KR101358601B1 - 도파민 뉴런의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Nurr1 유전자의 발현 수준 및 발현 시점을 조절함으로써 성숙한 도파민 뉴런을 제조하는 방법에 관한 것으로서, Nurr1 유전자가 포함된 벡터를 제조하는 단계; 상기 벡터를 신경 전구세포(neural precursor cell)에 도입시키는 단계; 및 상기 벡터의 도입 후 60시간 내지 84시간이 경과한 다음, 상기 신경 전구세포 내에서 Nurr1 유전자의 발현을 활성화시키면서 96시간 이상 배양하는 단계를 포함하는 도파민 뉴런 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 Nurr1 발현의 생리적인 패턴을 고려하여 외인성 Nurr1만의 발현을 조절하기 때문에 도파민 뉴런의 제조 과정을 단순화시킬 수 있고, 자연발생적인 도파민 뉴런과 생리학적 특성이 동일한 도파민 뉴런을 제조할 수 있다.

Description

도파민 뉴런의 제조 방법{The method for preparing dopamine neurons}
본 발명은 도파민 뉴런의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 Nurr1 유전자의 발현 수준 및 발현 시점을 조절함으로써 성숙한 도파민 뉴런을 제조하는 방법에 관한 것이다.
중뇌에 있는 도파민 뉴런은 운동 행동 및 감정의 조절에 결정적인 역할을 한다. 중뇌 도파민 뉴런 발생 및 퇴화에 관한 연구는 파킨슨병(Parkinson's disease, PD), 정신분열증(schizophrenia) 및 약물 중독과 같은 도파민 뉴런 관련 질환에 대한 치료법을 개발하는데 중요하다.
자가 증식 및 다분화능을 갖는 신경 줄기/전구 세포(Neural stem/precursor cells, NSCs/NPCs)는 발생중이거나 또는 성체에서의 뇌 조직으로부터 분리 및 배양되며, 배양된 NPC는 연구 및 약물 스크리닝을 위한 도파민 뉴런의 대량 형성에 사용될 수 있다. 또한, 배양된 NPC를 PD의 치료를 위한 세포 치료에 사용하는 것에 집중되고 있으며, 임상적 사용을 위해 세포 치료가 승인되고 있다(Deierborg et al., 2008; Morizane et al., 2008). 그러나, 배양된 NPC로부터 효율적인 도파민 뉴런의 분화는 배자기11 내지 12(E11 내지 E12)에 분리된 랫트 복측중뇌(ventral midbrain, VM)와 같이, 초기 배아 단계 동안 VM으로부터 유래되는 것으로 제한된다(Studer et al., 1998; Lee et al., 2003). 또한, VM-NPC의 도파민 뉴런 분화능은 시험관 내에서 NPC의 장기 증식 후에는 완전히 없어지게 된다(Yan et al., 2001). 이러한 한계를 극복하기 위하여, 배양된 NPC에서 중뇌 도파민 뉴런 발생에 특이적인 유전자의 조작이 시도되고 있다.
Nurr1은 발생하는 중뇌의 도파민 뉴런의 도메인에서 발현되는 스테로이드 수용체 타입 전사 인자이다(Zetterstrom et al., 1996). 도파민 뉴런은 Nurr1-녹아웃 마우스의 중뇌에서는 발생되지 않는 것으로 보고되었고(Zetterstrom et al., 1997), 이는 중뇌 도파민 뉴런 발생에 있어서 Nurr1이 특이적이고 필수적인 역할을 한다는 것을 의미한다. 배양된 NPC에서 Nurr1의 인위적인 발현은 도파민 뉴런 마커인, 티로신 수산화효소(tyrosine hydroxylase, TH), DA 트랜스포터(DA transporter, DAT) 및 vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2)에 대한 양성 세포로 NPC 분화를 유도한다(Kim et al., 2003). DA 형태를 얻는 것에 대한 Nurr1 매개된 효과는 NPC 배양물의 뇌 부위 또는 발생 단계에 상관없이 관찰되고(Kim et al., 2003 Shim et al., 2007), 이는 Nurr1이 도파민 뉴런 유도 전략에 사용하기 위한 가장 중요한 후보자라는 것을 의미한다. 그러나, 배양된 NPC에서 Nurr1의 인위적 발현은 비뉴런 또는 비성숙 도파민 뉴런을 산출한다(Kim et al., 2003 Sakurada et al., 1999 Park et al., 2006 Kim et al., 2007 Sonntag et al., 2004). 발생하는 중뇌에서의 Nurr1 발현은 특이적인 생리적 수준 내에서 발생 기간 동안 정확하게 조절되지만(Ang, 2006), 이전 시험관 내 연구에 있어서는 Nurr1 발현의 생리적인 패턴을 고려하지 않고 Nurr1 발현을 단지 유도하였다.
이에, Nurr1 발현의 생리적인 패턴을 고려하면서도 외인성 Nurr1 발현을 통해 형태 및 표현형적으로 성숙한 도파민 뉴런을 생성하는 기술은 개발되지 못하고 있는 실정이다.
본 발명의 목적은 외인성 Nurr1 발현을 통해 형태 및 표현형적으로 성숙한 도파민 뉴런을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 Nurr1 유전자가 포함된 벡터를 제조하는 단계; 상기 벡터를 신경 전구세포(neural precursor cell)에 도입시키는 단계; 및 상기 벡터의 도입 후 60시간 내지 84시간이 경과한 다음, 상기 신경 전구세포 내에서 Nurr1 유전자의 발현을 활성화시키면서 96시간 이상 배양하는 단계를 포함하는 도파민 뉴런 제조 방법을 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 다른 측면은 상기의 방법에 의하여 제조된 도파민 뉴런을 제공한다.
본 발명의 도파민 뉴런의 제조 방법은 Nurr1 발현의 생리적인 패턴을 고려하여 외인성 Nurr1만의 발현을 조절함으로써 형태 및 표현형적으로 성숙한 도파민 뉴런을 제조할 수 있기 때문에 도파민 뉴런의 제조 과정을 단순화시킬 수 있고, 자연발생적인 도파민 뉴런과 생리학적 특성이 동일한 도파민 뉴런을 제조할 수 있는 바, 본 발명의 제조 방법에 의하여 제조되는 도파민 뉴런은 파킨슨병, 정신분열증 및 약물 중독과 같은 도파민 뉴런 관련 질환의 연구 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 신경 전구세포에서 Nurr1의 발현 수준이 Nurr1에 의해 유도되는 도파민 뉴런의 신경세포 성숙도(neuronal maturity)를 결정한다는 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다:
상기 도 1의 A 내지 K는 외인성 및 내인성 Nurr1 발현에 의해서 유도되는 TH 양성 세포에서 신경세포의 성숙도 및 Nurr1 발현 수준의 차이를 나타낸 결과이다. 피층 유래 신경 전구세포들은 Nurr1 레트로바이러스로 형질감염된 후, 7일 동안 분화되었다. 외인성 Nurr1에 의해 유도되는 상기 TH 양성 세포의 신경세포로의 분화(Exo, A-D)는 TH 양성 섬유 길이(I) 및 총 TH 양성 세포 중 TH 및 TuJ1 양성 세포의 비율(%)을 측정함으로써 E12 VM-NPC의 신경세포로의 분화와 비교하였다(Endo, E-H). 상기 외인성 및 내인성 Nurr1의 발현 수준은 개별 Nurr1-염색 세포들의 평균 형광 세기(MFI)로 정량되었다(K);
상기 도 1의 L 내지 S는 Nurr1 발현 수준과 Nurr1-Th 양성 세포의 형태적 성숙도 간의 역 상관관계를 나타내는 결과이다. 피층 유래 신경 전구세포들을 높은 역가(25 MOI) 및 낮은 역가(5 MOI)의 Nurr1 레트로바이러스로 형질감염시키고, 7일 동안 분화시켰다. 상기 7일의 분화 후, 상기 피층 유래 신경 전구세포들을 Nurr1 및 TH에 대하여 염색하였다. R 및 S의 그래프에서, 각 점들은 단일 Nurr1 양성 세포 및 TH 양성 세포들에서 염색된 Nurr1 단백질의 평균 형광 세기(MFI) 및 TH 양성 세포에서의 섬유 길이(㎛)를 나타낸다. *p<0.001
도 2는 발생 중인 복측중뇌(ventral midbrain, VM), 및 VM 유래 신경 전구세포를 시험관 내 분화(in vitro differentiation)시킨 배양체에서의 Nurr1 발현 수준을 나타내는 사진 및 그래프이다:
상기 도 2의 A 및 B는 배자기14(E14) 생쥐의 VM 내 내층 영역(intermediate zone) 및 맨틀 영역(mantle zone)에 분포한 Nurr1 단백질의 발현 수준을 나타낸다. E14 VM 단편(slice)은 Nurr1/PCNA(A) 및 Nurr1/TH(B)에 대하여 면역염색되었다;
상기 도 2의 C는 E12 VM 유래 신경 전구세포의 배양체(윗 패널; Endo), 및 Nurr1이 도입된 E14 피층 유래 신경 전구세포의 배양체(아래 패널; Exo)에서 시험관 내 분화 0일(증식 기간의 마지막 날) 내지 분화 4일 동안 의 Nurr1 발현 수준을 나타낸다;
상기 도 2의 D는 E12 VM 유래 신경 전구세포의 배양체 및 Nurr1이 도입된 E14 피층 유래 신경 전구세포의 배양체 내에서 총 세포들 중 Nurr1 양성 세포의 비율(%)을 나타낸다.
