具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例
一.实验材料
1.分泌抗谷胱甘肽-硫-转移酶(GST)单克隆抗体的杂交瘤细胞株:由北京市农林科学院畜牧兽医研究所高技术实验室研制并保存,可对外发售。该细胞系经多次传代、冻存、复苏,杂交瘤细胞分泌抗体稳定,细胞生长旺盛,形态良好。细胞生长状态。(如图2)本发明所用抗GST单抗是自己制备的,本产品可从市场上购买。
2.含AIV HA1基因工程重组表达菌:禽流感病毒A/goose/Guangdong/96(H5N1)的血凝素主要抗原部分HA1克基因隆到表达质粒pGEX-5x-1构建重组质粒(周雪媚,霍惠玲,张飚,李永清,王连群.禽流感病毒HA1基因的克隆及原核表达[J].动物医学进展,2006,27(1):66~69.),然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。由北京市农林科学院畜牧兽医研究所高技术实验室研制并保存,可对外发售。
3.ELISA检测用试剂及溶液
(1)辣根过氧化物酶羊抗鼠IgG Sigma公司
(2)辣根过氧化物酶标记羊抗鸡IgG Sigma公司
(3)包被液(碳酸盐缓冲液):Na2CO3 1.59g,NaHCO3 2.93g,加蒸馏水定容至1000mL,调pH值到9.6。
(4)磷酸盐缓冲液(0.01M PBS):NaCl 8.00g,KCl 0.2g,KH2PO4 0.2g,Na2HPO4·12H2O2.9g,加蒸馏水定容至1000mL,调pH值到7.4。
(5)封闭液:5g脱脂牛奶用磷酸盐缓冲液溶解,定容至100mL。
(6)洗涤液:含有0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液。
(7)稀释液:0.01M,pH 7.4磷酸盐缓冲液。
(8)底物缓冲液:
0.2mol/LNa2HPO4:取Na2HPO4·12H2O 14.33g加蒸馏水150m,完全溶解后,定容至200mL。
0.1mol/L柠檬酸:取柠檬酸3.84g,加蒸馏水150mL,完全溶解后,定容至200mL。
(9)底物显色液:
0.2mol/L Na2HPO4 2.57mL
0.1mol/L柠檬酸 2.43mL
蒸馏水 5mL
邻苯二胺(OPD) 4mg
30%H2O2 1μL
(10)终止液(2M H2SO4):22.2mL浓硫酸缓慢加入177.8mL蒸馏水中。
4.血清:SPF鸡血清、火鸡H5亚型阳性血清、传染性法氏囊阳性血清、传染性支气管炎阳性血清、鼻炎阳性血清、大肠杆菌阳性血清、新城疫阳性血清、禽流感H9亚型阳性血清、禽流感H5亚型阳性血清及CAV阳性血清,由北京市农林科学院畜牧兽医研究所高技术实验室保存。
二.实验方法
1.抗GST单克隆抗体的制备
采用小鼠体内诱生法,取健康Balb/C雄性小鼠,腹腔注射灭菌石蜡油0.5ml/只,10-15天后使用。将细胞瓶中培养的阳性杂交瘤细胞吹下来,1000rpm离心10min弃上清液,收集细胞沉淀。用DMEM基础培养液将细胞沉淀悬浮,混匀,将细胞数调至106/mL,每只小鼠腹腔注射0.5ml。密切观察动物的健康状况与腹水征象,接种细胞7~10天后产生腹水,待腹水尽可能多,而小鼠濒于死亡之前,处死小鼠,用滴管将腹水收集到离心管中,10,000r/min离心10min,弃去上层的脂肪,石蜡油和下层的沉淀,小心抽去中层的淡黄色清凉液体,-20℃冷冻保存。
单克隆抗体效价和抗体亚类的测定。
经间接ELISA测定,腹水效价可达1∶819200,细胞上清为(1∶3200)。见表1。
表1 杂交瘤细胞上清和腹水中抗GST单克隆抗体的ELISA效价
用Sigma公司抗体亚类鉴定试剂(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA),经间接ELISA检测,4株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体分别属于IgG1和IgG2a。见表2。
表2 不同杂交瘤细胞分泌抗GST单克隆抗体的亚类
2.抗GST单克隆抗体的纯化
