JPWO2017038711A1 - 免疫学的測定用試薬組成物およびその用途 - Google Patents

Abstract

【課題】試料として糞便を用いる免疫学的測定法において、検出対象物との反応性の低下を最小限に抑制しつつ、非特異的反応の進行とそれに伴う偽陽性の発生を抑制しうる手段を提供する。【解決手段】糞便試料を用いた免疫学的測定法において、酸化剤を含む試薬組成物を用いる。【選択図】図１

Description

本発明は、免疫学的測定用試薬組成物およびその用途に関する。

近年、診療所や小規模病院において、「患者を診察している間に検査結果を知りたい」、というニーズが増加し、従来の院外への外注検査から、Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ（ＰＯＣＴ）への切り替えが行われている。ＰＯＣＴの普及に伴いイムノクロマトグラフィー法を原理とするテストストリップが体外診断薬として使用されている。イムノクロマトグラフィー法は、検査の際に試薬の調製を必要とせず、血液や尿、糞便の懸濁液などの被験試料（以下、単に「試料」とも称する）を当該テストストリップ上に（必要に応じてろ過フィルターを通過させた後に）直接滴下するなどの簡単な操作のみで、試料中の対象物を検出することが可能であり、検出対象物を簡便かつ迅速に分析するのに非常に有用である。

イムノクロマトグラフィー法を原理とするテストストリップ（以下、単に「テストストリップ」とも称する）は、一般に、試料供給部、標識試薬保持部、クロマトグラフ媒体および検出部を備えた多孔性のメンブレンであって、検出対象物に対する標識抗体などの標識試薬が、試料と接触後にクロマトグラフ媒体を通過して検出部に到達できるよう、クロマトグラフ媒体の展開開始部位に溶出、展開可能に保持され、さらにクロマトグラフ媒体の一部に抗体などが固定化され検出部を構成する構造となっている。ここで、試料が試料供給部に滴下され、標識試薬保持部に達すると、試料中の検出対象物が標識抗体と特異的に結合して複合体を形成する。当該複合体は、クロマトグラフ媒体を下流方向に向かって展開してゆき、さらに固定化された抗体に結合する。このため、検出部において、標識抗体、検出対象物および固定化抗体によるサンドイッチ型複合体を検出することで、検出対象物を定性または定量分析することが可能である。標識試薬を構成する標識物の一例は金コロイド粒子であり、金コロイド粒子による赤色のラインによって定性的な検出が可能となる。さらに、その赤色のラインの度合いに基づいて、試料中における検出対象物を定量的に検出することも可能である。

ところで、感染症の早期発見やその原因の特定を目的として、被験試料中のノロウイルスやロタウイルスなどのウイルスや細菌の存在を調べる検査などが知られている。感染症の原因となる菌やウイルスは糞便中に排出されることも多いことから、糞便試料からの病原体の検出は非常に有用である。感染症の病原体のうち、細菌は培養や遺伝子検査による方法などで検出され、ウイルスは遺伝子検査や電子顕微鏡による方法などで検出されるが、これらの検査方法では、試料の処理や検査に熟練した技術と時間、特別な装置を必要とし、しかも検出に時間がかかる、大量の試料を処理できないなどの欠点がある。また、ノロウイルスやロタウイルスは、子供や高齢者では重症化することもあり、ウイルス検出においては、感染拡大を防ぎ、早期に治療方針や隔離措置の決定を可能にするため、短時間での測定が求められている。一方、イムノクロマトグラフィー法などの免疫学的測定法を用いて糞便試料からの病原体の検出を行うことで、簡便で短時間にかつ高感度で検査を行うことが可能となるという利点がある。

しかしながら、イムノクロマトグラフィー法などの免疫学的測定法では、患者から採取された試料の分析において、分析対象物が試料中に存在しないにもかかわらず、非特異的な反応によって陽性と判定してしまうことがある（偽陽性）。免疫学的測定法におけるこのような偽陽性の発生を防止することを目的として、非特異反応の進行を抑制するための様々な技術が提案されている。例えば、試料や標識抗体を固相上で展開する際に特定の成分を溶液中に含有させる方法（例えば、特許文献１）や、抗体を固定化する際の固相作製用試薬（例えば、特許文献２）、異好性抗体による非特異的反応の抑制方法（例えば、特許文献３）などが提案されている。

また、特に糞便試料を用いた場合の非特異反応を抑制する方法として、固形の夾雑物が非特異物質であるとして強剛性フィルターを含むフィルターにより試料をろ過する方法（例えば、特許文献４）、ｐＨを調整した緩衝剤により試料を処理する方法（例えば、特許文献５）、さらに、ろ過材を使用したろ過操作によって発生する非特異反応を抑制する技術として、金属イオンのマスキング剤の存在下で免疫反応を行う方法（例えば、特許文献６）などがある。

特表２００９−５１７６３２号公報 特開２００９−１６２５３５号公報 特開２０１１−１９７０１４号公報 特開２００８−１２２３７２号公報 特開２００４−３０１６８４号公報 特開平０９−２０３７３５号公報

本発明者らの検討によれば、特許文献４〜６などにより従来種々提案されている技術を用いたとしても、依然として、糞便試料を用いた場合の非特異反応の進行とそれに伴う偽陽性の発生を十分に抑制できない場合があることが判明した。

そこで本発明は、試料として糞便を用いる免疫学的測定法において、検出対象物との反応性の低下を最小限に抑制しつつ、非特異的反応の進行とそれに伴う偽陽性の発生を抑制しうる手段を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、試料として糞便を用いる免疫学的測定法において、糞便試料が検出部へ到達する前に酸化剤と接触させることで、上記課題が解決されうることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明の一形態によれば、糞便試料を用いた免疫学的測定法に用いられる試薬組成物であって、酸化剤を含む、試薬組成物が提供される。

