CN106397549A - MERS‑CoV特异性多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了MERS‑CoV特异性多肽及其应用,属于免疫检测领域。本发明提供了三种针对BABL/c小鼠的MERS‑CoV特异性多肽,并且用相应多肽制备了MHC‑四聚体,有效地增加多肽‑MHC与特异性T细胞表面TCR的亲和力,可以作为T细胞评价的有效工具,该技术还可以用于特异性T细胞的分离与克隆、对MERS‑CoV感染或疫苗接种后小鼠相应组织切片进行原位染色等,在对MERS‑CoV感染或疫苗接种后小鼠模型的T细胞研究方面具有较高的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及MERS-CoV特异性多肽及其应用,属于免疫检测领域。
背景技术
2012年6月沙特阿拉伯发现第一例MERS病例,随后,更多的病例在阿拉伯半岛被报道,并传至亚洲,非洲,欧洲和北美洲等地,死亡率高达35.7%,2015年7月,我国也出现了一例输入性感染病例。开发安全有效的疫苗是控制MERS-CoV传播的重要手段之一。T细胞在病毒清除中发挥着非常重要的作用,在MERS-CoV疫苗免疫效果的评估中,T细胞免疫应答的评估尤为重要。MERS-CoV易感小鼠模型的建立为其疫苗的研发提供了很好的动物模型。开发高效、快速、敏感的检测MERS-CoV感染后患者和动物模型T细胞状态的检测手段尤为重要。
MHC-四聚体技术是将MHC单体分子四聚体化,提高其与T细胞上的TCR的亲和力,进而提高检测的灵敏度的技术。该技术可应用于检测抗原特异性T淋巴细胞反应、T细胞的直接分离与克隆、分离特异性TCR、原位染色等,为研究与细胞免疫反应有关的一系列工作提供了高效、快速、敏感的检测手段。然而目前还没有用四聚体技术评价MERS-CoV感染或疫苗接种后小鼠模型T细胞的报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供MERS-CoV特异性多肽,所述多肽氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示;或如SEQ ID NO.2所示,或如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第二个目的是提供所述特异性多肽的衍生物,是在所述多肽的氨基酸序列上取代、或缺失,或添加一个或几个氨基酸,且具有与所述多肽相同抗原性的多肽衍生物。
本发明的第三个目的是提供对MERS-CoV感染或疫苗接种后小鼠模型的T细胞高度特异性和高度灵敏性的多肽-MHC四聚体,所述多肽-MHC四聚体由生物素化的MHC-I与所述特异性多肽结合。
本发明的第四个目的是提供所述多肽-MHC四聚体的制备方法,包括如下步骤:(1)用大肠杆菌表达MHC轻链和MHC重链;(2)稀释复性,制备多肽/MHC复合物;(3)制备生物素化的多肽/MHC复合物;(4)与带标记的链亲和素反应。
在本发明的一种实施方式中,所述MHC重链C端连接生物素。
在本发明的一种实施方式中,所述步骤(3)是在BirA酶的催化下与D-biotin结合。
在本发明的一种实施方式中,所述步骤(4)是按照摩尔比5:1的比例与带标记的链亲和素反应。
在本发明的一种实施方式中,所述方法具体是:利用大肠杆菌表达MHC轻链及C端连接生物素的MHC重链,利用稀释复性的方法制备多肽/MHC复合物,用superdex200纯化,然后再BirA酶的催化下与D-biotin结合,形成生物素化的多肽/MHC复合物,再与带标记的链亲和素按照摩尔比5:1的比例反应,得到多肽/MHC复合物。
本发明的第五个目的是提供一种多肽疫苗,其活性成分含有所述的多肽和/或多肽衍生物。
本发明的第六个目的是提供MERS-CoV特异性细胞免疫检测试剂盒,所述试剂盒含有所述的多肽和/或多肽衍生物。
本发明还提供所述多肽-MHC四聚体的应用。
在本发明的一种实施方式中,所述应用包括:制备疫苗;作为T细胞免疫学评价的有效工具,对MERS-CoV感染或疫苗接种后小鼠模型的T细胞免疫应答进行评估;对MERS-CoV感染或疫苗接种后小鼠相应组织切片的原位染色、特异性T细胞的分离与克隆、结合单细胞测序技术分离特异性TCR、作为T细胞激活试剂。
有益效果:本发明用自主筛选的3条多肽制备的四聚体有高度的特异性和敏感性,可以作为T细胞评价的有效工具。通过流式分析表明,用本发明的方法制备的多肽-MHC四聚体检测用自主筛选的三条MERS-CoV特异性多肽免疫过的小鼠的T细胞,阳性率分别为3.89%、2.12%、2.57%,明显高于阴性对照组0.088%~0.122%。细胞用相应多肽体外刺激后培养9天,免疫组T细胞阳性率分别为69.5%、27.9%、20.1%,明显高于阴性对照组0.238%~6.0%。该技术还可以用于对MERS-CoV感染或疫苗接种后小鼠相应组织切片的原位染色、特异性T细胞的分离与克隆、结合单细胞测序技术分离特异性TCR、作为T细胞激活试剂等。
