ES2290032T3 - Procedimiento para la produccion de neuronas dopaminergicas. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la producción de neuronas dopaminérgicas, mediante la inducción de un destino neuronal dopaminérgico en una célula progenitora neural o en una célula madre neural, que comprende: la expresión de Nurr1 por encima de los niveles basales dentro de la célula, y la puesta en contacto de la célula con uno o más factores obtenibles a partir de un astrocito de Tipo 1 del mesencéfalo ventral, obteniéndose de este modo neuronas dopaminérgicas.

Description

Procedimiento para la producción de neuronas dopaminérgicas.

Campo de la invención

La presente invención está relacionada con la inducción del destino neuronal dopaminérgico en células madre neurales o en células progenitoras neurales. La misma está relacionada con la inducción de un fenotipo neuronal específico y, particularmente, con la inducción de un fenotipo neuronal dopaminérgico de mesencéfalo.

Antecedentes de la invención

Las células madre tienen la capacidad de diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Avances recientes en la biología de las células madre neurales han mostrado que las citadas células madre pueden ser aisladas, expandidas y utilizadas como material fuente para trasplantes cerebrales (Snynder, E.Y. et al., Cell 68: 33-51 (1992); Rosenthal, A. Neuron 20: 169-172 (1998); Gage, F.H. et al, Ann. Rev. Neurosci. 18, 159-192 (1995); Weiss, S. et al. Trends Neurosci. 19, 387-393 (1996); Snyder, E.Y. et al. Clin. Neurosci. 3, 310-316 (1996); Martinez-Serrano, A et al. Trends Neurosci, 20, 530-538 (1997); McKay, R. Science 276, 66-71 (1997); Turder, L. et al. Nature Neurosci. 1, 290-295 (1998)). No obstante, si bien múltiples estudios demuestran que las células madre neurales implantadas prenden completamente y asumen los fenotipos neurales legítimos, cuando son trasplantadas en el cerebro adulto intacto estás células parecen mostrar predisposición hacia destinos astro y oligodendrogliales ((Martínez Serrano, A. et al. Trenes Neurosci. 20, 530-538 (1997); McKay, R. Science 276, 66-71 (1997); Snyder, E.Y. et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 94, 11663-11668 (1997)).

La mayoría de las enfermedades neurodegenerativas afectas a las poblaciones neuronales. Además, la mayor parte de los daños se producen en un fenotipo neuroquímico específico. En la enfermedad de Parkinson en humanos, por ejemplo, el tipo de células principalmente pérdidas son las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo. La sustitución funcional de poblaciones neuronales específicas, a través de trasplante de tejido neural, representa una estrategia terapéutica atractiva para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas (Rosenthal, A. Neuron 20, 169-172 (1998)).

Resumen de la invención

Una célula expandible que pudiera ser instruida con vistas a asumir un fenotipo neuronal, particularmente un fenotipo neuronal específico, tras diferenciación, constituiría un material ideal para ser utilizado en terapia de trasplante. Esta estrategia evitaría asuntos éticos y prácticos que rodean la utilización de tejido fetal humano para trasplante. En particular, las células embrionarias implantadas son de una viabilidad reducida y son a menudo rechazadas. Además, cada feto proporciona tan solo un pequeño número de células.

La inducción de un fenotipo neuronal específico y único en células progenitoras o en células madre multipotentes in vitro ha demostrado ser difícil de obtener.

El Nurr1 (Law et al., (1992) Mol. Endocrinol 6, 2129-2135; Xing et al., (1997) Mol. Brain Res. 47, 251-261; Castillo (1997) Genomics, 41, 250-257; GenBank nos. S53744, U72345, U86783) es un factor de transcripción de la superfamilia de receptores nucleares hormona de la tiroides/ácido retinoico. La presente descripción muestra que la expresión de Nurr1 por encima de los niveles basales en células madre neurales o en células progenitoras neurales incrementa la proporción de células que se diferencian hacia un destino neuronal. La inducción de un destino neuronal puede ser llevada a cabo in vitro o in vivo. La capacidad de inducir diferenciación de las células madre neurales o de las células progenitoras neurales hacia el destino neuronal con anterioridad a, o después del trasplante, mejora la predisposición de las células madre trasplantadas hacia destinos astro- y oligodendrogliales.

Por "célula madre neural" se quiere dar a entender cualquier tipo de célula que pueda dividirse más de una vez y que pueda dar lugar a células que muestran el tipo más primitivo de fenotipo para neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. La célula madre neural puede expresar uno o más de los siguientes marcadores: Nestin; el receptor neurotrofina p75; Notch1. Por "célula progenitora neural" se quiere dar a entender una hija multipotente de una célula madre neural, la cual está restringida en cuanto a sus potenciales destinos y/o presenta un potencial proliferativo reducido, en comparación con el de la célula madre neural. En realizaciones preferidas, la célula progenitora neural o la célula madre neural no expresan la tirosina-hidroxilasa, ni de forma espontánea ni tras privación de mitógenos (por ejemplo, bFGF, EGF o suero).

Las células progenitoras neurales o las células madre neurales pueden ser obtenidas o derivadas a partir de cualquier región del sistema nervioso, por ejemplo, a partir del cerebelo, la zona ventricular, la zona sub-ventricular o el hipocampo. Pueden ser obtenidas o derivadas a partir de organismos vertebrados, por ejemplo, a partir de un mamífero, el cual puede ser humano o no humano, tal como un conejo, cobayo, rata, ratón u otro roedor, gato, perro, cerdo, oveja, cabra, ternera, caballo o primate, o a partir de un ave, tal como una gallina.

