RU2000060C1 - Способ получени белков, обладающих сродством к опиатным рецепторам - Google Patents

Abstract

Использование: в биотехнологии при получении белков микробного происхождени , обладающих биологической активностью . Сущность изобретени 1 получают фракцию кислоторастворимых белков, обладающих сродством к опиэтным рецепторам, путем экстрагировани  микробной массы подкисленной водой или подкисленными органическими растворител ми с последующим осаждением этой фракции органическими растворител ми. В микробную массу вход т молочно-кислые бактерии, уробактерии сенна  палочка. Дл  подкислени  используют сол ную кислоту Фракцию кислоторастворимых белков сушат, перед сушкой или после сушки ее подвергают стерилизации к чв

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии и касаетс  получени  белков микробного происхождени , обладающих биологической активностью .

Полученные предлагаемым способом белковые препараты могут быть использованы в медико-биологических исследовани х и  вл ютс  потенциальными лекарственными средствами.

Фундаментальными исследовани ми за вител  было установлено.что кислотора- створима  фракци  белков, выделенна  из биомассы бактерий обладает сродством к опиоидным клеточным рецепторам, и при введении в живой организм они вызывают эффекты, аналогичные эффектам природных опиоидов, - аналыезирующий. снотворный , психотропный.

Сущность предложенного способа состоит в том, что после дезинтеграции микробной массы ультразвуком и экстракции балластных веществ экстракцией ацетатным буфером из нее извлекают кислотора- створимую фракцию белков и освобождают ее от посторонних примесей

Исходным сырьем дл  получени  целевого продукта может служить микробна  масс многих видов бактерий, но предпочтительно использовать молочно-кислые бактерии , уробактерии, сенную палочку, как более доступные в требуемых количествах и

С

с о с

не обладающие патогенностыо дл  человека и животных.

Кислоторастворимую фракцию микробных белков можно извлекать любыми известными приемами, но наиболее рационально экстрагировать ее подкисленной водой или подкисленными органическими растворител ми, Степень кислотности экстракта не имеет решающего значени  и обычно составл ет 0,25 - 1.0 н, Природа кислоты также не оказывает особого вли ни  на эффективность процесса, однако использование сол ной кислоты представл етс  наиболее удачным.

Дл  освобождени  кислотораствори- мой фракции от остатков микробной массы взвесь микроорганизмов в растворах сол ной кислоты подвергают центрифугированию , надосадочную жидкость фильтруют. Могут примен тьс  и иные методы дополнительной очистки.

Из кислого экстракта белки могут быть осаждены органическими растворител ми. Осажденные кислоторастворимые белки могут быть повторно растворимы в растворах кислот, подвергнутых дополнительному центрифугированию и осаждению. Фракцию освобожденных от примесей кислото- растворимых белков дл  удобства работы можно высушивать, например, путем лио- филизации.

Поскольку целевой продукт используетс  дл  парентерального введени  после или до высушивани  возможен этап его стерилизации . Остаточна  влажность высушенного продукта составл ет 3-5%, препарат полностью растоор етс  в воде.

Полученный препарат дает все характерные реакции на белки. Его мо .м. составл ет от 14 кДа до 94 кДа. При дискэлектрофорезе в полиакриламидном геле установлено наличие нескольких индивидуальных белков.

Характер наблюдаемой биологической активности полученного препарата обусловлен , по-видимому, суммарным присутствием индивидуальных белков Дл  корректировки биологических эффектов допустимо фракционирование целевого продукта .

Сродство полученных предложенным способом белков х опиатным рецепторам было доказано классическим налоксоновым методом 1.

Теоретически и практически доказано. что биологический эффект природных соединений опийтной природы возникает в результате св зывани  опиоидных соединений со специфическими опиатными клеточными рецепторами нескольких типов

0

Известно также, что антагонист опиоидных соединений налоксон имеет большее сродство к опиатным рецепторам и поэтому вытесн ет опиоидные соединени  с их поверхности . тем самым отмен   биологические эффекты, обусловленные опиоидами.

Многочисленными экспериметами показано , что полученные предложенным способом белки при введении в организм экспериментального животного вызывают клиническую картину, соответствующую последстви м введени  природных опиоидов. Последующее введение налоксона полностью устран ет эффекты биологически ак5 тивных белков.