附图说明
图1为:H-2Kd与表位多肽superdex200分子筛柱形图;
图2为:H-2Kd与表位多肽形成的MHC复合物生物素化后superdex200分子筛柱形图;
图3为:生物素化效率检测;M,Marker;A,链亲和素;B,MHC和链亲和素;C,MHC;
图4为:用多肽37-1免疫小鼠后的流式分析结果代表图;
图5为:用多肽142免疫小鼠后的流式分析结果代表图;
图6为:用多肽122免疫小鼠后的流式分析结果代表图;
图7为:用表位多肽免疫小鼠后T细胞并用多肽37-1体外刺激细胞后培养9天流式分析的结果图;
图8为:用表位多肽免疫小鼠后T细胞并用多肽142体外刺激细胞后培养9天流式分析的结果图;
图9为:用表位多肽免疫小鼠后T细胞并用多肽122体外刺激细胞后培养9天流式分析的结果图。
具体实施方式
实施例1 MERS-CoV特异性多肽的筛选
用多肽预测软件对MERS-CoV的S蛋白进行预测,然后合成多肽,用载有MERS-CoV病毒的S蛋白的腺病毒免疫品系为H-2d(BALB/c)的小鼠,免疫完成后收获脾细胞,把合成的多肽编号后按照8×8的矩阵排列,横8组,竖8组,横组和竖组有交叉,有交叉的多肽混合在一起。通过Elispot技术检测混合多肽产生IFN-γ的情况,从产生IFN-γ的横组和竖组交叉的混合多肽中筛选获得3条功能肽(如表1所示),具有较强的特异性,能够用作T细胞免疫学评价的有效工具,对MERS-CoV感染或疫苗接种后小鼠模型的T细胞免疫应答进行评估。
表1筛选获得的功能肽及其序列
实施例2多肽-MHC四聚体的制备
(1)多肽/MHC复合物的制备:
1)在H-2Kd(Genbank登陆号XP_017174460.1)基因C端添加能够连接生物素的氨基酸序列GGGLNDIFEAQKIEWHE,构建重组质粒pET28a-H-2Kd-Bio,将B2m基因(Genbank登录号为AAA39668.1)与载体连接,构建重组载体pET28a-B2m,并将质粒分别转化到大肠杆菌BL21中;
2)将携带质粒的大肠杆菌BL21在37℃条件下培养并加入1mmol/L IPTG诱导蛋白表达,收集菌体,将菌体超声破碎,高速离心后将沉淀溶解在溶解buffer(6mol/L盐酸胍,10%甘油,50mmol/LTris pH8.0,100mmol/LNaCl,10mmol/L EDTA)中;
3)将序列如SEQ ID NO.1所示的多肽(命名为多肽37-1)和重链、轻链用稀释复性的方法在复性Buffer(100mmol/LTris pH 8.0,400mmol/L精氨酸,2mmol/L EDTA)中同时复性,使其形成MHC复合物;采用上述相同方法分别用SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的多肽(命名为多肽142和多肽122)和重链、轻链制备MHC复合物;
4)多肽/MHC复合物纯化:使用超滤杯使复性后样品通过10kDa滤膜浓缩样品,并通过浓缩换液为Exchange Buffer(20mmol/L Tris-HCl,50mmol/LNaCl,pH8.0);将样品取出后4℃离心12000rpm 10min,将上清转移到超滤管中浓缩到约0.5-1ml,过superdex200分子筛进行多肽/MHC复合物纯化,结果如图1所示。
(2)多肽/MHC分子的生物素化
1)将经过分子筛纯化后的多肽/MHC复合物蛋白样品收集于超滤浓缩管中,浓缩至约300μL,在BirA酶的催化下与D-biotin反应,4℃孵育过夜。
2)将生物素化后的蛋白样品离心后过superdex200分子筛进行生物素化后的复合物纯化,以去除多余的生物素,结果如图2所示。
3)将纯化的多肽/MHC复合物浓缩到约500μL,取样进行Gel shift试验验证生物素化效果。
样品制备:
A.2μL链亲和素Streptavidin+8μL分子筛Buffer。
B.8μL生物素化后多肽/MHC样品+2μL 20mg/mL链亲和素Streptavidin;
C.8μL生物素化后多肽/MHC样品+2μL分子筛buffer;
将上述三支样品置冰上孵育30min-2h后进行SDS-PAGE鉴定,结果如图3所示。
生物素化后的MHC能够与Streptavidin结合成为大分子,从而使得其在SDS-PAGE中的条带滞后,通过比较(C-B)/C的MHC含量的比值可以判断生物素化的效果,既有多少比例的MHC得到较好的生物素化,图3结果显示,本发明的技术方案生物素化效应约为90%。