En un procedimiento para inducir un destino neuronal dopaminérgico según la presente invención, en la que una diversidad de células madre neurales y/o de células progenitoras neurales expresan Nurr1 por encima de los niveles basales, una mayoría de las células madre o progenitoras pueden ser inducidas con vistas a adoptar un destino neuronal. En realizaciones preferidas, más del 60%, más del 70%, más del 80%, más del 90% de las células madre y/o de las células progenitoras pueden ser inducidas hacia un destino neuronal.

A través de la expresión "expresando Nurr1 por encima de los niveles basales dentro de la célula" se quiere dar a entender la expresión de Nurr1 a niveles superiores a los que el mismo es expresado en la célula (no modificada) in vivo, bajo condiciones no patológicas. Dentro de expresión por encima de niveles basales se incluye la sobrerregulación y la sobreexpresión artificial y farmacológica.

La expresión de Nurr1 por encima de los niveles basales pude ser lograda a través de cualquier procedimiento conocido por parte de los expertos en la materia. A título de ejemplo, la expresión por encima de los niveles basales puede ser inducida mediante la modulación de la regulación de Nurr1 genómico natural. Ello puede ser efectuado mediante el incremento de la transcripción y/o de la traducción de Nurr1, por ejemplo, mediante la puesta en contacto de la célula con factor de crecimiento de fibroblasto 8 (FGF8), el cual sobrerregula la transcripción de Nurr1 (Rosenthal, A. (1998), Cell, 93(5), 755-766), y/o mediante la introducción de secuencias reguladoras heterólogas en o adyacentes a la región reguladora natural de Nurr1, y/o mediante la sustitución de la región reguladora natural de Nurr1 por las citadas secuencias reguladoras heterólogas, por ejemplo, mediante recombinación homóloga, y/o mediante moléculas que interruptoras o infrarreguladoras, las cuales regulan negativamente, bloquean o infrarregulan la transcripción, la traducción o la función de Nurr1, por ejemplo, Nurr2 (Ohkura, et al., (1999) Biochim. Biophys. Acta 14444 69-79).

La transcripción puede ser incrementada proporcionando a las células progenitoras neurales o a las células madre neurales unos niveles incrementados de un activador transcripcional, por ejemplo, mediante la puesta en contacto de la célula con el citado activador o mediante la transformación de la célula con ácido nucleico que codifica para el activador. Alternativamente, la transcripción puede ser incrementada mediante la transformación de la célula con ácido nucleico antisentido, en un inhibidor transcripcional de Nurr1.

Por consiguiente, un procedimiento de la presente invención para la inducción de un destino neuronal dopaminérgico en una célula progenitora neural o en una célula madre neural puede incluir la puesta en contacto de la célula con FGF8.

Como alternativa, o además del incremento en la transcripción y/o de la traducción de Nurr1 endógeno, la expresión de Nurr1 por encima de los niveles basales puede ser lograda mediante la introducción de una o más copias extra de Nurr1 en la célula progenitora neural o en la célula madre neural.

Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento para inducir un destino neuronal dopaminérgico en una célula progenitora neural o en una célula madre neural, incluyendo el procedimiento la transformación de la célula con Nurr1. La transformación de la célula progenitora neural o de la célula madre neural puede ser efectuada in vitro o in vivo.

El Nurr1 transformado puede estar contenido en un vector extra-genómico o puede ser incorporado, preferiblemente estable, en el genoma. El mismo puede estar operativamente unido a un promotor que conduce su expresión por encima de los niveles basales en células progenitoras neurales o en células madre neurales, tal y como se discute más adelante con mayor detalle.

"Unido operativamente" significa unido como formando parte de la misma molécula de ácido nucleico, adecuadamente posicionado y orientado para que la transcripción se inicie desde el promotor.

Los procedimientos para la introducción de genes en células resultan bien conocidos por parte de los expertos en la materia. Para la introducción de Nurr1 en células progenitoras neurales o en células madre neurales pueden utilizarse vectores, ya sea en el caso de que Nurr1 permanezca en el vector o en el caso de que sea incorporado en el genoma. Los vectores adecuados puede ser seleccionados o construidos conteniendo secuencias reguladoras adecuadas, incluyendo secuencias de promotor, fragmentos terminales, secuencias de poliadenilación, secuencias reforzadoras. Los vectores pueden contener genes marcadores y otras secuencias, según resulte adecuado. Las secuencias reguladoras pueden conducir la expresión de Nurr1 dentro de las células promotoras neurales o de las células madre neurales. Por ejemplo, el vector puede ser un vector de expresión genómica o las secuencias reguladoras pueden ser incorporadas en el genoma con Nurr1. Los vectores pueden ser plásmidos o víricos.

El Nurr1 puede ser colocado bajo control de un promotor de gen inducible externalmente, para colocarlo bajo el control del usuario. El término "inducible", aplicado a un promotor, es bien entendido por parte de los expertos en la materia. En esencia, la expresión bajo control de un promotor inducible "encendido" o incrementado en respuesta a un estímulo aplicado. La naturaleza del estímulo varía entre promotores. Algunos promotores inducibles originan niveles pequeños o indetectables de expresión (o ausencia de expresión), en ausencia del estímulo adecuado. Cualquiera que sea el nivel de expresión en ausencia del estímulo, la expresión a partir de cualquier promotor inducible es incrementada en presencia del estímulo correcto. Un ejemplo de un promotor inducible es el sistema Tetracyclin ON/OFF (Gossen et al., (1995) Science, 268, 1766-1769), en el que la expresión del gen está regulada mediante análogos de tetraciclina.

