ES2633470T3

ES2633470T3 - Métodos y composiciones de generación de una respuesta inmune mediante la inducción de CD40 y adaptadores de receptores de reconocimiento de patrones

Info

Publication number: ES2633470T3
Application number: ES09815355.4T
Authority: ES
Inventors: David Spencer; Narayanan Priyadharshini
Original assignee: Baylor College of Medicine
Current assignee: Baylor College of Medicine
Priority date: 2008-09-22
Filing date: 2009-09-21
Publication date: 2017-09-21
Anticipated expiration: 2029-09-21
Also published as: US20180305667A1; EP3238739A1; JP2015129192A; CA2738031C; DK2331680T3; US20240124552A1; JP2014168479A; AU2009292996A1; ES2840750T3; EP2331680A1; WO2010033949A1; US20140087468A1; US20150111294A1; US9315559B2; US20100203067A1; JP2018184471A; US20210009655A1; EP2331680B1; EP3238739B1; JP2017114911A

Abstract

Un método in vitro de activación de una célula presentadora de antígeno, que comprende: transfectar o transducir una célula presentadora de antígeno con un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína quimérica, en el que la proteína quimérica comprende (i) una región dirigida a la membrana; (ii) un dominio de unión al ligando FKBP; (iii) una región de polipéptido CD40 citoplasmático carente del dominio extracelular; y (iv) un polipéptido MyD88 truncado carente del dominio TIR; y poner en contacto la célula presentadora de antígeno con FK506 dimérico o un análogo de FK506 dimérico que se une al dominio de unión al ligando; mediante lo que se activa la célula presentadora de antígeno.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

5

15

25

35

45

55

65

a la miristoilación.

La región de unión al ligando se puede seleccionar del grupo que consiste en región de unión al ligando FKBP, región de unión al ligando del receptor de ciclofilina, región de unión al ligando del receptor de esteroide, región de unión al ligando de los receptores de ciclofilina y región de unión al ligando del receptor de tetraciclina. A menudo, la región de unión al ligando comprende una secuencia de Fv'Fvls. A veces, la secuencia de Fv'Fvls comprende además una secuencia Fv' adicional.

El ligando puede ser una molécula pequeña. Los expertos en la materia pueden seleccionar el ligando apropiado para la región de unión al ligando seleccionada. A menudo, el ligando es dimérico, a veces, el ligando es un FK506 dimérico o un análogo dimérico de FK506. El ligando puede ser AP1903 o AP20187.

El ácido nucleico puede estar contenido en un vector vírico. Los expertos habituales en la materia pueden seleccionar el vector vírico apropiado. En ciertas realizaciones, el vector vírico es un vector adenovírico. Se entiende que, en algunos aspectos tratados en el presente documento, la célula presentadora de antígeno se pone en contacto con el vector vírico ex vivo y, en algunos aspectos descritos en al presente documento, la célula presentadora de antígeno se pone en contacto con el vector vírico in vivo.

En algunos aspectos descritos en el presente documento, la célula presentadora de antígeno es una célula dendrítica, por ejemplo, una célula dendrítica de mamífero. A menudo, la célula presentadora de antígeno es una célula dendrítica humana.

En ciertos aspectos descritos en el presente documento, la célula presentadora de antígeno también se pone en contacto con un antígeno. A menudo, la célula presentadora de antígeno se pone en contacto con el antígeno ex vivo. A veces, la célula presentadora de antígeno se pone en contacto con el antígeno in vivo. En algunos aspectos descritos en el presente documento, la célula presentadora de antígeno está en un sujeto, y se genera una respuesta inmune contra el antígeno. A veces, la respuesta inmune es una respuesta inmune de linfocitos T citotóxicos (CTL). A veces, la respuesta inmune se genera contra un antígeno tumoral. En ciertos aspectos tratados en el presente documento, la célula presentadora de antígeno se activa sin la adición de un adyuvante.

En algunos aspectos tratados en el presente documento, la célula presentadora de antígeno se transduce con el ácido nucleico ex vivo y se administra al sujeto mediante administración intradérmica. En algunos aspectos tratados en el presente documento, la célula presentadora de antígeno se transduce con el ácido nucleico ex vivo y se administra al sujeto mediante administración subcutánea. A veces, la célula presentadora de antígeno se transduce con el ácido nucleico ex vivo. A veces, la célula presentadora de antígeno se transduce con el ácido nucleico in vivo.

También se proporcionan en el presente documento composiciones que se pueden usar, por ejemplo, en los métodos de la presente invención. Así pues, se proporcionan composiciones que comprenden un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína quimérica, en las que la proteína quimérica comprende

(i) una región dirigida a la membrana, (ii) una región de unión al ligando, (iii) una región de polipéptido CD40 citoplasmático y (iv) un péptido MyD88 truncado carente de dominio TIR según lo definido en las reivindicaciones. A veces, el péptido MyD88 truncado está codificado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5. A menudo, el ácido nucleico comprende una secuencia promotora unida operativamente a la secuencia polinucleotídica. Los expertos en la materia pueden seleccionar una secuencia promotora apropiada, incluyendo, sin limitación, una secuencia promotora descrita en el presente documento.

Los expertos en la materia pueden seleccionar cualquier región dirigida a la membrana conocida apropiada, incluyendo, sin limitación, una región dirigida a la miristoilación, región dirigida a la palmitoilación, región dirigida a la prenilación o región transmembrana del receptor. A menudo, la región dirigida a la membrana es una región dirigida a la miristoilación.

La región de unión al ligando es una región de unión al ligando FKBP. A menudo, la región de unión al ligando comprende una secuencia de Fv'Fvls. A veces, la secuencia de Fv'Fvls comprende además una secuencia Fv’ adicional.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico está contenido dentro de un vector vírico. Los expertos en la materia pueden seleccionar el vector vírico apropiado. En ciertas realizaciones, el vector vírico es un vector adenovírico. Se entiende que, en algunas realizaciones, la célula presentadora de antígeno se pone en contacto con el vector vírico ex vivo y, en algunas realizaciones, la célula presentadora de antígeno se pone en contacto con el vector vírico in vivo.

También se proporcionan composiciones que comprenden una célula transducida con una composición de ácido nucleico de cualquiera de las realizaciones presentadas en el presente documento. En algunas realizaciones, la célula es una célula presentadora de antígeno. A menudo, la célula es una célula dendrítica, incluyendo, sin limitación, una célula de mamífero, por ejemplo, pero sin limitación, una célula dendrítica humana.