また、本発明の他の形態によれば、試料供給部と、前記試料供給部の下流側に位置するクロマトグラフ媒体と、前記クロマトグラフ媒体の一部に位置する、金属コロイドなどで標識された抗検出対象物抗体（標識試薬）が溶出可能に保持された標識試薬保持部と、前記クロマトグラフ媒体の一部であって前記標識試薬保持部より下流側に位置する、固定化抗体を含む検出部とを有するテストストリップであって、上述した形態に係る試薬組成物を含む、テストストリップが提供される。

さらに、本発明のさらに他の形態によれば、試料供給部と、前記試料供給部の下流側に位置するクロマトグラフ媒体と、前記クロマトグラフ媒体の一部に位置する、金属コロイドなどで標識された抗検出対象物抗体（標識試薬）が溶出可能に保持された標識試薬保持部と、前記クロマトグラフ媒体の一部であって前記標識試薬保持部より下流側に位置する、固定化抗体を含む検出部とを有するテストストリップを用いて、免疫学的測定法により糞便試料中の検出対象物を検出または定量する方法であって、上述した形態に係る試薬組成物を用いる、方法もまた、提供される。

また、本発明のさらに他の形態によれば、上述した形態に係る試薬組成物と、糞便試料とを接触させる工程を含む、免疫学的測定法における非特異反応の抑制方法もまた、提供される。

本発明によれば、試料として糞便を用いる免疫学的測定法において、検出対象物との反応性の低下を最小限に抑制しつつ、非特異的反応の進行とそれに伴う偽陽性の発生を抑制することが可能となる。

本発明の一実施形態に係るノロウイルス検出のためのイムノクロマトグラフィー用キットの模式断面図である。

［試薬組成物］
本発明の一形態は、糞便試料を用いた免疫学的測定法に用いられる試薬組成物であって、酸化剤を含む、試薬組成物である。

本形態に係る試薬組成物は、糞便試料の免疫学的測定法に用いられる。試薬組成物は、糞便試料を抽出するための抽出用溶液または展開液などの溶液に含まれてもよく、パッド、ろ過フィルターなど、試料が接触する部材に乾燥した状態で含まれてもよい。

「免疫学的測定法」とは、測定対象である検出対象物と特異的に結合する物質（例えば、抗体または抗原）を用いて、検出対象物の検出・定量を行う方法である。本発明において、免疫学的測定法として典型的にはイムノクロマトグラフィー法（好ましくは、後述するサンドイッチ型イムノクロマトグラフィー法）が挙げられるが、その他のＥＬＩＳＡ法、ラテックス凝集法、免疫比濁法などが用いられてもよい。

ここで、検出対象物が抗原性を有する物質である場合、検出対象物を特異的に認識する抗体を用いて免疫学的測定法を実施することができる。この場合、抗体の具体的な形態について特に制限はないが、例えば、その検出対象物によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分から得られるポリクローナル抗体、その分析対象物によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、または、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦｖ］を用いることができる。これらの抗体の調製は、公知の方法により行うことができる。特に、モノクローナル抗体−抗原−モノクローナル抗体複合体を形成するサンドイッチ型免疫学的測定法が好ましい。また、検出対象物が抗体（すなわち、特定の抗原に対する免疫グロブリン分子）である場合には、当該抗体が特異的に認識する物質（抗原）または免疫グロブリン分子に対する抗体を用いて免疫学的測定法を実施することができる。さらに、検出対象物が糖である場合には、糖に対する抗体のほか、レクチンタンパク質などを用いて免疫学的測定法を実施することができる。

「糞便試料」については、糞便由来の試料である限りその具体的な形態は特に制限されず、その由来とする糞便は、硬便、普通便、軟便、下痢便、水様便などのいずれであってもよい。なお、糞便試料は、通常、水分を約６０質量％、食物残渣や腸粘膜細胞、腸内細菌などを約４０質量％含むが、糞便試料は生体試料の中でも、体内に吸収されずに排泄される成分を多く含むことや、固体の夾雑物が多いこと、また、排出状態によって、成分や形状、ｐＨなどが多様であるという特有の性質を有する。このため、偽陽性が発生する状況や原因も様々であり、糞便試料において非特異的反応の進行とそれに伴う偽陽性の発生を抑制しうる手段は非常に有用である。本発明によれば、糞便試料における非特異的反応の進行とそれに伴う偽陽性の発生を抑制しうる。

イムノクロマトグラフィー法などの免疫学的測定法では、検出対象物の存在の有無の判定（検出）や、検出対象物が存在する場合にはその存在量の測定（定量）が行われる。本発明において、「検出対象物」に特に制限はなく、糞便試料中に含まれうる物質であればよい。検出対象物の一例としては、ウイルス（例えば、ノロウイルス、サポウイルス、ロタウイルス、アデノウイルスなど）、細菌（例えば、赤痢菌、サルモネラ属菌、腸管出血性大腸菌、カンピロバクターなど）または大腸がんスクリーニングの対象となる便潜血などが挙げられる。特に、ウイルスや細菌を検出対象物として用いることで、偽陽性の発生を抑制しつつ迅速な判定を可能としうる本発明の優位性が顕著なものとなる。また、抗検出対象物抗体が特異的に認識する物質（抗原）についても、上述した検出対象物のそれぞれに特異的に存在する物質であれば特に制限はなく、タンパク質、ペプチド、抗原、抗体のほか、核酸、糖（特に糖タンパク質の糖部分、糖脂質の糖部分など）、複合糖質などであってもよい。