辛酸-硫酸铵盐析法,辛酸在偏酸条件下能将血清中IgG外的蛋白质都沉淀下来,上清中只有IgG,具体方法如下:
(1)将腹水离心,取中间层,向一份腹水中加入两份0.06mol/L、pH5.0的乙酸缓冲液,用0.1mol/L的HCL调pH至4.5。
(2)于室温下搅拌在30min内逐滴加入辛酸,按每毫升稀释前的腹水加33μL,4℃静置2h,15000r/min离心30min,弃沉淀。
(3)上清经砂芯漏斗过滤,加入1/10体积的pH7.4、0.1mol/LPBS、8.5%NaCl(用1mol/L的NaOH调pH至7.4。
(4)在4℃冰浴下30min内加入0.277g/ml的硫酸铵,使成45%的饱和度,静置1h以上。
4℃下12000r/min离心30min,弃上清。
(5)沉淀溶于适量含137mmol/LNaCL、2.6mmol/LKCL、0.2mmol/L EDTA的PBS(pH7.4)中,对50-100倍的上述PBS于4℃透析过夜。
(6)4℃12000r/min离心30min,除去不溶性沉淀,上清分装冻存。(如图3)
结果表明:采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体,经12%的SDS-PAGE分析表明所获得的单克隆抗体纯度很高。
利用SDS-PAGE电泳测定单克隆抗体的分子量。根据分子量与迁移率的线形关系,计算出单克隆抗体的轻链分子量为22KD,重链分子量为53KD,单克隆抗体分子量为150KD。
3.抗GST单克隆抗体浓度的测定
利用分光光度计测量纯化后的单克隆抗体浓度,记录在260nm和280nm的吸光值,计算蛋白浓度。按下面公式进行计算:蛋白质浓度(mg/mL)=1.45×OD280nm-0.74×OD260nm
结果见表3。
表3 不同杂交瘤细胞分泌抗GST单克隆抗体的浓度
4.GST-HA1融合蛋白的制备与鉴定
挑取含阳性重组表达质粒的重组菌的单菌落,接种于5mL Amp/LB培养基中,37℃活化过夜后,1∶100稀释到Amp/LB中,37℃、200r/min振摇培养至对数生长期(OD6000.6~1),加入终浓度为1mmol/L的IPTG,于37℃、200r/min振摇诱导培养6-8h。10000r/min离心10min收集菌体。
将菌体沉淀重悬于裂解缓冲液中,超声破菌(超声30s,间歇30s,总共超声5min)。超声波裂解后12000r/min离心10min,上清即为可溶组分,沉淀为包涵体。弃上清后加入2×SDS上样缓冲液,煮沸10min,用12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检查。(如图5)
结果表明:菌体裂解产物中,在62ku处有一明显条带,与理论值相符。
将诱导表达的融合蛋白GST-HA1和纯化的GST蛋白做10倍稀释后做SDS-PAGE电泳,电泳后将其转印在PVDF膜上,封闭后加入H5亚型禽流感阳性血清,充分反应后加入酶标二抗,底物DAB显色,进行Western-Blot分析。(如图6)结果表明融合蛋白能与血清中抗体特异性结合,而GST蛋白不与血清中抗体反应。
5.抗GST单克隆抗体特异性鉴定
Western-Blot检测:将空载体诱导表达的GST蛋白及未纯化的融合蛋白GST-HA1经SDS-PAGE电泳分离后进行电转印至NC膜。转印条件为15V下转印40min。
将经转印的NC膜转移至封闭液中,室温轻摇3h后,4℃封闭过夜;倾去封闭液,用洗涤液PBS-T洗膜一次(5min);加入适当稀释度的一抗溶液(以封闭液1∶100稀释的SPF鸡阳性血清)中,室温下振荡1.5h;PBS-T洗膜3次,每次10min;转入适当稀释度二抗溶液(以封闭液1∶2000稀释的HRP-羊抗鸡心G酶标二抗)中,室温振荡1.5h;PBS-T洗膜3次,每次10min;置于底物溶液,显色3-5min至条带清晰后迅速用蒸馏水终止。(如图4)结果表明抗GST单抗与GST(26KD)及GST-HA1(62KD)能特异性反应。
6.抗GST单克隆抗体和抗原包被浓度的确定
