RU2000061C1 - Способ получени белков, обладающих сродством к опиатным рецепторам - Google Patents

Description

Кислоторастворимую фракцию растительных белков можно извлекать любыми известными приемами, но наиболее рационально ее экстрагировать подкисленной водой или подкисленными органическими растворител ми.

Степень кислотности экстракта не имеет решающего значени  и обычно составл ет 0,25 - 1,0 н. Природа; кислоты также не оказывает особого вли ни  на эффективность процесса, однако использование сол ной кислоты представл етс  наиболее удачным.

Дл  освобождени  кислотораствори- мой фракции от остатков растительных клеток взвесь растительной массы в растворах сол ной кислоты или подкисленного этанола подвергают центрифугированию, над- осадочную жидкость фильтруют. Могут, примен тьс  и иные методы дополнительной очистки.

Из кислотного экстракта белки могут быть осаждены органическими растворител ми . Осажденные кислоторастворимые белки могут быть повторно растворимы в растворах кислот, подвергнуты дополнительному центрифугированию и осаждению .

Фракцию освобожденных от примесей кислоторастворимых белков дл  удобства работы можно высушить, например, путем лиофилизации. Поскольку целевой продукт используетс  дл  парэнтерального введени  после или до высушивани  возможен этап его стерилизации (фильтрование через стерилизующие фильтры, стерилизующа  обработка продукта электронами высоких энергий).

Остаточна  влажность высушенного продукта составл ет 3 - 5%, препарат полностью раствор етс  в воде.

Полученный препарат дает все характерные реакции на белки. Его мол.м. составл ет от 1,5 кДа до 80 кДа.

При дискэлектрофореэе в полиакрила- мидном геле установлено наличие нескольких индивидуальных белков.

Характер наблюдений биологической активности полученного препарата обусловлен , по-видимому, суммарным присутствием индивидуальных белков. Дл  корректировки биологических эффектов допустимо фракционирование целевого продукта .

Сродство полученных предложенным способом белков к опиатным рецепторам было доказано классическим налоксоно- вым методом и методом конкурентного в реакции образовани  комплекта ЗН-на- локсон-рещзптор син птимеских мембран

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

головного мозга мышей в приг.уювии кис- поторасгворимых белков {1, 2.

Теоретически и практически доказано, что биологический эффект природных соединений опиоидной природы возникает в результате их св зывани  с опиатными рецепторами нескольких типов.

Известно также, что антагонист опиоид- ных соединений налоксон имеет большое сродство к опиатным рецепторам и поэтому пытесн ет опиоидные соединени  с их поверхности, тем самым отмен   биологические эффекты, обусловленные опиоида- ми.

Многочисленными экспериментами показано , что полученные предложенным способом белки при введении в организм экспериментального животного вызывают клиническую картину, соответствующую последстви м введени  природных опиоидов. Последующее введение налоксона полностью устран ет эффекты биологически активных белков.

Классическа  реакци  экспериментальных животных на налоксон и обща  клиническа  картина воздействи  белков, полученных предложенным способом, однозначно подтверждают специфическое взаимодействие этих белков с опиатными рецепторами.

Анализ патентной и научно-технической литературы показал, что сведений об оригинальной способности кислоторастворимых растительных белков св зыватьс  с опиатными клеточными рецепторами не имеетс 

За вителем впервые установлена спо- собность нового класса соединений - белков - св зыватьс  с опиатными рецепторами и вызывать биологические эффекты, воспроизвод щие эффекты природных опиоидов .

Установленна  за вителем закономерность априорно не вытекает из известного уровн  знаний.

До насто щего времени был известен лишь один класс соединений - низшие пептиды , которые св зывались с опиатными рецепторами Наиболее известны и доступны нейропептиды - энкефалины и эндорфины, дающие эффекты, сходные с эффектами опиоидов 1. 2, 3.

Способы получени  этих нейропепти- дов сложны, а их эффект воздействи  крат- ковременен

Предлагаемый способ получени  белков , обладающих сродством к опиатным рецепторам , несравненно проще способа получени  энкефалинов и чндорфинов. а полученные предложенным гппсоРюм брлки

вызывают более разносторонний и более длительный эффект.

Разработанный способ открывает по крайней мере путь решени  одной из наиболее актуальных проблем - безопасного длительного обезболивани .