도 3은 독시사이클린 유도성 레트로바이러스 벡터 시스템인 pCURT을 이용한 외인성 Nurr1 발현의 조절 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다:
상기 도 3의 A는 테트라사이클린 유도체인 독시사이클린이 존재하는 경우에 TRE 프로모터의 조절에 의하여 Nurr1이 발현되도록 고안된 pCURT 벡터(pCURT-Nurr1)의 모식도이다. 유비퀴틴 프로모터(pUbC)에 의하여 유도되는 rtTA3 단백질은 독시사이클린의 존재 하에서 TRE 프로모터에 결합하고, Nurr1 유전자 발현을 활성화시킨다. 상기 벡터에서 mCherry 유전자는 LTR 프로모터에 의해 유도된다;
상기 도 3의 B는 독시사이클린 처리에 의하여 외인성 Nurr1 유전자의 유도 효과를 나타낸다. E14 랫트의 피층 유래 신경 전구세포에 pCURT-Nurr1 벡터를 도입시킨 후, 독시사이클린(1 ㎍/㎖)의 존재(오른쪽) 또는 부재(왼쪽) 하에서 3일 동안 배양한 다음, Nurr1을 면역염색하였다;
상기 도 3의 C는 외인성 Nurr1의 독시사이클린 농도-의존적 발현을 나타낸다. 각기 다른 농도의 독시사이클린(0 ㎍/㎖ 내지 4 ㎍/㎖)으로 처리된 배양체 내 Nurr1 mRNA의 발현은 실시간-PCR을 이용하여 정량적으로 결정되었다. 상단 패널은 독시사이클린 농도에 따른 Nurr1-염색 세포의 사진을 나타낸다.
도 4는 pCURT-Nurr1 벡터가 도입된 후 분화된 배양체에서 TH 양성 세포의 독시사이클린 농도-의존적 성숙 여부를 형태학적으로 확인한 결과를 나타내는 사진이다. E14 랫트의 피층 유래 신경 전구세포에 pCURT-Nurr1 벡터가 도입되었고, 각기 다른 농도의 독시사이클린(0.5 ㎍/㎖ 내지 4 ㎍/㎖)의 존재 하에서 7일 동안 분화시켰다. 분화의 마지막 날, 상기 배양체들은 TH에 대하여 면역염색되었다:
상기 도 4의 A 및 B는 0.5 ㎍/㎖(A) 및 4 ㎍/㎖(B)의 독시사이클린을 처리한 배양체 내에서 TH 양성 세포의 존재를 나타내는 사진이다.
도 5는 Nurr1 유전자의 지연 발현(delayed expression)에 의해 성숙한 도파민 뉴런이 생성됨을 나타내는 사진 및 그래프이다. E14 랫트의 피층 유래 신경 전구세포에 pCURT-Nurr1 벡터를 도입하고, 1일 경과 후, 두 가지의 서로 다른 방법으로 독시사이클린을 처리하여 분화를 유도하였다-(1)전체 배양 기간인 7일 동안 1 ㎍/㎖ 농도의 독시사이클린을 처리/(2)분화 유도 2일 후부터 5일 동안 1 ㎍/㎖ 농도의 독시사이클린을 처리:
상기 도 5의 A, B, D, E 및 H는 분화가 완료된 배양체에서 TH(A 및 D) 및 TuJ1(B 및 E)를 면역염색한 후, 외인성 Nurr1에 의하여 유도된 TH 양성 세포의 신경세포 성숙도(neuronal maturity)를 TH 양성 세포의 섬유(fiber) 길이로 예측하였다(G)-총 TH 양성 세포 중 Th 양성 세포 및 TuJ1 양성 세포의 비율(%)(H);
상기 도 5의 C 및 F에서는 TH/TuJ1이 공동-발현되는 세포를 화살표로 표시하였다. 성숙한 신경세포성(I 및 J) 마커와 도파민 신경세포성(K 및 L) 마커의 공동-분포 및 도파민의 DAT-매개된 특이적 흡수(M)를 측정함으로써, 독시사이클린의 지연 처리(delayed treatment)에 의해서 생성된 TH 양성 세포의 기능 및 성숙한 도파민 뉴런으로서의 표현형을 평가하였다. *P<0.001
도 6은 본 발명에서 이용된 pCURT-Nurr1 벡터에서 마우스 CREB 5' UTR의 일부 서열(서열번호 17의 염기 서열)이 Nurr1 유전자의 발현에 미치는 영향을 분석한 결과의 사진 및 그래프이다.
도 7은 본 발명에서 이용된 pCL 레트로바이러스 벡터의 벡터맵이다.
도 8은 본 발명에서 이용된 pCL-Nurr1 레트로바이러스 벡터의 벡터맵이다.
도 9는 본 발명에서 이용된 pCURT 레트로바이러스 벡터의 벡터맵이다.
도 10은 본 발명에서 이용된 pCURT-Nurr1 레트로바이러스 벡터의 벡터맵이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 도파민 뉴런 제조 방법 및 이에 의하여 제조되는 도파민 뉴런
본 발명의 일 측면은 Nurr1 유전자가 포함된 벡터를 제조하는 단계; 상기 벡터를 신경 전구세포(neural precursor cell)에 도입시키는 단계; 및 상기 벡터의 도입 후 60시간 내지 84시간이 경과한 다음, 상기 신경 전구세포 내에서 Nurr1 유전자의 발현을 활성화시키면서 96시간 이상 배양하는 단계를 포함하는 도파민 뉴런 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명의 다른 측면은 상기 방법에 의하여 제조되는 도파민 뉴런을 제공한다.
상기 도파민 뉴런 제조 방법은 1) Nurr1 유전자가 포함된 벡터를 제조하는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 제조한 벡터를 신경 전구세포(neural precursor cell)에 도입시키는 단계; 및 3) 상기 단계 2)의 벡터 도입 후 60시간 내지 84시간이 경과한 다음, 상기 신경 전구세포 내에서 Nurr1 유전자의 발현을 활성화시키면서 96시간 이상 배양하는 단계를 포함한다.