Классическа  реакци  экспериметаль- ных животных на налоксон и обща  клиническа  картина воздействи  белков, полученных предложенным способом, од0 позначно подтверждают специфическое взаимодействие этих белков с опиатными рецепторами.

Анализ патентной и научно-технической литературы показал, что сведений об

5 оригинальной способности белков кислото- растворимой фракции микроорганизмов св зыватьс  с опиатными клеточными рецепторами не имеетс .

За вителем впервые установлена спо0 собность нового класса соединений - белков св зыватьс  с опизтными рецепторами и вызывать биологические эффекты, воспроизвод щие эффекты природных опиоидов. Установленна  за вителем закономер5 ность априорно не вытекает из известного уровн  знаний.

До насто щего времени был известен лишь один класс соединений - низшие пептиды , которые св зывались с опиатными ре0 цепторами Наиболее известны и доступны лишь два нейропептида - энкефалин и эн- дорфин, дающие эффекты, сходные с эффектами опиоидов 1,2, 3.

Способы получени  этих нейропепти5 дов сложны, а эффект воздействи  лина и эндорфина кратковременен.

Предлагаемый способ получени  белков , обладающих сродством к опиатным ре- цептортам, несравненно проще способа

0 получени  нейропептидов с аналогичной функцией а получаемые предложенным способом белки вызывают более разносторонний и более длительный эффект

Разработанный способ открывает по

5 крайней мере путь решени  одной из наиболее актуальных проблем - безопасного длительного обезболивани 

Более подробно сущность предложенного способа по сн етс  следующими примерами

Л р и м е р 1. Молочно-кислые бактерии L.plantarum культивируют на среде КД-5 до концентрации 90-110 млрд микробных тел в 1мл.

Культуру в объеме 16 л центрифугируют 60 мин при 5 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают.

Сырую микробную массу взвешивают в 3 л 0,2 М ацетат-уксусного буфера 0,14 М по хлориду натри  (рН 4,8).

Взвесь хорошо перемешивают и подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц. Провод т 3 цикла обработки ультразвуком по 30 мин. Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч. После этапа экстракции взвесь центрифугируют в течение 60 мин при 5 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают. Осадок после промывани  дистиллированной водой на центрифуге взвешивают в 1,5 л 80%-ного этанола 0,5 н. по сол ной кислоте. Взвесь после перемешивани  подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц. Провод т 2 цикла обработки ультразвуком по 30 мин.

Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч. После этапа экстракции взвесь центрифугируют 60 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость декантируют. Осадок промывают дистиллированной водой на центрифуге и взвешивают в 1 л 0,5 н. раствора сол ной кислоты. Провод т два цикла ультразвуковой обработки при частоте 25 кГц по 30 мин. Экстрагируют при периодическом перемешивании 48 ч. После экстрагировани  взвесь центрифугируют 60 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость декантируют, осадок отбрасывают.

Этанольный и кислотный экстракты обьедин ют, подвергают осветл ющей фильтрации через 8-10 слоев фильтровальной бумаги под вакуумом.

К осветленному фильтрату постепенно приливают 10 объемов охлажденного ацетона и оставл ют на 18 ч дл  отсто  взвеси. Осадок собирают на двойном бумажном фильтре, дважды промывают холодным ацетоном , снимают с фильтра, перенос т в кристаллизатор и помещают в вакуумный сушильный шкаф. Сушку осуществл ют при температуре 37 - 38°С в течение 4 ч.

Полученный сухой препарат измельчают до порошкообразного состо ни  и готов т его 2%-ный раствор в 0,1 М растворе лимонной кислоты. Дл  этого навеску продукта внос т в раствор кислоты и периодически перемешивают. После набухани  белков, что наблюдаетс  через 2 ч, сосуд

помещают в вод ную баню, постепенно нагревают до 45°С и выдерживают 50 мин до просветлени  жидкости. После растворени  белков и просветлени  раствора его 5 центрифугируют в течение 40 мин при 5 тыс. об/мин.

Надосадочную жидкость подвергают осветл ющей, а затем и стерилизующей фильтрации через пластинчатые -фильтры.

10 Раствор разливают по 3 мл в стерильные стекл нные ампулы по 10 мл. замораживают на прот жении 24 ч до температуры - 50°С и подвергают сублимационному высушиванию в течение 72 ч при начальной темперэ15 туре - 35°С до конечной температуры 25°С. Ампулы заполн ют азотом и запаивают. Кажда  ампула содержит 60 мг целевого продуктг1. а всего было получено 13,1 г препарата

0 В качестве экспериметальных животных использовали кроликов, кошек, павианов-гамадрилов .