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Para detalles adicionales, ver, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciado, introducción de DNA en células, expresión genética y análisis de proteínas, se describen en detalle en Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al., eds. John Wiley & Sons, 1992.

Para la identificación de clones que contienen ácido nucleico de interés, pueden utilizarse genes marcadores, tales como genes sensibles o resistentes a antibióticos, tal y como ya es conocido en el estado de la técnica. Través de estudios de unión pueden también identificarse clones o investigarlos adicionalmente, por ejemplo, a través de hibridación por el método Southern.

Ácidos nucleicos, incluyendo Nurr1, pueden ser integrados en el genoma de la célula progenitora neural o de la célula madre neural huésped. La integración puede ser promovida mediante inclusión en las secuencias de ácidos nucleicos transformados que promocionan la recombinación con el genoma, según las técnicas estándar. El ácido nucleico integrado puede incluir secuencias reguladoras capaces de conducir la expresión del gen Nurr1 en las células progenitoras neurales o en las células madre neurales. El ácido nucleico puede incluir secuencias que dirigen su integración hacia un sitio en el genoma donde la secuencia de codificación de Nurr1 caerá bajo control de elementos reguladores capaces de conducir y/o de controlar su expresión dentro de la célula progenitora neural o de la célula madre neural. El ácido nucleico integrado puede ser derivado a partir de un vector utilizado para transformar el Nurr1 en las células progenitoras neurales o en las células madre neurales, tal y como se discute en el presente
documento.

La introducción de ácido nucleico que comprende Nurr1, ya se trate de ácido nucleico lineal, ramificado o circular, pude ser generalmente identificada sin limitación como "transformación". La misma puede utilizar cualquier técnica disponible. Entre las técnicas adecuadas se pueden incluir la transfección con fosfato cálcico, DEAE-Dextrano, electroporación, técnicas mecánicas tales como la microinyección, la ingesta de DNA directa, la transferencia de DNA mediada por receptor, la transducción utilizando retrovirus u otros virus y la transfección mediada por liposoma. Cuando se introduce una construcción de un gen elegido en una célula, tienen que tenerse en cuenta determinadas consideraciones, las cuales resultan bien conocidas por parte de los expertos en la materia. Resultará evidente para el experto en la materia que la elección de un particular procedimiento de transformación para introducir Nurr1 en las células progenitoras neurales o en las células madre neurales no resulta esencial para la invención o no constituye ninguna limitación a la misma.

Las técnicas y los vectores para la transformación in vivo de células progenitoras neurales o de células madre neurales con Nurr1, son bien conocidas por parte de los expertos en la materia. Entre los vectores adecuados se incluyen adenovirus, papovavirus, virus vaccinia, virus de herpes, y retrovirus. Los vectores de virus discapacitados pueden ser producidos en líneas celulares colaboradoras, en la cuales son expresados los genes requeridos para la producción de partículas víricas infecciosas. Las líneas celulares colaboradoras adecuadas son bien conocidas por parte de los expertos en la técnica. A titulo de ejemplo, ver: Fallaux, F.J., et al., (1996) Hum Gene Ther 7(2), 215-222; Willenbrink, W. et al., (1994) J. Virol. 68(12), 8412-8417; Cosset, F.L. et al., (1993) Virology 193(1), 385-395; Highkin, M.K. et al (1991) Poult Sci. 70(4), 970-981; Dougherty, J.P. et al., (1989) J. Virol. 63(7), 3209-3212; Salmons, B. et al.(1989) Biochem Biophys. Res. Commun. 159(3), 1191-1198; Sorge et al., (1984) Mol. Cell Biol. 4(9), 1730-1737; Wang, S. et al., (1997) Gene Ther. 4(11), 1132-1141; Moore, K.W. et al., (1990) Science 248 (4960), 1230-1234; Reiss, C.S. et al., (1987) J. Immunol. 139(3), 711-714. Las líneas celulares colaboradoras carecen generalmente de una secuencia que es reconocida por el mecanismo que envuelve el genoma vírico. Las mismas producen viriones que no contienen ácido nucleico. Un vector vírico que contiene una señal de envoltura intacta junto con el gen u otra secuencia que tenga que ser entregada (Nurr1) es envuelta en las células colaboradoras en partículas virión infecciosas, las cales pueden ser después utilizadas para suministro genético a células progenitoras neurales o a células madre neurales.

La presente invención proporciona un procedimiento para la inducción de un destino neuronal dopaminérgico en una célula progenitora neural o en una célula madre neural, en el que la célula madre o la célula progenitora expresan Nurr1 por encima de los niveles basales, incluyendo el procedimiento la puesta en contacto de las células con uno o más factores suministrados por o derivados de un astrocito de Tipo 1. El factor o los factores pueden ser proporcionados a través de co-cultivo de la célula progenitora neural o de la célula madre neural con un astrocito de Tipo 1. El procedimiento puede tener lugar in vivo o in vitro. La célula progenitora neural o la célula madre neural que expresa a Nurr1 por encima de los niveles basales puede ser producida a través de la transformación de las células con Nurr1.

