CN116390749A - 使用嵌合cd40配体和冠状病毒疫苗增强免疫力 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了通过施用冠状病毒疫苗和嵌合CD40L多肽来增强免疫力的方法和组合物。冠状病毒疫苗可包含灭活的冠状病毒颗粒或抗原多肽、优选冠状病毒刺突蛋白。冠状病毒抗原多肽可以是纯化的抗原多肽或编码抗原多肽的核酸表达构建体。本发明的组合物中的嵌合CD40L多肽可以是纯化的嵌合CD40L多肽或编码嵌合CD40L多肽的核酸表达构建体。

Description

使用嵌合CD40配体和冠状病毒疫苗增强免疫力
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年9月11日提交的第63/077,204号临时申请的权益，其通过引用并入本文。
发明背景
1.发明领域
本发明总体上涉及疫苗和疫苗佐剂以及增强针对感染因子的免疫力的方法。特别地，本发明涉及嵌合CD40配体(CD40L)作为疫苗佐剂、特别是关于冠状病毒疫苗的佐剂的用途。
2.相关技术描述
身体使用固有免疫系统和适应性免疫系统抵御传染性病原体和微生物。固有免疫系统通常通过关键效应细胞(如中性粒细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞)作为第一道防线发挥作用，这通过它们对病原体上发现的通常不存在于哺乳动物细胞上的特征结构的识别和应答来进行。这些致病结构作为信号起作用，称为损伤相关分子模式(DAMP)和病原体相关分子模式(PAMP)。通过适应性免疫系统的第二道防线主要由B细胞和T细胞介导，B细胞和T细胞分别构成体液免疫和细胞介导的免疫。适应性免疫系统可以进化为特异性靶向和消除特定病原体，并在病原体再次攻击或进攻时提供长期监视和应答。
疫苗是一种可以刺激人的免疫系统产生对特定疾病的免疫力，从而保护人免受该疾病侵害的产品。可以向人或动物施用刺激其免疫系统产生针对病原体上存在的一种或多种抗原的体液(抗体)免疫应答和/或细胞(T细胞)免疫应答以试图防止由病原体感染引起的疾病的疫苗。这会启动免疫系统，以便将来当身体暴露于病原体时，适应性免疫系统的记忆细胞会识别该病原体，并且身体消除病原体的应答会更强。典型的疫苗由灭活或减毒的病毒颗粒、抗原多肽或编码抗原性多肽的遗传构建体组成。最近疫苗开发的一个特定领域与冠状病毒有关，包括例如SARS-CoV-1和SARs-CoV-2。
许多疫苗在引发免疫应答方面表现出希望，但应答不足以完全预防这种疾病。为此，一些疫苗与佐剂结合使用。佐剂可以与疫苗共同施用以在接受疫苗的人或动物中产生更强的免疫应答。
背景技术中讨论的所有主题不一定是现有技术，并且不应仅仅因为在背景部分中对其进行讨论而被假定为现有技术。按照这些原则，对背景技术中讨论的或与此类主题相关的现有技术中的问题的任何认识不应被视为现有技术，除非明确声明为现有技术。相反，背景技术中对任何主题的讨论应被视为发明人解决特定问题的方法的一部分，其本身也可以具有创造性。
发明内容
以下呈现本公开的简化概要以便提供对本公开的某些方面的基本理解。该概要不是本公开的详尽概述。它不旨在鉴别本公开的关键或重要要素或描绘本公开的范围。它的唯一目的是以简化的形式呈现一些构思，作为随后讨论的更详细描述的序言。
本公开通过提供通过施用冠状病毒疫苗和嵌合CD40L多肽来增强免疫力的方法和组合物，从而克服了与当前技术相关的几个主要问题。嵌合CD40L多肽可作为多肽提供或通过施用可表达嵌合CD40L的表达构建体来提供。具体而言，预期用于嵌合CD40L多肽的表达构建体可以是病毒载体，例如包括与嵌合CD40L的蛋白质编码序列和转录终止序列可操作地连接的真核转录启动子的腺病毒构建体。如下所述，嵌合CD40L在与冠状病毒疫苗一起施用时充当增强对冠状病毒的免疫力的佐剂。本发明预期，针对冠状病毒的疫苗可包含灭活的冠状病毒颗粒或抗原多肽，优选冠状病毒刺突蛋白。此外，本发明预期，冠状病毒疫苗可包含通过表达构建体施用的冠状病毒抗原，该表达构建体可以是病毒载体，例如，包括与冠状病毒抗原(优选冠状病毒刺突蛋白)的蛋白质编码序列和转录终止序列可操作地连接的真核转录启动子的腺病毒构建体。在某些实施方式中，嵌合CD40L多肽和冠状病毒抗原由同一表达构建体表达。
嵌合CD40L多肽包括至少一个来自两个不同物种的亚结构域。在某些实施方式中，嵌合CD40L多肽包括来自人CD40L和鼠CD40L两者的结构域和/或亚结构域。例如，嵌合CD40L多肽选自由ISF30、ISF31、ISF32、ISF33、ISF34、ISF35、ISF36、ISF37、ISF38、ISF39、ISF40和ISF41组成的组。特别地，嵌合CD40L多肽是ISF35。
在进一步的方面，嵌合CD40L多肽和/或冠状病毒抗原通过如下方式施用至受试者：在支持表达所述嵌合CD40L多肽和冠状病毒抗原(如适用时)的条件下，提供在表达载体中并且在在真核细胞中具有活性的启动子的控制下的嵌合CD40L多肽和/或冠状病毒抗原的编码区。在一些方面，表达盒在病毒载体中。例如，病毒载体是腺病毒载体、逆转录病毒载体、冠状病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体、腺相关病毒载体或多瘤病毒载体。特别地，病毒载体是腺病毒载体。
下文的描述中阐述了一种或多种实施方式的细节。结合一种示例性实施方式示出或描述的特征可以与其他实施方式的特征组合。因此，如果需要，可以修改各种实施方式中的任何实施方式以采用如本文所认定的各种专利、申请和出版物的构思来提供更多的实施方式。其他特征、目的和优点将从描述、附图和权利要求中显而易见。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分并且被包括以进一步展示本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文呈现的特定实施方式的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1显示了编码嵌合CD40L多肽的腺病毒表达构建体的图。
图2显示了编码嵌合CD40L多肽和冠状病毒抗原的腺病毒表达构建体的图。
图3显示了通过ELISPOT IFNγ分泌测量的冠状病毒刺突蛋白抗原特异性T细胞的数量。
图4显示了通过ELISA测量的冠状病毒刺突蛋白特异性抗体(IgG)体液免疫应答。
序列的简要描述
SEQ ID NO：1至12是编码嵌合人/小鼠CD40L的核酸序列(由这些序列编码的嵌合人/小鼠CD40L分别称为ISF30、ISF31、ISF32、ISF33、ISF34、ISF35、ISF36、ISF37、ISF38、ISF39、ISF40和ISF41)。
SEQ ID NO：13至24是嵌合CD40L氨基酸序列的示例(分别是ISF30、ISF31、ISF32、ISF33、ISF34、ISF35、ISF36、ISF37、ISF38、ISF39、ISF40和ISF41)。
SEQ ID NO 25是编码SARS-CoV-1的冠状病毒刺突蛋白的核酸序列。
SEQ ID NO 26是SARS-CoV-1的冠状病毒刺突蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO 27是编码SARS-CoV-2的冠状病毒刺突蛋白的核酸序列。
SEQ ID NO 28是SARS-CoV-2的冠状病毒刺突蛋白的氨基酸序列。
具体实施方式
下文描述了本公开的各种说明性实施方式。为了清楚起见，本说明书中的示例性实施方式没有描述实际实施的所有特征。当然可以理解，在任何此类实际实施方式的开发中，必须做出许多实现特异性的决策才能实现开发人员的特定目标，例如遵守与系统相关和与业务相关的约束，这些决策的实施彼此不同。此外，应当理解，这样的开发工作可能很复杂，但对于受益于本公开的本领域普通技术人员来说仍然是常规操作。
本公开通过提供由提供至少一种冠状病毒疫苗与嵌合CD40L多肽或编码嵌合CD40L多肽的核酸的组合来增强免疫细胞功能的方法和组合物，从而克服了与当前技术相关的几个主要问题。
在本公开的方法的某些实施方式中，嵌合CD40L多肽包含非人CD40L切割位点和结合人CD40受体的人CD40L的细胞外亚结构域。例如，包含切割位点的人CD40L的细胞外亚结构域被非人CD40L(例如鼠CD40L)的细胞外亚结构域替代。在具体实施方式中，嵌合CD40L多肽是ISF35。在一种方法中，嵌合CD40L多肽在编码多肽的表达盒(例如腺病毒载体)中(特别是在在真核细胞中有活性的启动子的控制下)递送。在其他方法中，嵌合CD40L多肽和冠状病毒抗原(例如冠状病毒刺突蛋白)均在编码多肽的表达盒(例如腺病毒载体)中(特别是在一个或多个在真核细胞中具有活性的启动子的控制下)递送。
A.定义
如本说明书中所使用的，“一种/一个(a)”或“一种/一个(an)”可以表示一个/种或多个/种。如权利要求中所使用的，当与单词“包含”结合使用时，单词“一种/一个(a)”或“一种/一个(an)”可以表示一个/种或多个/种。
在整个本申请中，术语“约”用于指示值包括由于装置、所采用的确定该值的方法或存在于研究对象中的变化导致的误差的固有变化。
本文中的术语“抗体”以最广泛的意义使用，具体包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所希望的生物学活性。
如本文所用，“载剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、溶媒、包衣料、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载剂溶液、悬浮液、胶体等。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。除非任何常规介质或药剂与活性成分不相容，否则其在治疗组合物中的用途是被预期的。补充活性成分也可以掺入组合物中。
如本文所使用的，术语“CD40配体”、“CD40L”和“CD154”在本文中可互换使用。例如，编码嵌合CD40配体的腺病毒构建体可称为ad-CD40L。
术语“嵌合”被定义为具有来自至少两个不同物种的序列。
术语“嵌合CD40L”或“嵌合ISF构建体”是指包括来自一个物种的CD40L的至少一个结构域或亚结构域和来自不同物种的CD40L的至少一个结构域或亚结构域的配体。在某些实施方式中，嵌合CD40L所源自的至少两个物种是人和鼠CD40L。
如本文所用，术语“切割位点”是指被蛋白酶识别的氨基酸序列，该蛋白酶通常是基质金属蛋白酶(MMP)，其从表达细胞的表面切割CD40L。CD40L的切割位点通常见于CD40L的结构域III和IV的边界处或附近。例如，一个这样的切割位点包含大约在人CD40L的氨基酸108至116之间的区域。