Кроликам препарат вводили в ушную вену в дозе 20 мг/кг. Через 5 мин после

5 введени  препарата у всех животных (3 кролика ) наступили кататонический ступор и глубока  анальгези  в зоне черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов и стойка  вазодил таци  микроциркул торного русла

0 ушных раковин. Анальгези  тканей ушных раковин очень глубока . Животные не реагируют на термический фактор даже при обугливнаии тканей. После развити  эффекта (через 60 мин) двум кроликам подкожно в

5 дозе 4 мг/кг был введен налоксон.

Через 6 мин наблюдалось восстановление двигательной активности животных, болевой чувствительности и исчезновение вазодил тации микроциркул торного русла

0 ушных раковин.

Изменени  поведени  кролика, не получавшего налоксон, не отмечалось на прот жении более б ч.

Кошкам препарат вводили в вену бедра

5 в дозе 20 мг/кг. Через 10 мин у всех животных (3 кошки) наступил кататонический ступор , исчезло чувство страха. Через 30 мин наступили глубокий сон и анальгези  в области черепно-мозговых и спинно-мозговых

0 нервов.

После полного развити  эффекта (через 60 мин) двум кошкам подкожно введен на- . локсон в дозе 4 мг/кг. Через 7 мин восстановились болева  чувствительность,

5 чувство страха, прерван сон.

Изменени  поведени  кошки, не получавшей налоксон, не отмечалось на прот жении более 6 ч.

Павианам-гамадрилам (3 павиана) препарат вводили в вену предплечь  в дозе 20

мг /кг Ч&рез Б ним после введени  препарата у животных исчезли чувство гтраха и агрессивность Через 15 мин наступила глубока  анальгези  в области черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов.

После полного развити  эффекта (через 60 мин) двум павианам подкожно введен налоксон в дозе 4 мг/кг. Через 3,5 мин у животных по вились страх и агрессивность, восстановилась болева  чувствительность.

Изменени  поведени  павиана-гамадрила , не получавшего налонсон. не отмечалось на прот жении более 6 ч.

П р и м е р 2. Молочно-кислые бактерии L.plantarum культивируют на среде КД-5 до концентрации 90-110 млрд микробных тел в 1 мл.

Культуру в количестве 16 л центрифугируют 60 мин при 5 тыс.об/мин. Надоса- дочную жидкость отбрасывают. Сырую микробную массу взвешивают в 3 л 0,2 М ацетат-уксусного буфера 0,14 М по хлЪриду натри  (рН 4,8).

Взвесь хорошо перемешивают и подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц. Провод т 3 цикла обработки ультразвуком по 30 мин. Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч.

После этапа экстракции взвесь центрифугируют в течение 60 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают . Осадок после промывани  дистиллированной подои на центрифуге взвешивают в 4,5 л 0,5 н. раствора сол ной кислоты. Взвесь после перемешивани  подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц. Провод т 2 цикла обработки ультразвуком по 30 мин.

Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч. После этапа экстракции взвесь центрифугируют 60 мин при 5 тыс об/мин. Надосадочную жикдость декантируют. Осадок отбрасывают.

Надосадочную жидкость фильтруют через 8-10 слоеп фильтровальной бумаги под вакуумом.

К осветленному фильтрату постепенно приливают 10 объемов охлажденного ацетона и оставл ют на 18 ч дл  отсто  взпеси.

Осадок собирают на двойном бумажном фильтре, дважды промывают холодным ацетоном , снимают с фильтра, перенос т в кристаллизатор и помещают в вакуумный сушильный шкаф.

Сушку осуществл ют при температуре 37 - 38°С в течение 4 ч

Полученный сухой продукт измельчают ДО порошкообразного гпсгочни  и ГОТОРЯ-I

его 2%-ный раствор в 0.1 М растворе лимонной кислоты

Дл  этого навеску продукта внос т в раствор кислоты и периодически перемешивают . После набухани  белков, что наблюдаетс  через 2 ч, сосуд помещают в вод ную баню, постепенно нагревают до 45°С и выдерживают 50 мин до просветлени  жидкости . После растворени  белков и

0 просветлени  раствора его центрифугируют в течение 40 мин при 5 тыс. об/мин, Надосадочную жидкость подвергают осветл ющей, а затем и стерилизующей фильтрации через пластинчатые фильтры.