7

imagen6

5

15

25

35

45

55

65

presente documento, la célula presentadora de antígeno está en un sujeto y se genera una respuesta inmune contra el antígeno, tal como una respuesta inmune de linfocitos T citotóxicos (CTL). En ciertos aspectos tratados en el presente documento, se genera una respuesta inmune contra un antígeno tumoral (por ejemplo, PSMA). En algunos aspectos tratados en el presente documento, el ácido nucleico se prepara ex vivo y se administra al sujeto mediante la administración intradérmica o mediante la administración subcutánea, por ejemplo. A veces la célula presentadora de antígeno se transduce o se transfecta con el ácido nucleico ex vivo o in vivo. En algunos aspectos tratados en el presente documento, el ácido nucleico comprende una secuencia promotora unida operativamente a la secuencia polinucleotídica. Como alternativa, el ácido nucleico comprende un ARN transcrito ex vivo que contiene la región codificante de la proteína quimérica.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Diagrama esquemático de iCD40 y expresión en DC humanas. A. El dominio citoplasmático de CD40 humano puede subclonarse cadena abajo de un dominio dirigido a la miristoilación (M) y dos dominios en tándem (Fv) (Clackson T., Yang W., Rozamus L. W., et al. “Redesigning an FKBP-Iigand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity”. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 1998; 95:10437-10442). La expresión de la proteína quimérica M-Fv-Fv-CD40, denominada en el presente documento CD40 inducible (iCD40) puede estar bajo control del promotor de citomegalovirus (CMV). B. La expresión de las formas endógena (eCD40) y recombinante inducible (iCD40) de CD40 evaluadas mediante transferencia Western. Carril 1, DC de tipo silvestre (control de CD40 endógeno); Carril 2, DC estimuladas con 1 microgramo/ml de LPS; Carriles 3 y 4, DC transducidas con

10.000 VP/célula (MOI ~ 160) de Ad5/f35-iCD40 (iCD40-DC) con y sin fármaco dimerizante AP20187, respectivamente; Carril 5, iCD40-DC estimulados con LPS y AP20187; Carril 6, DC estimuladas con CD40L (ligando de CD40, una proteína miembro de la familia TNF a) y LPS; Carril 7, DC transducidas con Ad5/f35-GFP (GFP-DC) a una MOI de 160 y estimuladas con AP20187 y LPS; Carril 8, GFP-DC estimuladas con AP20187; Carril 9, linfocitos T 293 transducidos con Ad5/f35-iCD40 (control positivo para la forma inducible de CD40). Los niveles de expresión de alfa-tubulina sirvieron como control interno. Figura 2. Esquema de iCD40. La administración del fármaco dimerizante permeable a lípidos, AP20187/AP19031 conduce a la oligomerización del dominio citoplasmático de CD40, modificado para contener dominios de unión a AP20187 y una secuencia dirigida a la miristoilación. La Figura 3 es un esquema de la TLR inducibles por CID. La Figura 4 es un esquema de los receptores de tipo Toll de material compuesto inducibles por CID (icTLR). La Figura 5 es un esquema de las TLR de material compuesto inducibles por CID (icTLR)/CD40. Figura 6: Las principales relaciones entre los receptores de tipo Toll (TLR), sus adaptadores, proteínas quinasa que están unidas a los mismos, y efectos de señalización cadena abajo. Nature 430, 257-263 (8 de Julio de 2004). Figura 7. iNod2 e iCD40 en células 293. Se transfectaron células 293 de forma transitoria a una velocidad de 1 millón de células/pocillo (de una placa de 6 pocillos) junto con plásmidos de expresión de 3 microgramos para el iNod-2 quimérico y 1 microgramo de plásmido indicador SEAP dependiente de NF-kappaB (indicado como R en la Figura). Se usó iCD40 como control positivo. Figura 8. iRIG-1 e iMyD88 en células RAW264.7. Se transfectaron células RAW 264.7 transitoriamente junto con plásmidos de expresión de 3 microgramos para iRIG-1 y 1 microgramo de plásmido indicador SEAP dependiente de IFN-gamma; y 3 microgramos de iMyD88 con 1 microgramo de plásmido indicador SEAP dependiente de NFkappaB. Figura 9. Esquema de los receptores de reconocimiento de patrones. Figura 10A. Esquema de un ejemplo de plásmido de iPRR. Figura 10B. Esquema de un ejemplo de plásmido de iPRR. Figura 10C. Esquema de un ejemplo de plásmido de iPRR. La Figura 11 es una gráfica de inducción del indicador de SEAP de NF-kappa B en iRIG, iNOD2 y células 293 transfectadas con iCD40. La Figura 12 es una gráfica de inducción del indicador de SEAP de NF-kappa B en iRIG-I y células 293 transfectadas con iCD40. La Figura 13 es una gráfica de inducción del indicador SEAP de NF-kappa B en iRIG, Icd40 y células 293 transfectadas con iRIG+CD40. La Figura 14 es una gráfica de inducción del indicador SEAP de NF-kappa B en iRIG-I y células Jurkat Tag transfectadas con iCD40. Las Figuras 15A y 15B proporcionan mapas de plásmidos para pSH1-Sn-RIGI-Fv’-Fvls-E y pSH1-Sn-Fv’-Fvls-RIGI-E, respectivamente. El término "Sn" representa "S" con un sitio Ncol, añadido con fines de clonación. El término "S" representa el término no-diana. La Figura 16 es un esquema de los receptores CD40 y MyD88 inducibles y la inducción de la actividad NF-kappa

B. La Figura 17 es un esquema de los receptores CD40/MyD88 quiméricos inducibles y la inducción de la actividad NF-kappa B. La Figura 18 es un gráfico de la activación de NF-kappa B en células 293 mediante MyD88 inducible y receptores de MyD88-CD40 quiméricos. CD40T indica CD40 "turbo", en el que el receptor incluye 3 copias del dominio FKBP12v36 (Fv'). La Figura 19 es un gráfico de la actividad de NF-kappa B mediante MyD88 (MyD88L) truncado inducible y

