SU1158201A1 - Способ получени стимул тора из селезенки млекопитающих - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТИМУЛЯТОРА ИЗ СЕЛЕЗЕНКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, вклюВСЕСОЮЗНАЯ 4 л. ;:(. , S15..-;4 ., чающий обработку органа ацетоном, его измельчение, получение надосадочной жидкости, обработку ее ацетоном с последующим отделением осадка, его экстракцией и лиофилизацией, о т л и Ч:а ю щ и ис   тем, что, с целью повышени  иммуностимулирующей активности, измельченную селезенку экстрагируют в 3%-ном растворе уксусной кислоты при рН 3,0-4,0, в присутствии хлористого цинка, а осадок, полученный после обработки экстракта ацетоном, экстрагируют водой в присутствии зксусной кислоты при рН 6,0-7,0 с последующим фипьтрованием и лиофштизацией. 5

Description

1 1 Изобретение относитс  к медицинской промышленности и может быть использовано дл  иммуностимул ции организма . Цель изобретени  - повышение им муностимулирующей активности. Цель достигаетс  тем, что согласно способу получени  стимул тора из селезенки млекопитающих, включаюи1ему обработку органа ацетоном, его измельчение , получение надосадочной жидкости, обработку ее ацетоном с последующим отделением осадка, его экстракцией и лиофилизацией, измельченную селезенку экстрагируют в 3%ном растворе уксусной кислоты при рН 3,0-4,0 с добавлением хлористого цинка, а осадок, полученный после обработки экстракта ацетоном, экстра гируют водой в присутствии уксусной кислоты при рН 6,0-7,0 с последующим фильтрованием и лиофилизацией, Переработка путем экстрагировани  измельченной селезенки в 3%-ном растворе уксусной кислоты позвол ет произвести гидролиз крупных белков . и других высокомолекул рных соединений , что способствует лучшей очист ке и устранению пирогенности. Добавление хлористого цинка способствует полному выделенш) из селезенки конечного продукта и лучшему осалодению его ацетоном. Экстракци  осадка в воде при определенном рН (экстрагент - раствор уксусной кислоты) способствует растворению в воде наиболее активных веществ и позвол ет отделить от них нерастворимые балластные вещества путем фильтрации, Отклонение от заданных пределов .кислотности приводит к потере активного вещества. Существующие известные решени  не имеют свойств, присущих предложенному . Концентраци  спиртовой фракции, концентраци  диализата, приводит к разрушению специфического начала вещества в результате гидролиза . Предложенное в известных способах отделение балластных веществ происходит за длительный период и малоэффективно. Отделение сопутствую щих веществ ведет к потер м. Способпрототип | вз тый эа базовый объект, позвол ет получить вещество, которое ингибирует синтез ДНК, но не оказьгеает стимулирующего действи  . 2 на лимфоциты и активные Т-лимфоциты селезенки. Пример I. Берут селезенку крушюго рогатого скота, промывают водой. Селезенку помещают в ацетон, берут 1 часть селезенки и 10 частей ацетона с температурой -зс. Через 24 ч ацетон сливают, а селезенку 0,5 кг измельчают и помещают в реактор с мешалкой. Измельченную селезенку заливают 5 л раствора 3%-ной уксусной кислоты при рН 3,О, добавл ют 0,005 у.г хлористого цинка и экстрагируют 36 ч, перемешива  1 ч через каждые 8 ч. По окончании экстракции субстрата сливают и центрифугируют 15 мин со скоростью 3000 об/мин, надосадочную жидкость декантируют, к ней добавл ют 6 час- тай ацетона на 1 часть жидкости, перемешивают и формуют осадок 20 ч. Выпавший осадок высушивают на фильтре , измельчают и раствор ют 0,01 кг в 0,5 л воды с добавлением уксусной кислоты до ,0, В течение 2 ч непрерьшно перемешивают и удал ют балластные вещества путем фильтрации , Полученньй раствор стерильно фильтруют через пластины ЕК, разливают во флаконы так, чтобы в каждом содержалось 10 мг вещества и лиофилизируют. Выход активного вещества 0,005 кг, Пример 2, Берут селезенку животных, промывают водой и ацетоном , помещают 1 часть селезенки в 10 частей ацетона с температурой -5 С, Через 24 ч ацетон сливают. 10 кг селезенки измельчают на волчке , помещают в реактор и заливают 100 л раствора уксусной кислоты до рН 4,0, добавл ют 0,1 кг хлористого цинка и экстрагируют 36 ч, перемешива  непрерьгоно по часу через каждые 8 ч. По окончании экстракции субстрат сливают и центрифугируют 15 мин со скоростью 3000 об/мин, надосадочную жидкость декантируют, к ней добавл ют 6 частей ацетона на 1 часть жидкости, перемешивают и формируют осадок 20 ч. Выпавший осадок высушивают на фильтре, измельчают и раствор ют 0,2 кг осадка в 10 л воды с добавлением уксусной кислоты до рН 6,0, Б течение 2 ч перемешивают и удал ют балластные вещества фильтрацией. Отфильтрованный раствор стерильно фильтруют через пластины ЕК& разливают во флаконы так, чтобы в каждом содержалось 10 мг веществаи лиофилизируют, Получают 0,1 кг активного вещества из 10 кг сырь . Пример 3, Берут свиную селезенку , промьгоают, помещают в ацетон г. температурой -5°С, выдерживают сутки,сливают ацетон. Берут 1 кг селезенки, измельчают и экстрагируют в 10 л 3%-ного раствора уксусной кис лоты при рН 3,5. Добавл ют 0,01 кг хлористого цинка, экстрагируют 36 ч попеременно перемепшва . По окончании экстракции субстрат сливают. центрифугируют, надосадочную жидкос декантируют,к ней добавл ют 6 часте ацетона на 1 часть жидкости,перемеш вают и формируют осадок за 20 ч.Пол . ченный осадок высущивают и измельча ют. Осадок в количестве 0,02 кг рас вор ют в 1 л воды с добавлением уксусной кислоты до рН 6,5, перемещи вают и удал ют балластные вещества фильтрацией. Раствор стерильно фильт руют и разливают во флаконы по 10 мг вещества, лиофилизируют. Выход активного вещества из исходного сырь  составл ет 0,01 кг. Биологическую активность вещества вьщеленного из селезенки, оценивали по показател м иммунитета эксперимен тальных животных. Эксперименты проводили на 50-ти морских свинках, самцах весом 200250 г. Животные бьти разделены на 5 равных групп: контрольную и подопытные . Подопытным животным вводили по 0,1 мг (рекомендуема  дл  людей терапевтическа  доза) активных веществ , выделенных из селезенки различными способами, растворенных в 0,5 мл физиологического раствора. Вещества вводили ежедневно внутримьшечно в течейие 20 дней. Контрольным животным по аналогичной схеме вводили по 0,5 мл физиологического раствора. На 21-е сутки всех, животных забивали, вьщел ли селезенку и лимфатические узлы. Ткань селезенки и лимфатических узлов гомогенизировали , выдел ли клетки и затем определ ли удельную концентрацию лимфоцитов (удельна  концентраци  - количество клеток в тыс чах на Г мг ткани) и активных Т-лимфоцитов ме