Более подробно сущность предложенного способа по сн етс  следующими примерами .

П р и м е р 1. Свежие  годы омелы белой (1 кг) взвешивают в 3 л 0,5 н. раствора сол ной кислоты, гомогенизируют при 15 тыс. оборотов ножа гомогенизатора в 1 мин 30 мин (6 циклов длительностью 5 мин в интервале 10 мин). Экстрагируют 48 ч при комнатной температуре при периодическом перемешивании (80 - 110 оборотов мешалки в 1 мин).

После этапа экстракции взвесь центрифугируют в течение 60 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость декантируют, осадок отбрасывают. Кислотный экстракт вновь центрифугируют 45 мин при 15 тыс.об/мин.

Надосадочную жидкость декантируют. Осадок отбрасывают.

К надосадочной жидкости постепенно приливают 12 объемов охлажденного ацетона , энергично перемешивают и оставл ют на 18 ч дл  отсто  взвеси.

Осадок собирают на двойном бумажном фильтре, дважды промывают холодным ацетоном , снимают с фильтра, перенос т в стекл нный сосуд. В сосуд внос т 1 л 0,1 М раствора лимонной кислоты и периодически перемешивают. После набухани  белков сосуд помещают в вод ную баню, постепенно нагревают до 45°С и выдерживают 30 мин.

После растворени  белков раствор центрифугируют 60 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость декантируют. Осадок отбрасывают. К надосадочной жидкости постепенно приливают 12 объемов ацетона, энергично перемешивают и оставл ют на 18 ч дл  отсто  взвеси.

Осадок собирают на двойном бумажном фильтре, дважды промывают холодным ацетоном , снимают с фильтра, перенос т в кристаллизатор и помещают в вакуумный сушильный шкаф. Сушку осуществл ют при температуре 37 - 38°С в течение 4 ч.

Полученный сухой препарат из мельча- ют до порошкообразного состо ни  и готов т его 2%-ный раствор в 0,1 М растворе лимонной кислоты. Дл  этого навеску продукта внос т в раствор кислоты и периодически перемешивают. После набухани  белков, что наблюдаетс  через 2 ч, сосуд помещают в вод ную баню, постепенно нагревают до и Р(ыдерживают 30 мин.

После растворени  белков и просветлени  раствора его центрифугируют в течение 40 мин при 5 тыс. об/мин.

Надосадочную жидкость подвергают 5 осветл ющей, а затем и стерилизующей фильтрации через пластинчатые фильтры. Раствор разливают по 3 мл стерильные стекл нные ампулы по 10 мл, замораживают на прот жении 24 ч до температуры - 50°С 10 и подвергают сублимационному высушиванию в течение 72 ч при начальной температуре - 35°С до конечной температуры 25°С.

Ампулы заполн ют азотом и запаивают.

Кажда  ампула содержит 60 мг целевого 5 продукта, а всего было получено 2,4 г препарата .

В качестве экспериментальных животных использовали кроликов и кошек.

Кроликам препарат вводили в ушную 0 вену в дозе 5 мг/кг.

Через 5 мин после введени  препарата

у всех животных (3 кролика) наступили катэтонический ступор и глубока  анальгези  в

зоне черепно-мозговых и спинно-мозговых

5 нервов.

Анальгези  тканей ушных раковин была очень глубокой. Животные не реагировали на действие термического фактора, даже при обугливании тканей.

0После развити  эффекта (через 60 мин)

двум кроликам подкожно в дозе 4 мг/кг был введен налоксон.

Через 5 мик наблюдалось восстановление двигательной активности животных и 5 болевой чувствительности.

Изменени  поведь и  кролика, не получавшего налоксон, не отмечалось на прот жении более 6 ч.

Кошкам препарат вводили в вену бедра 0 в дозе 10 мг/кг. Через мин у всех животных (5 кошек) наступили кататонический ступор, сонливость. Через 15 мин наступила глубока  анальгези  в зоне черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов, исчезли чувство 5 страха и агрессивность.

После полного развити  эффекта (через 60 мин) двум кошкам подкожно в дозе 4 мг/кг был введен налоксон.

0Через 5 мин наблюдалось восстановление болевой чувствительности, страха и агрессивности .

Изменени  поведени  кошек, не получавших налоксон, не отмечалось н  прот 5 жении более б ч.