（酸化剤）
本形態に係る試薬組成物に含まれる酸化剤の具体的な形態について、本発明の効果を奏することができる酸化剤であれば特に制限はなく、従来公知の酸化剤が用いられうる。本形態に係る試薬組成物に含まれる酸化剤は、糞便試料に含まれ、かつ非特異反応の原因となる何らかの成分を酸化する。酸化剤の一例としては、例えば、ハロゲンオキソ酸塩、遷移金属錯体の塩、過酸化物、有機水銀化合物、過マンガン酸塩、クロム酸塩、オキシダーゼ、亜硝酸塩、および超酸化物からなる群から選択される１種または２種以上が挙げられる。

ハロゲンオキソ酸塩として、例えば、次亜塩素酸、亜塩素酸、塩素酸、過塩素酸、次亜臭素酸、亜臭素酸、臭素酸、過臭素酸、次亜ヨウ素酸、亜ヨウ素酸、ヨウ素酸、および過ヨウ素酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、およびアンモニウム塩が挙げられ、特に、ヨウ素酸および過ヨウ素酸のアルカリ金属塩（例えば、ヨウ素酸カリウム、ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム）、アルカリ土類金属塩（例えば、ヨウ素酸カルシウム）、およびアンモニウム塩（例えば、ヨウ素酸アンモニウム）が好ましい。

遷移金属錯体の塩として、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、およびアンモニウム塩のフェリシアン化塩が挙げられ、特にフェリシアン化カリウムが好ましい。

過酸化物として、例えば有機過酸化物が挙げられ、特に過酸化尿素および過酸化水素、が好ましい。

有機水銀化合物として、チメロサールが好ましい。

過マンガン酸塩として、例えばアルカリ金属またはアルカリ土類金属の過マンガン酸塩が挙げられ、特に過マンガン酸カリウムが好ましい。

オキシダーゼとして、例えばグルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ラクテートオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、およびウリカーゼなどが挙げられ、特にグルコースオキシダーゼが好ましい。オキシダーゼは糞便中に存在する基質に対して酸化還元酵素として機能し、生じた過酸化水素を酸化剤として用いる。なかでも、非特異反応の抑制とこれに伴う偽陽性の発生を抑制する効果に特に優れるという観点からは、ヨウ素酸カリウム、過ヨウ素酸カリウムおよびフェリシアン化カリウムからなる群から選択される１種または２種以上が酸化剤として用いられることが特に好ましく、測定結果の視認性および濃度に対する非特異反応の抑制効果の観点から、ヨウ素酸カリウムが最も好ましい。

なお、本形態に係る試薬組成物に含まれる酸化剤について、酸化還元電位の観点から規定すると、１００ｍＶ以上の酸化還元電位を有するものであることが好ましい。このような酸化還元電位を有することで、非特異反応の抑制とこれに伴う偽陽性の発生を抑制するという効果が確実に奏されうる。なお、酸化剤の酸化還元電位の測定は、以下の方法で行うものとする。また、酸化還元電位の値は、より好ましくは２００ｍＶ以上であり、さらに好ましくは３００ｍＶ以上であり、特に好ましくは４００ｍＶ以上である。一方、酸化剤の酸化還元電位の上限値に特に制限はないが、通常は９００ｍＶ以下、好ましくは５００ｍＶ以下である。

酸化還元電位の測定方法：酸化剤を精製水に溶解し、１０ｍＭの溶液を１０ｍＬ調製する。得られた溶液について、３．３３ｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ−Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を用いて酸化還元電位を測定する。

［免疫学的測定用キット（イムノクロマトグラフィー用キット）］
上述した形態に係る試薬組成物において、酸化剤は種々の形態で含有されうる。以下では、酸化剤の含有形態の説明に先立ち、上述の形態に係る試薬組成物が用いられうる免疫学的測定用キットの詳細について、免疫学的測定法がイムノクロマトグラフィー法である場合を例に挙げて、図面を参照しつつ説明する。

図１は、本発明の一実施形態に係るノロウイルス検出のためのイムノクロマトグラフィー用キットの模式断面図である。

図１に示すイムノクロマトグラフィー用キット１０は、キットの本体としてテストストリップ１００を有している。テストストリップ１００は、最下層としてプラスチック製粘着シート１１０を有しており、当該粘着シート１１０上には、クロマトグラフ媒体（不溶性担体；固定相）としての抗体固定化メンブレン１２０が積層されている。以下、抗体固定化メンブレン１２０の試料供給部側を上流、試料が流れていく方向（吸収部側）を下流として説明する。

抗体固定化メンブレン１２０の上流側には標識試薬保持パッド１３０（標識試薬保持部）がさらに積層されている。標識試薬保持パッド１３０上にはサンプルパッド１４０（試料供給部）がさらに積層されている。当該標識試薬保持パッド１３０には、金コロイド粒子の表面に抗検出対象物抗体である抗ノロウイルス抗体（例えば、抗ノロウイルスＧＩマウスモノクローナル抗体および抗ノロウイルスＧＩＩマウスモノクローナル抗体）が固定化されてなる標識抗体（標識試薬）が溶出可能に保持されている。抗体固定化メンブレン１２０において、標識試薬保持パッド１３０より下流側には、抗検出対象物抗体である抗ノロウイルス抗体（例えば、抗ノロウイルスＧＩマウスモノクローナル抗体および抗ノロウイルスＧＩＩマウスモノクローナル抗体）が固定化されたテストライン１２２（検出部）が配置され、さらに、テストライン１２２より下流側には、抗免疫グロブリン抗体が固定化されたコントロールライン１２４（コントロール部）が配置されている。さらに、抗体固定化メンブレン１２０において、コントロールライン１２４より下流側には吸収パッド１５０が積層されている。

イムノクロマトグラフィー用キット１０は、キットの本体であるテストストリップ１００に加えて、サンプルパッド１４０（試料供給部）に供給される前の試料をろ過するためのろ過フィルター２００、および当該試料の抽出用溶液または展開液３００を備えている。イムノクロマトグラフィー用キット１０は、必要に応じてその他の構成要素（例えば、使用説明書、検体採取用器具、検体抽出用容器など）をさらに備えていてもよい。また、テストストリップ１００は、図示しないプラスチック製の専用ハウジング（試料供給窓部および検出窓部を有する）に格納・搭載し、イムノクロマトテストデバイスの形態とされることが好ましい。