9 5

15

25

35

45

55

65

MyD88/CD40 truncado inducible quimérico después de 3 horas de incubación con sustrato. La Figura 20 es un gráfico de la actividad de NF-kappa B mediante MyD88 (MyD88L) truncado inducible y MyD88/CD40 truncado inducible quimérico después de 22 horas de incubación con sustrato. En este ensayo está presente una cierta saturación del ensayo. La Figura 21 es una transferencia Western de la proteína HA, tras la transducción de adenovirus-MyD88L de células 293T. La Figura 22 es una transferencia Western de la proteína HA, tras la transducción de adenovirus-MyD88L-CD40 de células 293T. La Figura 23 es un gráfico de un ensayo ELISA después de la infección por adenovirus de DC derivadas de la médula ósea con las construcciones de CD40 y MyD88 inducibles indicadas. La Figura 24 es un gráfico de los resultados de un ensayo ELISA similar al de la Figura 23. La Figura 25 es un gráfico de los resultados de un ensayo ELISA similar al de las Figuras 23 y 24, tras la infección con una cantidad superior de adenovirus. La Figura 26 es un gráfico de los resultados de un ensayo con indicador SEAP de NF-kappaB en células transfectadas con iRIG-1 e iCD40. La Figura 27 es un gráfico de los resultados de un ensayo de IFN-beta-indicador SEAP en células transfectadas con iRIG-1 e iTRIF. La Figura 28 es un gráfico que compara la activación de iTRIF de los indicadores de NF-kappa B e IFN-beta en células transfectadas. La Figura 29 es un gráfico de la activación de iNOD2 de un indicador de NF-kappaB en células transfectadas. La Figura 30 es un mapa de construcción de pShuttleX-iMyD88. La Figura 31 es un mapa de construcción de pShuttleX-CD4-TLR4L3-E. La Figura 32 es un mapa de construcción de pShuttleX-iMyD88E-CD40. La Figura 33 es un gráfico de barras que representa los resultados de una inducción dependiente de la dosis de la expresión de IL-12p70 en células dendríticas derivadas de monocitos humanos (moDC) transducidas con diferentes multiplicidades de infecciones de adenovirus que expresan una construcción compuesta de MyD88. CD40 inducible. La Figura 34 es un gráfico de barras que representa los resultados de una inducción dependiente del fármaco de la expresión de IL-12p70 en células dendríticas derivadas de monocitos humanos (moDC) transducidas con adenovirus que expresan diferentes construcciones inducibles. La Figura 35 es un gráfico de barras que representa los niveles de IL-12p70 en células dendríticas transducidas antes de la vacunación. La Figura 36(a) es un gráfico de la inhibición del crecimiento tumoral de EG.7-OVA en ratones vacunados con células dendríticas transducidas; La Figura 36(b) presenta fotos de ratones vacunados representativos; la Figura 36(c) es la gráfica de 36(a) incluyendo las barras de error. La Figura 37(a) es un diagrama de dispersión, y 37(b) es un gráfico de barras, que muestran la mayor frecuencia de linfocitos T CD8+ específicos de Ag inducidos por células dendríticas transducidas. La Figura 38 es un gráfico de barras que muestra la mayor frecuencia de linfocitos T CD8+ y linfocitos TH1 CD4+ IFNgamma+ específicos de Ag inducidos por células dendríticas transducidas. La Figura 39 presenta un esquema y los resultados de un ensayo de linfocitos citotóxicos in vivo. La Figura 40 es un gráfico de barras que resume los datos de una actividad de los CTL in vivo mejorada inducida por células dendríticas. La Figura 41 presenta los resultados representativos de un ensayo de CTL en ratones inducidos por células dendríticas transducidas. La Figura 42 presenta los resultados de tinción intracelular para los linfocitos TH2 productores de IL-4 en ratones inoculados con células dendríticas transducidas. La Figura 43 presenta los resultados de un ensayo de inhibición del crecimiento tumoral en ratones tratados con células transducidas con Ad5-iCD40.MyD88. La Figura 44 presenta un ensayo de linfocitos T específicos de un tumor en ratones tratados con células transducidas cib Ad5-iCD40.MyD88. La Figura 45 presenta los resultados de un ensayo de linfocitos citolíticos naturales usando esplenocitos de los ratones tratados como efectores. La Figura 46 presenta los resultados de un ensayo de linfocitos citotóxicos usando esplenocitos de los ratones tratados como efectores. La Figura 47 presenta los resultados de un ensayo ELISPot de IFN-gamma usando linfocitos T cultivados junto con células dendríticas transducidas con el vector indicado. La Figura 48 presenta los resultados de un ensayo de regulación positiva de CCR7 usando células dendríticas transformadas con el vector indicado, con o sin LPS como adyuvante. La Figura 49 presenta los resultados del ensayo de regulación positiva de CCR7 presentado en la Figura 48, con los datos de múltiples animales incluidos en un gráfico.

Descripción detallada

Como se usa en el presente documento, el uso de la palabra "un" o “una” cuando se usan junto con la expresión "que comprende" en las reivindicaciones y/o en la memoria descriptiva, puede significar también "uno", pero también se refiere al significado de "uno/a o más", "al menos uno/a" y “uno/a o más de uno/a". Además, las expresiones "que

10

imagen7

imagen8

5

15

25

35

45

55

65

El término "inmunocomprometido", como se usa en el presente documento, se define como un sujeto que tiene un sistema inmune reducido o debilitado. El estado inmunocomprometido puede deberse a un defecto o a una disfunción del sistema inmune o a otros factores que aumentan la susceptibilidad a la infección y/o a la enfermedad. Aunque dicha clasificación permite una base conceptual para la evaluación, los individuos inmunocomprometidos no se suelen ajustar por completo a un grupo u otro. Puede verse afectado más de un defecto en los mecanismos de defensa del organismo. Por ejemplo, los individuos con un defecto específico en los linfocitos T producido por el VIH pueden tener también neutropenia causada por los fármacos usados para el tratamiento antivírico o estar inmunocomprometidos debido a una rotura en la integridad de la piel y de las membranas mucosas. Un estado inmunocomprometido puede ser el resultado de líneas centrales permanentes u otros tipos de deterioro debido a la drogodependencia intravenosa; o estar producidos por neoplasias malignas secundarias, desnutrición o haber sido infectados por otros agentes infecciosos tales como tuberculosis o enfermedades de transmisión sexual, por ejemplo, sífilis o hepatitis.

Como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen reacciones adversas, alérgicas u otras reacciones perjudiciales cuando se administran a un animal o a un ser humano.

Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con los vectores o células presentados en el presente documento, se contempla su uso en composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar principios activos suplementarios a las composiciones.

Como se usa en el presente documento, el término "polinucleótido" se define como una cadena de nucleótidos. Además, los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos. Así pues, los ácidos nucleicos y polinucleótidos que se usan en el presente documento son indistintos. Un experto en la materia tiene el conocimiento general de que los ácidos nucleicos son polinucleótidos que se pueden hidrolizar a "nucleótidos" monoméricos. Los nucleótidos monoméricos se pueden hidrolizar a nucleósidos. Como se usan en el presente documento, los polinucleótidos incluyen, pero sin limitación, todas las secuencias de ácidos nucleicos que se obtienen por cualquier medio disponible en la técnica, incluyendo, sin limitación, medios recombinantes, es decir, la clonación de las secuencias de ácidos nucleicos de una biblioteca recombinante o de un genoma celular, usando la tecnología de clonación habitual y PCR™, y similares, y por medios sintéticos. Además, un experto en la materia reconoce que los polinucleótidos incluyen mutaciones de los polinucleótidos, que incluyen pero sin limitación, mutaciones de los nucleótidos o nucleósidos mediante métodos bien conocidos en la técnica.

Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" se define como una cadena de restos de aminoácidos que normalmente tienen una secuencia definida. Como se usa en el presente documento, el término polipéptido se usa indistintamente con los términos "péptidos" y "proteínas".

Como se usa en el presente documento, el término "promotor" se define como una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula o la maquinaria sintética introducida, requerida para iniciar la transcripción específica de un gen.

Como se usa en el presente documento, la expresión "regular una respuesta inmune " o "modular una respuesta inmune" se refieren a la capacidad de modificar la respuesta inmune. Por ejemplo, la composición es capaz de potenciar y/o activar la respuesta inmune. Además, la composición también es capaz de inhibir la respuesta inmune. La forma de regulación se determina por el ligando que se usa con la composición. Por ejemplo, un análogo dimérico del agente químico produce la dimerización del polipéptido coestimulante que conduce a la activación de las DC, sin embargo, un análogo monomérico del agente químico no produce la dimerización del polipéptido coestimulante, que no activaría las DC.

Los términos "transfección" y "transducción" se usan indistintamente y se refieren al proceso mediante el que se introduce una secuencia de ADN exógeno en una célula hospedadora eucariota. La transfección (o transducción) puede realizarse mediante uno cualquiera de una serie de medios que incluyen electroporación, microinyección, administración mediante pistola génica, infección retrovírica, lipofección, superfección y similares.

