。
測定結果を表２に示す。
固相抗体の調製
抗Ｄダイマー抗体固定化磁性微粒子をウシ血清アルブミン、スクロースを含むＭＯＰＳＯ緩衝液に加え、さらに１００ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを加え凍結乾燥を行った。
酵素標識抗体の調製
アルカリ性ホスファターゼ標識抗Ｄダイマー抗体をウシ血清アルブミン、スクロース、塩化マグネシウム、塩化亜鉛を含むＭＯＰＳＯ緩衝液に加えて凍結乾燥を行った。
測定結果を表２に示す。
（比較例１）
固相抗体の調製
抗Ｄダイマー抗体固定化磁性微粒子をウシ血清アルブミン、スクロース等を含むＭＯＰＳＯ緩衝液に加えて凍結乾燥を行った。
酵素標識抗体の調製
アルカリ性ホスファターゼ標識抗Ｄダイマー抗体をウシ血清アルブミン、スクロース、塩化マグネシウム、塩化亜鉛を含むＭＯＰＳＯ緩衝液に加えて凍結乾燥を行った。
測定結果を表３に示す。
固相抗体の調製
抗Ｄダイマー抗体固定化磁性微粒子をウシ血清アルブミン、スクロース等を含むＭＯＰＳＯ緩衝液に加えて凍結乾燥を行った。
酵素標識抗体の調製
アルカリ性ホスファターゼ標識抗Ｄダイマー抗体をウシ血清アルブミン、スクロース、塩化マグネシウム、塩化亜鉛を含むＭＯＰＳＯ緩衝液に加えて凍結乾燥を行った。
測定結果を表３に示す。
ブロックエース、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムが含まれていない比較例１の場合は、未遠心の測定値が遠心済の５０〜１５０％となる確率が２０％であったが、固相抗体にブロックエースを添加した実施例１の場合、未遠心の測定値が遠心済の５０〜１５０％となる確率が６０％であった。固相抗体にエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを添加した実施例２の場合、未遠心の測定値が遠心済の５０〜１５０％となる確率が６５％であった。以上のようにブロックエース又はエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム添加を行うことで免疫反応試薬の性能が向上することが示された。
Claims (4)
- 試料中のＤダイマーを測定する免疫学的測定方法において、Ｄダイマーと抗Ｄダイマー抗体が反応する際に、乳タンパク質又はエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを共存させることを特徴とする前記測定方法。
- 乳タンパク質の濃度範囲が０．００１〜１０％（重量／容量）又はエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムの濃度範囲が０．０１〜４００ｍＭであることを特徴とする請求項１に記載の測定方法。
- 抗Ｄダイマー抗体に固相担体と酵素標識抗体の２種類を用いることを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の測定方法。
- 蛋白質と、乳タンパク質又はエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムが添加された抗Ｄダイマー抗体を凍結乾燥して得られる免疫反応試薬。
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