(3)生物素化的MHC分子四聚化:
将生物素化后的MHC分子浓缩,按照链亲和素与多肽/MHC复合物的摩尔比1:5将生物素化后的MHC分子四聚化,链亲和素为带荧光标记的链亲和素,置4℃孵育过夜,制备获得37-1-H-2Kd四聚体。
按上述相同步骤制备142-H-2Kd四聚体,122-H-2Kd四聚体。
实施例3多肽/MHC四聚体在T细胞分析中的应用
利用MERS-CoV特异性多肽/MHC四聚体的高亲和力和高特异性的特点对MERS-CoV相关疫苗免疫后小鼠T细胞进行检测,评估疫苗对小鼠细胞免疫的影响、T细胞的分离与克隆、对MERS-CoV感染小鼠相应组织切片进行原位染色等,采用下述步骤评价用载有MERS-CoV的S蛋白的腺病毒载体免疫的BABL/c小鼠T细胞水平:
1)将筛选获得的多肽37-1与不完全弗氏佐剂和GP96佐剂按照20μg多肽,50μL不完全弗氏佐剂,50μL GP96的比例制备成乳化剂,分三次免疫小鼠,每次间隔两周;以未经免疫的小鼠作为阴性对照;
2)获取免疫后的小鼠脾细胞,用FACS buffer/staining buffer(PBS+0.5%BSA)洗2遍;
3)染色。加抗体(如FITC-CD8,APC-CD4,PerCp-CD3,PE-Tetramer)。4℃冰上孵育30min;
4)洗涤。加200μL FACS buffer离心,洗2遍;
按上述相同步骤分别将多肽142,多肽122用于小鼠免疫,再分别用实施例3制备的37-1-H-2Kd四聚体142-H-2Kd四聚体,122-H-2Kd四聚体评价用载有MERS-CoV的S蛋白的腺病毒载体免疫的BABL/c小鼠T细胞水平。
用细胞流式仪进行流式分析,结果如图4-6所示,多肽免疫过的小鼠的T细胞,阳性率分别为3.89%、2.12%、2.57%,明显高于阴性对照组0.096%、0.122%、0.088%。
将细胞用相应多肽体外刺激后培养9天,再按上述步骤流式染色,结果如图7-9所示,免疫组T细胞阳性率分别为69.5%、27.9%、20.1%,明显高于阴性对照组仅为0.238%、1.92%、6.0%。
实施例4多肽、多肽衍生物制备疫苗
将上述制备获得的多肽或多肽衍生物溶于水相或油相佐剂,稀释为合适浓度,过滤除菌。可选择地,进行乳化,制备获得疫苗。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种MERS-CoV特异性多肽,其特征在于,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;或如SEQID NO.2所示,或如SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述特异性多肽的衍生物,其特征在于,在权利要求1所述多肽的氨基酸序列上取代、或缺失,或添加一个或几个氨基酸,且具有与权利要求1所述多肽相同抗原性的多肽衍生物。
3.一种多肽-MHC四聚体,其特征在于,由生物素化的MHC-I与权利要求1所述特异性多肽结合,或由生物素化的MHC-I与权利要求2所述特异性多肽衍生物结合。
4.权利要求3所述多肽-MHC四聚体的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)用大肠杆菌表达MHC轻链和MHC重链;(2)稀释复性,制备多肽/MHC复合物;(3)制备生物素化的多肽/MHC复合物;(4)生物素化的多肽/MHC复合物与带标记的链亲和素反应。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述MHC重链C端连接生物素。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)是在BirA酶的催化下,将多肽/MHC复合物与D-biotin结合。
7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤(4)是按照摩尔比5:1的比例将生物素化的多肽/MHC复合物与带标记的链亲和素反应。
8.一种疫苗,其特征在于,活性成分含有权利要求1所述的多肽和/或权利要求2所述的多肽衍生物。
9.MERS-CoV特异性细胞免疫检测试剂盒,其特征在于,含有权利要求1所述的多肽和/或权利要求2所述的多肽衍生物。
10.权利要求3所述多肽-MHC四聚体在T细胞免疫评价,对MERS-CoV感染或疫苗接种后生物体组织切片的原位染色,特异性T细胞的分离与克隆,分离特异性TCR、作为T细胞激活试剂中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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