术语“控制元件”统指启动子区域、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节结构域、复制起点、内部核糖体进入位点(IRES)、增强子、剪接点等，它们共同提供受体细胞中编码序列的复制、转录、转录后加工和翻译。并非所有这些控制元件都需要存在，只要选定的编码序列能够在适当的宿主细胞中复制、转录和翻译即可。
术语“冠状病毒抗原”是指诱导针对冠状病毒感染的免疫应答的多肽，例如冠状病毒刺突蛋白。SEQ ID NO 26提供SARS-CoV-1的冠状病毒刺突蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO28提供SARS-CoV-2的冠状病毒刺突蛋白的氨基酸序列。如本文所使用的，“冠状病毒刺突蛋白”是指与SEQ ID NO 26或SEQ ID NO 28基本同源的多肽。
术语“冠状病毒疫苗”是指含有灭活或减毒的冠状病毒颗粒、冠状病毒抗原或编码冠状病毒抗原的表达构建体的疫苗。
如本文所用，术语“对应”是指一个物种的CD40L的核苷酸或氨基酸序列与另一物种的CD40L的核苷酸或氨基酸序列基本上同源。这种同源性是基于二级结构(例如不同物种的CD40L之间结构域边界的位置)的相似性。
“有效量”至少是实现特定疾病的可测量的改善或预防所需的最小量。本文的有效量可根据诸如患者的疾病状态、年龄、性别和体重以及疫苗和/或佐剂在个体中引起所需应答的能力等因素而变化。有效量也是治疗有益作用超过治疗的任何毒性或有害作用的量。对于预防性使用，有益或所需的结果包括诸如消除或降低风险、减轻严重性或延迟疾病发作的结果，包括疾病的生化、组织学和/或行为症状、其并发症和在疾病的发展过程中呈现的中间病理表型。对于治疗性使用，有益或所需的结果包括诸如以下的临床结果：减少由疾病引起的一种或多种症状、提高患有疾病的人的生活质量、减少治疗疾病所需的其他药物的剂量、例如通过靶向增强另一种药物的效果、延缓疾病进展和/或延长生存期。可以在一次或多次施用中施用有效量。为了本发明的目的，有效量的药物、化合物或药物组合物是足以直接或间接完成预防性治疗或治疗性治疗的量。如在临床背景下所理解的，有效量的药物、化合物或药物组合物可以与也可以不与另一种药物、化合物或药物组合物联合实现。因此，在施用一种或多种治疗剂的背景下可以考虑“有效量”，并且如果与一种或多种其他药物联合使用，可以或已经实现所需的结果，则可以认为给予有效量的单一药物。
术语“增强子”是指这样的核酸序列，当该核酸序列位于启动子附近时，该核酸序列赋予相对于不存在增强子序列时由启动子产生的转录活性而言增加的转录活性。
术语“外源性”在与细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸相关地使用时，是指已通过人工手段或自然手段引入细胞或生物体的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸；或与细胞相关地使用时，该术语是指通过人工手段或自然手段分离并随后引入其他细胞或生物体的细胞。外源核酸可以来自不同的生物体或细胞，或者它可以是生物体或细胞内天然存在的核酸的一个或多个额外拷贝。外源细胞可能来自不同的生物体，也可能来自相同的生物体。例如，外源核酸可以是在染色体位置不同于它在自然细胞中的位置的核酸，或者在两侧具有与自然界中发现的不同的核酸序列。
“表达构建体”或“表达盒”是指能够指导转录的核酸分子。表达构建体至少包括一个或多个转录控制元件(例如启动子、增强子或其功能等同结构)，所述转录控制元件指导基因在一种或多种所需细胞类型、组织或器官中的表达。还可以包括额外的元件，例如转录终止信号。
“编码”特定蛋白质的“基因”、“多核苷酸”、“编码区”、“序列”、“区段”、“片段”或“转基因”是这样的核酸分子，该核酸分子在置于适当的调节序列的控制下时在体外或体内被转录和任选地还被翻译成基因产物(例如多肽)。编码区可以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，核酸分子可以是单链的(即有义链)或双链的。编码区的边界由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子决定。基因可包括但不限于来自原核mRNA或真核mRNA的cDNA、来自原核DNA或真核DNA的基因组DNA序列和合成DNA序列。转录终止序列通常将位于基因序列的3'端。
“同源性”是指两个多核苷酸或两个多肽之间的同一性百分比。一个序列与另一个序列之间的对应关系可以通过本领域已知的技术来确定。例如，同源性可以通过比对序列信息和使用容易获得的计算机程序对两个多肽分子之间的序列信息进行直接比较来确定。可选择地，同源性可以通过多核苷酸在促进同源区域之间稳定双链体形成的条件下杂交，然后用单链特异性核酸酶消化，并确定消化片段的大小来确定。如使用上述方法所确定的，当至少约80％，特别是至少约90％，最特别是至少约95％的核苷酸或氨基酸分别匹配分子的确定长度时，两个DNA或两个多肽序列彼此“基本上同源”。
如本文所用，短语“不易受切割”或“减少的切割”是指嵌合CD40L与天然人CD40L相比对蛋白水解切割的更高的抗性，如通过一段时间内给定数量的细胞产生的可溶性CD40L的量所测量的。特别地，本发明的嵌合CD40L“不易受切割”，因为它以比天然CD40L低至少50％、至少75％或至少90％的速率被切割。
术语“核酸”通常指至少一种DNA、RNA或其衍生物或模拟物的分子或链，包含至少一种核碱基，例如在DNA(例如，腺嘌呤“A”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”和胞嘧啶“C”)或RNA(例如A、G、尿嘧啶“U”和C)中发现的天然存在的嘌呤或嘧啶碱基。术语“核酸”包括术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”。术语“寡核苷酸”指的是至少一个长度为约3至约100个核碱基的分子。术语“多核苷酸”是指至少一个长度大于约100个核碱基的分子。这些定义一般是指至少一种单链分子，但在具体实施方式中也包括至少一种与该至少一种单链分子部分、基本上或完全互补的额外链。因此，核酸可涵盖至少一个双链分子或至少一个三链分子，该至少一个双链分子或至少一个三链分子包含构成该分子的链的特定序列的一条或多条互补链或“互补物”。
就核酸分子而言，“可操作地连接”或“共表达”是指两个或更多个核酸分子(例如，待转录的核酸分子、启动子和增强子元件)以允许核酸分子转录的方式连接。关于肽和/或多肽分子的“可操作地连接”或“共表达”是指两个或更多个肽和/或多肽分子以产生单个多肽链的方式连接，即融合多肽，具有融合物的每个肽和/或多肽组分的至少一个特性。融合多肽特别是嵌合的，即由异源分子组成。
权利要求书中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或替代方案相互排斥，尽管本公开支持仅提及替代方案和“和/或”的定义。如本文所用，“另一个”可表示至少第二的或更多的。
术语“药物制剂”是指这样的制剂，该制剂的形式允许活性成分的生物活性有效，并且该制剂不包含对该制剂将施用的受试者有不可接受的毒性的额外成分。这样的制剂是无菌的。“药学上可接受的”赋形剂(溶媒、添加剂)是可以合理地施用于受试哺乳动物以提供所用活性成分的有效剂量的那些赋形剂。
“质粒”是常见的载体类型，是与染色体DNA分离的染色体外DNA分子，其能够独立于染色体DNA进行复制。在某些情况下，它是环形且双链的。
术语“启动子”在本文中以其普通含义使用，指包含DNA调节序列的核苷酸区域，其中调节序列源自能够结合RNA聚合酶并起始下游(3'方向)编码序列转录的基因。它可能包含调节蛋白和分子可以结合的遗传元件，例如RNA聚合酶和其他转录因子，从而起始核酸序列的特定转录。短语“可操作地定位”、“可操作地连接”、“在控制下”和“在转录控制下”是指启动子相对于核酸序列处于正确的功能位置和/或取向以控制该序列的转录起始和/或表达。
术语“亚结构域”是指作为CD40L结构域的一部分的至少两个氨基酸的序列。“亚结构域”还涵盖其中缺失、添加或修饰了一个或多个氨基酸的氨基酸序列，包括从该序列末端截短的一个或多个氨基酸。
“载体”或“构建体”(有时称为基因递送系统或基因转移“运载体”)是指包含要在体外或体内递送至宿主细胞的多核苷酸的大分子或分子复合物。
B.CD40和CD40配体
CD40是在B细胞、树突细胞、正常上皮细胞和一些上皮癌的表面上表达的50Kd糖蛋白(Briscoe等人，1998)。CD40的配体CD40L在激活的T淋巴细胞、人树突细胞、人血管内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞上表达。CD40L作为三聚体结构存在于此类细胞上，其在结合后诱导其受体寡聚化。
CD40配体(也称为CD40L、gp39或CD154)是一种II型膜多肽，在其C末端具有细胞外区域，在其N末端具有跨膜区域和细胞内区域。已对CD40配体进行克隆和测序，并报道了来自人(GenBank登录号Z15017/S49392、D31793-7、X96710、L07414和X67878/S50586)、鼠(GenBank登录号X65453)、牛(GenBank登录号Z48469)、犬(GenBank登录号AF086711)、猫(GenBank登录号AF079105)和大鼠(GenBank登录号AF116582、AF013985)的核酸和氨基酸序列。此类鼠科动物、牛科动物、犬科动物、猫科动物和大鼠的序列也在美国专利第6,482,411号中公开，其通过引用并入本文。另外的CD40配体核酸和氨基酸序列公开于美国专利第5,565,321号和第5,540,926号，其通过引用并入本文，突变/嵌合CD40配体序列公开于美国专利第5,716,805号；第5,962,406号；第6,087,329号；第7,495,090号；第7,524,944号；第7,928,213号；和第8,138,310号，其中每个都通过引用并入本文。
C.嵌合CD40L多肽
CD40L是统称为TNF超家族的更大的配体家族中的一个成员(Gruss等人,Cytokines Mol Ther,1:75–105,1995和Locksley等人,Cell,104:487–501,2001)。TNF超家族的成员包括Fas配体(“FasL”)、TNFα、LTα、淋巴毒素(TNFβ)、CD154、TRAIL、CD70、CD30配体、4-1BB配体、APRIL、TWEAK、RANK配体、LIGHT、AITR配体、外异蛋白(ectodysplasin)、BLYS、VEGI和OX40配体。TNF超家族成员共享包含四个结构域的保守二级结构：结构域I，细胞内结构域；结构域II，跨越细胞膜，称为跨膜结构域；结构域III，由最靠近细胞膜的细胞外氨基酸组成；和结构域IV，远端细胞外结构域。通常，至少部分结构域IV可以从母体分子上切下。切割后的片段通常表现出与完整配体相同的生物活性，通常被称为TNF家族成员的“可溶性形式”。可溶性CD40配体可由细胞外区域或其片段制成，并且已在表达膜结合型CD40配体的细胞(例如EL-4细胞)的培养物上清液中发现了可溶性CD40配体。