상기 단계 1)의 벡터는 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터인 것이 가장 바람직하다. 특히 본 발명의 경우, Nurr1 유전자를 포함하는 벡터가 신경 전구세포에 형질도입되어야 하기 때문에 레트로바이러스 벡터를 이용하는 것이 가장 효율적이다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 pCURT-Nurr1 레트로바이러스 벡터를 이용하였다.
상기 단계 1) 벡터는 rtTA(reverse tetracycline controlled transactivator) 및 TRE(tetracycline response element) 프로모터를 더 포함하고, 상기 Nurr1 유전자는 상기 TRE 프로모터에 작동가능하게 연결된 것이 바람직하고, 상기 벡터는 상기 rtTA는 상기 제1 프로모터에 작동가능하도록 연결된 제1 프로모터를 추가적으로 포함하고 있는 것이 가장 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다. 상기 벡터는 제1 프로모터의 작용에 의하여 발현된 rtTA3(reverse tetracycline controlled transactivator 3)가 TRE 프로모터에 결합함으로써 상기 TRE 프로모터가 활성화되고, 상기 활성화된 TRE 프로모터에 의하여 Nurr1 유전자의 발현이 유도되는 것이다. 즉, rtTA가 TRE 프로모터에 대한 전사인자(transcription factor)로서 작용하는 것이다. 그러나, 자연형의 rtTA는 그 자체만으로는 TRE 프로모터에 결합하지 못하고, 테트라사이클린 또는 그 유도체인 독시사이클린과 결합하는 경우에만 TRE 프로모터에 결합할 수 있다. 즉, 상기 제1 프로모터에 의하여 발현된 rtTA는 독시사이클린과 결합하여 독시사이클린-rtTA 복합체가 형성됨으로써 상기 TRE 프로모터에 결합될 수 있도록 구조적 변형(conformational change)이 일어나게 되고, 상기 독시사이클린-rtTA 복합체가 TRE 프로모터에 결합함으로써 Nurr1 유전자의 발현이 유도되는 것이다. 따라서, 상기 벡터로부터 Nurr1 유전자가 발현되기 위해서는 독시사이클린 또는 테트라사이클린이 주어져야 한다.
상기 제1 프로모터는 상기에서 설명한 바와 같이, rtTA를 발현시키기 위한 것으로서, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터, SV40 프로모터, 레트로바이러스(retrovirus) 프로모터, 메탈로치오네인(metallothionein) 프로모터, 열충격 단백질(heat shock protein) 프로모터, CAG 프로모터, 연장인자 1a(elongation factor 1a) 프로모터, 액틴(actin) 프로모터, 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터, 알부민(albumin) 프로모터 및 MHC 클래스 Ⅱ(MHC class Ⅱ) 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 상기 제1 프로모터는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터, SV40 프로모터, 레트로바이러스(retrovirus) 프로모터, 메탈로치오네인(metallothionein) 프로모터, 열충격 단백질(heat shock protein) 프로모터, CAG 프로모터 및 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 더욱 바람직하며, 상기 제1 프로모터는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터, SV40 프로모터, 레트로바이러스(retrovirus) 프로모터 및 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 아니하고, 숙주세포 내에서 rtTA를 발현시킬 수 있는 모든 프로모터가 이용될 수 있다. 당업자는 숙주의 종류에 따라, 상기 제1 프로모터를 적절히 선택하여 상기 벡터를 구성할 수 있다.
상기 벡터는 상기 TRE 프로모터와 상기 Nurr1 유전자 사이에 서열번호 17로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열이 더 포함될 수 있다. 상기 서열번호 17의 염기 서열은 마우스 CREB 5' UTR을 코딩하는 염기 서열 중 일부 서열로서, 본 발명의 상기 벡터에서 TRE 프로모터와 상기 Nurr1 유전자 사이에 개재되어 Nurr1 유전자의 발현에 엔헨서(enhancer)로서 작용한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 상기 서열번호 17의 염기 서열을 삽입한 경우와 삽입하지 않은 경우의 GFP의 발현량을 비교한 결과, 삽입한 경우에 GFP의 발현량이 약 3배 정도 증가함을 확인하였다(도 6 참조).
상기 단계 2)의 신경 전구세포는 포유동물에서 유래한 것이 바람직하다. 상기 포유동물은 인간, 원숭이, 침팬지, 개, 고양이, 소, 염소, 돼지, 마우스 또는 랫트 등 일 수 있다. 상기 신경 전구세포가 포유동물에서 유래하는 것인 경우, 상기 신경 전구세포는 대뇌 또는 뇌의 피층를 포함한 뇌 조직의 모든 부위에서 유래한 모든 종류의 신경 전구세포일 수 있다. 특히, 상기 포유동물의 뇌 조직 중 피층은 도파민에 반응하지 않는 뇌 영역으로서, 상기 피층에서 유래한 신경 전구세포는 도파민 뉴런으로 분화하는 능력을 거의 가지고 있지 않다. 그럼에도 불구하고, 상기 피층 유래의 신경 전구세포 또한 상기 단계 2)의 신경 전구세포로 이용될 수 있다. 또한, 상기 신경 전구세포가 포유동물에서 유래하는 것인 경우, 상기 신경 전구세포는 배아 및 성체를 포함하는 모든 발생 단계에서 유래한 것일 수 있으나, 다량의 신경 전구세포를 획득하기 위해 신경 발생이 가장 왕성한 시기의 발생 중인 배아에서 유래한 것이 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 신경 발생이 왕성한 배자기14일 랫트의 배아의 뇌 조직 중 도파민 뉴런으로 분화하는 능력을 거의 가지고 있지 않은 피층(cortex)에서 분리한 신경 전구세포를 이용하였고, 상기 배자기14인 랫트 배아의 피층 유래 신경 전구세포에서 Nurr1 유전자를 강제 발현시킨 결과, TH가 발현되기는 하였지만, 확장된 신경돌기가 없는 미성숙/미분화의 뉴런으로 나타났으며(도 1의 A, D 및 I 참조), 오직 소수만이 뉴런-특이적 마커를 발현하였다(도 1의 B 및 J 참조).
상기 단계 2)의 벡터 도입은 리포펙타민(Lipofectamine), 칼슘-인산(calcium-phosphate), 양전하성 고분자, 리포좀 등과 같은 형질도입용 시약을 이용하거나, 나노입자, 뉴클레오펙션(nucleofection), 전기천공법(electroporation), 열충격(heat shock), 마그네토펙션(magnetofection) 또는 바이러스 감염에 의한 방법으로 수행될 수 있으나, 상기 벡터의 도입은 바이러스 감염에 의하여 도입되는 것이 가장 바람직하다. 상기 벡터의 도입이 바이러스 감염에 의하여 수행되는 경우, 바이러스의 종류는 상기 벡터의 종류에 따라 달라지게 되는데, 상기 벡터가 아데노바이러스 벡터인 경우에는 아데노바이러스를, 상기 벡터가 렌티바이러스 벡터인 경우에는 렌티바이러스를, 상기 벡터가 레트로바이러스인 경우에는 레트로바이러스를 이용한다. 특히, 벡터가 되입되는 세포가 줄기세포 또는 1차 배양세포인 경우에는 레트로바이러스 벡터를 이용하고, 레트로바이러스 감염에 의해 벡터를 도입하는 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 레트로바이러스 벡터에 Nurr1 유전자를 삽입하고, 레트로바이러스의 감염에 의하여 상기 벡터를 도입하였다.
상기 벡터의 도입이 레트로바이러스의 감염에 의하여 수행되는 경우, 상기 레트로바이러스는 5 내지 10 MOI(multiplicity of infection)의 바이러스 역가로 감염되는 것이 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 낮은 바이러스 역가(5 MOI)로 형질감염시킨 경우가 높은 바이러스 역가(25 MOI)로 형질감염시킨 경우보다 더욱 신경돌기를 잘 형성시키는 것으로 나타났다(도 1의 L 내지 S 참조).