5 Раствор разливают по 3 мл в стерильные стекл нные ампулы по 10мл, замораживают на прот жении 24 ч до температуры - 50°С и подвергают сублимационному высушиванию в течение 72 ч при начальной тем0 пературе 35°С до конечной температуры 25°С.

Ампулы заполн ют азотом и запаивают.

Кажда  ампула содержит 60 мг целевого

продукта, а всего было получено 12,7 г пре5 парата.

В качестве экспериметальных животных использовали кроликов, кошек, павиа- нов-гэмадрилоп.

Кроликам препарат вводили в ушную

0 вену в дозе 20 мг/кг. Через 5 мин у всех животных (3 кролика) наступили кататониче- ский ступор и глубока  анальгези  в зоне черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов и стойка  вазодил таци  микроциркул 5 торного русла ушных раковин, Анальгези  тканей ушных раковин очень глубока . Животные не реагируют на термический фактор даже при обугливании тканей.

После развити  эффекта (через 60 мин)

0 двум кроликам подкожно в дозе 4 мг/кг был введен налоксон. Через 6 мин наблюдались восстановление двигательной активности, болевой чувствительности и исчезновение вазодил тации микроциркул торного русла

5 ушных раковин.

Изменени  поведени  кролика, не получившего налоксон, не отмечалось на прот жении более 6 ч.

Кошкам препарат вводили в вену бедра

0 в дозе 20 мг/кг. Через 10 мин у всех животных (3 кошки) наступил кататонический ступор , исчезло чувство страха. Через 30 мин наступили глубокий сон и анальгези  в области черепно-мозговых и спинно-мозговых

5 нервов.

После поного развити  эффекта (через 60 мин) двум кошкам подкожно введен налоксон в дозе 4 мг/кг Через 7 мин восстановилась болева  чувгтвиггл игч. гь чувгтно страха прерван спи

Изменени  поведени  кошки, не получавшей налоксон, не отмечалось на прот жении более б ч.

Павианам-гамадрилам (3 павиана) препарат вводили в вену предплечь  в до- зе 20 мг/кг. Через 5 мин после введени  препарата у животных исчезли чувство страха и агрессивность.

Через 15 мин наступила глубока  анальгези  в области черепно-мозговых испинно- мозговых нервов. После полного развити  эффекта (через 60 мин) двум павианам подкожно был введен налоксон в дозе 4 мг/кг. Через 3.5 мин у животных по зились страх и агрессивность, восстановилась болева  чувствительность.

Изменени  поведени  павиана-гамадрила , не получавшего налокг.он, не отмечалось на прот жении более б ч.

Примерз. Молрчно-кислые бкатерии Lplantarum культивируют на соеде КД-5 до концентрации 90-110 млрд микробных тел в 1 мл

Культуру в количестве 16л центрифугируют 60 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадоч- ную жидкость отбрасывают. Сырую микробную массу взвешивают в 3 л, 9,2 М ацетат-уксусного буфера 0,14 М по хлориду натри  (рН 4,8).

Взвесь хорошо перемешивают и под- вергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц. Провод т 3 цикла обработки ультразвуком по 30 мин. Экстрагиуют при комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч.

После этапа экстракции взвесь центрифугируют в течение 60 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают. Осадок после промывани  дистиллированной водой на центрифуге взвешивают в 4;5 л 0,25 н. раствора сол ной кислоты. Взвесь после перемешивани  подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц. Провод т 2 цикла обработки ультразвуком по 30 мин.

Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч. После этапа экстракции взвесь центрифугируют 60 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость декантируют. Осадок отбрасывают.

Надосадочную жидкость фильтруют через 8-10 слоев фильтровальной бумаги под вакуумом.

К осветленному фильтрату постепенно приливают 10 обьемов охлажденного ацетона и оставл ют на 18 ч дл  отсто  взвеси.