CD40L与其同源受体CD40之间的相互作用对于免疫识别至关重要(BanchereauJ.等人，Annu.Rev.Immunol.12:881–922,1994)。在抗原呈递细胞通过MHC II类分子衔接T细胞受体后，CD40L在CD4+T细胞上瞬时表达(CantwellM.等人，Nat.Med.,3:984–989,1997)。这反过来又可导致表达CD40的包括B细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞在内的抗原呈递细胞(APC)的激活(RanheimEA等人,Cell.Immunol.,161:226–235,1995)。这种CD40激活细胞可以引发一连串的免疫激活事件，从而导致针对病毒或肿瘤等外来抗原的特异性有效免疫应答。
本领域已知人CD40L的至少一部分切割自母体分子并成为可溶性分子，然而，可溶性形式通常是不希望的。因此，本公开的嵌合CD40L多肽可以通过将包含被蛋白水解酶识别的切割位点的人CD40L的氨基酸或氨基酸序列与不包含该切割位点的非人CD40L的氨基酸或氨基酸序列交换来形成。在某些实施方式中，非人CD40L是鼠CD40L。可选择地，嵌合CD40L多肽可以包括在切割位点的点突变或切割位点的缺失。
在一些实施方式中，嵌合CD40L多核苷酸序列包含第一核苷酸序列，该第一核苷酸序列编码对应于并替代人CD40L切割位点的非人CD40L的细胞外亚结构域。嵌合CD40L多肽可以通过用相应的非人CD40L的亚结构域替代含有CD40L切割位点的人CD40L的亚结构域来产生，导致与人CD40L相比对切割的敏感性明显降低的嵌合CD40L。在其他实施方式中，对切割位点的氨基酸修饰、改变或缺失以降低对蛋白酶切割的敏感性。第一核苷酸序列可以可操作地连接到第二核苷酸序列，该第二核苷酸序列编码参与结合人CD40受体的人CD40L细胞外亚结构域。这样，本公开的多核苷酸序列编码与表达CD40受体的人细胞结合的嵌合CD40L。此外，在一些方面，鼠和人CD40L的细胞外结构域包括允许该分子在鼠和人细胞的膜上表达的至少一个氨基酸或氨基酸的序列。
本公开的CD40L多肽可以是嵌合的，它们可以包含来自至少两个不同物种的CD40L结构域或亚结构域，在一些情况下是人和小鼠CD40L。这些多肽被指定为“免疫刺激因子”或ISF，因为它们将人和非人CD40L区域组合起来以最大限度地刺激免疫应答。具体而言，至少一个包含人CD40L切割位点的CD40L结构域或亚结构域被非人CD40L，特别是鼠CD40L的相应结构域或亚结构域替代。此外，嵌合多肽由负责结合CD40L受体的人CD40L结构域或亚结构域组成。
用于本公开的嵌合CD154或CD40L多肽在美国专利第7,495,090号和第US7,928,213号中有所描述，两者均通过引用并入本文。例如，人CD40L的结构域IV可以连接到鼠CD40L的结构域I、II和III。这类具体的多核苷酸序列的示例在本文中以SEQ ID NO 1、3、5、7、9和11提供并编码嵌合CD40L构建体，分别命名为ISF 30、32、34、36、38和40。此外，鼠CD40L的结构域IV可与人CD40L的结构域I、II和III连接。这类多核苷酸序列的示例以SEQID NO 2、4、6、8、10和12提供并编码嵌合CD40L构建体，分别命名为ISF 31、33、35、37、39和41。在具体的实施方式中，用于本发明的嵌合CD40L多肽是ISF35。
D.多肽递送方法
在一些实施方式中，嵌合CD40L多肽和/或冠状病毒抗原以纳米颗粒递送。例如，纳米粒子由可生物降解的聚合物制成，例如聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚富马酸-癸二酸酐共聚物壳聚糖和改性壳聚糖。或者，嵌合CD40L多肽和/或冠状病毒抗原在脂质体、PEG化脂质体、囊泡(niosomes或aquasomes)中递送。可以使用本领域已知的用于肽或蛋白质递送的其他方法，例如在美国专利号8,288,113和5,641,670以及美国专利公开号US20100291065、US20140242107、US2014023213、US20150191710和US2010026678中描述的；所有这些都通过引用并入本文。
在一些实施方式中，嵌合CD40L多肽和/或冠状病毒抗原在表达构建体中提供。特别地，嵌合CD40L构建体将是膜稳定的并且对蛋白水解切割具有抗性，因此不太可能产生可溶形式的CD40L。然而，嵌合CD40L构建体将保持天然CD40L的受体结合功能。此外，特定的CD40L构建体在人体中施用后对对于受体结合至关重要的结构域不会具有免疫原性，从而避免了功能中和。
本领域的技术人员将有能力通过标准重组技术构建载体(参见例如，Sambrook等人,2001和Ausubel等人,1996，均通过引用并入本文)。载体包括但不限于质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如YAC)，例如逆转录病毒载体(例如源自莫洛尼鼠白血病病毒载体(MoMLV)，MSCV、SFFV、MPSV、SNV等)、慢病毒载体(例如源自HIV-1、HIV-2、SIV、BIV、FIV等)、腺病毒(Ad)载体(包括其复制型、复制缺陷型和无活力型(gutlessforms))、腺相关病毒(AAV)载体、猿猴病毒40(SV-40)载体、牛乳头瘤病毒载体、EB病毒载体、疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、哈维鼠肉瘤病毒载体、鼠乳腺肿瘤病毒载体、冠状病毒载体和Rous肉瘤病毒载体。
1.病毒载体
在本发明的某些方面可以提供编码嵌合CD40L多肽和/或冠状病毒抗原的病毒载体。在产生重组病毒载体时，非必需基因通常被异源(或非天然)蛋白质的基因或编码序列替代。病毒载体是利用病毒序列将核酸和可能的蛋白质引入细胞的表达构建体。某些病毒通过受体介导的内吞作用感染细胞或进入细胞以及整合到宿主细胞基因组中并稳定有效地表达病毒基因的能力使它们成为将外来核酸转移到细胞(例如哺乳动物细胞)中的有吸引力的候选物。下文描述了可用于递送本发明某些方面的核酸的病毒载体的非限制性实例。
a.慢病毒载体
慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还包含其他具有调节或结构功能的基因。慢病毒载体是本领域众所周知的(参见，例如，Naldini等人，1996年；Zufferey等人，1997年；Blomer等人，1997年；美国专利6,013,516和5,994,136)。
重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞，并且可用于体内和体外基因转移以及核酸序列的表达。例如，美国专利5,994,136(通过引用并入本文)描述了能够感染非分裂细胞的重组慢病毒，其中合适的宿主细胞被两种或更多种携带包装功能的载体转染，即gag、pol和env，以及rev和tat。
b.腺病毒载体
病毒载体的另一个实例是腺病毒表达载体，其可用作递送嵌合CD40L多肽和/或冠状病毒抗原的方法。尽管已知腺病毒载体整合到基因组DNA的能力较低，但这一特征由于这些载体提供的基因转移效率高而被抵消。腺病毒表达载体包括含有足以(a)支持构建体包装并(b)最终表达已克隆到其中的重组基因构建体的腺病毒序列的构建体。图1显示了编码嵌合CD40L多肽的腺病毒表达构建体的图。在某些实施方式中，表达构建体中使用的嵌合CD40L序列102选自编码ISF31、ISF32、ISF33、ISF34、ISF35、ISF36、ISF37、ISF38、ISF39、ISF40、ISF41或ISF42，优选ISF35的序列中的一种，或基本上与前述序列中的一种同源。嵌合CD40L的转录受包含额外调节区的控制，该额外调节区包括启动子/增强子区101和聚腺苷酸化序列103，启动子/增强子区101通常在嵌合CD40配体序列102的上游，聚腺苷酸化序列103通常在CD40配体序列的下游。尽管图1显示了CMV启动子101，但是另一启动子(例如本文公开的启动子)可以用于表达构建体，只要它促进嵌合CD40L多肽的表达即可。尽管图1显示嵌合CD40L盒在E1缺失位点处插入到腺病毒基因组中，但也可以使用插入用于嵌合CD40L表达盒的腺病毒基因组的替代插入位点，只要它促进嵌合CD40L多肽的表达。在图1所示的腺病毒表达构建体中，腺病毒基因组的E1区缺失并用嵌合CD40L盒插入物100替代，并且腺病毒基因组的E3区110缺失。
MemVax包含编码嵌合CD40L多肽的腺病毒表达载体。具体来说，MemVax中的腺病毒表达载体编码ISF35。MemVax还包括储存制剂，该储存制剂包含TRIS-乳糖缓冲溶液，允许储存和通过多种施用途径(包括注射、鼻内或口服)施用至人类或动物。
图2显示了编码嵌合CD40L多肽和冠状病毒抗原的组合腺病毒表达构建体的图。优选地，组合表达构建体中使用的嵌合CD40L序列202选自编码ISF30、ISF31、ISF32、ISF33、ISF34、ISF35、ISF36、ISF37、ISF38、ISF39、ISF40或ISF41、优选ISF35的序列中的一种，或者与那些序列中的一种基本上同源。优选地，组合表达构建体中使用的冠状病毒抗原序列212选自编码SARS-CoV-1或SARS-CoV-2的冠状病毒刺突蛋白的序列之一。嵌合CD40L和冠状病毒抗原的转录均受包含额外调节区的控制，该额外调节区包括通常在嵌合CD40配体序列和冠状病毒抗原序列上游的启动子/增强子区，分别为201和211。虽然图2显示了用于嵌合CD40L的CMV启动子201和用于冠状病毒抗原的SV40启动子211，但是其他启动子，例如本文公开的启动子，可以用于表达构建体，只要它促进嵌合CD40L多肽和冠状病毒抗原的表达。在优选的实施方式中，不同的启动子用于嵌合CD40L和冠状病毒抗原以降低病毒构建体同源重组的风险。图2还描绘了嵌合CD40L盒插入物200中的聚腺苷酸化序列203。在图2中，嵌合CD40L盒插入物200在E1缺失位点处插入到腺病毒基因组中，冠状病毒抗原盒210在E3缺失位点插入到腺病毒基因组中。尽管图2显示嵌合CD40L盒插入物200在E1缺失位点处插入到腺病毒基因组，冠状病毒抗原盒210在E3缺失位点CMV启动子101处插入到腺病毒基因组，对于每个表达盒都可以使用腺病毒基因组的替代插入位点，只要它能促进嵌合CD40L多肽和冠状病毒抗原的表达。
腺病毒的生长和操作是本领域技术人员已知的，并且在体外和体内表现出广泛的宿主范围。可以以高滴度获得这组病毒，例如每毫升109至1011个噬菌斑形成单位(pfu)，并且它们具有很强的传染性。腺病毒的生命周期不需要整合到宿主细胞基因组中。腺病毒载体递送的外源基因是游离基因，因此对宿主细胞的遗传毒性较低。在用野生型腺病毒接种疫苗的研究中没有报告副作用(Couch等人，1963；Top等人，1971)，证明了它们的安全性和作为体内基因转移载体的治疗潜力。
