CN105203772A - 甘氨酸在减弱荧光素fitc标记d-二聚体抗体时猝灭现象中的应用 - Google Patents

甘氨酸在减弱荧光素fitc标记d-二聚体抗体时猝灭现象中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种甘氨酸在减弱荧光素FITC标记D-二聚体抗体时猝灭现象中的应用。该应用为利用甘氨酸通过共价键或离子键结合抗体标记时残留的多余荧光素FITC，减少超滤次数，减弱猝灭现象，提高荧光素-抗体纯度和荧光检测信号。所述的应用步骤如下：先将荧光素FITC用DMF溶解至0.5-2mg/mL，得到所需荧光素FITC的浓度；将D-二聚体抗体和荧光素FITC分别用PBS溶液稀释；将稀释后的荧光素FITC和D-二聚体抗体混匀，添加甘氨酸至最终甘氨酸的浓度为1-5mmol/L，然后在30-40℃下混匀1-2小时；经过超滤、离心，最后用D-二聚体抗体稀释液定容。本发明添加甘氨酸可以有效减弱荧光素FITC标记D-二聚体抗体时的猝灭现象，且应用的方法简单可行。

Description

甘氨酸在减弱荧光素FITC标记D-二聚体抗体时猝灭现象中的应用
技术领域
本发明涉及一种甘氨酸在减弱荧光素FITC标记D-二聚体抗体时猝灭现象中的应用。
背景技术
在荧光免疫层析中，常常会涉及到采用荧光素标记抗体的实验。在用荧光素标记抗体时由于荧光素浓度的原因会出现荧光猝灭现象。荧光猝灭现象是由于荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互作用，引起荧光强度降低或荧光强度与浓度偏离线性关系，当荧光物质的浓度过高时，由于荧光物质分子间碰撞的概率增加，产生荧光猝灭现象，浓度越高，这种现象越明显。在实际免疫检测分析中，由于荧光素之间的光谱重叠，以及生物样品、溶质、溶剂的本底荧光、散射光和化学发光物质的干扰，使检测灵敏度大大降低，很难检测识别微量的抗原抗体。FITC，荧光素异硫氰酸酯，是目前应用最为广泛的荧光素，具有光敏感基团，易产生浓度猝灭现象。
甘氨酸，结构式如下：是人体非必需的一种氨基酸，在分子中同时具有酸性和碱性官能团，在水中可电离，具有很强的亲水性，属于极性氨基酸。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提出了甘氨酸在减弱荧光素FITC标记D-二聚体抗体时猝灭现象中的应用。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：甘氨酸在减弱荧光素FITC标记D-二聚体抗体时猝灭现象中的应用，利用甘氨酸通过共价键或离子键结合抗体标记时残留的多余荧光素FITC，减少超滤次数，减弱猝灭现象，提高荧光素-抗体纯度和荧光检测信号。
在荧光素FITC标记D-二聚体抗体时，多余的荧光素会影响荧光素结合抗体的效率，影响荧光值的读取，本发明通过不断试验发现添加甘氨酸可以结合多余的荧光素，减少超滤次数，减弱猝灭现象，提高荧光素-抗体纯度和荧光检测信号。
在上述甘氨酸在减弱荧光素FITC标记D-二聚体抗体时猝灭现象中的应用，所述的应用步骤如下：
先将荧光素FITC用DMF溶解至0.5-2mg/mL，得到所需荧光素FITC的浓度；
将D-二聚体抗体和荧光素FITC分别用PBS溶液稀释；
将稀释后的荧光素FITC和D-二聚体抗体混匀，添加甘氨酸至最终甘氨酸的浓度为1-5mmol/L，然后在30-40℃下混匀1-2小时；
经过超滤、离心，最后用D-二聚体抗体稀释液定容。
本发明先将荧光素FITC和D-二聚体抗体结合，多余未反应的荧光素FITC再和甘氨酸反应，经研究发现，多余未反应的荧光素FITC再和甘氨酸反应在30-40℃的条件下更有利于荧光素FITC与抗体的结合。
在上述甘氨酸在减弱荧光素FITC标记D-二聚体抗体时猝灭现象中的应用，D-二聚体抗体和荧光素FITC分别都用PBS溶液稀释至原浓度的8-10％。
在上述甘氨酸在减弱荧光素FITC标记D-二聚体抗体时猝灭现象中的应用，所述荧光素FITC和D-二聚体抗体混匀时的比例为1：10-20。