тодом спонтанного розеткообразованй  с эритроцитами кролика. Известно, что лимфоциты и активные Т-лимфо1 1

Проведены эксперименты, подтверждающие высокую эффективность препарата в отношении стимул ции антител 1 4 циты  вл ютс  «тммунокомпетеитными клетками. Установлено, что введение вещества , полученного из селезенки по предложенному способу приводит к значительному увеличению лимфоцитов и активных Т-лимфоцитов в селезенке. Все остальные вещества, полученные известньми способами подобной активностью не обладали. При физико-химическом анализе выделенного из селезенки вещества установлено , что оно представл ет собой комплекс полипептидов. Изучение токсичности и аллергизирующих свойств выделенного вещества на лсивотных показало , что препарат из селезенки не обладает в терапевтических дозах подобной активностью. Это указьшает на перспективность препарата из селезенки дл  применени  в медицинской практике. Эксперименты, проведенные на животных , указьшают на тканеспецифическую стимул цию иммунокомпетентных клеток в селезенке под воздействием вещества, вьщеленного из этого же органа. Это  вление может быть использовано дл  создани  лекарственного препарата с целью стимул ции активности клеток селезенки, где, как известно, происходит образование и функционирование антителообразующйх клеток после по влени  антигенов в организме. Известно, что применение различных цитостатических средств, ионизирующей радиации, глюкокортикоидов приводит к резкому подавлению иммуногенеза. Поэтому применение в этих случа х препарата из селезенки  вл етс  целесообразным и полезным. Дл  получени  вещества предложенным способом имеетс  в достаточном количестве сырье. Известно, что в селезенке присутствуют лимфоциты (антителообразующие клетки), которые осуществл ют выраотку антител на различные антигены. днако выработка антител лимфоцитами селезенки на р д антигенов недостаточна . Поэтому применение вещества, увеличивающего количество клеток в селезенке, позвол ет увеличить об- разование и выход антител.

на тимусзависимые антигены, Опыты проведены на 250 мышах-самцах, ли НИИ СВА, весом 18-20 г, которые были разделены на 5 групп. Мьгаам вводилм тимусзависимый антиген (эритроциты барана) в дозе клеток в 1 МП и сутки 3 раза ежедневно подкожно вводили в(ещество из селезенки по 0,1 мг на мышь а также вещества аналогов и прототипа. Затем через 7 дней мышей забивали, брали кровь и определ ли общеприн тым методом титр антител и количество антителообразующих клеток в селезенке.

Результаты опыта представлены в таблице

Из таблицы следует,что использование вещества из селезенки позвол ет значительно (статистически достоверно ) увеличить количество антителообразующих клеток и образование и выход антител.

Эти результаты могут быть использованы дл  повьпиени  выхода антител V животных - продуцентов антител при пол5гчении лечебных антисьшороток, что даст большой зкономический эффект . Это в.ещество также можно будет использовать и дл  введени  больным с целью стимул ции образовани  антител при введении различных вакцин, к которым антитела образуютс  в недостаточном количестве.

Статистически достоверно по сравнению с контролем (Р- 0,05)

Claims (1)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТИМУЛЯТОРА ИЗ СЕЛЕЗЕНКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, вклю чающий обработку органа ацетоном, его измельчение, получение надосадочной жидкости, обработку ее ацетоном с последующим отделением осадка, его экстракцией и лиофилизацией, о т л и ч _:а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения иммуностимулирующей активности, измельченную селезенку экстрагируют в 3/-ном растворе уксусной кислоты при pH = 3,0-4,0, в присутствии хлористого цинка, а осадок, полученный после обработки экстракта ацетоном, экстрагируют водой в присутствии уксусной кислоты при pH 6,0-7,0 с последующим фипьтрованием и лиофилизацией. 5