El factor o los factores pueden ser suministrados por o derivados de un astrocito inmortalizado. El factor o los factores pueden ser suministrados por o derivados de una línea celular de astrocito, por ejemplo, una línea celular mesencefálica de astrocito. Las líneas celulares proporcionan una población celular homogénea.

La presente descripción proporciona la primera evidencia de que los astrocitos de Tipo I están involucrados en la determinación de destinos neuronales específicos. Los datos presentados en el presente documento sugieren que los astrocitos procedentes de diferentes regiones del cerebro pueden ser utilizados como fuente de señales requeridas para la inducción de fenotipos neuronales apropiados, en múltiples estructuras del cerebro.

Importantes aspectos de la presente invención están basados en el hallazgo de que las neuronas dopaminérgicas pueden ser generadas a partir de células progenitoras neurales o de células madre neurales in vitro, a través de un procedimiento que incluye la expresión de Nurr1 por encima de los niveles basales en las células y la puesta en contacto de las células con uno o más factores suministrados o derivados de astrocitos de Tipo I del mesencéfalo ventral.

Por consiguiente, el destino neuronal específico es un destino dopaminérgico y el astrocito de Tipo I es un astrocito de Tipo I del mesencéfalo ventral.

La presente invención permite la generación de grandes números de neuronas dopaminérgicas. Estas neuronas dopaminérgicas pueden ser utilizadas como material fuente para sustituir células que han resultado dañadas o pérdidas en la enfermedad de Parkinson.

Preferiblemente, la célula progenitora neural o la célula madre neural que expresa Nurr1 por encima de los niveles basales es mitótica cuando la misma es puesta en contacto con uno o más factores suministrados por o derivados del astrocito de Tipo 1.

Cuando se induce un destino dopaminérgico en una célula progenitora neural o en una célula madre neural, la célula puede ser adicionalmente puesta en contacto con uno o más agentes seleccionados de entre: factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF); factor de crecimiento epidérmico (EFG); y un activador del receptor retinoide X (RXR), por ejemplo, el análogo retinoide sintético SR11237, (Gendimenico, G.J. et al., (1994) J. Invest Dermatol 102(5), 676-80), o 9-cis-retinol. Para incrementar la proporción de las células progenitoras y/o de las células madre que adoptan un destino dopaminérgico, puede tratarse un co-cultivo de células progenitoras neurales o de células madre neurales que expresan Nurr1 por encima de los niveles basales y astrocitos de Tipo 1 con uno o más de estos agentes, tal y como se demuestra experimentalmente más adelante. El procedimiento de inducir un destino dopaminérgico, en consonancia con la presente invención, puede incluir la puesta en contacto de la célula progenitora neural o de la célula madre neural con un miembro de la familia FGF de factores de crecimiento, por ejemplo, FGF4, FGF8.

De forma ventajosa, las células pueden ser puestas en contacto con dos o más de los agentes mencionados anteriormente. Los inventores han averiguado, de forma inesperada, que los efectos beneficiosos de bFGF o de EGF y SR11237 son aditivos a dosis de saturación. Esta averiguación sugiere que estos agentes pueden actuar a través de diferentes mecanismos.

El procedimiento de inducir un fenotipo dopaminérgico puede incluir el pretratamiento de la célula progenitora neural o la célula madre neural con bFGF y/o EGF, con anterioridad a su puesta en contacto con uno o más de los factores suministrados por o derivados de astrocitos de Tipo 1 del mesencéfalo ventral, por ejemplo, con anterioridad a co-cultivar el mismo con un astrocito de Tipo 1 del mesencéfalo ventral.

El paso de pretratamiento opcional surge de dos averiguaciones adicionales inesperadas de los inventores: (i) que las líneas de células madre neurales que expresan Nurr1 por encima de los niveles basales y que muestran que elevada proliferación, muestran una inducción reforzada hacia el destino dopaminérgico cuando son co-cultivadas con astrocitos de Tipo 1 del mesencéfalo ventral, y (ii) que después del tratamiento con bFGF o con EGF en medio exento de suero (SFM), la proliferación basal de la mayoría de líneas de células madre que expresan Nurr1 por encima del nivel basal permanecía elevada tras el paso hacia SFM en solitario.

El procedimiento de inducir un fenotipo dopaminérgico puede incluir el pretratamiento de una célula progenitora neural o la célula madre neural con un miembro de la familia FGF de factores de crecimiento, por ejemplo, FGF4, FGF8.

Un procedimiento en el cual un destino neuronal dopaminérgico es inducido en una célula progenitora neural o en una célula madre neural puede incluir la detección de un marcador para el destino neuronal dopaminérgico. Para el destino dopaminérgico, la expresión de tirosina-hidroxilasa (TH) y/o la liberación de dopamina y/o DOPAC puede ser detectada, por ejemplo, a través de inmunorreactividad (Cooper, J.R. et al., The Biochemical Basis of Neuropharmacology, 7th Edition (1996) Oxford University Press). La ausencia de dopamina-\beta-hidroxilasa (en presencia de TH/dopamina/DOPAC) resulta también indicativa de destino dopaminérgico.