Осадок собирают на двойном бумажном фильтре, дважды промывают холодным ацетоном , снимают с фильтра перенос т в кристэллиз тор и помещают в вакуумный сушильный шкаф. Сушку осуществл ют при температуре 37 38°С в течение 4 ч

Полученный сухой продукт измельчают до порошкообразного состо ни  и готов т его 2%-ный раствор в 0,1 М растворе лимонной кислоты

Дл  этого навеску продукта пнос т в раствор кислоты и периодически перемешивают . После набухани  белков, что наблюдаетс  через 2 ч сосуд помещают в вод ную баню, постепенно НЕтрквают до 45°С и выдержиазю 50 мин до про- сеетлени  жидкости После раствоое- ник белков и просветлени  раствора его центрифугируют в течение 40 мин при 5 тыс об/мин.

Надосадочную жидкость подвергают осветл ющей, а ЗЭТРМ и стерилизующей фильтрации через пластинчатые фильтры

Раствор разливают по 3 мл в стерильные стекл нные ампулы по 10 мл, замораживают на прот жении 24 ч до тепературы -50°С и подвергают сублимационному высушиванию в течение 72 ч при начальной температуре -35°С до конечной температуры 25ПС

Ампулы заполн ют азотом и запаивают. Кажда  ампула содержит 60 мг целевого продукта, а всего было получено 12,2 г препарата

В качестве экспериментальных животных использовали кроликов и кошек.

Кроликам препарат вводили в ушную вену в дозе 20 мг/кг. Через 5 мин у всех животных (3 кролика) нжтупили кататониче- ский ступор, глубока  анальгези  в зоне черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов и стойка  вэзодил таци  микроциркул тор- ного русла ушных раковин

Анальгези  тканей ушных раковин очень глубока . Животные не реагируют на термический фактор даже при обугливании тканей

После развити  эффекта (через 60 мин) двум кроликам подкожно в дозе 4 мг/кг был введен налоксон Через 6 мин наблюдалось восстановление двигательной активности, болевой чувствительности и исчезновение в зодил тации микроциркул рного русла ушных рэковин.

Изменени  поведени  кролика, не получавшего налоксон, не отмечалось на прот жении более 6 ч.

Кошкам препарат вводили в вену бедра в дозе 20 мг/кг. Через 10 мин у ВСРХ животных (3 кошки) наступил кататоничегкий ступор , исчезло чувство страха. Черет 30 мин наступили глубокий сон и анальгези  в области чйрепно-мозговых и спинно-моэговых нервов.

После полного развити  эффекта (через 60 мин) двум  кошкам подкожно введен на- клоксон в дозе 4 мг/кг. Через 7 мин песета- новились болева  чувствительность, чувство страха, прерван сон.

Изменени  поведени  кошки, не получившей налоксон, не отмечалось на прот жении более 6 ч.

П р и м е р 4. Сенную палочку (Bac.subtllls) культивируют на м сопептон- ном бульоне до концентрации 30-40 млрд микробных тел в 1 мл.

Культуру о количестве 16 л центрифуги- руют 60 мин при 5 тыс. об/мин. Надосадоч- ную жидкость отбрасывают. Сырую микробную массу взвешивают в 3 л 0,2 М ацетат-уксусного буфера 0,14 М по хлориду натри  (рН 4,8).

Взвесь хорошо перемешивают и подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц, Провод т 3 цикла обработки ультразвуком по 30 мин. Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч.

После этапа экстракции взвесь центрифугируют в течение 60 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают. Осадок после промывани  дистиллированной во- дои на центрифуге взвешивают в 4,5 л 0.5 н. раствора сол ной кислоты.

Взвесь после перемешивани  подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц. Провод т 2 цикла обработки ультра- звуком по 30 мин.

Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч.

После этапа экстракции взвесь центри- фугируют 60 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость декантируют. Осадок отбрасывают.

Надосадочную жидкость фильтруют через 8-10 слоев фильтровальной бумаги под вакуумом.

К осветленному фильтрату постепенно приливают 10 объемов охлажденного ацетона и оставл ют на 18 ч дл  отсто  взвеси.

Осадок собирают на двойном бумажном фильтре, дважды промывают холодным ацетоном , снимают с фильтра, перенос т в кристаллизатор и помещают в вакуумный сушильный шкаф. Сушку осуществл ют при температуре 37 - 38°С в течение 4 ч.

Полученный сухой продукт измельчают до порошкообразного состо ни  и готов т его2%-ный раствор о0.1 М растворе лимонной кислоты.