상기 단계 3)의 Nurr1 유전자 발현은 상기 단계 2)의 벡터 도입 후 60시간 내지 84시간이 경과한 후에 활성화시키는 것이 바람직하다. 이는 Nurr1 유전자 발현의 생리적인 패턴을 고려한 것으로서, 본 발명의 구체적인 실시예에서 확인한 결과, Nurr1 유전자의 발현은 후기 전구 세포 단계(late precursor cell stage)부터 시작됨을 확인하였다(도 2 참조). 상기 Nurr1 유전자의 발현이 시작되는 시점이 상기 60시간 시점에 미달하거나 84시간 시점을 도과하는 경우, Nurr1 유전자의 발현에 의하여 형성되는 도파민 뉴런이 미성숙/미분화되는 문제가 있다.
특히, 상기 단계 1) 및 단계 2)에서 각각 제조 및 도입되는 벡터가 rtTA와 TRE 프로모터의 상호활성화 작용(transactivation)에 의하여 Nurr1 유전자를 유도 발현시키는 경우, 상기 단계 3)의 Nurr1 유전자 발현은 상기 신경 전구세포에 독시사이클린을 처리함으로써 활성화된다.
상기와 같이 rtTA와 TRE 프로모터의 상호활성화 작용(transactivation)에 의하여 Nurr1 유전자를 유도 발현시키는 벡터를 이용하는 경우, 상기 벡터가 도입된 신경 전구세포를 12시간 내지 18시간 동안 증식시키고, 상기 증식의 종료 시점으로부터 48시간 내지 66시간이 경과한 시점에 상기 독시사이클린을 처리하는 것이 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 피층 유래 신경 전구세포에 pCURT-Nurr1 레트로바이러스 벡터를 도입한 후, 12시간 내지 18시간 동안 증식시키고, 상기 증식의 종료 시점으로부터 48시간 내지 66시간이 경과한 시점에 상기 독시사이클린을 처리함으로써, 성숙한 도파민 뉴런을 제조하였다(도 5 참조).
또한, 상기와 같이 rtTA와 TRE 프로모터의 상호활성화 작용(transactivation)에 의하여 Nurr1 유전자를 유도 발현시키는 벡터를 이용하는 경우, 상기 독시사이클린은 상기 신경 전구세포를 배양하는데 가해지는 배지의 부피를 기준으로 0.5 ㎍/㎖ 내지 2 ㎍/㎖의 농도로 처리되는 것이 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 피층 유래 신경 전구세포는 독시사이클린의 농도에 의존적으로 성숙된 형태를 나타내는 것을 확인(도 4의 A 및 B)할 수 있었으나, 독시사이클린을 너무 많이 처리하여 Nurr1 유전자의 발현을 지나치게 많이 유도하면 신경돌기가 지나치게 뭉쳐서 발생되고(도 3의 C(상단, 4 ㎍/㎖)), 독시사이클린이 너무 적게 처리되어 Nurr1 유전자의 발현이 충분하지 않으면 신경 돌기가 잘 형성되지 않음을 확인(도 3의 C(상단, 0.2 ㎍/㎖))함으로써, 0.5 ㎍/㎖ 내지 1 ㎍/㎖의 독시사이클린이 처리된 경우에 Nurr1 유전자 발현의 생리적인 패턴과 유사해짐을 확인하였다.
상기 단계 3)의 Nurr1 유전자 발현은 96시간 이상 활성화될 수 있다. 상기 Nurr1 유전자 발현은 96시간 이상만 활성화되면 되고, 상기 Nurr1 유전자 발현은 96시간 내지 2000시간 동안 활성화되는 것이 더욱 바람직하며, 상기 Nurr1 유전자 발현은 96시간 내지 960시간 동안 활성화되는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다. 상기 Nurr1 유전자의 발현은 96시간 이상 지속적으로 활성화된 상태로 유지되는 것이 바람직하고, 상기 Nurr1 유전자의 발현은 96시간 내지 2000시간 동안 지속적으로 활성화된 상태로 유지되는 것이 더욱 바람직하며, 상기 Nurr1 유전자의 발현은 96시간 내지 960시간 동안 지속적으로 활성화된 상태로 유지되는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다. 상기 신경 전구세포가 도파민 뉴런으로 분화하는 동안, 상기 Nurr1 유전자는 지속적으로 발현되고 있어야 하고, 상기 Nurr1 유전자의 발현이 중간에 중단되는 경우에는 미성숙/미분화된 형태의 뉴런이 형성된다. 특히, 단계 1) 및 단계 2)에서 각각 제조 및 도입되는 벡터가 rtTA와 TRE 프로모터의 상호활성화 작용(transactivation)에 의하여 Nurr1 유전자를 유도 발현시키는 경우, 상기 Nurr1 유전자의 지속적인 발현은 지속적인 독시사이클린의 처리에 의하여 수행될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 피층 유래 신경 전구세포에 pCURT-Nurr1 레트로바이러스 벡터를 도입한 후, 12시간 내지 18시간 동안 증식시키고, 상기 증식화의 종료 시점으로부터 48시간 내지 66시간이 경과한 시점에 상기 독시사이클린을 처리하기 시작하여 120시간 이상 지속적으로 상기 독시사이클린을 처리해 줌으로써, 성숙한 도파민 뉴런을 제조하였다(도 5 참조). 또한, 상기 독시사이클린의 처리를 960시간 진행시킨 경우에도 성숙한 도파민 뉴런을 제조할 수 있었다(결과 미도시).
2. 도파민 뉴런을 포함하는 약학적 조성물
본 발명의 다른 측면은 상기 "1. 도파민 뉴런 제조 방법 및 이에 의하여 제조되는 도파민 뉴런 " 항목에서 설명된 도파민 뉴런 제조 방법에 의하여 제조되는 도파민 뉴런을 포함하는 도파민 결핍에 의한 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 도파민 결핍에 의한 질환은 파킨슨병(Parkinson's disease, PD), 정신분열증(schizophrenia) 및 약물 중독으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 특히 상기 도파민 결핍에 의한 질환은 파킨슨병일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 세포 치료제로서 이용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함된 도파민 뉴런은 자연발생적인 도파민 뉴런과 동일한 생리학적 특성을 나타내는 바, 뇌의 도파민 결핍 부위에 주사되어 상기 도파민을 공급함으로써 상기 질환을 치료하는데 이용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 도파민 뉴런을 0.0001 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내, 뇌 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하고, 중뇌에 직접 주사되어 투여되는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다.
또한, 상기 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.1 ~ 1,000 ㎎/일이며, 바람직하게는 1 ~ 500 ㎎/일이며, 단위 제형당 상기 약학적 조성물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 하루 1 내지 6회 분할 투여할 수도 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
피층 유래의 신경 전구세포의 특성 분석
<1-1> 피층 유래의 신경 전구세포의 분리 및 배양
설치류 배아 뇌로부터 유래된 신경 전구세포(neural precursor cell, NPC)는 이전 문헌(Park C.H. et al., FEBS Lett. 582, 537-542, 2008)에 보고된 방법에 따라 분리 및 배양하였다.
구체적으로, 배자기 14일(embryonic day 14, E14)된 랫트 배아(Sprague Dawley(SD))(대한바이오링크, 한국)를 대상으로 도파민에 반응하지 않는 뇌 부위(non-dopaminergic brain region)인 '피층(cortex)'으로부터 배아 뇌 조직을 분리하여 물리적으로 분쇄한 후, 이를 15 ㎎/㎖의 폴리-L-오르니틴(poly-L-ornithine(PO), Sigma, St Louis, MO, USA) 및 1 ㎎/㎖의 피브로넥틴(fibronectin(FN), Sigma, St Louis, MO, USA)으로 코팅된 배양 접시에 분주하였다. 그런 다음, 20 ng/㎖의 bFGF(basic fibroblast growth factor)(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 처리하여 4일 내지 6일 동안 배양하였다. 상기 배양된 세포를 상기 PO/FN-코딩된 직경 12㎜의 커버슬립(Marienfeld GmbH & Co.KG, Lauda-Knlgshofen, Germany)에 계대 배양하여 단일 개체군(uniform population)의 NPC를 수득하였다.