La detección de un marcador puede ser efectuada según cualquier procedimiento conocido por parte de los expertos en la materia. El procedimiento de detección puede utilizar un miembro de unión específico capaz de unirse a una secuencia de ácido nucleico que codifica para el marcador, comprendiendo el miembro de unión específico una sonda de ácido nucleico hidrolizable con la secuencia o un dominio inmunologulina/anticuerpo con especificidad para la secuencia de ácido nucleico o el polipéptido codificado por la misma, estando el miembro de unión específico marcado, a los efectos de que la unión del miembro de unión específico para la secuencia o polipéptido resulte detectable. Un "miembro de unión específico" presenta una especificidad particular para el marcador y, en condiciones normales se une al marcador con preferencia a otras especies. Alternativamente, cuando el marcador es un mRNA específico, el mismo puede se detectado a través de unión a cebadores oligonucleótidos específicos y amplificación en, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa.

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Las sondas y cebadores de ácido nucleico pueden hibridar con el marcador en condiciones restrictivas. Entre las condiciones adecuadas se incluyen, por ejemplo, para la detección de secuencias de marcador que son aproximadamente idénticas entre el 80 y el 90%, hibridación durante el transcurso de una noche a 42ºC en Na_{2}HPO_{4} 0,25M, pH 7,2, SDS 6,5%, sulfato dextrano 10% y un lavado final a 55ºC en 0,1xSSC, SDS 1%. Para la detección de secuencias de marcador que tienen una identidad superior a aproximadamente el 90%, las condiciones adecuadas incluyen hibridación durante el transcurso de una noche a 65ºC en Na_{2}HPO_{4}, pH 7,2, SDS 6,5%, sulfato de dextrano 10% y un lavado final a 60ºC en 0,1x SSC, SDS 0,1%.

La neurona puede contener ácido nucleico que codifica para una molécula con propiedades neuroprotectoras o neurorregeneradoras, unida operativamente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión de la molécula en la neurona. El promotor puede ser un promotor inducible, por ejemplo, el promotor quimérico TetON, por lo que cualquier sobreexpresión dañina puede ser evitada. El promotor puede estar asociado con un fenotipo neuronal específico, por ejemplo, el promotor TH.

La molécula codificada puede ser tal que su expresión convierta a la neurona en independiente de su entorno, a saber, de tal forma que su supervivencia no esté en función de la presencia de uno o más factores o condiciones en, por ejemplo, el entorno neural en el que tiene que ser implantada. A título de ejemplo, la neurona puede contener ácido nucleico que codifique para una o más de las moléculas neuroprotectoras o neurorregeneradoras descritas más adelante, unidas operativamente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión de la molécula en la neurona.

Adicional o alternativamente, la expresión de la molécula codificada puede funcionar en la neuroprotección y en la neurorregenaración del entorno celular que rodea a la neurona. De este modo, la neurona puede ser utilizada en un planteamiento a base de terapia genética y celular combinadas, para suministrar moléculas con propiedades neuroprotectoras y neurorregeneradoras.

Entre los ejemplos de moléculas con propiedades neuroprotectoras y neurorregeneradoras se incluyen:

(i)

factores neurotrópicos capaces de compensar y de evitar la neurodegeneración. Un ejemplo es el factor de crecimiento neurotrópico derivado de glial (GDNF), el cual es un potente factor de supervivencia neural, promociona el crecimiento rápido a partir de neuronas dopaminérgicas e incrementa la expresión de la tirosina-hidroxilasa (Tomac, et al., (1995) Nature, 373, 335-339; Arenas, et al., (1995) Neuron, 15, 1465-1473). A través del reforzamiento de la elongación axonal, el GDNF puede incrementar la capacidad de las neuronas para inervar sus entornos locales. Otras moléculas neurotrópicas de la familia GDNF incluyen Neurturina, Persephin y Artemina. Las moléculas neurotrópicas de la familia de neurotropina incluyen el factor de crecimiento nervioso (NGF), el factor neurotrópico derivado del cerebro (BDNF) y la neurotropina-3, -4/5 y -6.

(ii)

moléculas antiapoptóticas, como la Bc12, la cual desempeña un papel central en la muerte celular. La sobreexpresión de Bc12 protege a las neuronas frente a la muerte celular derivada de causas naturales y de isquemia (Martinou et al., (1994) Neuron, 1017-1030). Otra molécula antiapoptótica es BcIXL.

(iii)

las moléculas regeneradores de axón y/o elongadoras y/o guiadoras, las cuales ayudan a la neurona en la inervación y en la formación de conexiones con su entorno, por ejemplo, las efrinas. Las efrinas definen una clase de ligandos unidos a membrana que son capaces de activar los receptores de la tirosina-quinasa. Las efrinas han sido implicadas en el desarrollo neural (Irving, et al. (1996) Dev. Biol. , 173, 26-38; Krull et al., (1997) Curr. Biol. 7, 571-580; Frisen et al., (1998) Neuron, 20 235-243; Gao, et al., (1996) PNAS, 93, 11161-11166; Torres et al., (1998) Neuron, 21, 1453-1463; Winslow et al., (1995) Neuron, 14, 973-981; Yue et al., (1999) J. Neurosci 19(6), 2090-2101.

(iv)

moléculas diferenciadoras, por ejemplo, la proteína de dominio de caja homeótica Ptxe (Smidt, M.P. et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(24), 13305-13310).