Дл  этого навеску продукта внос т в раствор кислоты и периодически перемешивают . После набухани  белков, что наблюдаетс  через 2 ч, сосуд помещают в вод ную баню, постепенно нагревают до 45°С и выдерживают 50 мин до просветлени  жидкости . После растворени  белков и просветлени  жидкости ее центрифугируют в течение 40 мин при 5 тыс.об/мин.

Надосадочную жидкость подвергают осветл ющей, а затем и стерилизующей фильтрации через пластинчатые фильтры.

Раствор разливают по 3 мл в стерильные стекл нные ампулы по 10мл, замораживают на прот жении 24 ч до температуры -50°С и подвергают сублимационному высушиванию в течение 72 ч при начальной температуре -35°С до конечной температуры 25°С.

Ампулы заполн ют азотом и запаивают.

Кажда  ампула содержит 60 мг продукта , а всего было получено 7,8 г препарата.

В качестве экспериметальных животных использовали кроликов, кошек, павианов-гамадрилов .

Кроликам препарат вводили в ушную вену в дозе 20 мг/кг. Через 5 мин у всех животных (3 кролика) наступили кататониче- ский ступор, глубока  анальгези  в зоне черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов и стойка  вазодил таци  микроциркул тор- ного русла ушных раковин.

Анальгези  тканей ушных раковин очень глубока . Животные не реагируют на термический фактор даже при обугливании тканей.

После развити  эффекта (через 60 мин) двум кроликам подкожно в дозе 4 мг/кг был введен налоксон. Через 5 мин наблюдалось восстановление двигательной активности, болевой чувствительности и исчезновение вазодил тации микроциркул торного русла ушных арковин.

Изменени  поведени  кролика, не получавшего налоксон, не отмечалось на прот жении более 6 ч.

Кошкам препарат вводили в вену бедра в дозе 20 мг/кг. Через 10 мин у всех животных (3 кошки) наступил катэтонический ступор , исчезло чувство страха. Через 20 мин наступили глубокий сон и анальгези  в области черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов.

После полного развити  эффекта (через 60 мин) двум кошкам подкожно был введен налоксон в дозе 4 мг/кг. Через 7 мин восстановились болева  чувствительность, чувство страха, был прерван сои

Изменени  поведени  кошки, не получившей налоксон. не отмечалось на прот жении более 6 ч.

Павианам-гамадрилам (3 павиана) препарат вводили в вену предплечь  о дозе 20 мг/кг. Через 5 мин после введени  препарата у животных исчезли чувство страха и агрессивность , наблюдалась сильна  вэзодил таци  микроциркул торною русла головы. Через 15 мин наступила глубока  анальгези  в области черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов.

После полного развити  эффекта (через 60 мин) двум павианам подкожно был введен налоксон в дозе 4 мг/кг. Через 5 мин у животных повысились страх, агрессивность , восстановилась болева  чувствительность .

Изменени  поведени  павиана-гамадрила , не получавшего налоксон, не омтечэ- лось на прот жении более 6 ч.

П р и м е р 5. Уробактерии (B.Sulfureum) культивируют на м сопептонном бульоне до концентрации 30-40 млрд микробных теп в 1 мл.

Культуру в количестве 16 л центрифугируют 60 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадоч- ную жидкость отбрасывают. Сырую микробную массу взвешивают в 3 л 0.2 М ацетат-уксусного буфера 0.14 М по хлориду натри  (рН 4,8).

Взвесь хорошо перемешивают и подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц. Провод т 3 цикла обработки ультразвуком по 30 мин. Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч.

После этапа экстракции взвесь центрифугируют в течение 60 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают. Осадок после промывани  дистиллированной водой на центрифуге взвешивают в 4,5 л 0,5 н. раствора сол ной кислоты.

Взвесь после перемешивани  подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц. Провод т 2 цикла обработки ультразвуком по 30 мин.

Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании48 ч.

После этапа экстракции взвесь центрифугируют 60 мин при 5 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость декантируют. Осадок отбрасывают.

Надосадочную жидкость фильтруют через 8-10 слоев фильтровальной бумаги под вакуумом.

К осветленному фильтрату постепенно приливают 10 объемов охлажденного ацетона и оставл ют на 18 ч дл  отсто  взвеси.

Осадок собирают на двойном бумажном фильтре, дважды промывают холодным ацетоном , снимают г. фильтра, перенос т в кри сталпизэтор и помещают п вакуумный сушильный шк ф.