对腺病毒(一种36kb线性双链DNA病毒)的遗传结构的了解允许用长达7kb的外来序列替换大段的腺病毒DNA(Grunhaus和Horwitz，1992)。与逆转录病毒相反，宿主细胞的腺病毒感染不导致染色体整合，因为腺病毒DNA可以游离基因方式复制而没有潜在的遗传毒性。此外，腺病毒结构稳定，在广泛扩增后未检测到基因组重排。
腺病毒特别适合用作基因转移载体，因为它具有中等大小的基因组、易于操作、高效价、靶细胞范围宽和高感染性。病毒基因组的两端含有100至200个碱基对的反向重复序列(ITR)，该ITR是病毒DNA复制和包装所必需的顺式元件。基因组的早期(E)和晚期(L)区域包含不同的转录单位，这些转录单位通过病毒DNA复制的开始来划分。E1区域(E1A和E1B)编码负责调节病毒基因组和一些细胞基因转录的蛋白质。E2区域(E2A和E2B)的表达导致用于病毒DNA复制的蛋白质的合成。这些蛋白质参与DNA复制、晚期基因表达和宿主细胞关闭(Renan,1990)。包括大部分病毒衣壳蛋白在内的晚期基因的产物仅在对主要晚期启动子(MLP)发出的单个初级转录本进行显著处理后才表达。MLP(位于16.8m.u.)在感染后期特别有效，并且从该启动子发出的所有mRNA都具有5'-三联前导(TPL)序列，这使它们成为特别有效的用于翻译的mRNA。
可以由穿梭载体和前病毒载体之间同源重组产生重组腺病毒。由于两个前病毒载体之间可能发生重组，因此可以从该过程中产生野生型腺病毒。因此，从单个斑块中分离出单个病毒克隆，并检查其基因组结构。
腺病毒载体可以是复制缺陷型的，或者至少是条件性缺陷型的，认为腺病毒载体的性质对于本发明的成功实践并不是至关重要的。腺病毒可以是42种不同的已知血清型或A至F亚群中的任何一种。C亚群5型腺病毒是获得用于本发明的条件性复制缺陷型腺病毒载体的特定起始材料。这是因为5型腺病毒是一种大量生化和遗传信息已知的人类腺病毒，并且在历史上它被用于大多数使用腺病毒作为载体的构建。
可以将核酸在编码序列已去除的位置引入到腺病毒载体中。例如，复制缺陷型腺病毒载体可以去除E1编码序列。编码目的基因的多核苷酸也可如Karlsson等人(1986)所述插入E3替代载体中缺失的E3区中，或插入到辅助细胞系或辅助病毒补充E4缺陷的E4区中。
复制缺陷型腺病毒载体的产生和繁殖可以用辅助细胞系进行。一种命名为293的独特的辅助细胞系由Ad5 DNA片段从人胚肾细胞转化而来，并组成型表达E1蛋白(Graham等人，1977)。由于E3区域与腺病毒基因组无关(Jones和Shenk，1978)，腺病毒载体在293细胞的帮助下，在E1、E3或两个区域携带外源DNA(Graham和Prevec，1991)。
辅助细胞系可来源于人细胞，例如人胚肾细胞、肌肉细胞、造血细胞或其他人胚胎间充质细胞或上皮细胞。可替代地，辅助细胞可以来源于其他对人腺病毒是可允许的哺乳动物物种的细胞。此类细胞包括例如Vero细胞或其他猴胚胎间充质细胞或上皮细胞。如上所述，特定的辅助细胞系是293。
用于产生重组腺病毒的方法是本领域已知的，例如美国专利第6,740,320号，其通过引用并入本文。此外，Racher等人(1995)公开了培养293细胞和繁殖腺病毒的改进方法。在一种形式中，通过将个体细胞接种到含有100-200ml培养基的1L硅化转瓶(Techne，Cambridge，UK)中来培养天然细胞聚集体。以40rpm的速度搅拌后，使用台盼蓝评估细胞活力。在另一种形式中，如下使用Fibra-Cel微载体(BibbySterlin，Stone，UK)(5g/l)。将重悬于5ml培养基中的细胞接种物添加到250ml锥形瓶中的载体(50ml)中，并静置1至4小时，偶尔搅拌。然后将培养基更换为50ml新鲜培养基并开始摇动。对于病毒生产，允许细胞生长至约80％汇合度，之后更换培养基(至最终体积的25％)并以0.05的MOI添加腺病毒。培养物静置过夜，随后将体积增加至100％并再摇动72小时。
c.逆转录病毒载体
此外，嵌合CD40L多肽和/或冠状病毒抗原可以由逆转录病毒载体编码。逆转录病毒是一类单链RNA病毒，特征在于能够通过逆转录过程在受感染细胞中将其RNA转化为双链DNA(Coffin,1990)。然后，所得DNA作为前病毒稳定地整合到细胞染色体中，并指导病毒蛋白的合成。整合导致病毒基因序列保留在受体细胞及其后代中。逆转录病毒基因组包含三个基因，gag、pol和env，分别编码衣壳蛋白、聚合酶和包膜组分。在gag基因上游发现的序列包含将基因组包装到病毒颗粒中的信号。两个长末端重复(LTR)序列存在于病毒基因组的5'和3'末端。它们包含强启动子和增强子序列，也是整合到宿主细胞基因组中所必需的(Coffin,1990)。
为了构建逆转录病毒载体，将编码感兴趣基因的核酸插入病毒基因组中代替某些病毒序列，以产生复制缺陷型病毒。为了生产病毒颗粒，构建了包含gag、pol和env基因但不含LTR和包装组分的包装细胞系(Mann等人，1983)。当含有cDNA的重组质粒连同逆转录病毒LTR和包装序列被引入该细胞系时(例如通过磷酸钙沉淀)，包装序列允许重组质粒的RNA转录物被包装到病毒颗粒中，然后该病毒颗粒分泌到培养基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等人，1983)。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地进行浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染多种细胞类型。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂(Paskind等人，1975)。
对使用有缺陷的逆转录病毒载体的关注是在包装细胞中可能出现具有复制能力的野生型病毒。这可能是由重组事件引起的，在重组事件中，来自重组病毒的完整序列插入到整合到宿主细胞基因组中插入的gag、pol、env序列的上游。然而，包装细胞系可以大大降低重组的可能性(Markowitz等人，1988年；Hersdorffer等人，1990)。
d.腺相关病毒载体
腺相关病毒(AAV)是用于本公开的有吸引力的载体系统，因为它具有高整合频率并且它可以感染非分裂细胞，因此使其可用于将基因递送到哺乳动物细胞中(Muzyczka，1992)。AAV具有广泛的感染宿主范围(Tratschin等人，1984；Laughlin等人，1986；Lebkowski等人，1988；McLaughlin等人，1988)，这意味着它适用于本发明。关于rAAV载体的产生和使用的细节在美国专利第5,139,941号和美国专利第4,797,368号中有所描述。
AAV是一种依赖性细小病毒，因为它需要与另一种病毒(腺病毒或疱疹病毒家族的成员)共同感染才能在培养的细胞中进行生产性感染(Muzyczka，1992)。在没有与辅助病毒共同感染的情况下，野生型AAV基因组通过其末端整合到人类19号染色体中，在此它作为前病毒处于潜伏状态(Kotin等人，1990；Samulski等人，1991)。然而，rAAV并不局限于19号染色体的整合，除非还表达AAVRep蛋白(Shelling和Smith，1994)。当携带AAV前病毒的细胞被辅助病毒过度感染时，AAV基因组从染色体或重组质粒中“拯救”出来，并建立正常的生产性感染(Samulski等人，1989年；McLaughlin等人，1988年；Kotin等人，1990年；Muzyczka，1992年)。
通常，重组AAV(rAAV)病毒通过共转染质粒和表达质粒来制备，该质粒含有两侧为两个AAV末端重复序列的目的基因(McLaughlin等人，1988；Samulski等人，1989；均通过引用并入本文)，该表达质粒含有无末端重复序列的野生型AAV编码序列，例如pIM45(McCartyetal.，1991)。细胞也被携带AAV辅助功能所需的腺病毒基因的腺病毒或质粒感染或转染。以这种方式制备的rAAV病毒毒种被腺病毒污染，该腺病毒必须与rAAV颗粒物理分离(例如，通过氯化铯密度离心)。可替代地，可以使用包含AAV编码区的腺病毒载体或包含AAV编码区和一些或所有腺病毒辅助基因的细胞系(Yang等人，1994；Clark等人，1995)。也可以使用携带rAAV DNA作为整合前病毒的细胞系(Flotte等人，1995)。
e.冠状病毒载体
冠状病毒是正义的单链RNA病毒，由四个属组成：α冠状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒和δ冠状病毒。SARS-CoV-1和SARS-CoV-2是β冠状病毒。冠状病毒编码多种病毒蛋白，包括四种主要结构蛋白：刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、核壳蛋白(N)和包膜蛋白(E)。常见的人类冠状病毒，包括α冠状病毒和β冠状病毒株，与轻度至中度上呼吸道疾病(如普通感冒)有关。更严重的获得性呼吸综合征疾病是由MERS-CoV、SARS-CoV-1和SARS-CoV-2引起的。冠状病毒基因组相对较大，约为30kb，可以通过本领域已知的重组遗传操作进行遗传修饰，以去除或包含病毒或外来遗传物质。
可以生成重组冠状病毒载体以包含靶向基因修饰或用于异源基因表达。在一些实施方式中，制备重组冠状病毒载体以表达嵌合CD40L。描述了用于生成重组冠状病毒载体的方法(Eriksson等人，2008年，Methods Mol Biol.vol.454:237-54)。经修饰以表达嵌合CD40L的重组冠状病毒载体可用作疫苗。
f.其他病毒载体
其他病毒载体可用作本公开中的构建体。可以使用源自诸如痘苗病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)和疱疹病毒等病毒的载体。它们为各种哺乳动物细胞提供了几个有吸引力的特征(Friedmann，1989年；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等人，1988；Horwich等人，1990)。
委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒的分子克隆毒株已被遗传改良为可复制的疫苗载体以表达异源病毒蛋白(Davis等人，1996)。研究表明，VEE感染会刺激有效的CTL应答，并表明VEE可能是非常有用的免疫载体(Caley等人，1997)。
在进一步的实施方式中，编码嵌合CD40L和/或冠状病毒抗原的核酸被容置在已被改造以表达特异性结合配体的感染性病毒内。因此，病毒颗粒将特异性结合靶细胞的同源受体并将内容物递送至细胞。基于通过向病毒包膜化学添加乳糖残基对逆转录病毒进行的化学修饰，开发了旨在允许特异性靶向逆转录病毒载体的新方法(Neda等人，J Biol Chem1991vol 4:14143-46)。这种修饰可以允许通过唾液酸糖蛋白受体特异性感染肝细胞。