用方阵滴定法确定最适工作浓度。将抗GST单克隆抗体以包被缓冲液从1∶10开始作倍比稀释,到1∶1280为止,每孔加100μl,37℃温育2h,4℃过夜。抗原用脱脂奶从1∶100开始倍比稀释,到1∶51200为止,每孔100μL,37℃温育1h,PBST洗板3次。加入1∶100稀释的AIV(H5N1亚型)阳性血清(血凝抑制效价HI=25),同时设立SPF鸡血清为阴性对照。酶标板37℃温育1h,PBST洗板3次,然后加入羊抗鸡酶标IgG作为二抗,37℃温育1h,PBST洗板3次,以OPD显色,最后加入终止液50uL/孔。酶标仪测490nm处OD值。由此初步确定aGST-ELISA工作条件。见表4。
表4 aGST-ELISA的单抗和抗原的工作浓度
最后确定,本发明双夹心ELISA方法,纯化的抗GST单克隆抗体的最适稀释度为160倍稀释,融合蛋白GST-HA1的稀释度为3000倍稀释。
7.aGST-ELISA在检测血清样品中的应用
采用双夹心ELISA方法。具体操作步骤如下:
(1)包被单抗最适工作浓度100μL/孔,37℃温育2h,4℃过夜,倒出孔内液体,加入200μl/孔PBST洗涤,每次3min,拍干,重复洗涤3次。
(2)加封闭液100μL/孔,37℃温育1h,倒出孔内液体,洗涤3次。
(3)加入最适浓度的抗原,100μL/孔,37℃温育1h,倒出孔内液体,加入200μl/孔PBST洗涤,每次3min,拍干,重复洗涤3次。
(4)待测血清样品倍比稀释,100μL/孔,设2个加阴性血清孔为阴性对照,37℃温育1h,倒出孔内液体,加入200μL/孔PBST洗涤,每次3min,拍干,重复洗涤3次。
(5)加入抗鸡特异性抗体的酶标二抗,100μl/孔,37℃温育1h,倒出孔内液体,加入200μL/孔PBST洗涤,每次3min,拍干,重复洗涤3次。
(6)加人新鲜配制的底物溶液,100μL/孔,避光静置15min。
(7)加入终止液50μL/孔。酶标仪测490nm处OD值。
血清效价定义为OD值大于或者等于阴性对照OD值2倍时的最高血清稀释倍数。
融合蛋白与其他血清的交叉反应。
注:本试验所用血清包括:传染性法氏囊阳性血清、传染性支气管炎阳性血清、鼻炎阳性血清、大肠杆菌阳性血清、新城疫阳性血清、禽流感H9亚型阳性血清、CAV阳性血清、禽流感H5亚型阳性血清(血凝抑制效价HI=23-29)及阴性对照血清。所有血清均以100倍稀释,并作两个重复,加二抗后,OPD显色,读数。见表5。
表5 aGST-ELISA的特异性
aGST-ELISA检测结果显示,传染性法氏囊阳性血清、传染性支气管炎阳性血清、鼻炎阳性血清、大肠杆菌阳性血清、新城疫阳性血清、禽流感H9亚型阳性血清及鸡传染性贫血阳性血清为阴性(P/N<2.1),只有禽流感H5亚型阳性血清孔为强阳性P/N≈7.5。
共对21份人工攻毒(H5N1亚型的AIV)火鸡血清样品进行检测,aGST-ELISA共检出阳性21例,阳性检出率为100%,HI检出20例,检出率为95%,且aGST-ELISA检出阳性结果和HI法阳性结果符合率为100%。由此可见,aGST-ELISA具有比HI更高的敏感性。
表6 火鸡血样检测结果
注:所有血清样品先进行了1×100稀释
另外,随机取2份火鸡血样,每份样品100倍稀释,然后分别测6孔,最后计算出批内变异系数。见表6
表7 aGST-ELISA检测禽流感血清样品的稳定性
对随机取的2个样品,在一个板内分别测6孔,根据读数结果计算板内变异系数分别为0.03和0.04,表明aGST-ELISA有很好的稳定性。
结论:本发明建立了“GST单抗-GST-HA1融合蛋白抗原-鸡抗HA抗体-HRP羊抗鸡二抗”的双夹心结构ELISA检测H5亚型AI血清抗体的方法,该结构的特点是在酶联板上利用GST单抗特异性地捕获GST-HA1融合蛋白抗原达到纯化的目的,不仅提高了包被抗原的纯度,而且消除常规方法对抗原结构的影响,这样不仅提高了抗原抗体反应的特异性,减少了假阳性结果,而且加强了抗原与血清抗体结合的能力。该方法对H5亚型AI阳性血清有高度的特异性,而与其他禽类常见疾病阳性血清无反应,在诊断过程中不会出现假阳性的结果。使用双夹心ELISA和HI两种方法对21份火鸡血清进行检测,结果表明双夹心ELISA法在检测血清抗体方面比HI具有更高的灵敏度,为成功检测鸡体内AI血清抗体奠定了基础。