Сушку осуществл ют при температуре 5 37 - 38°С птечение 4 ч,

Полученный сухой продукт измельчают до порошкообразного состо ла и готов т его 2 % -ный раствор з 0 1 М рлстьорг: лимонной кислоты.

10 Дл  этого навеску продукта внос т в раствор кислоты и периодически перемешивают . После набухани  белков, что наблюдаетс  через 2 ч, сосуд помещают в вод ную баню постепенно нагревают до 45°С и оы- 15 держивают 50 мин до просветлени  жидкости , После растворени  белков и просветлени  жидкости ее центрифугируют в течение 40 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость подвергают осветл ющей, 0 э затем и стерилизующей фильтрации через пластинчатые фильтры.

Раствор разливают по 3 мл в стерильные стекл нные ампулы по 10 мл, замораживают на прот жении 24 ч до температуры -50°С 5 и подвергают сублимационному высушиванию в течение 72 ч при начальной температуре - 35° С до коночной температуры 25°С.

Амулы заполн ют азотом и запаивают. Кажда  ампула содержит 60 мг продук- 0 та, а всего было получено 6.9 г препарата.

В качестве экспериметальных животных использовали кроликов, кошек и павианов-гамадрилов .

Кроликам препарат вводили в ушную 5 вену в дозе 10 мг/кг. Через 3 мин у всех животных(3 кролика) наступили кататониче- ский ступор, глубока  анальгези  в зоне черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов и стойка  вазодил таци  микроциркул тор- 0 ного русла ушных раковин. Анальгези  тканей ушных раковин очень глубока . Животные не реагируют на термический фактор даже при обугливании тканей.

После развити  эффекта (через 60 мин)

5 двум кроликам подкожно в дозе 4 мг/кг был

введен налоксон. Через 5 мин наблюдалось

восстановление двигательной активности.

болевой чувствительности и исчезновение

вазодил тации микроциркул торного русла

0 ушных раковин.

Изменени  поведени  кролика, не получавшего налоксон, не отмечалось на прот жении более 6 ч.

Кошкам препарат вводили в вену бедра 5 в дозе 20 мг/кг.Через 10 мин у всех животных (3 кошки) наступил кататонический ступор , исчезло чувство страха. Через 20 мин наступили глубокий сон и анальгези  в области черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов.

После полного развити  эффекта (через 60 мин) двум кошкам подкожно был введен налоксон в доче 4 мг/кг. Через 5 мин восстановились Полова  чувствительность, чувство страха, был прерван сон.

Изменени  поведени  кошки, не получавшей налоксон, не отмечалось на прот жении более 6 ч.

Павианам-гамадрилам (3 павиана) препарат вводили в вену в дозе 15 мг/кг. Через 5 мин после введени  препарата у животных исчезли чувство страха и агрессивность, наблюдалась сильна  вазодил таци  микро- циркул торного русла головы,

Через 15 мин наступила глубока  аналь- гези  в области черепно-мозговых и спинномозговых нервов.

После полного развити  эффекта (через 60 мин) двум павианам подкожно был введен налоксон в дозе 4 мг/кг. Через 5 мин у животных по вились страх и агрессивность , восстановилась болева  чувствительность .

Изменени  поведени  павиана-гамадрила , не получавшего налоксон. не отмеча- лось на прот жении более 6 ч.

Claims (6)

1. Способ получени  белков, обладающих сродством к опиатным рецепторам,

отличающийс  тем. что в качестве белков, обладающих сродством к опиатным рецепторам, используют фракцию кислото- растворимых белков микробной массы с мол.мае. 14-94 кД.

2.Способ по п.1.отличающийс  тем, что в состав микробной массы включают молочнокислые бактерии, уробактерии, сенную палочку.

3.Способ по п.1,отличающийс  тем, что фракцию кислоторастворимых белков получают путем экстрагировани  микробной массы подкисленной водой или подкисленными органическими растворител ми с последующим осаждением этой фракции органическими растворител ми.

4.Способ по п.1,отличающийс  тем, что дл  подкислени  воды или органического растворител  используют сол ную кислоту.

5.Способ по п. 1,отличающийс  тем, что Фракцию кислоторастворимых белков подвергают сушке.

6.Способ по пп.1 и 5, отличающий- с   тем. что перед сушкой или после сушки фракцию кислоторастворимых белков подвергают стерилизации.