Como se usa en el presente documento, el término "singénico" se refiere a células, tejidos o animales que tienen genotipos que son idénticos o están estrechamente relacionados lo suficiente para permitir el trasplante de tejidos, o que son inmunológicamente compatibles. Por ejemplo, gemelos o animales idénticos de la misma cepa endogámica. Singénico e isogénico se pueden usar indistintamente.

El término "sujeto", como se usa en el presente documento, incluye, pero sin limitación, un organismo o un animal; un mamífero, incluyendo, por ejemplo, un ser humano, un primate no humano (por ejemplo, mono), ratón, cerdo, vaca, cabra, conejo, rata, cobaya, hámster, caballo, mono, oveja u otro mamífero no humano; un no mamífero, incluyendo, por ejemplo, un vertebrado no mamífero, tal como un pájaro (por ejemplo, un pollo o un pato) o un pez, y

13

imagen9

imagen10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

De acuerdo con las reivindicaciones, la molécula polipeptídica coestimulante es CD40. La molécula CD40 comprende una molécula de ácido nucleico que: (1) se hibrida en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que tiene la secuencia de un gen CD40 conocido; y (2) codifica un polipéptido CD40. El polipéptido CD40 carece de dominio extracelular. Las secuencias de polinucleótidos ilustrativas que codifican los polipéptidos CD40 incluyen, pero sin limitación, la SEQ ID NO: 1 y a las isoformas CD40 de otras especies. Se contempla que se pueden usar otras variantes normales o mutantes de CD40 en los presentes métodos y composiciones. Por lo tanto, una región CD40 puede tener una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia nativa en una o más sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos. Por ejemplo, se puede eliminar o eliminar eficazmente una o más regiones de unión al factor asociado al receptor de TNF (TRAF) (por ejemplo, se elimina o se altera una secuencia de aminoácidos de CD40 de modo que una proteína TRAF no se une o se une con afinidad inferior a la que se une a la secuencia de CD40 nativa). Se puede eliminar o alterar una región de unión a TRAF3 de manera que se elimine o se elimine eficazmente (por ejemplo, se pueden alterar o eliminar los aminoácidos 250-254, Hauer et al., PNAS 102 (8): 2874-2879 2005)).

Los presentes métodos pueden implicar la manipulación de material genético para producir construcciones de expresión que codifican una forma inducible de CD40 (iCD40). Dichos métodos implican la generación de construcciones de expresión que contienen, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica el dominio citoplasmático de CD40 y un medio para su expresión. El vector puede replicarse en una célula auxiliar apropiada, se pueden producir partículas víricas a partir de la misma y células infectadas con las partículas víricas recombinantes.

Por lo tanto, la molécula CD40 presentada en el presente documento puede carecer del dominio extracelular. El dominio extracelular puede estar truncado o eliminado. También se contempla que el dominio extracelular se puede mutar usando mutagénesis convencional, inserciones, eliminaciones o sustituciones para producir una molécula CD40 que no tiene un dominio extracelular funcional. Un ácido nucleico de CD40 puede tener la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1. Los ácidos nucleicos de CD40 también incluyen homólogos y alelos de un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1, así como, fragmentos funcionalmente equivalentes, variantes y análogos de los ácidos nucleicos anteriores. Los métodos de construcción de un vector de CD40 inducible se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n.º 7.404.950, expedida el 29 de julio de 2008.

En el contexto de la terapia génica, el gen será una secuencia de polinucleótidos heteróloga derivada de una fuente diferente a la del genoma vírico que proporciona la estructura principal del vector. El gen se deriva de una fuente procariota o eucariota tal como una bacteria, un virus, levadura, un parásito, una planta, o incluso un animal. El ADN heterólogo se deriva también de más de una fuente, es decir, una construcción multigénica o una proteína de fusión. El ADN heterólogo también puede incluir una secuencia reguladora, que se deriva de una fuente y del gen de una fuente diferente.

B. Regiones de unión al ligando

El dominio de unión al ligando ("dimerización") de la construcción de expresión puede ser cualquier dominio conveniente que permita la inducción usando un ligando natural y no natural, por ejemplo, un ligando sintético no natural. El dominio de unión al ligando puede ser interno o externo a la membrana celular, dependiendo de la naturaleza de la construcción y de la elección del ligando. Se conoce una amplia variedad de proteínas de unión al ligando, incluyendo los receptores, que incluyen proteínas de unión al ligando asociadas con las regiones citoplasmáticas indicadas anteriormente. Como se usa en el presente documento, la expresión "dominio de unión al ligando" se puede usar indistintamente con el término "receptor". Son de particular interés las proteínas de unión al ligando para las que se conocen ligandos (por ejemplo, ligandos orgánicos pequeños) o se pueden producir fácilmente. Estos dominios o receptores de unión al ligando incluyen los receptores de FKBP, según las reivindicaciones, y de la ciclofilina, los receptores esteroides, los receptores de la tetraciclina, los otros receptores indicados anteriormente, y similares, así como receptores "no naturales", que se pueden obtener a partir de anticuerpo, en particular, la subunidad de la cadena pesada o ligera, sus secuencias mutadas, las secuencias de aminoácidos aleatorios obtenidas mediante procedimientos estocásticos, las síntesis combinatorias, y similares. Los ejemplos incluyen, por ejemplo, los descritos en Kopytek, S. J., et al., Chemistry & Biology 7:313-321 (2000) y en Gestwicki, J. E., et al., Combinatorial Chem. & High Throughput Screening 10:667-675 (2007); Clackson T (2006) Chem Biol Drug Des 67:440-2; Clackson, T. “Controlling Protein-Protein Interactions Using Chemical Inducers and Disrupters of Dimerization,” en Chemical Biology: From Small Molecules to Systems Biology and Drug Design (Schreiber, s., et al., eds., Wiley, 2007)).

Para la mayor parte, los dominios de unión al ligando o los dominios receptores tendrán al menos aproximadamente 50 aminoácidos, y menos de aproximadamente 350 aminoácidos, normalmente, menos de 200 aminoácidos, bien como el dominio natural o como la parte activa truncada del mismo. El dominio de unión puede ser, por ejemplo, pequeño (< 25 kDa, para permitir una transfección eficaz en vectores víricos), monomérico (esto descarta el sistema de avidina-biotina), no inmunógeno, y debe ser sintéticamente accesible, permeable a células, tener ligandos no tóxicos que se pueden configurar para la dimerización.

16 5

15

25

35

45

55

65

El dominio receptor puede ser intracelular o extracelular dependiendo del diseño de la construcción de expresión y de la disponibilidad de un ligando adecuado. Para ligandos hidrófobos, el dominio de unión puede encontrarse en cualquier lado de la membrana, pero para los ligandos hidrófilos, en particular, los ligandos de proteínas, el dominio de unión normalmente será externo a la membrana celular, a menos que exista un sistema de transporte para internalizar el ligando en una forma la que esté disponible para la unión. Para un receptor intracelular, la construcción puede codificar un péptido señal y un dominio 5' o 3' transmembrana de la secuencia del dominio receptor o puede tener una secuencia señal 5' de unión al lípido de la secuencia del dominio receptor. Cuando el dominio receptor está entre el péptido señal y el dominio transmembrana, el dominio receptor será extracelular.