例如，设计了重组逆转录病毒的靶向，其中使用了针对逆转录病毒包膜蛋白和特定细胞受体的生物素化抗体。使用链霉亲和素通过生物素成分偶联抗体(Roux等人，1989)。使用针对主要组织相容性复合体I类和II类抗原的抗体，他们证明了携带这些表面抗原的各种人类细胞在体外被同向性病毒感染(Roux等人，1989)。
2.调节元件
包含在可用于本公开的载体中的表达盒特别包含(在5'至3'方向)可操作地连接至蛋白质编码序列的真核转录启动子、包括间插序列的剪接信号和转录终止/聚腺苷酸化序列。真核细胞中控制蛋白质编码基因转录的启动子和增强子由多种遗传元件组成。细胞机制能够收集和整合每个元件传递的调节信息，使不同的基因能够进化出截然不同的、通常是复杂的转录调控模式。在本发明的上下文中使用的启动子包括组成型、诱导型和组织特异性启动子。
a.启动子/增强子
表达构建体包含启动子以驱动由该构建体编码的多肽的表达。启动子通常包含功能是定位RNA合成的起始位点的序列。最著名的实例是TATA盒，但在一些缺少TATA盒的启动子中，例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子，覆盖起始位点本身的离散元件有助于固定起始位置。额外的启动子元件调节转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30至110bp的区域，尽管许多启动子已被证明也包含起始位点下游的功能元件。要将编码序列置于启动子的“控制下”，可以将转录阅读框的转录起始位点的5'端定位到所选启动子的“下游”(即3'端)。“上游”启动子刺激DNA转录并促进编码RNA的表达。
启动子元件之间的间距通常是灵活的，因此当元件彼此倒置或相对移动时，启动子功能得以保留。例如，在tk启动子中，启动子元件之间的间距可以在活性开始下降之前增加到50bp。根据启动子的不同，似乎单个元件可以协同或独立地发挥作用以激活转录。启动子可以或不可以与“增强子”结合使用，“增强子”是指参与核酸序列转录激活的顺式作用调节序列。
启动子可以是与核酸序列天然相关的启动子，如可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5'端非编码序列获得。这样的启动子可以称为“内源性的”。类似地，增强子可以是与核酸序列天然相关的增强子，其位于该序列的下游或上游。可选择地，通过将编码核酸区段置于重组或异源启动子的控制下将获得某些优势，所述重组或异源启动子是指通常不与其天然环境中的核酸序列相关联的启动子。重组或异源增强子还指通常不与其天然环境中的核酸序列相关联的增强子。此类启动子或增强子可包括其他基因的启动子或增强子，以及从任何其他病毒、或原核或真核细胞分离的启动子或增强子，以及非“天然存在”的启动子或增强子，即包含不同转录调控区的不同元件和/或改变表达的突变的启动子或增强子。例如，最常用于重组DNA构建的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp)启动子系统。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列，还可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术，包括PCRTM，连同本文公开的组合物，来产生序列(参见美国专利第4,683,202号和第5,928,906号，均通过引用并入本文)。此外，预计还可以使用在非核细胞器如线粒体、叶绿体等中指导序列转录和/或表达的控制序列。
自然地，重要的是使用启动子和/或增强子来有效地指导DNA片段在选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物体中进行表达。分子生物学领域的技术人员通常知道使用启动子、增强子和细胞类型组合进行蛋白质表达(参见，例如Sambrook等人，1989，其通过引用并入本文)。所采用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、诱导型的和/或在适当条件下可用于指导引入的DNA片段的高水平表达，例如在重组蛋白和/或肽的大规模生产中是有利的。启动子可以是异源的或内源的。
启动子的非限制性实例包括早期或晚期病毒启动子，例如SV40早期或晚期启动子、巨细胞病毒(CMV)立早启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)早期启动子；真核细胞启动子，例如β肌动蛋白启动子(Ng，1989；Quitsche等人，1989)、GADPH启动子(Alexander等人，1988；Ercolani等人，1988)、金属硫蛋白启动子(Karin等人，1989；Richards等人，1984)；和串联应答元件启动子，例如环状AMP应答元件启动子(cre)、血清应答元件启动子(sre)、佛波醇酯启动子(TPA)和靠近最小TATA盒的应答元件启动子(tre)。
在某些方面，本公开的方法还涉及增强子序列，即增加启动子活性并具有顺式作用潜力的核酸序列，无论它们的取向如何，甚至是具有相对长的距离(距离目标启动子多达几千碱基)。然而，增强子的功能不一定局限于如此长的距离，因为它们也可以在靠近给定启动子的地方起作用。
b.起始信号和相关表达
特定起始信号也可用于本公开中提供的表达构建体以有效翻译编码序列。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域的普通技术人员将很容易能够确定这一点并提供必要的信号。众所周知，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框位于“读框内(in-frame)”，以确保整个插入物的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。可以通过包含适当的转录增强子元件来提高表达效率。
在某些实施方式中，使用内部核糖体进入位点(IRES)元件来产生多基因或多顺反子信息。IRES元件能够绕过5'端甲基化Cap依赖性翻译的核糖体扫描模型，并在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。已经描述了来自小核糖核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)，以及来自哺乳动物信息的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可以连接到异源开放阅读框。多个开放阅读框可以一起转录，它们各自被IRES分隔，从而创建多顺反子信息。凭借IRES元件，每个开放阅读框都可以被核糖体访问以进行有效翻译。多个基因可使用单个启动子/增强子转录单个信息来有效表达(参见美国专利第5,925,565号和第5,935,819号，均通过引用并入本文)。
此外，某些2A序列元件可用于在本公开提供的构建体中产生基因的连锁表达或共表达。例如，切割序列可用于通过连接开放阅读框形成单顺反子来共表达基因。示例性切割序列是F2A(口蹄疫病毒2A)或“2A样”序列(例如，东亚细亚病毒2A(Thosea asigna virus2A)；T2A)(Minskaia和Ryan，2013)。
c.复制起点
为了在宿主细胞中增殖载体，它可包含一个或多个复制起始位点(通常称为“ori”)，例如，在编程中具有相似或增强功能的遗传改造的oriP，其是起始复制的特定核酸序列。可替代地，可以使用如上所述的其他染色体外复制病毒的复制起点或自主复制序列(ARS)。
3.选择和筛选标记物
在一些实施方式中，包含本公开的构建体的细胞可通过在表达载体中包含标记物来在体外或体内鉴定。这样的标记物将赋予细胞可识别的变化，从而允许容易地识别含有表达载体的细胞。通常，选择标记物是赋予允许选择的特性的标记物。阳性选择标记物是标记物的存在允许其被选择的标记物，而阴性选择标记物是标记物的存在阻止其被选择的标记物。阳性选择标记物的实例是耐药性标记物。
通常包含药物选择标记物有助于转化体的克隆和鉴定，例如，赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇抗性的基因是有用的选择标记物。除了赋予允许基于条件的实施来区分转化体的表型的标记物之外，还考虑了其他类型的标记物，包括可筛选标记物，例如GFP，其基础是比色分析。可替代地，可以使用可筛选酶作为阴性选择标记物，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还知道如何使用免疫标记物，该免疫标记物可以与FACS分析组合使用。所使用的标记物被认为是不重要的，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。选择和可筛选标记物的其他实例是本领域技术人员众所周知的。
B.核酸递送
除了病毒递送编码嵌合CD40L和/或冠状病毒抗原的核酸之外，以下是将重组基因递送至给定宿主细胞的其他方法，因此在本公开中被考虑。
核酸如DNA或RNA的引入可使用任何合适的核酸递送方法来转化细胞，如本文所述或如本领域普通技术人员所知。核酸如DNA或RNA的引入可使用任何合适的核酸递送方法来转化细胞，如本文所述或如本领域普通技术人员所知。此类方法包括但不限于直接递送DNA，例如通过离体转染(Wilson等人，1989；Nabel等人，1989)、通过注射(美国专利第5,994,624号、第5,981,274号、第5,945,100号、第5,780,448号、第5,736,524,5,702,932,5,656,610号、第5,589,466号和第5,580,859号，均通过引用并入本文)，包括显微注射(Harland和Weintraub，1985；美国专利第5,789,215号，通过引用并入本文)；通过电穿孔(美国专利第5,384,253号，通过引用并入本文；Tur-Kaspa等人，1986；Potter等人，1984)；通过磷酸钙沉淀法(Graham和VanDerEb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等人，1990)；使用DEAE-葡聚糖，然后使用聚乙二醇(Gopal，1985)；通过直接声波加载(Fechheimer等人，1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau和Sene，1982；Fraley等人，1979；Nicolau等人，1987；Wong等人，1980；Kaneda等人，1989；Kato等人，1991)和受体介导的转染(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)；通过微粒轰击(PCT申请号WO94/09699和95/06128；美国专利第5,610,042号；第5,322,783号、第5,563,055号、第5,550,318号、第5,538,877号和第5,538,880号，每篇均以引用方式并入本文)；通过与碳化硅纤维搅拌(Kaeppler等人，1990年；美国专利第5,302,523号和第5,464,765号，均通过引用并入本文)；通过农杆菌介导的转化(美国专利第5,591,616号和第5,563,055号，均通过引用并入本文)；通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus等人，1985)，以及这些方法的任何组合来进行。通过应用诸如这些的技术，可以稳定转化或瞬时转化细胞器、细胞、组织或生物体。