상기와 같이 수득된 단일 개체군의 피층 유래 신경 전구세포(이하, 피층-NPC라 한다.)를 대상으로 도파민 뉴런에 대한 특이적 마커인 티로신 수산화효소(tyrosine hydroxylase, TH)의 존부 및 Nurr1 유전자의 내인성 발현 여부를 확인한 결과, 상기 TH에 양성인 세포는 거의 없었고, Nurr1의 내인성 발현이 나타나지 않음을 확인하였다(결과 미도시).
<1-2> pCL-Nurr1 레트로바이러스 벡터의 제조
상기 실시예 <1-1>에서 수득한 피층-NPC에서 Nurr1 유전자를 강제 발현시키기 위하여, pCL-Nurr1 레트로바이러스 벡터를 제조하였다.
보다 구체적으로, 이전 문헌(Bae E.J. et al., FEBS Lett. 583, 1505-1510, 2009)에 보고된 공지의 pCL 레트로바이러스 벡터(도 7 및 서열번호 13)에 서열번호 9 및 서열번호 10을 각각 정방향 및 역방향 프라이머로 하여 PCR로 증폭시킨 Nurr1 유전자상기 pCL 레트로바이러스 벡터에 적절히 도입하여 서열번호 14의 염기서열 및 도 8의 벡터 맵을 갖는 pCL-Nurr1 레트로바이러스 벡터를 제조하였다.
상기 pCL 및 pCL-Nurr1 레트로바이러스 벡터는 하기 표 1과 같은 벡터 특성을 갖는다.
Figure 112011105337915-pat00001
<1-3> pCL - Nurr1 레트로바이러스 벡터의 도입
상기 실시예 <1-1>에서 수득한 피층-NPC를 50% 내지 60%의 밀도(confluence)까지 배양한 후, 이전 문헌(Bae E.J. et al., FEBS Lett. 583, 1505-1510, 2009)에 보고된 방법에 따라, 상기 피층-NPC에 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 pCL-Nurr1 레트로바이러스 벡터를 5 MOI 또는 25 MOI의 바이러스 역가로 형질감염(transfection)시켰다.
<1-4> 피층-NPC에서 Nurr1과 TH의 발현 확인, 및 신경돌기의 길이 측정
상기 실시예 <1-3>에서 pCL-Nurr1 레트로바이러스 벡터로 형질감염된 피층-NPC를 인산염완충용액(phosphate-buffered saline, PBS)에 포함된 4% 파라포름알데히드(formaldehyde)로 고정시킨 후, Nurr1 염색을 위하여 상온에서 5분 동안 SDS(sodium dodecyl sulfate)(1% in PBS)를 처리하여 항원 복구 절차(antigen retrieval procedure)를 실시하였다. 그런 다음, 1시간 동안 0.1% 우혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)/10% 염소혈청/0.3% 트리톤X-100(Triton X-100)(DAT 염색의 경우, 1% 사포닌)에서 1시간 동안 블로킹하였고, 4℃에서 하룻밤 동안 Nurr1(토끼, 1:500, E-20, Santa Cruz), TH(토끼, 1:1000, Pel-Freez 및 마우스, 1:1000, Sigma) 및 TuJ1 (마우스, 1:500, Covance)의 1차 항체가 포함된 블로킹 용액으로 배양하였다. 그런 다음, Alexa 488(1:200, Invitrogen) 또는 Cy3(1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA)이 결합된 2차 항체를 처리하였다. 염색된 시료는 4'-6-이아미디노-2-페닐인돌(4'-6-diamidino-2-phenylindole(DAPI), Vector)이 포함된 벡타쉴드(Vectashield)TM에 마운팅하여, 형광 현미경(epifluorescence microscope)(Leica, Wetzlar, Germany)으로 형광을 분석하였다.
또한, 세포의 섬유(fiber) 길이에 대한 형태학적 분석을 위하여, 3회의 독립된 실험에서 얻은 최소 3개의 배양물로부터 30개 내지 60개의 세포를 무작위로 선정하여 Axiocam 디지털 카메라가 장착된 Axiovert 위상차 현미경으로 세포를 촬영하였다. 그런 다음, Axiovision image analyzer(Carl Zeiss, Jena, Germany)를 사용하여 세포체(soma)에서부터 신경 가지(branch)의 끝부분까지 신경돌기의 길이(neurite lengths)를 측정하였다. 총 신경돌기 길이는 세포 당 모든 신경돌기의 길이의 합으로서 결정하였다.
그 결과, 90% 이상의 피층-NPC에 Nurr1이 형질도입 되었고, Nurr1이 형질도입된 피층-NPC 중 50% 내지 70%의 피층-NPC에서 시험관 내 분화(in vitro differentiation) 후 6일째(형질전환 후 7일째)에 TH가 발현되기 시작하였다. 또한, pCL-Nurr1 레트로바이러스 벡터로 형질감염되어 형성된 TH 양성 세포는 형태적으로, 확장된 신경돌기가 없는 미성숙/미분화의 뉴런으로 나타났으며(도 1의 A, D 및 I), 오직 소수만이 뉴런-특이적 마커를 발현하였다(도 1의 B 및 J).
복측중뇌(ventral midbrain, VM) 유래의 신경 전구세포의 특성 분석
<2-1> 복측중뇌 유래의 신경 전구세포의 분리 및 배양
내인성 도파민 뉴런의 특성 분석을 위하여, 배자기12(E12) 랫트의 복측중뇌(ventral midbrain, VM)로부터 신경 전구세포를 분리하여 시험관 내(in vitro) 배양을 한 후, 계대 배양 없이 바로 분화를 유도하였다. 상기 복측중뇌 유래 신경 전구세포(이하, VM-NPC라 한다.)를 37 ℃ 및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하였으며, 배지는 bFGF를 매일 첨가 또는 첨가하지 않는 조건에서 이틀에 한 번씩 교체하였다.
<2-2> VM-NPC에서 Nurr1과 TH의 발현 확인, 및 신경돌기의 길이 측정
상기 실시예 <2-1>에서 배양한 VM-NPC에서 상기 실시예 <1-4>와 같은 방법으로 Nurr1과 TH의 발현을 확인하고, 신경돌기의 길이를 측정하였다.
그 결과, 상기 실시예 <1-4>외 피층-NPC와는 달리, VM-NPC는 TH 양성 세포의 개체군이 증가하였고(총 세포의 5% 내지 15%)(도 1의 E, F 및 H), 확장된 다중의 신경돌기를 갖는 성숙한 형태의 뉴런이 관찰되었다(도 1의 E, H 및 I). 또한, 분화 6일 째 거의 모든 TH 양성 세포는 뉴런 마커인 TuJ1을 발현하는 것으로 나타났다(도 1의 E 및 J). 분화된 VM-NPC는 내인성으로 Nurr1을 발현하였고, 이는 TH 양성 도파민 뉴런에 분포하였다(도 1의 G 및 H).
<2-3> 실시예 <1-4> 및 실시예 <2-2>의 결과 비교
<2-3-1> 평균 형광 세기의 비교
상기 실시예 <1-4> 및 상기 실시예 <2-2>에서 면역 염색된 세포를 무작위로 선정하여 LAS image analysis(Leica)로 Nurr1의 형광 세기를 측정하고, 이를 비교하였다.