イムノクロマトグラフィー用キット１０が使用される際、例えば抽出用溶液３００を用いる場合には、採便容器やマイクロチューブなどの容器中で糞便試料を抽出用溶液と混合し、得られた懸濁液をろ過フィルター２００に通過させることでろ過処理物の形態の試料を得る。この際、ろ過フィルター２００は上記容器とは別の部材として用いられてもよいし、上記容器の蓋などと一体化した部材として用いられてもよい。ろ過フィルター２００を上記容器の蓋と一体化した部材として構成することで、容器から懸濁液を排出させると同時にろ過処理が行われてろ過処理物の形態の試料が得られることから、抽出後のろ過操作が簡便に行われうる。

続いて、上記で得られたろ過処理物の形態の試料をサンプルパッド１４０に滴下すると、ろ過処理物の形態の試料は展開液として機能し、サンプルパッド１４０を通過した後に標識試薬保持パッド１３０へと移動する。そして、試料中に検出対象物（例えば、ノロウイルス）が存在する場合には、試料が毛細管現象により標識試薬保持パッド１３０中を移動するときに、標識試薬を構成する抗ノロウイルス抗体と試料中のノロウイルス（抗原）との抗原−抗体反応により複合体（金コロイド粒子−抗ノロウイルス抗体−ノロウイルス（抗原）複合体）が形成される。この複合体は試料とともにさらに毛細管現象によって抗体固定化メンブレン１２０中を下流へと移動する。複合体が抗体固定化メンブレン１２０の途中に設けられたテストライン１２２（検出部）に到達すると、テストライン１２２に固定化されている抗検出対象物抗体である抗ノロウイルス抗体が上記複合体に含まれるノロウイルス（抗原）との間で抗原−抗体反応を生じ、ノロウイルス（抗原）が２つの抗ノロウイルス抗体（標識試薬を構成する（金コロイド粒子に固定化された）抗体およびテストラインに固定化された抗体）で挟まれるように捕捉されたサンドイッチ複合体が形成される。ここで、サンドイッチ複合体を構成する一方の抗体はテストライン１２２に固定化されていることから、当該サンドイッチ複合体はテストライン１２２上に留まることになり、金コロイド粒子の集積によって赤色のラインを呈する。このラインにより、試料中における検出対象物（ノロウイルス）の存在を目視にて確認することが可能となるのである。なお、試料中に検出対象物（ノロウイルス）が存在しなければ、抗原と、標識試薬を構成する抗体とによる抗原−抗体複合体が形成されず、テストラインにおけるサンドイッチ複合体は形成されないことから、テストラインに赤色のラインは生じない。すなわち、テストライン１２２（検出部）が金コロイドの色（例えば、赤色〜赤褐色）に着色していれば、試料中に検出対象物（ノロウイルス）が存在していると判定される。一方、テストラインに色調の変化がなく膜部材の色のままであれば、試料中に検出対象物（ノロウイルス）は存在していないと判定される。

なお、反応に関与しなかった抗ノロウイルス抗体結合金コロイド（標識試薬）は、コントロールライン１２４（コントロール部）に固定化された抗免疫グロブリン抗体に捕捉される。これにより、コントロールライン１２４は赤色のラインを呈することから、テストストリップ１００上での反応が正常に進んだことが確認される。

以上、キットの使用時に抽出用溶液３００を用いる場合を例に挙げて、キットの使用形態を詳細に説明したが、抽出用溶液ではなく展開液３００を用いる場合には、例えば、サンプルパッド１４０上に重ねたろ過フィルター２００上に糞便試料を載置した状態で、試料に展開液３００を滴下することで、上述したのと同様のろ過処理物がサンプルパッド１４０に供給される。その後の挙動については、上記と同様であるため、ここでは詳細な説明を省略する。

（酸化剤（試薬組成物）の含有形態）
上述した形態に係る酸化剤を含む試薬組成物は、免疫学的測定用キット（イムノクロマトグラフィー用キット）において、以下のような種々の形態で含有されうる。
（１）抽出用溶液または展開液３００に添加される形態；
（２）ろ過フィルター２００に添加される形態；
（３）サンプルパッド１４０に添加される形態；
（４）標識試薬保持パッド１３０に添加される形態；
（５）抗体固定化メンブレンのテストライン１２２の上流に添加される形態。

ここで、上記の（３）〜（５）の形態では、テストストリップ１００に酸化剤が含有されるが、いずれもサンプルパッド（試料供給部）から抗体固定化メンブレン１２０（クロマトグラフ媒体）におけるテストライン１２２（検出部）の上流までのいずれかの部位に酸化剤が含まれることになる。このため、（１）〜（５）のすべての形態において、試料またはそのろ過処理物と抽出用溶液または展開液との混合物は、テストライン１２２（検出部）の上流において酸化剤と接触することになる。これにより、糞便試料に含まれる何らかの成分に起因する非特異反応が酸化剤の存在によって抑制される。その結果、偽陽性の発生が抑制されうる。なお、上記（１）〜（５）の形態のうち、上記混合物と酸化剤との接触が抗体固定化メンブレン１２０の上流で行われる（１）〜（４）の形態が好ましく、上記混合物と酸化剤との接触が標識試薬保持パッド１３０の上流で行われる（１）〜（３）の形態がより好ましい。また、より低い酸化剤濃度で偽陽性の発生を抑制しうるという観点からは、上記（１）または（４）の形態がさらに好ましく、酸化剤と試料との反応を均一に進行させることができるという観点からは、上記（１）の形態が最も好ましい。