在上述甘氨酸在减弱荧光素FITC标记D-二聚体抗体时猝灭现象中的应用，所述D-二聚体抗体稀释液的组分为：1-2％酪蛋白，0.1-0.3％叠氮化钠，1-3％表面活性剂，10-20mMPBS。该稀释液可以更好地标记D-二聚体抗体的保存液。
本发明的原理：D-二聚体是深静脉血栓、肺血塞、弥漫性血管内凝血的关键检测指标，根据抗原抗体特异性结合原理，采用免疫荧光技术将荧光素FITC标记D-二聚体抗体，利用甘氨酸通过共价键或离子键结合抗体标记时残留的多余荧光素FITC，标记后的抗体与血液中的D-二聚体结合形成抗原抗体复合物，通过在荧光读数仪640nm波长的激发光激发，测定其在690nm接受光的荧光值，可计算出血液中D-二聚体浓度，荧光值的变化反映了荧光猝灭现象的减弱程度。另外，荧光素FITC标记蛋白质的示意图如图1所示。
与现有技术相比，本发明添加甘氨酸可以有效减弱荧光素FITC标记D-二聚体抗体时的猝灭现象，且应用的方法简单可行。
附图说明
图1为荧光素FITC标记蛋白质示意图。
图2为D-二聚体标准品稀释成不同浓度的定标液绘制成的标准曲线。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例结合附图说明，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
先将荧光素用先将荧光素用DMF溶解至1.2mg/mL得荧光素FITC；
将D-二聚体抗体和荧光素FITC分别用PBS溶液稀释至原浓度的10％；
室温下，将稀释后的荧光素FITC和D-二聚体抗体按1：10的比例混匀，再添加甘氨酸至最终甘氨酸的浓度为3mmol/L，然后在30℃下混匀1小时；
经过超滤、离心，最后用D-二聚体抗体稀释液定容。
实施例2
与实施例1的区别仅在于，实施例2-5中添加甘氨酸至最终甘氨酸的浓度分别为1mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、5mmol/L，其他与实施例1相同，此处不再累述。
实施例6-10
与实施例1-5对应的区别仅在于，实施例6-10稀释后的荧光素FITC和D-二聚体抗体分别按1：12、1：14、1：16、1：18、1：20的比例混匀，其他分别与实施例1-5对应相同，此处不再累述。
对比例1
与实施例1的区别仅在于，荧光素FITC标记D-二聚体抗体时过程中未添加甘氨酸。
本发明实施例中的参数并不局限于上述列举的，还可以包括如下：荧光素用DMF溶解可溶解至0.5-2mg/mL，如0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.4mg/mL、1.5mg/mL、1.6mg/mL、1.8mg/mL、2mg/mL等；D-二聚体抗体和荧光素FITC分别用PBS溶液稀释至原浓度的8-10％，可以稀释至浓度的8％、8.5％、9％、9.5％等；稀释后的荧光素FITC、D-二聚体抗体、甘氨酸三者在30-40℃下混匀1-2小时，可以为在32℃下混匀1小时、在35℃下混匀2小时、在38℃下混匀2小时、在30℃下混匀1小时等。
将D-二聚体标准品稀释成不同浓度的定标液，绘制标准曲线，见表1和图2。
表1：D-二聚体标准值
D-二聚体(mg/L) 荧光信号值
10 8562
8 7653
5 4563
1.25 1239
0.6 658
0.2 213
0.05 63
0 0
将实施例1中D-二聚体抗体稀释液定容荧光素标记的D-二聚体抗体与血清中的D-二聚体抗原结合后，用荧光读数仪读取荧光值，见表2。
表2：实施例1和对比例1中对荧光猝灭现象的处理效果
由表1、表2和图2的数据可以看出，对比例1中未添加甘氨酸处理荧光猝灭现象，为了提高检测灵敏度，标记抗体时提高了荧光素浓度但多余的荧光素发生了猝灭，从而使血清荧光检测信号偏低。在本发明添加甘氨酸处理荧光猝灭现象后，不仅达到提高检测灵敏度的实验目的，而且不同浓度的血清的检测信号都会不同程度地提高，将血清的检测信号赋值到D-二聚体标准曲线上，与血清真实值比较接近。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims (5)