1.电穿孔
在本公开的某些特定实施方式中，基因构建体通过电穿孔引入到靶标过度增殖细胞中。电穿孔涉及将细胞(或组织)和DNA(或DNA复合物)暴露于高压放电。
使用电穿孔转染真核细胞已经相当成功。小鼠前B淋巴细胞已用人kappa免疫球蛋白基因转染(Potter等人，1984)，大鼠肝细胞已以这种方式用氯霉素乙酰转移酶基因转染(Tur-Kaspa等人，1986)。
预期可以针对来自不同来源的过度增殖细胞优化电穿孔条件。人们可能特别希望优化诸如电压、电容、时间和电穿孔介质组成等参数。其他例行调整的执行对于本领域的技术人员来说是已知的。参见，例如，Hoffman，1999；Heller等人，1996。
2.脂质介导的转化
在进一步的实施方式中，嵌合CD40L和/或冠状病毒抗原可以被包裹在脂质体或脂质制剂中。脂质体是以磷脂双层膜和内部水性介质为特征的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质分隔的多个脂质层。它们会在磷脂悬浮在过量的水溶液中时自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前进行自我重排，并在脂质双层之间截留水和溶解的溶质(Ghosh和Bachhawat，1991)。还考虑了与阳离子脂质体(Lipofectamine)(Gibco BRL)复合的基因构建体。
脂质介导的核酸递送和外源DNA的体外表达已经非常成功(Nicolau和Sene，1982；Fraley等人，1979；Nicolau等人，1987)。Wong等人(1980)证明了在培养的鸡胚、HeLa和肝癌细胞中进行脂质介导的外源DNA递送和表达的可行性。
基于脂质的非病毒制剂提供了腺病毒基因疗法的替代方法。尽管许多细胞培养研究已经记录了基于脂质的非病毒基因转移，但通过基于脂质的制剂进行的全身基因递送是受限的。基于脂质的非病毒基因递送的主要限制是包含非病毒递送载体的阳离子脂质的毒性。脂质体的体内毒性部分解释了体外和体内基因转移结果之间的差异。造成这种矛盾数据的另一个因素是在存在和不存在血清蛋白的情况下脂质载体稳定性的差异。脂质载体和血清蛋白之间的相互作用对脂质载体的稳定性特征具有显著影响(Yang和Huang，1997)。阳离子脂质吸引并结合带负电荷的血清蛋白。与血清蛋白相关的脂质载体溶解或被巨噬细胞吸收，导致它们从循环中被去除。当前的体内脂质递送方法使用皮下、皮内、瘤内或颅内注射，以避免与循环中阳离子脂质相关的毒性和稳定性问题。脂质载体和血浆蛋白的相互作用导致体外(Felgner等人，1987)和体内基因转移(Zhu等人，1993；Philip等人，1993；Solodin等人，1995年；Liu等人，1995；Thierry等人，1995；Tsukamoto等人，1995；Aksentijevich等人，1996)效率之间的差异。
脂质制剂的进步提高了体内基因转移的效率(Templeton等人，1997；WO98/07408)。一种由等摩尔比的1,2-双(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)和胆固醇组成的新型脂质制剂显著增强了全身性体内基因转移，大约150倍。DOTAP：胆固醇脂质制剂形成称为“三明治脂质体”的独特结构。据报道，该制剂将DNA“夹在”内陷的双层或“花瓶(vase)”结构之间。这些脂质结构的有益特性包括正ρ、胆固醇的胶体稳定性、二维DNA堆积和血清稳定性增加。专利申请第60/135,818号和第60/133,116号讨论了可用于本发明的制剂。
脂质制剂的生产通常是通过在(I)反相蒸发(II)脱水-再水化(III)洗涤剂透析和(IV)薄膜水化后超声处理或连续挤压脂质体混合物来完成的。一旦制造出来，脂质结构可用于封装在循环中有毒(化疗)或不稳定(核酸)的化合物。脂质封装导致此类化合物的毒性较低，血清半衰期较长(Gabizon等人，1990)。许多疾病治疗正在使用基于脂质的基因转移策略来增强常规疗法或建立新疗法，特别是用于治疗过度增殖性疾病的疗法。
E.冠状病毒疫苗和/或嵌合CD40L多肽的组合物
在某些实施方式中，冠状病毒疫苗与嵌合CD40L多肽或编码嵌合CD40L多肽的表达构建体同时或接近同时施用。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含在与嵌合CD40L多肽或编码CD40L多肽的表达构建体相同的药物制剂中。冠状病毒疫苗可包含冠状病毒抗原，例如冠状病毒刺突蛋白。可替代地，冠状病毒疫苗可包含灭活的或减毒的冠状病毒颗粒，特别地，冠状病毒颗粒可以是灭活或减毒的SARS-CoV-1颗粒或灭活或减毒的SARS-CoV-2颗粒。在又一种实施方式中，冠状病毒疫苗可包含编码冠状病毒抗原如冠状病毒刺突蛋白的表达构建体。优选地，当冠状病毒疫苗包含表达构建体时，表达构建体编码冠状病毒刺突蛋白，该冠状病毒刺突蛋白与SARS-CoV-1(SEQ ID NO 26)或SARS-CoV-2(SEQ ID NO 28)的冠状病毒刺突蛋白同源或基本上同源。
虽然本发明的纯化多肽或病毒载体可以作为分开的试剂施用，但优选将这些病毒载体作为药物组合物的一部分施用。因此，本发明进一步提供包含冠状病毒疫苗和嵌合CD40L多肽或编码嵌合CD40L多肽的表达构建体以及至少一种药学上可接受的载体的组合物。根据本发明的方法施用的组合物可以根据用于制备药学上有用的组合物的已知方法来配制。适用于施用的制剂包括，例如，水性无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；水性和非水性无菌悬浮液，其中可以包含助悬剂和增稠剂。制剂可以存在于单剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且在使用前可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要无菌液体载体(例如注射用水)的条件。
本发明组合物的施用途径可以是口服、鼻腔、局部或注射(包括输注)。在冠状病毒疫苗和嵌合CD40L分开施用的实施方式中，各自的施用途径可以相同或不同，例如，嵌合CD40L多肽可以通过鼻施用途径施用，与此基本上同时地，通过注射施用冠状病毒疫苗。对于可注射施用途径，注射可以是皮下、皮内、肌内、静脉内、气管内或腹膜内。
可以根据患者的临床表现、体重和临床护理的其他方面来优化根据本发明的组合物的剂量水平、给药频率、给药持续时间和施用的其他方面。对于包含一种或多种病毒载体的组合物，每个剂量可包含大约1e5至1e12个病毒颗粒(vp)/载体，优选剂量为1e8至1e10个vp/载体。对于包含纯化多肽的组合物，每个剂量可包含在这种组合物中包括的大约100ng至1mg的每种多肽，并且优选剂量为1μg至100μg。
材料与方法
实施例1.通过ELISPOT测量的基于施用嵌合CD40L和冠状病毒抗原增强的免疫力
将6至8周龄的Balb/c雌性小鼠分配到以下疫苗接种组：对照组(磷酸盐缓冲盐水)；纯化的重组SARS-CoV-1刺突蛋白(20μg/剂量)；MemVax(1e10个病毒颗粒/剂量)；纯化的重组SARS-CoV-1刺突蛋白(20μg/剂量)加MemVax(1e10个病毒颗粒/剂量)。小鼠(n＝5组)在第0天和第15天通过肌内注射接种疫苗。
在第29天从小鼠中收集脾细胞，并通过IFNγELISPOT测量抗刺突蛋白特异性细胞应答。96孔ELISPOT板包被有抗小鼠IFNγ捕获抗体，然后铺板脾细胞以及重叠覆盖整个SARS-CoV-1刺突蛋白的15聚体刺突蛋白肽混合物。在孵育过夜以使得细胞激活后，洗涤板并使用生物素化抗IFNγ检测一抗和链霉亲和素-辣根过氧化物酶二抗来检测IFNγ结合的细胞因子。使HRP底物显色并通过显微镜对斑点进行定量。该测定的结果在图3和下表1中显示。
表1
通过ELISPOT IFNγ分泌测量的冠状病毒刺突蛋白抗原特异性T细胞的数量。
Figure BDA0004169031860000271
如所示的，MemVax与SARS-CoV-1刺突蛋白的共同施用产生了显著的T细胞特异性抗刺突蛋白抗原应答，而仅使用冠状病毒刺突蛋白进行疫苗接种时不会显著产生T细胞特异性抗刺突蛋白抗原应答。
实施例2.通过ELISA测量基于施用嵌合CD40L和冠状病毒抗原增强的免疫力
将6至8周龄的Balb/c雌性小鼠分配到以下疫苗接种组：对照组(磷酸盐缓冲盐水)；纯化的重组SARS-CoV-1刺突蛋白(20μg/剂量)；MemVax(1e10个病毒颗粒/剂量)；纯化的重组SARS-CoV-1刺突蛋白(20μg/剂量)加MemVax(1e10个病毒颗粒/剂量)。小鼠(n＝5组)在第0天和第15天通过肌内注射接种疫苗。
从接种疫苗前(第0天)、第14天和第28天的小鼠中收集血清。通过ELISA测量血清中的抗刺突蛋白IgG抗体。将重组SARS-CoV-1刺突蛋白固定到96孔微量滴定板的表面上，然后用封闭缓冲液封闭。添加1:200稀释的血清以允许任何抗刺突蛋白抗体进行复合。使用辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG抗体和四甲基联苯胺(TMB)显色底物显色以及使用96孔板读数器在450nm处测量吸光度来检测抗IgG结合抗体。该测定的结果显示在图4和下表2中。
表2
通过ELISA测量的抗刺突蛋白抗体(IgG)体液免疫应答
Figure BDA0004169031860000281
接受冠状病毒刺突蛋白加MemVax的疫苗接种组是唯一能够在疫苗接种后产生显著的抗刺突蛋白抗体应答的组。接种冠状病毒刺突蛋白加MemVax的疫苗接种组在仅单次疫苗接种后也能够产生显著的抗刺突蛋白抗体应答。此外，第二剂冠状病毒刺突蛋白疫苗加MemVax疫苗能够比单剂疫苗接种增强抗刺突蛋白抗体应答。
根据本公开内容，无需过度实验即可制定和执行本文公开和要求保护的所有方法。虽然已经根据特定实施方式描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文描述的方法和方法的步骤或步骤的顺序进行变化。更具体地说，很明显，某些化学和生理学相关的试剂可以替代本文所述的试剂，同时将获得相同或相似的结果。所有这些对本领域技术人员显而易见的类似替换和修改都被认为在所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念之内。
序列表
<110> 曼珍公司(Memgen, Inc.)
马克·J·坎特韦尔(Cantwell, Mark J.)