П р и м е р 2. Сухую калусную культуру клеток корн  родиолы розовой измельчают до порошкообразного состо ни  Навеску исходного сырь  массой 2 кг взвешивают в 10 л 40%-ного водно-спиртового р с твора и

экстрагируют при комнатной температуре 96ч.

После этапа экстракции взвесь центрифугируют в течение 60 минут при 5 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость декантируют , отстаивают 48 ч, провод т осветл ющую фильтрацию, используют как готовую лекарственную форму.

Осадок взвешивают в 10 л 0,2 М ацетат- уксусного буфера 0,14 М по хлориду натри  (рН 4,8).

Взвесь хорошо перемешивают и подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц. Провод т 3 цикла обработки ультразвуком по 30 мин. Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч.

После этапа экстракции взвесь центрифугируют в течение 60 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают. Осадок после промывани  дистиллированной водой на центрифуге взвешивают Ъ 10 л 0,5 н. раствора сол ной кислоты. Взвесь после перемешивани  подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц. Провод т 2 цикла обработки ультразвуком по 30 мин.

Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч. После экстракции взвесь центрифугируют 60 мин при 5 тыс.об/мин.

Надосадочную жидкость декантируют, Отстаивают 24 ч, подвергают осветл ющей фильтрации.

К осветленному фильтрату постепенно приливают 10 объемов охлажденного ацето- на и оставл ют на 18 ч дл  отсто  взвеси.

Осадок собирают на двойном бумажном фильтре, дважды промывают холодным ацетоном , снимают с фильтра, перенос т в кристаллизатор и помещают в вакуумный сушильный шкаф.

Сушку осуществл ют при температуре 37 - 38°С в течение 4 ч. Полученный сухой препарат измельчают до порошкообразного состо ни  и готов т его 2%-ный раствор в 0,1 М растворе лимонной кислоты.

Дл  этого навеску продукта внос т в раствор кислоты и периодически перемешивают . После набухани  белков, что наблюдалось через 2 ч, сосуд помещают в вод ную баню, постепенно нагревают до 45°С и выдерживают 50 мин до просветлени  жидкости .

После растворени  белков и просветлени  раствора его центрифугируют в течение 40 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость подвергают осветл ющей, а затем и стерилизующей фильтрации через пластинчатые фильтры.

Раствор разливают по 3 мл в стерильные стекл нные ампулы по 10мл, замораживают на прот жении 24 ч до температуры -50°С и подвергают сублимационному высушиванию в течение 72 ч при начальной температуре -35°С до конечной температуры 25°С.

Ампулы заполн ют азотом и запаивают. Кажда  ампула содержит 60 мг целевого

0 продукта, а всего было получено 28.5 г препарата .

В качестве экспериментальных животных использовали кошек. Кошкам препарат вводили в вену бедра в дозе 15 мг/кг.

5 Через 10 мин у всех, животных (10 кошек) наступили кэтатонический ступор, сонливость и эйфори . Через 30 мин наступила глубока  анальгези  в области черепно-мозговых и спинно-моэговых нервов.

0После полного развити  эффекта (через

60 мин) трем кошкам подкожно введен на локсон в дозе 4 мг/кг. Через 5-7 мин у них

восстановилась болева  чувствительность,

прерваный сон и эйфори .

5Изменени  поведени  кошек, не получавших налоксон, не отмечалось на прот жении более 6 ч.

П р.и м е р 3. Сухое корневище элеутерококка :солючего измельчают до порошко0 образного состо ни . Навеску исходного сырь  массой 1 кг взвешивают в 5 л 0,2 М ацетат-уксусного буфера 0.14 М по хлориду натри  (рН 4,8).

Взвесь хорошо перемешивают и под5 вергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц. Провод т 3 цикла обработки ультразвуком по 30 мин. Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч.

0 После этапа экстракции взвесь центрифугируют в течение 60 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают. Осадок после промывани  дистиллированной водой на центрифуге взвешивают в 5 л

5 0,25 н. раствора сол ной кислоты.

Взвесь перемешивают и подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц. Провод т 2 цикла обработки ультразвуком по 30 мин. Экстрагируют при

0 комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч.

После этапа экстракции взвесь центрифугируют в течение 60 мин при 5 тыс.об/мин. надосадочную жидкость подвергают отстою

5 24 ч и осветл ющей фильтрации. Осадок отбрасывают .