1.甘氨酸在减弱荧光素FITC标记D-二聚体抗体时猝灭现象中的应用，其特征在于，甘氨酸通过共价键或离子键结合抗体标记时残留的多余荧光素FITC，减少超滤次数，减弱猝灭现象，提高荧光素-抗体纯度和荧光检测信号。
2.根据权利要求1所述的甘氨酸在减弱荧光素FITC标记D-二聚体抗体时猝灭现象中的应用，其特征在于，所述的应用步骤如下：
先将荧光素用DMF溶解至0.5-2mg/mL得荧光素FITC；
将D-二聚体抗体和荧光素FITC分别用PBS溶液稀释；
将稀释后的荧光素FITC和D-二聚体抗体混匀，添加甘氨酸至最终甘氨酸的浓度为1-5mmol/L，然后在30-40℃下混匀1-2小时；
经过超滤、离心，最后用D-二聚体抗体稀释液定容。
3.根据权利要求2所述的甘氨酸在减弱荧光素FITC标记D-二聚体抗体时猝灭现象中的应用，其特征在于，D-二聚体抗体和保存处理后的荧光素FITC分别都用PBS溶液稀释至原浓度的8-10％。
4.根据权利要求2所述的甘氨酸在减弱荧光素FITC标记D-二聚体抗体时猝灭现象中的应用，其特征在于，所述荧光素FITC和D-二聚体抗体混匀时的比例为1：10-20。
5.根据权利要求2所述的甘氨酸在减弱荧光素FITC标记D-二聚体抗体时猝灭现象中的应用，其特征在于，所述D-二聚体抗体稀释液的组分为：1-2％酪蛋白，0.1-0.3％叠氮化钠，1-3％表面活性剂，10-20mMPBS。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109406775A (zh) * 2018-10-12 2019-03-01 东莞市暨科生物科技有限公司 自身免疫性疾病患者免疫功能评估试剂盒及评估方法
JP2020148580A (ja) * 2019-03-13 2020-09-17 東ソー株式会社 添加剤によるｄダイマー測定での偽高値の抑制

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011047871A (ja) * 2009-08-28 2011-03-10 Fancl Corp ブロッキング剤
JP2011047873A (ja) * 2009-08-28 2011-03-10 Fancl Corp ブロッキング剤
CN103919558A (zh) * 2014-04-13 2014-07-16 中南民族大学 荧光猝灭体系用于潜在指纹显现的方法
CN104459147A (zh) * 2013-09-18 2015-03-25 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 一种生物标记物的保存液、试剂和方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011047871A (ja) * 2009-08-28 2011-03-10 Fancl Corp ブロッキング剤
JP2011047873A (ja) * 2009-08-28 2011-03-10 Fancl Corp ブロッキング剤
CN104459147A (zh) * 2013-09-18 2015-03-25 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 一种生物标记物的保存液、试剂和方法
CN103919558A (zh) * 2014-04-13 2014-07-16 中南民族大学 荧光猝灭体系用于潜在指纹显现的方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109406775A (zh) * 2018-10-12 2019-03-01 东莞市暨科生物科技有限公司 自身免疫性疾病患者免疫功能评估试剂盒及评估方法
JP2020148580A (ja) * 2019-03-13 2020-09-17 東ソー株式会社 添加剤によるｄダイマー測定での偽高値の抑制

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