以下、免疫学的測定用キット（イムノクロマトグラフィー用キット）の各構成要素について、詳細に説明する。

（抽出用溶液／展開液）
抽出用溶液および展開液は、上述したようにその使用形態が異なるが、同一の組成の溶液が抽出用溶液および展開液の双方として機能しうる。抽出用溶液および展開液は、緩衝剤および溶媒（通常は、水）からなる緩衝液を含む。緩衝剤としては、目的とする免疫反応に好適なｐＨに調節可能な緩衝剤が用いられる。一般に、緩衝液のｐＨは５〜１０が好ましく、この場合にはリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液などの通常使用される緩衝液が用いられうる。特に免疫反応に好適なｐＨ６〜８を与える緩衝剤としては、ＨＥＰＥＳやＰＩＰＥＳなどのグッド緩衝液が好ましい。また、抽出用溶液および展開液には、緩衝剤以外に塩化ナトリウムなどを添加してもよく、公知の添加剤をさらに添加してもよい。添加剤としては、例えば、抗原−抗体反応の促進または非特異反応の抑制を目的としたタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチンなど）、高分子化合物（例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ツイーン（登録商標）２０、トリトン（登録商標）Ｘ−１００など）、イオン性界面活性剤またはポリアニオン（例えば、デキストラン硫酸、ヘパリン、ポリスチレンスルホン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸など）またはその塩など；抗菌剤としてのアジ化ナトリウム、長鎖アルキル４級アンモニウム塩などが挙げられる。

ここで、抽出用溶液または展開液に酸化剤が含まれる場合、これらの溶液中の酸化剤濃度の下限は、好ましくは０．０５ｍＭ以上であり、より好ましくは０．１ｍＭ以上であり、さらに好ましくは１ｍＭ以上であり、最も好ましくは２．５ｍＭ以上である。ただし、酸化剤として過酸化尿素を用いる場合には、酸化剤濃度の下限は１ｍＭ以上であることが好ましく、酸化剤としての過酸化水素を生成するグルコースオキシダーゼを用いる場合には、酸化剤濃度の下限は好ましくは５ｕｎｉｔｓ／ｍＬ以上であり、より好ましくは１０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ以上である。一方、酸化剤濃度の上限は、溶液の保存安定性や免疫反応の阻害性の観点から、好ましくは１００ｍＭ以下であり、より好ましくは１０ｍＭ以下であり、さらに好ましくは４ｍＭ以下であり、最も好ましくは３ｍＭ以下である。また、グルコースオキシダーゼの上限は、好ましくは２０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ以下、より好ましくは１０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ以下である。ただし、酸化剤としてチメロサールまたは過マンガン酸カリウムを用いる場合には、免疫反応の阻害性の観点から、酸化剤濃度の上限は１０ｍＭ以下であることが好ましく、１ｍＭ以下であることがより好ましい。

（抗体固定化メンブレン）
抗体固定化メンブレン１２０の主相は、イムノクロマトグラフィーのクロマトグラフ媒体（固定相）として機能する多孔質体からなる不溶性担体である。当該抗体固定化メンブレン１２０の構成材料である多孔質体としては、例えば、ニトロセルロース膜、セルロース膜、アセチルセルロース膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布などの多孔質シートが挙げられ、特にニトロセルロース膜が好ましく用いられる。なお、滴下された試料のメンブレン１２０上での移動速度は、メンブレンの材質、大きさなどにより変えることができ、検出対象物の測定に合った速度を設定することができる。

（サンプルパッド）
サンプルパッド１４０は、試料供給部として機能するが、ろ過フィルター２００を通過した後に滴下された試料を受けるだけではなく、試料中の不溶物粒子などをろ過する機能をも兼ねることができる。サンプルパッド１４０の構成材料としては、例えば、セルロースろ紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、および綿布などの均一な特性を有する材料が挙げられる。

（標識試薬保持パッド）
標識試薬保持パッド１３０は、上述したように標識試薬を保持する標識試薬保持部として機能する。標識試薬保持パッド１３０の構成材料としては、例えば、セルロースろ紙、ガラス繊維、および不織布などが挙げられ、好ましくはガラス繊維が用いられる。

標識試薬保持パッド１３０によって保持される標識試薬は、検出対象物と特異的に結合する物質と、適当な標識体との複合体である。「検出対象物と特異的に結合する物質」としては、上述したように、検出対象物が抗体である場合には、当該抗体が特異的に認識する物質（抗原）または免疫グロブリン分子に対する抗体が用いられ、検出対象物が抗原性を有する物質である場合には、検出対象物を特異的に認識する抗検出対象物抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）が用いられる。一方、「標識体」としては、着色粒子が好ましく、例えば、金、銀、白金または銅などの金属粒子または金属コロイド；酸化鉄などの金属酸化物粒子または金属酸化物コロイド；セレン、テルル、硫黄などの非金属粒子；あるいは、染料などで着色したものを含む有色ラテックス粒子などが挙げられ、特に金コロイドが好ましい。

（テストライン）
テストライン１２２は、抗体固定化メンブレン１２０における標識試薬保持パッド１３０より下流側に位置しており、検出対象物と特異的に結合する物質が固定化試薬として配置されていることで、検出部として機能する。図１において、検出部はテストライン１２２としてライン状に形成されているが、検出部の形状はこれに限定されず、固定化試薬が局所的に配置された形状に対応して、円状、帯状などの任意の形状でありうる。ただし、検出部の形状はライン状であることが好ましく、幅０．５〜１．５ｍｍのライン状であることがより好ましい。なお、標識試薬保持パッド１３０への標識試薬の固定化や、テストライン１２２への固定化試薬（抗体など）の固定化方法は特に制限されず、従来公知の方法を用いることができる。これらの固定化方法としては、固定化すべき試薬をクロマトグラフ媒体に物理的手段または化学的手段により直接固定化する方法がある。直接固定化する方法としては物理吸着や共有結合がある。一般に、クロマトグラフ媒体がニトロセルロース膜または混合ニトロセルロースエステル膜の場合、物理吸着を行うことができる。なお、固定化した後、非特異的な吸着により分析の精度が低下することを防止するため、必要に応じて、公知の方法でブロッキング処理を行ってもよい。