면역형광 염색에 의한 세포의 Nurr1 발현 수준을 비교한 결과, 내인성으로 Nurr1을 발현하는 VM-NPC에 비해 25 MOI의 바이러스 역가로 Nurr1을 형질감염시킨 피층-NPC에서 평균 형광 세기(mean fluorescent intensities, MFI)가 현저하게 높게 나타나는 반면(도 1의 C, G 및 K), 5 MOI의 바이러스 역가로 Nurr1을 형질감염시킨 피층-NPC는 상기 내인성으로 Nurr1을 발현하는 VM-NPC에 비하여 평균 형광 세기(mean fluorescent intensities, MFI)가 낮게 나타났다(피층-NPC(5 MOI):30.95±1.32 MFI vs. VM-NPC:39.02±1.49 MFI).
<2-3-2> 신경돌기의 길이 측정
VM-NPC, 25 MOI의 바이러스 역가로 Nurr1을 형질감염시킨 피층-NPC 및 5 MOI의 바이러스 역가로 Nurr1을 형질감염시킨 피층-NPC의 신경돌기 형성을 비교하였다.
그 결과, VM-NPC와는 달리, Nurr1을 형질감염시킨 실시예 <1-4>의 피층-NPC에서는 대부분 미성숙/미분화의 뉴런이 형성되었으나, 그 중에서도 낮은 바이러스 역가(5 MOI)로 형질감염시킨 경우가 높은 바이러스 역가(25 MOI)로 형질감염시킨 경우보다 더욱 신경돌기를 잘 형성시키는 것으로 나타났다(도 1의 L 내지 S).
상기와 같은 결과로부터, Nurr1 유전자의 발현 세기를 낮춤으로써, 신경돌기 형성을 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.
<2-3-3> Nurr1 발현 및 TH 양성 섬유(fiber) 길이의 역상관관계 확인
상기와 같은 Nurr1 양성/TH 양성 세포의 측정 결과로부터, 상기 세포에 대한 Nurr1 발현 세기와 TH 양성 섬유(fiber) 길이 간에 역상관관계(reverse correlation)가 존재함을 알 수 있다. 즉, Nurr1 발현 수준은 TH 양성 도파민 세포의 신경 분화/성숙에 중요하며, Nurr1 유도성 도파민 뉴런의 미성숙은 Nurr1 발현 수준을 조절함으로써 극복할 수 있음을 알 수 있다(도 1의 R 및 S).
Nurr1 유전자의 발현 특성
<3-1> 발생 중인 배자기14 랫트의 VM에서 Nurr1 유전자의 발현 특성
발생중인 VM 조직에서의 Nurr1 단백질의 발현 특성을 확인하기 위하여, 배자기14(E14) 랫트의 복측중뇌(ventral midbrain, VM) 조직을 적출하여 25 ㎛의 크기로 분쇄하고, 상기 실시예 <2-1>에서 실시한 방법에 따라 면역형광 염색을 실시하였다. 이때, 1차 항체로서 Nurr1(토끼, 1:500, E-20, Santa Cruz), TH(토끼, 1:1000, Pel-Freez 및 마우스, 1:1000, Sigma), 또는 증식 세포 특이적 핵 항원(proliferating cell-specific nuclear antigen, PCNA)(마우스, 1:40, Upstate)에 대한 항체를 사용하여, 상기 E14의 랫트 VM 조직(이하, VM-E14라 한다.)을 면역 염색하였다.
그 결과, Nurr1 단백질은 발생하는 VM-E14의 뇌실 영역(ventricular zone)에서는 검출되지 않았고, VM-E14의 내층 영역(intermediate zone)에서부터 맨틀영역(mantle zone)에 걸쳐 분포되면서 발현되는 것으로 나타났다(도 2의 A 및 B). 상기와 같은 결과, 및 신경 튜브의 뇌실영역에 있는 미분화된 증식성의 NPC는 뉴런으로 분화되면서 튜브의 맨틀 영역(mantle zone)으로 이동한다는 사실로부터, Nurr1 유전자의 발현은 후기 전구 세포 단계(late precursor cell stage)부터 시작됨을 알 수 있다.
<3-2> VM-NPC(실시예 <2-1>) 및 피층-NPC(실시예 <1-3>)에서 Nurr1 유전자의 발현 특성
상기 실시예 <2-1>에서 수득한 VM-NPC, 및 상기 실시예 <1-3>에서 제조한 Nurr1이 형질감염된 피층-NPC에서 Nurr1 유전자의 발현 특성을 분석하기 위하여, 상기 두 종류의 세포를 실시예 <1-4>에서와 동일한 방법으로 면역형광 염색하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에서 수득한 VM-NPC, 및 상기 실시예 <1-3>에서 제조한 Nurr1이 형질감염된 피층-NPC에 대하여 시험관 내 분화 0일 내지 4일째 되는 시점에 Nurr1 단백질에 대한 항체를 이용하여 면역 염색을 실시하였다. 또한, 총 세포수에 대한 Nurr1 양성 세포수를 확인하기 위하여, 최종 배율 200ㅧ의 접안렌즈를 사용하여 각각의 커버슬립마다 임의로 10개 내지 30개의 구역을 선정하여 세포를 계수하였다. 각각의 독립된 실험마다 1 내지 3개의 커버슬립을 측정하였고, 데이터는 SPSS version 12.0를 사용한 one-way ANOVA(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)로 분석하였으며, 3회 내지 4회의 독립된 실험의 '평균±측정표준오차'로 나타냈다.
그 결과, 실시예 <2-1>의 VM-NPC는 세포 증식이 일어나는 동안 증식성 세포에서 Nurr1 유전자의 발현이 검출되지 않았으나, 분화 후 2일이 경과한 시점부터 Nurr1 유전자의 발현이 확인되었고(도 2의 C(위쪽 패널) 및 D), Nurr1 유전자의 발현 시작 후 약 0.5일 내지 1일이 경과한 시점부터 Nurr1 양성 세포의 개체군에서 TH 발현이 나타났다. 반면, Nurr1이 형질감염된 피층-NPC는 분화가 시작되면서 Nurr1 유전자의 발현이 나타났다(도 2의 C(아래쪽 패널) 및 D).
상기와 같은 결과로부터, Nurr1 유전자를 너무 이른 시기에 발현시키기 시작하면 미성숙/미분화의 뉴런이 생성됨을 알 수 있다.
Nurr1 유전자의 발현 수준 및 발현 시점의 조절을 통한 성숙한 도파민 뉴런의 제조
Nurr1 유전자의 발현 수준 및 시점를 조절하기 위하여, 유도성 벡터 시스템을 이용하였고, 그 구체적인 방법은 하기와 같다.
<4-1> pCURT-Nurr1 레트로바이러스 벡터의 제조
외인성 Nurr1의 발현 수준 및 시기를 조절하기 위하여, 신경 전구세포(neural precursor cell, NPC)에 Nurr1의 발현을 유도하기 위한 독시사이클린(doxycycline) 유도성 레트로바이러스 벡터인, pCURT-Nurr1을 제조하였다(도 3의 A). 상기 pCURT-Nurr1 레트로바이러스 벡터의 제조 과정은 하기와 같다.
하기 표 2에 기재된 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 방법으로 mCherry, 유비퀴틴 프로모터 (pUbC), TRE 프로모터, 마우스 CREB 5' UTR 염기서열을 증폭시켰고, 이전 문헌(Bae E.J. et al., FEBS Lett. 583, 1505-1510, 2009)에 보고된 공지의 pCL 레트로바이러스 벡터(도 7 및 서열번호 13)에 적절히 도입하여 서열번호 15의 염기서열 및 도 9의 벡터 맵을 갖는 pCURT 레트로바이러스 벡터를 제조하였다. 그런 다음, 서열번호 9 및 서열번호 10을 각각 정방향 및 역방향 프라이머로 하여 PCR로 증폭시킨 Nurr1 유전자를 상기 pCURT 레트로바이러스 벡터에 적절히 도입하여 서열번호 16의 염기서열 및 도 10의 벡터 맵을 갖는 pCURT-Nurr1 레트로바이러스 벡터를 제조하였다.