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Una neurona de acuerdo con o para ser utilizada en la presente invención puede estar sustancialmente exenta de una o más de otras células tipo, por ejemplo, de células progenitoras neurales o de células madre neurales. Las neuronas pueden ser separadas de las células progenitoras neurales o de las células madre neurales utilizando cualquier tipo de técnica conocida por los expertos en la materia. A título de ejemplo, pueden utilizarse anticuerpos frente a regiones extracelulares de moléculas encontradas en células progenitoras neurales o en células madre neurales pero no en neuronas. Entre las citadas moléculas se incluyen Notch 1 y el receptor de factor neurotrópico GFR\alpha2 derivado de línea celular glial. Las células madre unidas a anticuerpos pueden ser sometidas a lisis a través de exposición a complemento, o separadamente, a través de, por ejemplo, ordenamiento magnético (Johansson, et al., (1999) Cell, 96, 25-34). Si se utilizan anticuerpos que son xenogénicos para el receptor pretendido de las neuronas, cualquiera de, por ejemplo, las células progenitoras neurales o de las células madre neurales, que escapan del citado procedimiento de ordenamiento celular constituyen objetivos primarios para el sistema inmune del paciente.

Una composición farmacéutica, medicamento, fármaco u otra composición puede comprender una neurona producida según cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la citada neurona o composición puede ser utilizada en un método de tratamiento médico, comprendiendo el método la administración de la citada neurona o composición a un paciente, por ejemplo, para el tratamiento (que puede incluir el tratamiento preventivo) de la enfermedad de Parkinson o de otras enfermedades (por ejemplo, neurodegenerativas), la citada neurona puede ser utilizada en la fabricación de una composición para administración, por ejemplo, para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson o otras (por ejemplo enfermedades neurodegenerativas) enfermedades, y en un procedimiento de preparación de una composición farmacéutica que comprende el mezclado de la citada neurona con un excipiente, vehículo o soporte farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, uno o más ingredientes adicionales, por ejemplo, una molécula neuroprotectora, una molécula neurorregeneradora, un retinoide, un factor de crecimiento, un astrocito, un factor anti-apoptótico o un factor que regula la expresión del gen en células progenitoras neurales o en células madre neurales o en el cerebro del huésped. Los citados ingredientes opcionales pueden convertir a la neurona en independiente de su entorno, a saber, de tal forma que su supervivencia no esté en función de uno o más factores o dolencias en su entorno. A título de ejemplo, el procedimiento de preparación de una composición farmacéutica puede incluir el mezclado de la neurona con uno o más factores encontrados en el mesencéfalo ventral en desarrollo. La neurona puede ser mezclada con GNDF y/o neurturina (NTN).

Una composición puede contener una neurona producida según la invención y uno o más componentes adicionales. Las composiciones farmacéuticas para ser utilizadas según la presente invención pueden comprender, además de la neurona, un excipiente, soporte, tampón, conservante, estabilizador, antioxidante u otro material farmacéuticamente aceptable, bien conocido por parte de los expertos en la materia. Los citados materiales deberían ser no tóxicos y no interferir con la actividad de la neurona. La naturaleza precisa del soporte o de otro material dependerá de la ruta de administración. La composición puede incluir una o más moléculas neuroprotectoras, una molécula neurorregeneradora, un retinoide, un factor de crecimiento, un astrocito, o factor que regula la expresión genética en células progenitoras neurales o en células madre neurales. Las citadas sustancias pueden convertir a la neurona en independiente de su entorno, tal y como se ha comentado anteriormente.

Las composiciones farmacéuticas líquidas incluyen generalmente un soporte líquido, tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceites de origen animal o vegetal, aceite mineral o aceite sintético. Pueden también incluirse solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido o glicoles, tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.

La composición puede ser presentada en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable, la cual está exenta de pirógenos y tiene un pH, una isotonicidad y una estabilidad adecuadas. Los expertos en la materia serán capaces de preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos, tales como cloruro sódico, inyección de Ringer, o inyección de lactato de Ringer. Una composición puede ser preparada utilizando fluido cefalorraquídeo artificial.

Una neurona producida según la invención puede ser utilizada en un método de tratamiento médico, particularmente para el tratamiento de una dolencia médica asociada con daño a, con la pérdida de, o con un trastorno en, células neuronales. Más particularmente, una neurona dopaminérgica producida según la invención puede ser utilizada en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson en humanos. Si bien las neuronas preparadas según la invención resultan particularmente de utilidad para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, la enfermedad de Parkinson), ellas no quedan limitadas a las mismas. A título de ejemplo, las mismas pueden ser también utilizadas para el tratamiento de daño a la médula espina y/o al corteza cerebral.

En métodos de tratamiento en los cuales la neurona administrada es una célula pluripotente que es capaz de dar lugar a dos o más fenotipos neuronales distintos, la neurona o composición puede ser introducida en una región que contiene astrocitos, los cuales dirigen la diferenciación de la neurona hacia un destino neuronal dopaminérgico deseado. La neurona o la composición puede, por ejemplo, ser inyectada en el mesencéfalo ventral, donde la misma puede interaccionar con astrocitos de Tipo 1 y ser inducida para adoptar un fenotipo dopaminérgico. Alternativa o adicionalmente, una composición implantada puede contener una neurona pluripotente en combinación con uno o más factores que dirigen su desarrollo hacia un destino neuronal dopaminérgico, tal y como se ha comentado anteriormente, por ejemplo, con un astrocito de Tipo 1.

Las neuronas pueden ser implantadas en un paciente a través de cualquier técnica conocida (por ejemplo, Lindvall, O. (1998) Mov. Disord. 13, Suppl. 1:83-7; Freed, C.R. et al., (1997) Cell Transplant, 6201-202; Kordower, et al., (1995) New England Journal of Medicine, 392, 1118-1124; Freed, C.R. (1992) New England Journal of Medicine, 327, 1549-1555).