La parte de la construcción de expresión que codifica el receptor puede estar sometida a mutagénesis por una variedad de motivos. La proteína mutagenizada puede proporcionar una afinidad de unión superior, permitir la diferenciación por parte del ligando entre el receptor natural y el receptor mutagenizado, proporcionar oportunidades para diseñar una pareja receptor-ligando, o similares. El cambio en el receptor puede implicar cambios en los aminoácidos conocidos por encontrarse en el sitio de unión, mutagénesis aleatoria usando técnicas combinatorias, en las que los codones de los aminoácidos asociados con el sitio de unión u otros aminoácidos asociados con cambios conformacionales pueden someterse a mutagénesis cambiando el uno o varios codones del aminoácido en particular, tanto con cambios conocidos como aleatoriamente, expresando las proteínas resultantes en un hospedador procariota adecuado y, a continuación, seleccionando las proteínas resultantes para establecer la unión.

Se pueden usar anticuerpos o subunidades de anticuerpos, por ejemplo, de cadena pesada o ligera, en particular, fragmentos, más particularmente toda o parte de la región variable, o fusiones de la cadena pesada y ligera para crear una unión de alta afinidad, como el dominio de unión. Los anticuerpos que se contemplan incluyen aquellos que expresan ectópicamente un producto humano, tal como un dominio extracelular que no generaría una respuesta inmune y, en general, no se expresa en la periferia (es decir, fuera del SNC/área del cerebro). Dichos ejemplos, incluyen, pero sin limitación, receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (LNGFR) y proteínas superficiales embrionarias (es decir, antígeno carcinoembrionario).

Además, se pueden preparar anticuerpos contra moléculas hapténicas que sean fisiológicamente aceptables, y seleccionarse las subunidades de anticuerpos individuales para la afinidad de unión. El ADNc que codifica las subunidades puede aislarse y modificarse por eliminación de la región constante, partes de la región variable, mutagénesis de la región variable, o similares, para obtener un dominio de la proteína de unión que tenga la afinidad adecuada por el ligando. De esta forma, se puede emplear casi cualquier compuesto hapténico fisiológicamente aceptable como ligando o proporcionar un epítopo para el ligando. En vez de unidades de anticuerpos, se pueden emplear receptores naturales, en los que se conoce el dominio de unión y existe un ligando útil para la unión.

C. Oligomerización

La señal transducida normalmente será el resultado de la oligomerización mediada por el ligando de las moléculas de proteínas quiméricas, es decir, como resultado de la oligomerización tras la unión al ligando, aunque se pueden emplear otras uniones, por ejemplo, activación alostérica, para iniciar una señal. La construcción de la proteína quimérica variará con el orden de diversos dominios y el número de repeticiones de un dominio individual.

Para multimerizar el receptor, el ligando para los dominios de unión a ligando/dominios receptores de las proteínas quiméricas de la membrana superficial normalmente será multimérico en el sentido de que tendrá al menos dos sitios de unión, siendo cada uno de los sitios de unión capaz de unirse al dominio receptor del ligando. Lo deseable es que los ligandos en cuestión sean un dímero o un oligómero de orden superior, normalmente no mayor de aproximadamente tetramérico, de moléculas orgánicas sintéticas pequeñas, las moléculas individuales normalmente tienen al menos aproximadamente 150 Da y menos de aproximadamente 5 kDa, normalmente menos de aproximadamente 3 kDa. Se puede emplear una variedad de pares de ligandos y receptores sintéticos. Por ejemplo, en aspectos tratados en el presente documento que implican receptores naturales, se puede usar FK506 dimérico con un receptor FKBP12, se puede usar ciclosporina A dimerizada con el receptor de ciclofilina, estrógeno dimerizado con un receptor de estrógenos, glucocorticoides dimerizados con un receptor de glucocorticoides, tetraciclina dimerizada con el receptor de la tetraciclina, vitamina D dimerizada con el receptor de la vitamina D, y similares. Como alternativa, se pueden usar órdenes superiores de los ligandos, por ejemplo, se puede usar el trimérico. Para los aspectos tratados en el presente documento que implican receptores no naturales, por ejemplo, subunidades de anticuerpos, subunidades de anticuerpos modificados o receptores modificados y similares, se puede usar cualquiera de una gran variedad de compuestos. Una característica significativa de estas unidades de ligandos es que cada sitio de unión puede unirse al receptor con alta afinidad y pueden dimerizarse químicamente. Además, los expertos en la materia conocen métodos para equilibrar la hidrofobicidad/hidrofilidad de los ligandos de manera que pueden disolverse en suero a niveles funcionales, incluso difundirse a través de las membranas plasmáticas para la mayoría de las aplicaciones.

Los presentes métodos pueden utilizar la técnica de la dimerización inducida químicamente (CID) para producir una proteína o un polipéptido controlado condicionalmente. Además de que esta técnica es inducible, también es reversible, debido a la degradación del agente de dimerización lábil o a la administración de un inhibidor competitivo monomérico.

17 5

15

25

35

45

55

65

El sistema CID usa ligandos bivalentes sintéticos para reticular rápidamente las moléculas de señalización que se fusionan a los dominios de unión al ligando. Este sistema se ha usado para generar la oligomerización y la activación de la superficie celular (Spencer, D. M., et al., Science, 1993. 262: pág. 1019-1024; Spencer D. M. et al., Curr Biol 1996, 6:839-847; Blau, C. A. et al., Proc Natl Acad. Sci. EE.UU. 1997, 94:3076-3081) o proteínas citosólicas (Luo, Z. et al., Nature 1996, 383:181-185; MacCorkle, R. A. et al., Proc Natl Acad Sci, EE.UU., 1998, 95:3655-3660) o el reclutamiento de factores de transcripción a elementos de ADN para modular la transcripción (Ho, S. N. et al., Nature 1996, 382: 822-826, Rivera, V. M. et al., Nat. Med. 1996, 2: 1028-1032) o el reclutamiento de moléculas de señalización a la membrana plasmática para estimular la señalización (Spencer D. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1995, 92:9805-9809; Holsinger, L. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1995, 95:9810-9814).

El sistema CID se basa en la noción de que la agregación de receptores de superficie activa de manera eficaz las cascadas de señalización cadena abajo. En la realización más sencilla, el sistema CID usa un análogo dimérico del fármaco inmunosupresor permeable a los lípidos, FK506, que pierde su bioactividad normal, al tiempo que gana la capacidad de reticular moléculas fusionadas genéticamente a la proteína de unión a FK506, FKBP12. Mediante la fusión de una o más FKBP y una secuencia de miristoilación al dominio de señalización citoplasmático de un receptor diana, se puede estimular la señalización de una manera dependiente del fármaco dimerizante, pero independiente del ligando y del ectodominio. Esto proporciona al sistema control temporal, reversibilidad usando análogos de fármaco monoméricos y especificidad potenciada. La alta afinidad los CID AP20187/AP1903 de tercera generación para su dominio de unión, FKBP12 permite la activación específica del receptor recombinante in vivo sin la inducción de efectos secundarios no específicos a través de FKBP12 endógeno. Además, los ligandos sintéticos son resistentes a la degradación de la proteasa, haciéndolos más eficaces en la activación de los receptores in vivo que la mayoría de los agentes proteicos suministrados.