Figure 112011105337915-pat00002
상기 pCL 및 pCL-Nurr1 레트로바이러스 벡터는 하기 표 3과 같은 벡터 특성을 갖는다.
Figure 112011105337915-pat00003
상기와 같이 제조된 pCURT-Nurr1 레트로바이러스 벡터 내에 삽입된 Nurr1 유전자는 테트라사이클린(tetracycline) 유도체인 독시사이클린의 존재 하에서 TRE(tetracycline-responsive element) 프로모터의 조절 하에 발현되도록 고안되었다. 독시사이클린의 존재 하에서, 유비퀴틴 프로모터(ubiquitin promoter, pUbC)에 의하여 발현된 rtTA3(reverse tetracycline controlled transactivator 3)가 TRE 프로모터에 결합함으로써 상기 TRE 프로모터가 활성화되어 Nurr1 유전자의 발현이 유도되는 것이다. 또한, 상기 레트로바이러스 벡터의 감염다중도(multiplicity of infection, MOI)의 결정에 사용되는 mCherry 유전자는 LTR(long terminal repeat) 프로모터에 의해 발현되었다.
<4-2> pCURT-Nurr1 레트로바이러스 벡터의 도입
상기 실시예 <1-1>에서 수득한 피층-NPC를 50% 내지 60%의 밀도(confluence)까지 배양한 후, 이전 문헌(Bae E.J. et al., FEBS Lett. 583, 1505-1510, 2009)에 보고된 방법에 따라, 상기 피층-NPC에 상기 실시예 <4-1>에서 제조한 pCURT-Nurr1 레트로바이러스 벡터를 5 MOI 또는 25 MOI의 바이러스 역가로 형질감염(transfection)시켰다. 상기 레트로바이러스의 MOI 값은 pCURT-Nurr1 벡터에 재조합된 mCherry 유전자의 발현에 기초하여 결정하였다. 상기와 같이 레트로바이러스를 도입한 피층-NPC를 bFGF를 첨가하지 않은 조건하에서 24시간 동안 분화시켰다.
<4-3> 독시사이클린 처리 농도에 따른 Nurr1 단백질의 발현 확인
독시사이클린의 처리 농도에 의한 독시사이클린 유도성 벡터 내에 존재하는 Nurr1의 발현을 확인하기 위하여, 상기 실시예 <4-1>에서 제조한 pCURT-Nurr1 레트로바이러스 벡터를 상기 실시예 <4-2>와 같이 피층-NPC에 형질감염 시킨 후 24시간이 경과한 시점부터 분화를 유도하였다. 이때, 0 ㎍/㎖ 내지 4 ㎍/㎖의 독시사이클린을 처리하거나 처리하지 않는 조건하에서 3일 동안 배양하였고, Nurr1에 대해 면역 염색을 실시하였다.
그 결과, 독시사이클린을 처리하지 않은 경우에는 Nurr1에 대한 양성 세포가 전혀 확인되지 않았으나(도 3의 B(왼쪽)), 1 ㎍/㎖의 독시사이클린을 처리한 후에는 24시간 내에 내인성 Nurr1 발현이 나타났다(도 3의 B(오른쪽)).
또한, 0.5 ㎍/㎖ 내지 4 ㎍/㎖의 독시사이클린을 처리하여 7일 동안 분화시킨 후 TH에 대한 면역 염색을 실시한 결과, pCURT-Nurr1 레트로바이러스 벡터가 형질감염되어 분화된 피층-NPC는 독시사이클린의 농도에 의존적으로 성숙된 형태를 나타내는 것을 확인하였다(도 4의 A 및 B).
아울러, 독시사이클린을 너무 많이 처리하여 Nurr1 유전자의 발현을 지나치게 많이 유도하면 신경돌기가 지나치게 뭉쳐서 발생되는 경향이 있고(도 3의 C(상단, 4㎍/㎖)), 독시사이클린이 너무 적게 처리되어 Nurr1 유전자의 발현이 충분하지 않으면 신경 돌기가 잘 형성되지 않음을 확인하였고(도 3의 C(상단, 0.2 ㎍/㎖)), 0.5 ㎍/㎖ 내지 1 ㎍/㎖의 독시사이클린이 처리된 경우에 자연적으로 발생이 진행되는 E12의 VM-NPC와 비슷한 수준으로 신경돌기가 형성되는 것을 알 수 있었다(도 3의 C(상단, 0.5 ㎍/㎖ 내지 1 ㎍/㎖)).
<4-4> 독시사이클린 처리 농도에 따른 Nurr1 mRNA의 발현 확인
독시사이클린의 처리 농도에 따른 Nurr1의 mRNA 발현량을 확인하기 위하여, 상기 실시예 <4-2>와 같이 pCURT-Nurr1 레트로바이러스 벡터가 형질감염된 피층-NPC에 0 ㎍/㎖ 내지 4 ㎍/㎖의 독시사이클린을 처리한 후, 정량적 실시간 PCR을 실시하여 Nurr1 mRNA의 발현을 분석하였다. 구체적으로, 총 RNA를 TRI REAGENT(Molecular Research Center)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 분리하였고, Superscript kit(Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 그런 다음 실시간 PCR은 하기 표 1에 기재된 프라이머쌍을 사용하여 iQTMSYBR green Supermix (Bio-Rad)의 CFX96TM 실시간 시스템 상에서 수행하였다. 유전자 발현값은 GAPDH 발현값으로써 표준화하였다.
Figure 112011105337915-pat00004
그 결과, Nurr1 mRNA는 독시사이클린의 처리 용량에 의존적으로 발현량이 증가하는 것을 확인하였다(도 3C).
<4-5> 독시사이클린의 처리 시점에 따른 Nurr1 및 뉴런 마커의 발현 확인
TH 양성 세포의 뉴런 성숙에 있어서, 적절한 Nurr1 유도 시점를 확인하기 위하여, 상기 실시예 <4-2>에서와 같이 피층-NPC를 pCURT-Nurr1 레트로바이러스 벡터로 형질감염시킨 후 bFGF를 첨가하지 않은 조건하에서 24시간 동안 분화시킨 피층-NPC에 1 ㎍/㎖의 독시사이클린을 전체 분화 기간 동안(+7), 또는 분화 시작 2일 후부터 5일 동안(-2/+5) 처리한 후, Nurr1(토끼, 1:500, E-20, Santa Cruz), TH(토끼, 1:1000, Pel-Freez and mouse, 1:1000, Sigma), TuJ1 (마우스, 1:500, Covance), MAP2(마우스, 1:1000, Sigma), HuC/D(마우스, 1:100, chemicon), DAT(랫트, 1:100, Abcam), 또는 VMAT2(랫트, 1:250, Pel-Freez)에 대한 1차 항체로 염색하였다. 그런 다음 Nurr1 유도성 TH 양성 세포의 뉴런 성숙도를 TH 양성 섬유(fiber) 길이, 및 총 TH 양성 세포 중 TH 및 TuJ1 양성 세포의 비율(%)로서 측정하였다.