La administración de una composición que contiene neuronas producidas según la presente invención se produce preferiblemente en una "cantidad fisiológicamente aceptable" o en una "cantidad terapéuticamente eficaz" (según sea el caso, si bien la profilaxis puede ser considerada como terapia), resultando ello suficiente para mostrar un beneficio para el individuo. La cantidad real administrada y la frecuencia y duración de la administración dependerán de la naturaleza y de la gravedad de lo que esté siendo tratado. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre dosis, etc, cae dentro del ámbito de responsabilidad de los doctores en medicina general y de otros doctores en medicina.

Una composición puede ser administrada en solitario o en combinación con otros tratamientos, ya sea de forma simultánea o secuencial, dependiendo de la dolencia que tenga que ser tratada.

Los procedimientos proporcionados en el presente documento para la inducción de un destino neuronal en células progenitoras neurales o en células madre neurales, pueden ser llevados a cabo utilizando líneas celulares progenitoras neurales o líneas celulares madre neurales como fuente de material. De este modo, no existe virtualmente ningún límite en el número de neuronas que puede ser producido.

Con vistas a mejorar las posibles desventajas asociadas con el rechazo inmunológico de células trasplantadas, pueden aislarse células progenitoras neurales o células madre neurales procedentes de un paciente y ser inducidas hacia el fenotipo deseado. De forma ventajosa, las células progenitoras neurales o las células madre neurales pueden ser utilizadas para establecer líneas celulares progenitoras o líneas de células madre, por lo que puede producirse un elevado número de células neuronales inmunocompatibles. Una nueva opción pasa por establecer un banco de células que abarque un número de compatibilidades inmunológicas a partir del cual pueda efectuarse una elección adecuada para un paciente individual. Las células progenitoras neurales o las células madre neurales derivadas de un individuo pueden ser modificadas para mejorar el rechazo cuando las mismas o su progenie son introducidas en un segundo individuo. A título de ejemplo, uno o más alelos MHC en una célula donante pueden ser sustituidos por los de un receptor, por ejemplo, mediante recombinación homóloga.

Si para su implantación a un paciente se utilizan células progenitoras neurales o células madre neurales derivadas de una línea celular que soporta un encogen inmortalizante, el oncogén puede ser eliminado utilizando el sistema CRE-loxP con anterioridad a la implantación de las células en el paciente (Westerman, K.A. et al., Proc. Natl. Scad. Sci., USA 93, 8971 (1996)). Puede utilizarse un encogen inmortalizante que sea inactivo a la temperatura corporal del paciente.

En un procedimiento de cribado en busca de un agente para ser utilizado en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa puede utilizarse una neurona dopaminérgica producida según la invención. La enfermedad neurodegenerativa pude ser la enfermedad de Parkinson. El agente puede ser una molécula neuroprotectora y/o neurorregeneradora. El procedimiento puede ser llevado a cabo in vitro.

El procedimiento puede incluir:

(i)

el tratamiento de una neurona de la invención con una toxina para la citada neurona;

(ii)

la separación de la neurona de la toxina;

(iii)

la puesta en contacto de la neurona tratada con una agente para prueba o agentes para prueba;

(iv)

la determinación de la capacidad de la neurona para recuperarse de la toxina;

(v)

la comparación de la citada capacidad de la neurona para recuperarse de la toxina con la capacidad de la misma o de una neurona idéntica de recuperarse de la toxina, en ausencia de contacto con el(los) agente(s) de prueba.

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El procedimiento puede comprender:

(i)

el tratamiento de una neurona de la invención con una toxina para la neurona, en presencia de un agente para prueba o de agentes para prueba;

(ii)

la determinación de la capacidad de la neurona para tolerar la toxina;

(iii)

la comparación de la citada capacidad de la neurona para tolerar la toxina con la capacidad de la misma o de una neurona idéntica de tolerar la toxina, en ausencia de contacto con el(los) agente(s) de prueba.

La toxina puede ser 6-hidroxidopamina, 5,7-dihidroxitriptamina o 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina
(MPTP). La capacidad de recuperación de la neurona a partir de la toxina o de toleración de la misma puede ser determinada a través de cualquier procedimiento conocido por parte de los expertos en la materia, por ejemplo, mediante la monitorización de la viabilidad celular, (por ejemplo, mediante contaje celular, por ejemplo, a través de la técnica TUNEL, mediante monitorización de la morfología, (por ejemplo, a través de crecimiento acelerado, elongación axonal y/o ramificación), y/o mediante la monitorización de la bioquímica, por ejemplo, de la actividad TH, por ejemplo, ingesta de neurotransmisor/liberación/contenido).

Entre las células progenitoras neurales o las células madre neurales que pueden utilizarse en la presente invención se incluyen la C17.2 (Snyder, E. Y. et al Cell 68, 33-51 (1992)) y la línea celular humana H6 (Flax et al., Nature Biotech 16 (1998)). Nuevos ejemplos se relacionan en (Gage, F.H. et al. Ann. Rev. Neurosci. 18, 159-192 (1995)).