Los ligandos usados pueden unirse a dos o más de los dominios de unión al ligando. Un experto en la materia prevé que las proteínas quiméricas pueden unirse a más de un ligando cuando contienen más de un dominio de unión al ligando. Por lo general, el ligando es una no proteína o un compuesto químico. Los ligandos ilustrativos incluyen, pero sin limitación, FΚ506 dimérico (por ejemplo., FΚ1012).

Como el mecanismo de activación de CD40 se basa fundamentalmente en la trimerización, este receptor es particularmente adecuado para el sistema CID. La regulación de CID proporciona al sistema 1) control temporal; 2) reversibilidad mediante la adición de un monómero no activo tras los signos de una reacción autoinmune; y 3) potencial limitado para los efectos secundarios no específicos. Además, la activación de CD40 por DC inducible in vivo podría evitar el requisito de una segunda señal de "peligro" requerida normalmente para la inducción completa de la señalización de CD40, y podría fomentar potencialmente la supervivencia de las DC in situ permitiendo un cebado potenciado de los linfocitos T. Así pues, las vacunas de DC diseñadas para expresar iCD40 amplifican la respuesta de destrucción mediada por los linfocitos T regulando positivamente la expresión de DC de las moléculas de presentación de antígeno, moléculas de adhesión, citocinas promotoras de TH1 y factores prosupervivencia.

Otros sistemas de dimerización contemplados incluyen el sistema de cumermicina/ADN girasa B. La dimerización inducida por la cumermicina activa una proteína Raf modificada y estimula la cascada de la MAP quinasa. Véase Farrar et al., 1996.

D. Dirección a la membrana

Una secuencia dirigida a la membrana proporciona el transporte de la proteína quimérica a la membrana de la superficie celular, donde la misma u otras secuencias pueden codificar la unión de la proteína quimérica a la membrana de la superficie celular. Las moléculas en asociación con las membranas celulares contienen ciertas regiones que facilitan la asociación de la membrana, y dichas regiones se puede incorporar a una molécula de proteína quimérica para generar moléculas dirigidas a la membrana. Por ejemplo, algunas proteínas contienen secuencias en el extremo N o en el extremo C que están aciladas, y estas fracciones acilo facilitan la asociación de la membrana. Dichas secuencias son reconocidas por aciltransferasas y se suelen adaptar a un motivo de secuencia en particular. Algunos motivos de acilación son capaces de ser modificados con una sola fracción acilo (a menudo seguido por varios restos cargados positivamente (por ejemplo, c-Src: M-G-S-N-K-S-K-P-K-D-A-S-Q-R-R-R) para mejorar la asociación con grupos de cabeza lipídica aniónicos) y otros son capaces de ser modificados con múltiples fracciones acilo. Por ejemplo, la secuencia N-terminal de la proteína tirosina quinasa Src puede comprender una sola fracción miristoílo. Las regiones de acilación doble están situadas dentro de las regiones N-terminales de ciertas proteínas quinasas, tales como un subconjunto de miembros de la familia Src (por ejemplo, Yes, Fyn, Lck) y subunidades alfa de la proteína G. Dichas regiones de acilación doble se suelen encontrar dentro de los primeros dieciocho aminoácidos de dichas proteínas y se adaptan al motivo de secuencia Met-Gly-Cys-Xaa-Cys, donde Met está escindido, GIy está N-acilado y uno de los Cys está S-acilado. El GIy suele estar miristoilado y un Cys puede estar palmitoilado. Las regiones de acilación que conforman al motivo de secuencia Cys-Ala-Ala-Xaa (denominadas “cajas CAAX”), que pueden modificarse con fracciones isoprenilo C15 o C10, del extremo C de las subunidades gamma de la proteína G y otras proteínas (por ejemplo, dirección de la World Wide Web ebi.ac.uk/interpro/DίsplaylproEntry?ac=IPR001230) también se pueden utilizar. Estos y otros motivos de acilación son conocidos por el experto habitual en la materia (por ejemplo, Gauthier-Campbell et al., Molecular Biology of the Cell 15: 2205-2217 (2004); Glabati et al., Biochem. J. 303: 697-700 (1994) y Zlakine et al., J. Cell Science 110: 673

18

imagen11

imagen12

imagen13

imagen14

imagen15

imagen16

5

15

25

35

45

55

65

va a administrar el polinucleótido que se ha unido operativamente. Se han usado algunos ligandos para la transferencia génica mediada por el receptor (Wu y Wu, (1987) J. Biol. Chem., 262, 4429-4432; Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 87(9):3410-3414, 1990; Perales et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 91:4086-4090, 1994; Myers, EPO 0273085), que establece la operabilidad de la técnica. Se ha descrito la administración específica en el contexto de otro tipo de célula de mamífero (Wu y Wu, Adv. Drug Delivery Rev., 12:159-167, 1993). En ciertos aspectos, se selecciona un ligando para corresponder a un receptor expresado específicamente en la población de células diana.

Un componente de vehículo de administración de polinucleótidos de un vehículo dirigido a un polinucleótido específico de célula puede comprender un ligando de unión específico en combinación con un liposoma. El/los polinucleótido/s que se van a administrar se alojan en el liposoma, y el ligando de unión específico se incorpora funcionalmente a la membrana del liposoma. El liposoma se unirá específicamente de esta manera al/a los receptor/es de una célula diana y administrará el contenido a una célula. Dichos sistemas han demostrado ser funcionales usando sistemas, en los que, por ejemplo, se use el factor de crecimiento epidérmico (EGF) en la administración mediada por receptor de un polinucleótido a las células que presentan una regulación positiva del receptor de EGF.

El componente del vehículo de administración de polinucleótidos de un vehículo de administración dirigida puede ser el propio liposoma, que comprenderá preferentemente uno o más lípidos o glicoproteínas que dirigen la unión específica de células. Por ejemplo, se ha incorporado lactosil ceramida, un asiogangliósido terminado en galactosa, a liposomas, y se ha observado un aumento en la captación del gen de la insulina por parte de los hepatocitos (Nicolau et al., (1987) Methods Enzymol., 149,157-176). Se contempla que las construcciones transformantes específicas de los tejidos pueden administrarse específicamente a una célula diana de una manera similar.

9. Bombardeo de microproyectiles

Se pueden usar técnicas de bombardeo de microproyectiles para introducir un polinucleótido en al menos un orgánulo, una célula, un tejido o un organismo (patente de EE.UU. n.º 5.550.318; patente de EE.UU. n.º 5.538.880; patente de EE.UU. n.º 5.610.042; y solicitud PCT n.º WO 94/09699). Este método depende de la capacidad de acelerar los microproyectiles recubiertos de ADN a una alta velocidad, lo que les permite perforar membranas celulares y penetrar en las células sin destruirlas (Klein et al., (1987) Nature, 327,70-73). Existe una amplia variedad de técnicas de bombardeo con microproyectiles conocidas en la materia, muchas de las cuales son aplicables a los presentes métodos.