К осветленному фильтрату постепенно приливают 12 обьемпп охлажденного ацетона и оставл ют на 1R и дл  отсто  вз чси

Осадок собирают на двойном бумажном фильтре, дважды промывают холодным ацетоном , снимают с фильтра, перенос т в стекл нный сосуд. В сосуд внос т 2,5 л 0,1 М раствора лимонной кислоты и периодически перемешивают. После набухани  белков сосуд помещают в вод ную баню, постепенно нагревают до 45°С и выдерживают 30 мин.

После растворени  белков раствор центрифугируют 60 мин. при 5 тыс.об/мин. К надосадочной жидкости постепенно приливают 12 объемов ацетона, энергично перемешивают и оставл ют на 18 ч дл  отсто  взвеси.

Осадок собирают на двойном бумажном фильтре, дважды промывают холодным ацетоном , снимают с фильтра, перенос т в кристаллизатор и помещают р вакуумный сушильный шкаф.

Сушку осуществл ют при температуре 37 - 38°С в течение 4 ч.

Полученный сухой препарат измельчают до порошкообразного состо ни  и готов т его 2%-ный раствор в 0.1 М растворе лимонной кислоты.

Дл  этого навеску продукта внос т в раствор кислоты и периодически перемешивают .

После набухани  белков, что наблюдаетс  через 2 ч, сосуд помещают в вод ную баню, постепенно нагревают до 45°С и выдерживают 30 мин.

После растворени  белков и просветлени  раствора его центрифугируют в течение 40 мин при 5 тыс.об/мин.

Надосадочную жидкость подвергают осветл ющей, а затем и стерилизующей фильтрации через пластинчатые фильтры,

Раствор разливают по 3 мл в стерильные стекл нные ампулы по 10 мл, замораживают на прот жении 24 ч до температуры -50°С и подвергают сублимационному высушиванию в течение 72 ч при начальной температуре -35°С до конечной температуры 25°С.

Ампулы заполн ют азотом и запаивают.

Кажда  ампула содержит 60 мг целевого продукта, а всего было получено 10.8 г препарата .

В качестве экспериментальных животных использовали кошек.

Кошкам препарат вводили в вену бедра в дозе 15 мг/кг и подкожно в дозе 20 мг/кг.

Через 5 мин у всех животных (6 кошек), которым препарат был введен внутривенно, а через 15 мин у особей (6 кошек), которым было сделано подкожное введение, наступили кататонический ступор, сонливость. Через 30 мин наступили глубока  анальгези  в зоне мерепно мозговых и г.пинно-мозговых первой и пубокий сон

Поспи полного развити  эффекта (чере. 60 мин) четырем кошкам (по ДВР кошки из 5 каждой группы) в дпзп 4 мг/кг был введен налоксон. Через 3-5 мим наблюдалось восстановление двигательной активности болевом чуаств .лтет-ности, был прерван сон.

Изменени  поведени  кошек, не пол- 10 учивших налок.сон, не oiMcu-) н на прот жении fonee б ч.

П р и м е р 4. Наческу кормовчх дрож- жей-паприн в 2 к( втвг мивают в 5 л 0 2 М ацетат-уксусного буфера °.14 М по 15 хлори ду нтри  (рН 1,8)

Взвесь хорошо перемешивают и подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц. Провод т 3 цикла обработки ультразвуком по 30 мин. экстрагируют при 0 комнатной температуре 24 ч.

После этапа экстракции взвесь центрифугируют в течение 60 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают. Осадок после промывани  дистиллированной 5 водой на центрифуге р вешивают в 5 л 0,25 н раствора сол ной кислоты,

Взвесь перемешивают, подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц. Провод т 2 цикла обработки ультразвуком 0 по 30 мин.

Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч. После экстракции взвесь центрифугируют в течение 60 мин при 5 тыс.об/мин. 5 Надосадочную жидкость декан,ируют, оставл ют на 24 ч дл  отсто , вновь центрифугируют 45 мин при 5 тыс.об/мин, надосадочную жидкость фильтруют через двойной бумажный фильтр. 0К фильтрату постепенно приливают 10

объемов охлажденного ацетона, энергично перемешивают и оставл ют на 18 ч дл  отсто  взвеси.