（コントロールライン）
コントロールライン１２４は、抗体固定化メンブレン１２０におけるテストライン１２２より下流側に位置しており、標識試薬と特異的に結合する物質が固定化試薬として配置されている。例えば標識試薬として金コロイド標識マウスモノクローナル抗体を用いた場合には、例えば抗マウスＩｇＧ抗体を固定化しておけばコントロール部として機能する。標識試薬がコントロールライン１２４まで移動すると、コントロールライン１２４に配置された固定化試薬と反応して標識試薬が集積する。その結果、コントロールライン１２４は標識試薬の集積に起因して発色などを示すことから、テストストリップ１００上での反応が正常に進んだことが確認される。図１において、コントロール部もコントロールライン１２４としてライン状に形成されているが、コントロール部の形状はこれに限定されず、固定化試薬が局所的に配置された形状に対応して、円状、帯状などの任意の形状でありうる。ただし、コントロール部の形状はライン状であることが好ましく、幅０．５〜１．５ｍｍのライン状であることがより好ましい。

（吸収パッド）
吸収パッド１５０は、滴下された試料や展開液がクロマトグラフ媒体を移動することにより吸収されるとともに、検出部に不溶化されない未反応標識物質などを吸収除去する機能を有する部材である。吸収パッド１５０の構成材料について特に制限はなく、例えば、セルロ−スろ紙、不織布、布、またはセルロースアセテートなどの吸水性材料が用いられる。

なお、これらの部材は、毛細管現象により試料が移動できればよく、サンプルパッド、標識試薬保持パッド、テストライン、コントロールライン、および吸収パッドなどを基材に貼り付けても、単一の多孔性部材シートとしてもよい。

（ろ過フィルター）
ろ過フィルター２００は、採便容器やマイクロチューブなどに設けられ、試料を含む抽出液をろ過して、未消化の固形物（夾雑物）を除去するために用いられる。ろ過フィルターを用いることで、検査の妨げとなる固形分（夾雑物）をろ過により除去することができる。なお、ろ過フィルターの構成材料は、検出対象物に対して不活性のものであれば特に限定されず、例えば、モルトフィルター、ろ紙、樹脂焼結フィルターなどの多孔性物質、ガラス繊維、脱脂綿などの繊維性物質などが挙げられ、所定の細孔径を有するモルトフィルター、樹脂焼結フィルターを用いることが好ましい。

試料と接触する部位、例えばろ過フィルターや試料供給部、標識試薬保持部などの各部材に酸化剤を保持させる方法としては、公知の方法であればよく、例えば、ろ過フィルターや試料供給部、標識試薬保持部などの作製時に用いられる溶液や緩衝液、洗浄液などに酸化剤を含ませて各部材に塗布、滴下、含浸または噴霧などした後、これを凍結乾燥や風乾などにより乾燥して保持させる方法などが挙げられる。

各部材が酸化剤を保持する場合、１試験あたり試料が接触する酸化剤の量（含浸量）の下限は、好ましくは０．１ｎｍｏｌ／ｔｅｓｔ以上であり、より好ましくは０．５ｎｍｏｌ／ｔｅｓｔ以上である。特にサンプルパッドまたはろ過フィルターが酸化剤を保持する場合、含浸量の下限は、好ましくは０．５ｎｍｏｌ／ｔｅｓｔ以上であり、より好ましくは１．０ｎｍｏｌ／ｔｅｓｔ以上であり、特に好ましくは２．０ｎｍｏｌ／ｔｅｓｔ以上である。酸化剤をパッド類に含浸させることにより、パッド類の酸化剤量を、測定に必要とされる量の試料と反応できる量にすればよく、酸化剤の使用量を効率良く抑えることができる。

以下、実施例を用いて本発明の好ましい実施形態を説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１：各種酸化剤の添加による非特異反応の抑制］
図１に示す構造を有するノロウイルス検出用のイムノクロマトグラフィー用キットであるイムノキャッチ（登録商標）−ノロ（栄研化学株式会社製）を用いて、酸化剤の使用による本発明の効果（非特異反応の抑制）を確認した。なお、イムノキャッチ（登録商標）−ノロのテストストリップは、ニトロセルロース膜からなる抗体固定化メンブレン１２０上に標識試薬保持パッド１３０が配置された構成を有しており、標識試薬保持パッド１３０には、抗ノロウイルスＧＩマウスモノクローナル抗体結合金コロイド液、および抗ノロウイルスＧＩＩマウスモノクローナル抗体結合金コロイド液が含浸されている。また、検出部であるテストライン１２２には、固定化抗体として抗ノロウイルスＧＩマウスモノクローナル抗体、および抗ノロウイルスＧＩＩマウスモノクローナル抗体が固定化されている。さらに、コントロール部であるコントロールライン１２４には、抗マウスＩｇＧウサギ抗体が固定化されている。また、イムノキャッチ（登録商標）−ノロの抽出用溶液は、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ７．０）からなっており、アジ化ナトリウムを含有している。これにより、イムノキャッチ（登録商標）−ノロの最小検出感度は、ノロウイルスＧＩに対して２．５ｎｇ／ｍＬ、ノロウイルスＧＩＩに対して０．２５ｎｇ／ｍＬとなっている。

本実施例では、まず、イムノキャッチ（登録商標）−ノロに付属の抽出用溶液に、下記の表１に示す種類・濃度の酸化剤を添加し（実施例）、または添加せずに（比較例）、抽出用溶液を準備した。