그 결과, 분화 마지막 날 Nurr1 발현 세기는 상기와 같은 두 조건에서 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 한편, TH 양성 세포의 세포 형태적 성숙도에 있어서, 분화 후 7일째에 TH 양성 파이버 길이는 Nurr1 발현을 전체 분화기간 동안에 유도한 경우(+7)보다 Nurr1 발현을 지연시킨 경우(-2/+5) 더 길게 측정되었다(세포에서 총 TH 양성 파이버 길이: 60.03±4.77 μm(-2/+5), 및 24.58±2.95 μm(+7), 각 군 당 세포의 수 = 41, p<0.01)(도 5의 A, D 및 G). 또한, 신경 마커인 TuJ1을 발현하는 TH 양성 세포의 비율 또한 Nurr1 발현을 지연시킨 경우에 더욱 높게 나타났다(총 TH 양성 세포당 TH 양성, TuJ1 양성 세포 %: 56.22±3.33%(-2/+5), 및 17.59±1.77%(+7), 독립된 배양 수 = 3, p<0.01)(도 5의 A 내지 F, 및 H). 따라서, Nurr1 발현 시기는 도파민 뉴런 성숙에 영향을 미치는 결정적인 인자이며, 성숙된 도파민 뉴런은 후기 및 분화하는 전구세포로부터 Nurr1 발현의 개시를 지연시킴으로서 시험관 내에서 형성할 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, 1 ㎍/㎖ 농도의 독시사이클린을 -2/+5의 시기에 처리하는 것이 가장 최적의 성숙한 도파민 뉴런을 형성하는 조건임을 확립하였고, 이러한 조건하에서 성숙한 뉴런의 마커인 MAP2와 HuC/D, 및 성숙한 도파민 뉴런 마커인 DAT와 VMAT2가 공동 발현되는 것을 확인하였다(도 5의 I 내지 L).
<4-6> 도파민 흡수 분석을 통한 도파민 유도성 뉴런으로의 분화 확인
상기 실시예 <4-5>과 같이 독시사이클린이 -2/+13 또는 +15의 시기에 처리된 각각의 세포에 대하여 도파민의 DAT 매개된 특이적 흡수를 분석하였다. 구체적으로, 각각의 세포를 PBS로 세척하고, 비특이적인 흡수 값을 확인하기 위하여, DAT 차단제인 10 μm의 노미펜신(RBI, Natick, MA, USA)을 첨가하거나 첨가하지 않는 조건에서 PBS에 포함된 50 nM의 [3H] 도파민(5 ㅅCi /mmol, Amersham, Buckinghamshire, UK)에 배양하였다. 10분 동안 37℃에서 배양한 후, 반응 용액을 제거하여 흡수 반응을 종결하였고 차가운 PBS에 2회 세척하였다. 그런 다음, 세포를 0.5 M NaOH에 용해하고 액체 섬광 계수기(liquid scintillation counter)(MicroBetaㄾ TriLux ver. 4.4, Finland)로 방사능을 측정하였다. 특이적인 도파민 흡수 수준은 노미펜신의 부재 하에 측정된 흡수 값으로부터 비특이적인 흡수값(노미펜신을 처리한 경우)을 빼는 방법으로 측정하였다.
그 결과, DAT 매개된 도파민의 특이적 흡수는 독시사이클린이 +15로 처리된 경우보다 -2/+13로 처리된 경우 현저히 높게 나타났다(8.14±0.42(-2/+13) 및 2.62±0.53(+15), n=4, p<0.01)(도 5의 M). 또한, 상기 독시사이클린의 처리를 40일 동안 진행시킨 경우에도 성숙한 도파민 뉴런을 제조할 수 있었다(결과 미도시). 따라서, 성숙한 기능적 프리시냅틱(presynaptic) 도파민 뉴런 형성은 Nurr1 발현의 수준 및 시기를 조절함으로써 유도될 수 있다는 것을 확인하였고, 본 발명에서 독시사이클린의 처리 농도 및 처리 시점을 조절함으로써 가능함을 검증하였다.
CREB 5' UTR 삽입의 효과
상기 실시예 <4-1> pCURT-Nurr1 레트로바이러스 벡터에 포함된 서열번호 17의 CREB 5' UTR 부분의 효과를 검증하기 위하여, 상기 실시예 <4-1>과 같은 구조의 레트로바이러스 벡터에서, Nurr1 대신 GFP를 삽입하고, 마우스 CREB 5' UTR 부분을 넣은 벡터와 넣지 않은 벡터를 상기 실시예 <1-1>에서 수득한 피층-NPC에 형질감염시키고, 독시사이클린을 처리하여 발현되는 GFP의 형광 세기를 비교하였다.
그 결과, 마우스 CREB 5' UTR을 삽입하지 않은 경우에는 GFP 형광발현이 25.4±2.2%에 불과하였으나, 마우스 CREB 5' UTR을 삽입한 경우에는 GFP 형광발현이 66.8±4.2%로 증가하였다(도 6). 상기와 같은 결과로부터, 상기 서열번호 17의 마우스 CREB 5' UTR 서열은 본 발명의 상기 pCURT-Nurr1 레트로바이러스 벡터에서 엔헨서로서 작용하여 Nurr1 유전자의 발현을 향상시키는 작용을 함을 알 수 있다.
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Claims (18)

  1. Nurr1 유전자가 포함된 벡터를 제조하는 단계;
    상기 벡터를 신경 전구세포(neural precursor cell)에 도입시키는 단계; 및
    상기 벡터의 도입 후 60시간 내지 84시간이 경과한 다음, 상기 신경 전구세포 내에서 Nurr1 유전자의 발현을 활성화시키면서 96시간 내지 2000시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 도파민 뉴런 제조 방법.
  2. 제1항에 있어, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 도파민 뉴런 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 벡터는 rtTA(reverse tetracycline controlled transactivator) 및 TRE(tetracycline response element) 프로모터를 더 포함하고, 상기 Nurr1 유전자는 상기 TRE 프로모터에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 도파민 뉴런 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 벡터는 제1 프로모터를 더 포함하고, 상기 rtTA는 상기 제1 프로모터에 작동가능하도록 연결된 것을 특징으로 하는 도파민 뉴런 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제1 프로모터는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터, SV40 프로모터, 레트로바이러스(retrovirus) 프로모터, 메탈로치오네인(metallothionein) 프로모터, 열충격 단백질(heat shock protein) 프로모터, CAG 프로모터, 연장인자 1a(elongation factor 1a) 프로모터, 액틴(actin) 프로모터, 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터, 알부민(albumin) 프로모터 및 MHC 클래스 Ⅱ(MHC class Ⅱ) 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 도파민 뉴런 제조 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 벡터는 상기 TRE 프로모터와 상기 Nurr1 유전자 사이에 서열번호 17로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열이 더 포함되는 것을 특징으로 하는 도파민 뉴런 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 신경 전구세포는 포유동물에서 유래한 것을 특징으로 하는 도파민 뉴런 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 신경 전구세포는 포유동물의 뇌 조직에서 유래한 것을 특징으로 하는 도파민 뉴런 제조 방법.
  9. 제2항에 있어서, 상기 벡터의 도입은 레트로바이러스의 감염에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 도파민 뉴런 제조 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 레트로바이러스는 5 MOI 내지 10 MOI의 바이러스 역가로 감염되는 것을 특징으로 하는 도파민 뉴런 제조 방법.
  11. 제3항에 있어서, 상기 Nurr1 유전자의 발현은 독시사이클린(doxycycline)을 상기 벡터가 도입된 신경 전구세포에 처리함으로써 활성화되는 것을 특징으로 하는 도파민 뉴런 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 독시사이클린은
    상기 벡터가 도입된 신경 전구세포를 12시간 내지 18시간 동안 증식시키고, 상기 증식의 종료 시점으로부터 48시간 내지 66시간이 경과한 시점에 처리되는 것을 특징으로 하는 도파민 뉴런 제조 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 독시사이클린은 상기 신경 전구세포를 배양하는 배지의 부피를 기준으로 0.5 ㎍/㎖ 내지 1 ㎍/㎖의 농도로 처리되는 것을 특징으로 하는 도파민 뉴런 제조 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 Nurr1 유전자의 발현 활성화는 96시간 내지 960시간 동안 지속되는 것을 특징으로 하는 도파민 뉴런 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 Nurr1 유전자 발현 활성화의 지속은 지속적인 독시사이클린의 처리에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 도파민 뉴런 제조 방법.
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  17. 삭제
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