Осадок собирают на двойном бумажном 5 фильтре, дважды промывают холодным ацетоном , снимают с фильтра, перенос т в кристаллизатор и помещают в вакуумный сушильный шкаф. Сушку осуществл ют при температуре 37 - 38°С в течение 4 ч. 0Сухой продукт измельчают до порошкообразного состо ни  и готов т его 5%-ный раствор в 0,1 М растворе лимонной кислоты. Дл  этого навеску препарата внос т в раствор кислоты и периодически перемеши- 5 вают. После набухани  белков сосуд помещают в вод ную баню, постепенно нагревают до 45°С и выдерживают 30 мин.. После растворени  белков и просветлени  раствора его центрифугируют в течение 40 мин при 5 тыс.об/мин

Надосадочную жидкость подвергают осветл ющей, а затем и стерилизующей фильтрации через пластинчатые фильтры.

Раствор разливают по 3 мл в стерильные стекл нные ампулы по 10 мл, заморажи- вают на прот жении 24 ч до температуры -50°С и подвергают сублимационному высушиванию в течение 72 ч при начальной температуре -35°С до конечной температуры 25°С.-

Ампулы заполн ют азотом и запаивают.

Кажда  ампула содержит 150мг целевого продукта, а всего было получено 21,5 г препарата.

В качестве экспериментальных живо- тных использовали кроликов, кошек, павианов-гамадрилов .

Кроликам препарат вводили в ушную вену в дозе 15 мг/кг.Через 10 мин после введени  препарата у всех животных (3 кро- лика) наступили кататонический ступор и глубока  анальгези  в области черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов.

Животные не реагировалиЛна сильный термический фактор даже при обугливании тканей ушных раковин.

После развити  эффекта (через 60 мин) одному кролику подкожно в дозе 4 Мг/кг был введен налоксон.

Через 4 мин наблюдалось восстановле- ние двигательной активности и болевой чувствительности .

Изменени  поведени  кроликов, не получавших налоксон. не отмечалось на прот жении более 6 ч.

Кошкам препарат вводили в вену бедра в дозе 20 мг/кг. Через 5 мин у всех животных (5 кошек) развивались кататонический ступор , сонливость, Через 15 мин наступили глубока  анальгези  в зоне черепно-мозговых и спинно-мозгоиых нервов, глубокий сон.

После полного развити  эффекта (через 60 мин) двум кошкам подкожно в дозе 5 мг/кг был введен налоксон.

Через 3 мин наблюдалось восстановление болевой чуствительности, был прерван сон.

Изменени  поведени  кошек не получавших напоксон. не отмечалось на прот жении более 6 ч

Павианам-гамадрилам препарат вводили в вену предплечь  в дозе 20 мг/кг.

В течение первых 30 мин после введени  у всех животных (3 павиана) наступили тремор мышц, сонливость, исчезли чувство страха и агрессивность. Развивались глубока  анальгези  в зоне черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов, эйфори .

После полного развити  эффекта (через 60 мин) одному павиану-гамадрилу подкожно в дозе 5 мг/кг был введен налоксон.

Через 6 мин наблюдалось восстановление болевой чувствительности, по вление чувства страха и агрессивности.

Изменени  поведени  павианов-гамадрилов , не получавших налоксон, не отмечалось на прот жении более 6 ч.

Claims (6)

1.Способ получени  белков, обладающих сродством к опиатным рецепторам, отличающийс  тем, что в качестве белков, обладающих сродством к опиатным рецепторам, используют фракцию кислото- растворимых растительных белков растительного сырь  с мол.мае. 1,5 - 80 кД.

2.Способ по п.1,отличающийс  тем, что в качестве растительного сырь  используют  годы, траву омелы белой, калуст- ную культуру корн  радиолы розовой.

3 Способ по п.1, отличающийс  тем, что фракцию растворимых белков получают экстрагированием растительного сырь  подкисленной водой или подкисленными органическими растворител ми с последующим осаждением ее органическими растворител ми.

4.Способ по пп. 1-3, отличающий- с   тем, что дл  подкислени  воды или органического растворител  используют сол ную кислоту.

5.Способ по п.1,отличающийс  тем, что фракцию кислоторастворимых белков подвергают сушке.

6.Способ по пп.1 и7,отличающий- с   тем. что перед сушкой или после сушки фракцию кислоторастворимых белков подвергают стерилизации.