上記で準備した抽出用溶液（１ｍＬ）のそれぞれに、ヒトから採取した糞便試料（２０〜５０ｍｇ）を添加し、撹拌して、懸濁させた。ここで、糞便試料としては、検出対象物であるノロウイルスの存在をＲＴ−ＰＣＲ法により確認済みの陽性検体、ノロウイルスの不存在を確認済みの偽陽性検体および陰性検体の３種を用いた。

次いで、この懸濁させた試料をイムノキャッチ（登録商標）−ノロに付属のろ過フィルターでろ過した後、サンプルウェル（試料供給部）へ３滴（９０〜１３５μＬ）滴下した。滴下後、室温で１５分間静置した後、検出部のラインを確認した。具体的には、イムノクロマトリーダーＣ１００６６−１０（浜松ホトニクス株式会社製）を用いて、テストラインの反射光強度を測定した。結果を下記の表１に示す。なお、表１に記載の数値［％］は発色率（下記数式により算出される）を示しており、酸化剤を添加していない試料（偽陽性検体または陽性検体）の反射光強度を１００とした場合の相対値である。一方、表１に記載の「−」は、陰性（テストラインが着色しなかったこと）を示す。なお、酸化剤を添加していない偽陽性検体の反射光強度は４８．０ｍＡｂｓであり、陽性検体の反射光強度は３３５．７ｍＡｂｓであった。また、酸化剤を添加した（またはしていない）抽出用溶液についても同様に測定を行ったが、いずれの抽出用溶液についても反射光は検出されなかった。

発色率［％］＝（各試料の検出部における反射光強度（ｍＡｂｓ）／酸化剤無添加での検出部における反射光強度（ｍＡｂｓ））×１００
また、本実施例で用いた酸化剤のいくつかについて、酸化還元電位の値を下記の表１に示す。ここで、酸化剤の酸化還元電位の測定は以下の方法により行った。

酸化還元電位の測定方法：酸化剤を精製水に溶解し、１０ｍＭの溶液を１０ｍＬ調製する。得られた溶液について、３．３３ｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ−Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を用いて酸化還元電位を測定した。

表１に示す結果から、各種の酸化剤を抽出用溶液に添加し、検出部の上流において糞便試料を酸化剤と接触させることで、偽陽性の発生を有意に抑制できたことがわかる。これは、糞便試料に含まれる何らかの成分に起因する非特異反応が抑制されたことによるものと考えられる。一方、陽性検体に対する発色率は、酸化剤の添加によっても大きく低下することはなかったことから、迅速な検査および診断に資するという免疫学的測定法の利点を損なうことはないことも確認された。

また、非特異反応の進行とこれに伴う偽陽性の発生を酸化剤の添加により抑制する効果は、酸化剤の濃度依存的に発現することも判明した。多くの酸化剤では０．１ｍＭ程度の極めて低濃度の添加でも上述した効果を発現することができる。一方、酸化剤の種類によっては（例えば、チメロサール、過マンガン酸カリウム）、添加濃度が大きくなるにつれて陽性検体の発色率が低下してしまい、いわゆる「偽陰性」が生じやすくなることから、酸化剤の添加濃度は多くても数ｍＭ程度にとどめることで、偽陽性および偽陰性の発生をともに防止することができることも判明した。

［実施例２：酸化剤としての各種ヨウ素酸塩の添加による非特異反応の抑制］
酸化剤として、各種のヨウ素酸塩を用いたこと以外は、上述した実施例１と同様の手法により、酸化剤の添加による偽陽性の発生の抑制効果を確認した。結果を下記の表２に示す。なお、本実施例で用いた酸化剤のいくつかについて、酸化還元電位の値を下記の表２に示す（酸化還元電位の測定方法は上記と同様である）。

表２に示すように、各種のヨウ素酸塩を酸化剤として添加した場合についても、表１に示すのと同様の結果が得られた。このことから、非特異反応の発生とこれに伴う偽陽性の発生を抑制するという本発明の効果は、各種のヨウ素酸塩を酸化剤として用いた場合にも同様に奏されることが確認された。

［実施例３：テストストリップの各部位またはろ過フィルターへの酸化剤の添加による非特異反応の抑制］
上述した実施例１および実施例２では、試料の抽出用溶液に酸化剤を添加したが、本実施例では、抽出用溶液ではなくテストストリップの構成要素の一部またはろ過フィルターに酸化剤（ヨウ素酸カリウム）を含ませることで、上記と同様の効果（非特異反応の抑制）が奏されるかどうかを確認した。

（標識試薬保持パッドへの酸化剤の添加効果の確認）
抗ＮＶ−ＧＩマウス抗体結合金コロイド液および抗ＮＶ−ＧＩＩマウス抗体結合金コロイド液に、ヨウ素酸カリウムを添加し、得られた溶液を標識試薬保持パッド（ガラス繊維ろ紙）に含浸させ、乾燥させて、下記の表３に示す各含浸量の酸化剤を含む本実施例の標識試薬保持パッドを得た。なお、得られた標識試薬保持パッドにおける標識試薬の担持濃度はイムノキャッチ（登録商標）−ノロにおけるのと同様であった。このようにして得られた標識試薬保持パッドを用い、抽出用溶液に酸化剤を添加しなかったこと以外は、上述した実施例１および実施例２と同様の手法により、各検体における反射光強度を測定し、発色率を算出した。結果を下記の表３に示す。

（サンプルパッドへの酸化剤の添加効果の確認）
精製水に、ヨウ素酸カリウムを添加し、得られた溶液をサンプルパッド（セルロース膜）に含浸させ、乾燥させて、下記の表３に示す各含浸量の酸化剤を含む本実施例のサンプルパッドを得た。このようにして得られたサンプルパッドを用い、抽出用溶液に酸化剤を添加しなかったこと以外は、上述した実施例１および実施例２と同様の手法により、各検体における反射光強度を測定し、発色率を算出した。結果を下記の表３に示す。