<120> 使用嵌合CD40配体和冠状病毒疫苗增强免疫力
<130> 150415.00009US
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ISF30
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(783)
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tga 783
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<220>
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atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60
atgaaaattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120
ctttttgctg tgtatcttca tagaaggctg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180
gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc 240
ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300
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gccaacagta atgcagcatc cgttctacag tgggccaaga aaggatatta taccatgaaa 420
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tatatctatg ctcaagtcac cttctgctct aatcgggagg cttcgagtca agccccattc 540
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> ISF34
<220>
<221> misc_feature
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aacaaagaag agaaaaaaga aaacagcttt gaaatgcaaa gaggtgatga ggatcctcaa 360
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(759)
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<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ISF36
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(783)
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atgaagattt ttatgtattt acttactgtt ttccttatca cccaaatgat tggatctgtg 120
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gaagattttg tattcataaa aaagctaaag agatgcaaca aaggagaagg atctttatcc 240
ttgctgaact gtgaggagat gagaaggcaa tttgaagacc ttgtcaagga tataacgtta 300
aacaaagaag agaaaaaaga aaacagcttt gaaatgcaaa gaggtgatga ggatcctcaa 360
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actgatccaa gccaagtgag ccatggcact ggcttcacgt cctttggctt actcaaactc 780
tga 783
<210> 8
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ISF37
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(759)
<400> 8
atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60
atgaaaattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120
ctttttgctg tgtatcttca tagaaggctg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180
gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc 240
ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300
aacaaagagg agacgaagaa agatgaggat cctcaaattg cagcacacgt tgtaagcgaa 360
gccaacagta atgcagcatc cgttctacag tgggccaaga aaggatatta taccatgaaa 420
agcaacttgg taaccctgga aaatgggaaa cagctgacgg ttaaaagaca aggactctat 480
tatatctatg ctcaagtcac cttctgctct aatcgggagg cttcgagtca agccccattc 540
atcgtcggcc tctggctgaa gcccagcagt ggatctgaga gaatcttact caaggcggca 600
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gaattacaac caggtgcttc ggtgtttgtc aatgtgactg atccaagcca agtgagccat 720
ggcactggct tcacgtcctt tggcttactc aaactctga 759
<210> 9
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ISF38
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(783)
<400> 9
atgatagaaa catacagcca accttccccc agatccgtgg caactggact tccagcgagc 60
atgaagattt ttatgtattt acttactgtt ttccttatca cccaaatgat tggatctgtg 120
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ttgctgaact gtgaggagat gagaaggcaa tttgaagacc ttgtcaagga tataacgtta 300
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tga 783
<210> 10
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ISF39
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(759)
<400> 10
atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60
atgaaaattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120
ctttttgctg tgtatcttca tagaaggctg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180
gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc 240
ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300
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gccaacagta atgcagcatc cgttctacag tgggccaaga aaggatatta taccatgaaa 420
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tatatctatg ctcaagtcac cttctgctct aatcgggagc cttcgagtca acgcccattc 540
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gaattacaac caggtgcttc ggtgtttgtc aatgtgactg atccaagcca agtgagccat 720
ggcactggct tcacgtcctt tggcttactc aaactctga 759
<210> 11
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ISF40
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(783)
<400> 11
atgatagaaa catacagcca accttccccc agatccgtgg caactggact tccagcgagc 60
atgaagattt ttatgtattt acttactgtt ttccttatca cccaaatgat tggatctgtg 120
ctttttgctg tgtatcttca tagaagattg gataaggtcg aagaggaagt aaaccttcat 180
gaagattttg tattcataaa aaagctaaag agatgcaaca aaggagaagg atctttatcc 240
ttgctgaact gtgaggagat gagaaggcaa tttgaagacc ttgtcaagga tataacgtta 300
aacaaagaag agaaaaaaga aaacagcttt gaaatgcaaa gaggtgatga ggatcctcaa 360
attgcagcac acgttgtaag cgaagccaac agtaatgcag catccgttct acagtgggcc 420
aagaaaggat attataccat gaaaagcaac ttggtaaccc tggaaaatgg gaaacagctg 480
acggttaaaa gacaaggact ctattatatc tatgctcaag tcaccttctg ctctaatcgg 540
gagccttcga gtcaacgccc attcatcgtc ggcctctggc tgaagcccag cagtggatct 600
gagagaatct tactcaaggc ggcaaatacc cacagttccg ccaagccttg cgggcagcag 660
tctattcact tgggcggagt gtttgaatta caaccaggtg cttcggtgtt tgtcaatgtg 720
actgatccaa gccaagtgag ccatggcact ggcttcacgt cctttggctt actcaaactc 780
tga 783
<210> 12
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ISF41
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(759)
<400> 12
atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60
atgaaaattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120
ctttttgctg tgtatcttca tagaaggctg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180
gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc 240
ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300
aacaaagagg agacgaagaa agatgaggat cctcaaattg cagcacacgt tgtaagcgaa 360
gccaacagta atgcagcatc cgttctacag tgggccaaga aaggatatta taccatgaaa 420
agcaacttgg taaccctgga aaatgggaaa cagctgacgg ttaaaagaca aggactctat 480
tatatctatg ctcaagtcac cttctgctct aatcgggagc cttcgagtca acgcccattc 540
atcgtcggcc tctggctgaa gcccagcagt ggatctgaga gaatcttact caaggcggca 600
aatacccaca gttccgccaa gccttgcggg cagcagtcta ttcacttggg cggagtgttt 660
gaattacaac caggtgcttc ggtgtttgtc aatgtgactg atccaagcca agtgagccat 720
ggcactggct tcacgtcctt tggcttactc aaactctga 759
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<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合的人/小鼠CD40配体
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(260)
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260
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ISF31
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(252)
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Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
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Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ISF32
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(260)
<400> 15
Met Ile Glu Thr Tyr Ser Gln Pro Ser Pro Arg Ser Val Ala Thr Gly
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Leu Pro Ala Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
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Leu Leu Lys Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ISF33
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(252)
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Ile Ala Ala His Val Val Ser Glu Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Val
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Leu Gln Trp Ala Lys Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Val
130 135 140
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Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser
165 170 175
Gln Ala Pro Phe Ile Val Gly Leu Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser
180 185 190
Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ser Gln Leu
195 200 205
Cys Glu Gln Gln Ser Val His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro
210 215 220
Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His
225 230 235 240
Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
245 250
<210> 17
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(260)
<400> 17
Met Ile Glu Thr Tyr Ser Gln Pro Ser Pro Arg Ser Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Ala Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Val Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35 40 45
Arg Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu Val Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50 55 60
Phe Ile Lys Lys Leu Lys Arg Cys Asn Lys Gly Glu Gly Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Met Arg Arg Gln Phe Glu Asp Leu Val Lys
85 90 95
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100 105 110
Gln Arg Gly Asp Glu Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Val Val Ser Glu
115 120 125
Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Val Leu Gln Trp Ala Lys Lys Gly Tyr
130 135 140
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165 170 175
Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Val Gly Leu
180 185 190
Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala
195 200 205
Asn Thr His Ser Ser Ser Gln Leu Cys Glu Gln Gln Ser Ile His Leu
210 215 220
Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val
225 230 235 240
Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly
245 250 255
Leu Leu Lys Leu
260
<210> 18
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ISF35
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(252)
<400> 18
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Asp Glu Asp Pro Gln
100 105 110
Ile Ala Ala His Val Val Ser Glu Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Val
115 120 125
Leu Gln Trp Ala Lys Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Val
130 135 140
Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr
145 150 155 160
Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser
165 170 175
Gln Ala Pro Phe Ile Val Gly Leu Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser
180 185 190
Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ser Gln Leu
195 200 205
Cys Glu Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro
210 215 220
Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His
225 230 235 240
Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
245 250
<210> 19
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ISF36
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(260)
<400> 19
Met Ile Glu Thr Tyr Ser Gln Pro Ser Pro Arg Ser Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Ala Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Val Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35 40 45
Arg Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu Val Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50 55 60
Phe Ile Lys Lys Leu Lys Arg Cys Asn Lys Gly Glu Gly Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Met Arg Arg Gln Phe Glu Asp Leu Val Lys
85 90 95
Asp Ile Thr Leu Asn Lys Glu Glu Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met
100 105 110
Gln Arg Gly Asp Glu Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Val Val Ser Glu
115 120 125
Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Val Leu Gln Trp Ala Lys Lys Gly Tyr
130 135 140
Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu
145 150 155 160
Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe
165 170 175
Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Val Gly Leu
180 185 190
Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala
195 200 205
Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu
210 215 220
Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Cys Phe Val Asn Val
225 230 235 240
Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly
245 250 255
Leu Leu Lys Leu
260
<210> 20
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ISF37
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(252)
<400> 20
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35 40 45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys
85 90 95
Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Asp Glu Asp Pro Gln
100 105 110
Ile Ala Ala His Val Val Ser Glu Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Val
115 120 125
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130 135 140
Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr
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Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser
165 170 175
Gln Ala Pro Phe Ile Val Gly Leu Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser
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Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro
195 200 205
Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro
210 215 220
Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His
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Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
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<212> PRT
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<220>
<221> 肽
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<400> 21
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1 5 10 15
Leu Pro Ala Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
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Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Val Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
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Arg Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu Val Asn Leu His Glu Asp Phe Val
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Phe Ile Lys Lys Leu Lys Arg Cys Asn Lys Gly Glu Gly Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Met Arg Arg Gln Phe Glu Asp Leu Val Lys
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Asp Ile Thr Leu Asn Lys Glu Glu Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met
100 105 110
Gln Arg Gly Asp Glu Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Val Val Ser Glu
115 120 125
Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Val Leu Gln Trp Ala Lys Lys Gly Tyr
130 135 140
Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu
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Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe
165 170 175
Cys Ser Asn Arg Glu Pro Ser Ser Gln Arg Pro Phe Ile Val Gly Leu
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Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala
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Asn Thr His Ser Ser Ser Gln Leu Cys Glu Gln Gln Ser Ile His Leu
210 215 220
Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val
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Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<220>
<221> 肽
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<400> 22
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Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
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Gln Arg Pro Phe Ile Val Gly Leu Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser
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Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
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<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ISF40
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(260)
<400> 23
Met Ile Glu Thr Tyr Ser Gln Pro Ser Pro Arg Ser Val Ala Thr Gly
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Leu Pro Ala Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
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Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Val Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
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Arg Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu Val Asn Leu His Glu Asp Phe Val