En este bombardeo de microproyectiles, se pueden recubrir una o más partículas con al menos un polinucleótido y administrarse a células mediante una fuerza propulsora. Se han desarrollado varios dispositivos para acelerar partículas pequeñas. Uno de dichos dispositivos se basa en una descarga de alto tensión para generar una corriente eléctrica que, a su vez, proporcione la fuerza motora (Yang et al., (1990) Proc. NatΊ Acad. Sci.. EE.UU., 87, 95689572). Los microproyectiles usados han consistido en sustancias biológicamente inertes tales como partículas o perlas de tungsteno u oro. Las partículas ilustrativas incluyen las comprendidas por tungsteno, platino y, preferentemente, oro. Se contempla que, en algunos casos, la precipitación de ADN sobre partículas metálicas no sería necesaria para la administración del ADN a una célula receptora usando el bombardeo de microproyectiles. Sin embargo, se contempla que las partículas puedan contener ADN en lugar de estar recubiertas con ADN. Las partículas recubiertas con ADN pueden aumentar el nivel de administración del ADN mediante el bombardeo de partículas pero no son, en ni por sí mismas, necesarias.

B. Ejemplos de métodos de transferencia mediada por vectores víricos

En determinadas realizaciones, se incorpora un transgén a una partícula vírica para mediar la transferencia génica a una célula. Por lo general, el virus simplemente se expondrá a la célula hospedadora adecuada en condiciones fisiológicas, permitiendo la captación del virus. Los presentes métodos se emplean ventajosamente usando una variedad de vectores víricos, como se analiza más adelante.

1. Adenovirus

El adenovirus es particularmente adecuado para su uso como vector de transferencia génica debido a su genoma de ADN de tamaño medio, facilidad de manipulación, títulos altos, amplia selección de células diana y alta infectividad. El genoma vírico de aproximadamente 36 kb se une por repeticiones terminales invertidas (ITR) de 100a a 200 pares de bases (pb), donde están contenidos elementos que actúan en cis necesarios para la replicación y el empaquetamiento del ADN vírico. Las regiones inicial (E) y posterior (L) del genoma que contienen diferentes unidades de transcripción se dividen al inicio de replicación del ADN vírico.

La región E1 (E1A y E1B) codifica las proteínas responsables de la regulación de la transcripción del genoma vírico y unos cuantos genes celulares. La expresión de la región E2 (E2A y E2B) da lugar a la síntesis de las proteínas para la replicación del ADN vírico. Estas proteínas participan en la replicación del ADN, la expresión final del gen y la desactivación de la célula hospedadora (Renan, M. J. (1990) RadiotherOncoI., 19, 197-218). Los productos de los

25 5

15

25

35

45

55

65

genes posteriores (L1, L2, L3, L4 y L5), incluyendo la mayoría de las proteínas de cápsidas víricas, solo se expresan después de un procesamiento significativo de una sola transcripción primaria caracterizada por el promotor posterior mayor (MLP). El MLP (situado a 16,8 unidades cartográficas) es particularmente eficaz durante la fase final de la infección, y todos los ARNm caracterizados a partir de este promotor poseen una secuencia líder 5' tripartita (TL), que les convierte en ARNm preferidos para la traducción.

Para optimizar el adenovirus para la terapia génica, es necesario aumentar al máximo la capacidad de transporte de manera que se puedan incluir grandes segmentos de ADN. Es también muy deseable reducir la toxicidad y la reacción inmunológica asociadas con determinados productos adenovíricos. Las dos metas son, de manera amplia, colindantes en tanto en cuanto dicha eliminación de genes adenovíricos sirve para ambos fines. Poniendo en práctica los presentes métodos, es posible conseguir ambas metas reteniendo a la vez la capacidad de manipular las construcciones terapéuticas con relativa facilidad.

El gran desplazamiento del ADN es posible gracias a que los elementos cis requeridos para la replicación del ADN vírico están situados en las repeticiones terminales invertidas (ITR) (100-200 pb) en cualquier extremo del genoma vírico lineal. Los plásmidos que contienen las ITR pueden replicarse en presencia de un adenovirus no defectuoso (Hay, R. T., et al., J Mol Biol. 5 de junio de 1984;175(4):493-510). Por lo tanto, la inclusión de estos elementos en un vector adenovírico debería permitir la replicación.

Además, la señal de empaquetamiento para la encapsulación vírica se localiza entre los pb 194-385 (0,5-1,1 unidades cartográficas) en el extremo izquierdo del genoma vírico (Hearing et al., J. (1987) Virol., 67,2555-2558). Esta señal imita el sitio de reconocimiento de la proteína en el ADN del bacteriófago lambda donde una secuencia específica cierra el extremo izquierdo, pero lejos de la secuencia del extremo cohesivo, media la unión a las proteínas que se requieren para la inserción del ADN en la estructura de cabeza. Los vectores de sustitución E1 de Ad han demostrado que un fragmento de 450 pb (0-1,25 unidades cartográficas) en el extremo izquierdo del genoma vírico podría dirigir el empaquetamiento en células 293 (Levrero et al., Gene, 101:195-202, 1991).

Anteriormente, se ha demostrado que se pueden incorporar ciertas regiones del genoma adenovírico al genoma de células de mamífero, mediante lo que se pueden expresar los genes codificados. Estas líneas celulares son capaces de soportar la replicación de un vector adenovírico que sea deficiente en la función adenovírica codificada por la línea celular. También se han publicado informes sobre la complementación de vectores adenovíricos deficientes en la replicación por vectores "auxiliares", por ejemplo, el virus de tipo silvestre o mutantes condicionalmente defectuosos.

Se pueden complementar vectores adenovíricos deficientes en la replicación, en trans, por el virus auxiliar. Esta observación sola no permite el aislamiento de los vectores deficientes en la replicación; sin embargo, debido a la presencia del virus auxiliar, necesaria para proporcionar funciones replicativas, podría contaminarse cualquier preparado. Así pues, era necesario un elemento adicional que pudiera añadir especificidad a la replicación y/o al empaquetamiento del vector deficiente en la replicación. Este elemento se deriva de la función de empaquetamiento del adenovirus.

Se ha mostrado que existe una señal de empaquetamiento para el adenovirus en el extremo izquierdo de la cartografía convencional del adenovirus (Tibbetts et. al. (1977) Cell, 12,243-249). Estudios posteriores han mostrado que un mutante con una eliminación en la región E1A (194-358 pb) del genoma creció mal incluso en una línea celular complementaba la función inicial (E1A) (Hearing y Shenk, (1983) J. Mol. Biol. 167,809-822). Cuando se recombinó un ADN adenovírico de compensación (0-353 pb) en el extremo derecho del mutante, el virus se empaquetó con normalidad. El análisis adicional de la mutación identificó un elemento corto, repetido, dependiente de la posición en el extremo izquierdo del genoma de Ad5. Se ha encontrado que una copia de la repetición bastaba para un empaquetado eficaz si estuviera presente en cualquier extremo del genoma, pero no cuando se mueve hacia el interior de la molécula de ADN de Ad5 (Hearing et al., J. (1987) Virol., 67,2555-2558).