（ろ過フィルターへの酸化剤の添加効果の確認）
精製水に、ヨウ素酸カリウムを添加し、得られた溶液をセルロース膜に含浸させ、乾燥させ、下記の表３に示す各含浸量の酸化剤を含む酸化剤含有セルロース膜を得た。得られた酸化剤含有セルロース膜を、イムノキャッチ（登録商標）−ノロの検体抽出容器に付属のろ過フィルターに重ねて抽出液のろ過を行い、抽出用溶液に酸化剤を添加しなかったこと以外は、上述した実施例１および実施例２と同様の手法により、各検体における反射光強度を測定し、発色率を算出した。結果を下記の表３に示す。なお、下記の表３に示す含浸量は、それぞれの部材が含有するヨウ素酸カリウム量であって、１テストあたりの試料と反応する量である。

表３に示すように、本発明に係る酸化剤の添加による非特異反応の抑制とこれに伴う偽陽性の発生の抑制効果は、酸化剤を抽出用溶液ではなくテストストリップの各構成要素またはろ過フィルターに含ませた場合であっても同様に奏されることが確認された。

本出願は、２０１５年８月２８日に出願された日本特許出願番号２０１５−１６９７４２号に基づいており、その開示内容は、参照により全体として組み入れられている。

１０ イムノクロマトグラフィー用キット、
１００ テストストリップ、
１１０ プラスチック製粘着シート、
１２０ 抗体固定化メンブレン（クロマトグラフ媒体）、
１２２ テストライン（検出部）、
１２４ コントロールライン（コントロール部）、
１３０ 標識試薬保持パッド（標識試薬保持部）、
１４０ サンプルパッド（試料供給部）、
１５０ 吸収パッド、
２００ ろ過フィルター、
３００ 抽出用溶液または展開液。

Claims (18)

1. 糞便試料を用いた免疫学的測定法に用いられる試薬組成物であって、酸化剤を含む、試薬組成物。
2. 前記酸化剤が、ハロゲンオキソ酸塩、遷移金属錯体の塩、過酸化物、有機水銀化合物、過マンガン酸塩、クロム酸塩、オキシダーゼ、亜硝酸塩、および超酸化物からなる群から選択される１種または２種以上である、請求項１に記載の試薬組成物。
3. 前記酸化剤が、ヨウ素酸塩、過ヨウ素酸塩、フェリシアン化塩、過酸化尿素、過酸化水素、チメロサール、過マンガン酸塩、およびグルコースオキシダーゼからなる群から選択される１種または２種以上である、請求項１または２に記載の試薬組成物。
4. 前記酸化剤が、ヨウ素酸カリウム、過ヨウ素酸カリウムおよびフェリシアン化カリウムからなる群から選択される１種または２種以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の試薬組成物。
5. 前記免疫学的測定法が、イムノクロマトグラフィー法である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の試薬組成物。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の試薬組成物を含む、糞便試料の抽出用溶液または展開液。
7. 前記酸化剤の濃度が０．０５〜１００ｍＭである、請求項６に記載の抽出用溶液または展開液。
8. 試料供給部と、
   前記試料供給部の下流側に位置するクロマトグラフ媒体と、
   前記クロマトグラフ媒体の一部に位置する、標識試薬が溶出可能に保持された標識試薬保持部と、
   前記クロマトグラフ媒体の一部であって前記標識試薬保持部より下流側に位置する、固定化抗体を含む検出部と、
   を有するテストストリップであって、請求項１〜５のいずれか１項に記載の試薬組成物を含む、テストストリップ。
9. 前記試薬組成物が、前記試料供給部から前記クロマトグラフ媒体における前記検出部の上流までのいずれかの部位に含まれている、請求項８に記載のテストストリップ。
10. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の試薬組成物を含む、糞便試料をろ過するためのろ過フィルター。
11. 請求項６または７に記載の抽出用溶液または展開液、請求項８または９に記載のテストストリップ、および請求項１０に記載のろ過フィルターの少なくとも１つを含む、糞便試料中の検出対象物を検出または定量するための免疫学的測定法に用いられる免疫学的測定用キット。
12. 試料供給部と、
    前記試料供給部の下流側に位置するクロマトグラフ媒体と、
    前記クロマトグラフ媒体の一部に位置する、標識試薬が溶出可能に保持された標識試薬保持部と、
    前記クロマトグラフ媒体の一部であって前記標識試薬保持部より下流側に位置する、固定化抗体を含む検出部と、
    を有するテストストリップを用いて、免疫学的測定法により糞便試料中の検出対象物を検出または定量する方法であって、
    請求項１〜５のいずれか１項に記載の試薬組成物を用いる、方法。
13. 前記試料またはそのろ過処理物と抽出用溶液または展開液との混合物を前記試料供給部に供給する工程と、
    前記検出対象物と前記標識試薬との複合体を前記検出部において検出する工程と、
    を含み、
    前記検出部の上流において、前記混合物を前記酸化剤と接触させる工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記混合物を前記酸化剤と接触させる工程は、前記標識試薬保持部の上流において行われる、請求項１３に記載の方法。
15. 前記抽出用溶液または前記展開液が前記酸化剤を含み、前記混合物を前記酸化剤と接触させる工程は前記試料と前記抽出用溶液または前記展開液との混合時に行われる、請求項１３または１４に記載の方法。
16. 前記抽出用溶液または前記展開液における前記酸化剤の濃度が０．０５〜１００ｍＭである、請求項１５に記載の方法。
17. 前記検出対象物が、ウイルス、細菌または便潜血である、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の試薬組成物と、糞便試料とを接触させる工程を含む、免疫学的測定法における非特異反応の抑制方法。