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65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Met Arg Arg Gln Phe Glu Asp Leu Val Lys
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Asp Ile Thr Leu Asn Lys Glu Glu Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met
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115 120 125
Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Val Leu Gln Trp Ala Lys Lys Gly Tyr
130 135 140
Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu
145 150 155 160
Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe
165 170 175
Cys Ser Asn Arg Glu Pro Ser Ser Gln Arg Pro Phe Ile Val Gly Leu
180 185 190
Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala
195 200 205
Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu
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Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val
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Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly
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Leu Leu Lys Leu
260
<210> 24
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ISF41
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(252)
<400> 24
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35 40 45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50 55 60
Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys
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Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Asp Glu Asp Pro Gln
100 105 110
Ile Ala Ala His Val Val Ser Glu Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Val
115 120 125
Leu Gln Trp Ala Lys Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Val
130 135 140
Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr
145 150 155 160
Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Pro Ser Ser
165 170 175
Gln Arg Pro Phe Ile Val Gly Leu Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser
180 185 190
Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro
195 200 205
Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro
210 215 220
Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His
225 230 235 240
Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu
245 250
<210> 25
<211> 3768
<212> DNA
<213> SARS-CoV-1
<400> 25
atgtttattt tcttattatt tcttactctc actagtggta gtgaccttga ccggtgcacc 60
acttttgatg atgttcaagc tcctaattac actcaacata cttcatctat gaggggggtt 120
tactatcctg atgaaatttt tagatcagac actctttatt taactcagga tttatttctt 180
ccattttatt ctaatgttac agggtttcat actattaatc atacgtttga caaccctgtc 240
atacctttta aggatggtat ttattttgct gccacagaga aatcaaatgt tgtccgtggt 300
tgggtttttg gttctaccat gaacaacaag tcacagtcgg tgattattat taacaattct 360
actaatgttg ttatacgagc atgtaacttt gaattgtgtg acaacccttt ctttgctgtt 420
tctaaaccca tgggtacaca gacacatact atgatattcg ataatgcatt taattgcact 480
ttcgagtaca tatctgatgc cttttcgctt gatgtttcag aaaagtcagg taattttaaa 540
cacttacgag agtttgtgtt taaaaataaa gatgggtttc tctatgttta taagggctat 600
caacctatag atgtagttcg tgatctacct tctggtttta acactttgaa acctattttt 660
aagttgcctc ttggtattaa cattacaaat tttagagcca ttcttacagc cttttcacct 720
gctcaagaca cttggggcac gtcagctgca gcctattttg ttggctattt aaagccaact 780
acatttatgc tcaagtatga tgaaaatggt acaatcacag atgctgttga ttgttctcaa 840
aatccacttg ctgaactcaa atgctctgtt aagagctttg agattgacaa aggaatttac 900
cagacctcta atttcagggt tgttccctca ggagatgttg tgagattccc taatattaca 960
aacttgtgtc cttttggaga ggtttttaat gctactaaat tcccttctgt ctatgcatgg 1020
gagagaaaaa aaatttctaa ttgtgttgct gattactctg tgctctacaa ctcaacattt 1080
ttttcaacct ttaagtgcta tggcgtttct gccactaagt tgaatgatct ttgcttctcc 1140
aatgtctatg cagattcttt tgtagtcaag ggagatgatg taagacaaat agcgccagga 1200
caaactggtg ttattgctga ttataattat aaattgccag atgatttcat gggttgtgtc 1260
cttgcttgga atactaggaa cattgatgct acttcaactg gtaattataa ttataaatat 1320
aggtatctta gacatggcaa gcttaggccc tttgagagag acatatctaa tgtgcctttc 1380
tcccctgatg gcaaaccttg caccccacct gctcttaatt gttattggcc attaaatgat 1440
tatggttttt acaccactac tggcattggc taccaacctt acagagttgt agtactttct 1500
tttgaacttt taaatgcacc ggccacggtt tgtggaccaa aattatccac tgaccttatt 1560
aagaaccagt gtgtcaattt taattttaat ggactcactg gtactggtgt gttaactcct 1620
tcttcaaaga gatttcaacc atttcaacaa tttggccgtg atgtttctga tttcactgat 1680
tccgttcgag atcctaaaac atctgaaata ttagacattt caccttgctc ttttgggggt 1740
gtaagtgtaa ttacacctgg aacaaatgct tcatctgaag ttgctgttct atatcaagat 1800
gttaactgca ctgatgtttc tacagcaatt catgcagatc aactcacacc agcttggcgc 1860
atatattcta ctggaaacaa tgtattccag actcaagcag gctgtcttat aggagctgag 1920
catgtcgaca cttcttatga gtgcgacatt cctattggag ctggcatttg tgctagttac 1980
catacagttt ctttattacg tagtactagc caaaaatcta ttgtggctta tactatgtct 2040
ttaggtgctg atagttcaat tgcttactct aataacacca ttgctatacc tactaacttt 2100
tcaattagca ttactacaga agtaatgcct gtttctatgg ctaaaacctc cgtagattgt 2160
aatatgtaca tctgcggaga ttctactgaa tgtgctaatt tgcttctcca atatggtagc 2220
ttttgcacac aactaaatcg tgcactctca ggtattgctg ctgaacagga tcgcaacaca 2280
cgtgaagtgt tcgctcaagt caaacaaatg tacaaaaccc caactttgaa atattttggt 2340
ggttttaatt tttcacaaat attacctgac cctctaaagc caactaagag gtcttttatt 2400
gaggacttgc tctttaataa ggtgacactc gctgatgctg gcttcatgaa gcaatatggc 2460
gaatgcctag gtgatattaa tgctagagat ctcatttgtg cgcagaagtt caatggactt 2520
acagtgttgc cacctctgct cactgatgat atgattgctg cctacactgc tgctctagtt 2580
agtggtactg ccactgctgg atggacattt ggtgctggcg ctgctcttca aatacctttt 2640
gctatgcaaa tggcatatag gttcaatggc attggagtta cccaaaatgt tctctatgag 2700
aaccaaaaac aaatcgccaa ccaatttaac aaggcgatta gtcaaattca agaatcactt 2760
acaacaacat caactgcatt gggcaagctg caagacgttg ttaaccagaa tgctcaagca 2820
ttaaacacac ttgttaaaca acttagctct aattttggtg caatttcaag tgtgctaaat 2880
gatatccttt cgcgacttga taaagtcgag gcggaggtac aaattgacag gttaattaca 2940
ggcagacttc aaagccttca aacctatgta acacaacaac taatcagggc tgctgaaatc 3000
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agagttgact tttgtggaaa gggctaccac cttatgtcct tcccacaagc agccccgcat 3120
ggtgttgtct tcctacatgt cacgtatgtg ccatcccagg agaggaactt caccacagcg 3180
ccagcaattt gtcatgaagg caaagcatac ttccctcgtg aaggtgtttt tgtgtttaat 3240
ggcacttctt ggtttattac acagaggaac ttcttttctc cacaaataat tactacagac 3300
aatacatttg tctcaggaaa ttgtgatgtc gttattggca tcattaacaa cacagtttat 3360
gatcctctgc aacctgagct tgactcattc aaagaagagc tggacaagta cttcaaaaat 3420
catacatcac cagatgttga tcttggcgac atttcaggca ttaacgcttc tgtcgtcaac 3480
attcaaaaag aaattgaccg cctcaatgag gtcgctaaaa atttaaatga atcactcatt 3540
gaccttcaag aattgggaaa atatgagcaa tatattaaat ggccttggta tgtttggctc 3600
ggcttcattg ctggactaat tgccatcgtc atggttacaa tcttgctttg ttgcatgact 3660
agttgttgca gttgcctcaa gggtgcatgc tcttgtggtt cttgctgcaa gtttgatgag 3720
gatgactctg agccagttct caagggtgtc aaattacatt acacataa 3768
<210> 26
<211> 1273
<212> PRT
<213> SARS-CoV-1
<400> 26
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
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900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
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930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
1010 1015 1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1055 1060 1065
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
1070 1075 1080
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
1085 1090 1095
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln
1100 1105 1110
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
1115 1120 1125
Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro
1130 1135 1140
Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
1145 1150 1155
His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1160 1165 1170
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
1175 1180 1185
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1205 1210 1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1250 1255 1260
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 27
<211> 3822
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 27
atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60
agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120
aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180
aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240
aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300
ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360
aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420
ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480
tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540
ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600
tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660
tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720
ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780
ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840
gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900
tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960
caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020
gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080
tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140
ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200
gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260
tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320
cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380
ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440
aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500
aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560
ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620
ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680
cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740
acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800
ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860
cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920
aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980
gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040
cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100
gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160
agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220
tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280
acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340
gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400
aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460
ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520
cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580
ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640
acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700
caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760
aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820
acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880
acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940
ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000
cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060
tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120
gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180
gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240
atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300
cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360
tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420
ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480
tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540
aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600
caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660
atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720
tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780
tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aa 3822
<210> 28
<211> 1273
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 28
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
1010 1015 1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1055 1060 1065
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
1070 1075 1080
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
1085 1090 1095
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln
1100 1105 1110
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
1115 1120 1125
Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro
1130 1135 1140
Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
1145 1150 1155
His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1160 1165 1170
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
1175 1180 1185
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1205 1210 1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1250 1255 1260
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270

Claims (43)

1.一种组合物，包含：
冠状病毒疫苗；和
嵌合CD40L多肽或编码嵌合CD40L多肽的核酸中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述CD40L多肽选自由ISF30、ISF31、ISF32、ISF33、ISF34、ISF35、ISF36、ISF37、ISF38、ISF39、ISF40和ISF41组成的组。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中，所述嵌合CD40L多肽或编码嵌合CD40L多肽的核酸是ISF35。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述编码嵌合CD40L多肽的核酸包含载体。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述载体是DNA或RNA载体。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述载体是病毒载体或质粒DNA载体。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中，所述病毒载体选自由腺病毒、痘病毒、甲病毒、沙粒病毒、黄病毒、弹状病毒、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、副粘病毒、冠状病毒和小核糖核酸病毒组成的组。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中，所述病毒载体是腺病毒载体。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述冠状病毒疫苗包含编码冠状病毒抗原的表达构建体。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中，所述冠状病毒抗原是SARS-CoV-1或SARS-CoV-2的冠状病毒刺突蛋白。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述冠状病毒疫苗包含冠状病毒抗原。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中，所述冠状病毒抗原包含纯化的多肽。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中，所述纯化的多肽是冠状病毒刺突蛋白。
14.根据权利要求11所述的组合物，其中，所述冠状病毒抗原包含灭活的冠状病毒颗粒。
15.根据权利要求1所述的组合物，其适合施用于人受试者或动物受试者。
16.根据权利要求9所述的组合物，其中，所述编码嵌合CD40L多肽的核酸和所述冠状病毒抗原由相同的表达载体编码。
17.一种增强免疫力的方法，包括：
向人或动物施用有效量的根据权利要求1所述的组合物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，施用有效量的根据权利要求1所述的组合物包括选自由口服、鼻腔、局部和注射组成的组中的施用途径。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述施用途径是注射并且选自由皮下、皮内、肌内、静脉内、气管内和腹膜内注射组成的组。
20.一种增强免疫力的方法，包括：
施用包含冠状病毒疫苗的药物制剂；和
施用包含嵌合CD40L多肽或编码嵌合CD40L多肽的核酸中的至少一种的药物制剂。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，施用包含嵌合CD40L多肽或编码嵌合CD40L多肽的核酸中的至少一种的药物制剂的步骤与施用包含冠状病毒疫苗的药物制剂的步骤在大约相同的时间进行。
22.一种增强免疫力的方法，包括：
将包含冠状病毒疫苗的药物制剂与包含嵌合CD40L多肽或编码嵌合CD40L多肽的核酸中的至少一种的药物制剂混合；
向人或动物施用混合的制剂。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，混合步骤发生在施用步骤之前。
24.一种增强免疫力的方法，包括：施用包含冠状病毒疫苗，以及嵌合CD40L多肽或编码嵌合CD40L多肽的核酸构建体中的一种的药物制剂。
25.用于向人或动物施用的试剂盒，包括：
包含冠状病毒疫苗的药物制剂；和
包含嵌合CD40L多肽或编码嵌合CD40L多肽的核酸中的至少一种的药物制剂。
26.根据权利要求20所述的方法，其中，所述包含冠状病毒疫苗的药物制剂是编码冠状病毒抗原的病毒表达载体，其中所述制剂中的病毒颗粒的量为1e5至1e12个病毒颗粒。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述病毒颗粒的量为1e8至1e11个病毒颗粒。
28.根据权利要求26所述的方法，其中，所述病毒颗粒的量是1e10个病毒颗粒。
29.根据权利要求20所述的方法，其中，包含嵌合CD40L多肽或编码嵌合CD40L多肽的核酸中的至少一种的所述药物制剂包含编码嵌合CD40L多肽的病毒表达载体，其中所述制剂中的病毒颗粒的量为1e5至1e12个病毒颗粒。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述病毒颗粒的量为1e8至1e11个病毒颗粒。
31.根据权利要求29所述的方法，其中，所述病毒颗粒的量是1e10个病毒颗粒。
32.根据权利要求20所述的方法，其中，所述冠状病毒疫苗包含纯化的冠状病毒刺突蛋白。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，冠状病毒疫苗的所述药物制剂包含量为1微克至100微克的冠状病毒刺突蛋白。
34.根据权利要求30所述的方法，其中，所述冠状病毒刺突蛋白的量为20微克。
35.根据权利要求20所述的方法，其中，所述嵌合CD40L多肽或编码嵌合CD40L多肽的核酸中的至少一种是嵌合CD40L多肽，并且所述多肽以1微克至100微克的量存在。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述嵌合CD40L多肽的量是20微克。
37.一种组合物，包含：
冠状病毒疫苗的药物制剂；和
嵌合CD40L多肽或编码嵌合CD40L多肽的核酸中的至少一种的药物制剂。
38.根据权利要求37所述的组合物，其中，冠状病毒疫苗的所述药物制剂包含编码冠状病毒抗原的病毒表达载体，其中所述制剂中的病毒颗粒的量为1e5至1e12个病毒颗粒。
39.根据权利要求37所述的组合物，其中，包含嵌合CD40L多肽或编码嵌合CD40L多肽的核酸中的至少一种的所述药物制剂包含编码嵌合CD40L多肽的病毒表达载体，其中所述制剂中的病毒颗粒的量为1e5至1e12个病毒颗粒。
40.根据权利要求37所述的组合物，其中，冠状病毒疫苗的所述药物制剂包含冠状病毒刺突蛋白。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中，所述药物制剂中的冠状病毒刺突蛋白的量为1至100微克。
42.根据权利要求37所述的组合物，其中，嵌合CD40L多肽或编码嵌合CD40L多肽的核酸中的至少一种是嵌合CD40L多肽。
43.根据权利要求42所述的组合物，其中，所述嵌合CD40L多肽的量为1至100微克。
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