Usando versiones mutadas de la señal de empaquetamiento, es posible crear virus auxiliares que se empaqueten con eficacias variables. Por lo general, las mutaciones son mutaciones o eliminaciones puntuales. Cuando se desarrollan virus auxiliares con una baja eficacia de empaquetamiento en células auxiliares, el virus se empaqueta, aunque a tasas reducidas en comparación con el virus de tipo silvestre, permitiendo, por tanto, la propagación del auxiliar. Cuando, sin embargo, estos virus auxiliares se desarrollan en células junto con el virus que contiene las señales de empaquetamiento de tipo silvestre, las señales de empaquetamiento de tipo silvestre se reconocen preferentemente sobre las versiones mutadas. Dada una cantidad limitante de factor de empaquetamiento, el virus que contiene las señales de tipo silvestre se empaqueta selectivamente en comparación con los auxiliares. Si la preferencia es suficientemente elevada, deben conseguirse soluciones madre que se acerquen a la homogeneidad.

Para mejorar el tropismo de las construcciones de ADV para tejidos o especies particulares, las secuencias de fibras de unión a receptores se suelen poder sustituir entre aislamientos adenovíricos. Por ejemplo, el ligando de receptor del adenovirus Coxsackie (CAR) encontrado en el adenovirus 5 puede sustituirse con la secuencia de fibra de unión a CD46 del adenovirus 35, fabricando un virus con afinidad de unión enormemente mejorada para células hematopoyéticas humanas. El virus "pseudotipificado" resultante, Ad5f35, ha sido la base de varios aislados víricos

26

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

imagen21

imagen22

imagen23

imagen24

imagen25

imagen26

imagen27

imagen28

imagen29

imagen30

imagen31

imagen32

imagen33

imagen34

imagen35

imagen36

imagen37

imagen38

imagen39

imagen40

imagen41

imagen42

imagen43

imagen44

imagen45

imagen46

5

10

15

20

25

30

35

40

Tabla 1

Grupo: Tratamiento Nivel de dosis ADV vp/célula [LPS] [AP1903] (in vitro) Otros reactivos (in vitro) Vía de administración (Vacyba) Vía de administración (AP1903) N

1: PBS NA N/D SC N/D 6

2: DC + CD40L + LPS 1,5 x 106 células 200 ng/ml N/D CD40L 2 µg/ml SC N/D 6

3: DC + Ad-Luc + LPS + AP1903 1,5 x 106 células 5 mg/kg (AP1903) 20K wGJ 200 ng/ml 100 nM sc IP 6

4: DC + Ad-ίCD40 + LPS + AP1903 1,5 x 106 Células 5 mg/kg (AP1903) 20K wGJ 200 ng/ml 100 nM SC IP 6

5: DC + Ad-iMyD88 + AP1903 1,5 x 106 Células 5 mg/kg (AP1903) 20K wGJ 100 nM SC IP 6

6: DC + Ad-iMyD88 1,5 x 106 células 20K wGJ N/A SC N/A
6

7: DC + AdiMyD88.CD40 + AP1903 1,5 x 106 Células 5 mg/kg (AP1903) 20K wGJ 100 nM SC IP 6

8: DC + AdiMyD88.CD40 1,5 x 106 células 20K wGJ N/D SC N/A 6

Antes de la vacunación de los ratones inoculados con el tumor, se midieron los niveles de IL-12p70 de las células dendríticas transducidas in vitro. Los niveles de IL-12p70 se presentan en la Figura 35.

La Figura 36 muestra un gráfico de la inhibición del crecimiento tumoral observada en los ratones transducidos. La inoculación de las células dendríticas transducidas con MyD88 y tratadas con AP1903 dio como resultado una velocidad de curado de 1/6, mientras que la inoculación de las células dendríticas transducidas con MyD88-CD40 sin AP1903 dio como produjo una tasa de curación de 4/6, indicando un potencial efecto independiente del dimerizante. El asterisco indica una comparación de Luc+LPS+AP y iCD40MyD88+LPS+/-AP1903. La Figura 36 también proporciona fotografías de ratones vacunados representativos.

La Figura 37 presenta un análisis de la frecuencia mejorada de la inducción de los linfocitos T CD8+ específicos de Ag en ratones tratados con células dendríticas transducidas con iMyD88-CD40. Se recogieron células periféricas de médula ósea de ratones tratados diez días después de la vacunación el día 7. Se tiñeron las PBMC con anti-mCD8-FITC y H2-Kb-SIINFEKL-tetrámero-PE y se analizaron por citometría de flujo.

La Figura 38 presenta la frecuencia aumentada de linfocitos T CD8+ y linfocitos TH1 CD4+ específicos de Ag inducidos en ratones después del tratamiento con células dendríticas transducidas con iMyD88-CD40. Se sacrificaron tres ratones de todos los grupos experimentales 18 días después de la vacunación. Los esplenocitos de tres ratones por grupo se "agruparon" entre sí y se analizaron mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma. Se recubrieron placas MultiScreen-HA de Millipore con 10 microgramos/ml de anticuerpo AN18 anti-IFN-gamma de ratón (Mabtech AB, Inc., Nacka, Suecia). Se añadieron esplenocitos y se cultivaron durante 20 horas a 37 ºC en CO2 al 5 % en medio ELISpot completo (RPMI, FBS al 10 %, penicilina, estreptomicina). Los esplenocitos se incubaron con 2 microgramos/ml de OT-1 (SIINFEKL), OT-2 (ISQAVHAAHAEINEAGR) o péptido TRP-2 (péptido control no dirigido). Después de los lavados, se aplicó un segundo anticuerpo monoclonal biotinilado al IFN-gamma de ratón (R4-6A2, Mabtech AB) a los pocillos a una concentración de 1 microgramo/ml, seguido de la incubación con complejos de estreptavidina-fosfatasa alcalina (Vector Laboratories, Ltd. , Burlingame, CA). Después se desarrollaron placas con el sustrato de fosfatasa alcalina, 3-amino-9-etilcarbazol (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO). Se calificó el número de puntos en los pocillos por ZellNet Consulting, Inc. con un sistema lector ELISPOT automatizado (Carl Zeiss, Inc, Thornwood NY).

La Figura 39 presenta un esquema y los resultados de un ensayo de linfocitos citotóxicos in vivo. Dieciocho días después de las vacunaciones con DC, se realizó un ensayo de CTL in vivo. Se usaron esplenocitos sin tratamiento previo singénicos como células diana in vivo. Se marcaron por incubación durante 10 minutos a 37 ºC bien con células CFSE 6 micromolar (CFSEhl) o CFSE 0,6 micromolar en medio de CTL (células CFSEl0). Las células CFSEh se pulsaron con péptido OT-1 SIINFEKL y las células FSEl0 se incubaron con el péptido TRP2 de control. Se inyectó por vía intravenosa una mezcla de 4 x106 de CFSEhl más 4 x 106 células CFSEl0 a través de la vena de la cola. Después de 16 horas de incubación in vivo, se recogieron esplenocitos y se analizaron las suspensiones monocelulares para la detección y cuantificación de las células marcadas con CFSE. La Figura 40 es un gráfico que presenta la actividad de CTL mejorada inducida por células dendríticas transducidas con iMyD88-CD40 en los ratones inoculados. La Figura 41 muestra los histogramas en bruto de los CTL para muestras seleccionadas, que

57

imagen47

imagen48

imagen49

imagen50

imagen51

imagen52

Claims

imagen1

imagen2