Si bien la presente discusión ha sido efectuada en relación con células progenitoras neurales o con células madre neurales, los procedimientos proporcionados en la presente invención pueden ser aplicados a la inducción de destinos neuronales en otras células progenitoras/madre. Entre los ejemplos de las citadas células se incluyen las células madre asociadas con sistemas no neurales. Los procedimientos pueden ser aplicados a células proliferativas y/o células hematopoyéticas procedentes de la epidermis. Las células hematopoyéticas pueden ser recogidas a partir de sangre o de biopsia ósea. Las células epiteliales pueden ser recogidas a partir de biopsia de la piel o mediante rascado, por ejemplo, de la mucosa oral. Dado que un fenotipo neuronal no constituye un destino fisiológico in vivo de estas células progenitoras/madre, el proceso inductivo puede ser identificado como una trans-diferenciación o una des-diferenciación y re-diferenciación neural. Un procedimiento para la inducción de las citadas células hacia un destino neuronal puede incluir la utilización de reguladores antisentido asociados con fenotipos no neuronales, a saber, para suprimir y/o invertir la diferenciación de estas células hacia destinos no neuronales.

Los procedimientos de la presente invención pueden ser aplicados a células madre localizadas antes que las células madre neurales en la ruta de desarrollo. Los mismos pueden ser aplicados a células madre que sean capaces de dar lugar a dos o más células madre hijas asociadas con diferentes sistemas de desarrollo. Constituyen ejemplos de células madre hijas, las células madre hematopoyéticas, las células proliferativas procedentes de la epidermis y las células madre neurales.

Tal y como se ha demostrado anteriormente, la presente invención describe que pueden generarse neuronas dopaminérgicas a partir de células progenitoras neurales multipotentes o de células madre neurales multipotentes, a través de un proceso que requiere la expresión de Nurr1 por encima de los niveles basales, en combinación con uno o más factores suministrados por o derivados de astrocitos de Tipo 1 del mesencéfalo ventral. Uno o más factores son solubles y secretados, tal y como se determina a través de la capacidad de paso a través de un inserto microporoso. El factor o factores parecen también ser lábiles.

En diversos aspectos adicionales, la presente invención está relacionada con la provisión de ensayos y procedimientos para cribado en búsqueda de un factor o factores que inducen un destino dopaminérgico en una célula progenitora neural o en una célula madre neural que expresa Nurr1 por encima de los niveles basales y con un factor o factores identificados a través de los mismos.

La invención proporciona un procedimiento de cribado en búsqueda de un factor o factores capaces, ya sea en solitario o en combinación, de inducir un destino dopaminérgico en una célula progenitora neural o en una célula madre neural que expresa Nurr1 por encima de los niveles basales. Un nuevo aspecto de la invención proporciona la utilización de una célula progenitora neural o una célula madre neural que expresa Nurr1 por encima de los niveles basales, en el cribado o en la búsqueda y/o en la obtención/identificación de un factor o factores que induce(n) un destino dopaminérgico en la citada célula progenitora o madre.

Un procedimiento de cribado puede incluir:

(a)

la puesta en contacto de una sustancia de prueba con una célula progenitora neural o con una célula madre neural que expresa Nurr1 por encima de los niveles basales, contacto éste que puede dar lugar a interacción entre la sustancia de prueba y la célula progenitora neural o la célula madre neural; y

(b)

la determinación de la interacción entre la sustancia de prueba y la célula progenitora o la célula madre.

Un procedimiento de cribado puede incluir la puesta en contacto de una sustancia de prueba con una fracción de membrana derivada de una célula progenitora neural o de una célula madre neural que expresa Nurr1 por encima de los niveles basales y la determinación de la interacción entre la sustancia de prueba y la fracción de membrana. La preparación de fracciones de membrana resulta bien conocida por parte de los expertos en la materia.

La unión o la interacción pueden ser determinadas a través de cualquier técnica conocida, de forma cualitativa o cuantitativa. La interacción entre la sustancia de prueba y la célula progenitora o la célula madre puede ser estudiada mediante el marcado de cada una de ellas con una marca detectable y su puesta en contacto con la otra, la cual puede haber sido inmovilizada sobre un soporte sólido, por ejemplo, mediante la utilización de un anticuerpo unido a un soporte sólido o a través de otras tecnologías que resultan conocidas per se.

Un procedimiento de cribado puede incluir el cultivo de una célula progenitora neural o de una célula madre neural en presencia de una sustancia de prueba o de sustancias de prueba y el análisis de la célula para determinar la diferenciación con un fenotipo dopaminérgico, por ejemplo, a través de la detección de un marcador del fenotipo dopaminérgico, tal y como se discute en el presente documento. La tirosina-hidroxilasa (TH) es un marcador de fenotipo dopaminérgico.

Cualquiera de las sustancias cribadas según la presente invención puede ser un compuesto químico natural o sintético.

Un procedimiento de cribado puede incluir la comparación de astrocitos de Tipo 1 del mesencéfalo ventral con células neurales (por ejemplo, astrocitos) que son incapaces de inducir un destino dopaminérgico en células progenitoras neurales o en células madre neurales que expresan Nurr1 por encima de los niveles basales. La comparación puede, por ejemplo, ser efectuada entre astrocitos de Tipo 1 del mesencéfalo ventral y astrocitos de Tipo 1 de otras localizaciones neurales.

Un procedimiento de cribado que involucra astrocitos puede utilizar astrocitos inmortalizados. El mismo puede conllevar líneas celulares de astrocitos, por ejemplo, líneas celulares mesencefálicas de astrocitos. Las citadas líneas celulares proporcionan una población celular homogénea.

Un procedimiento de cribado puede utilizar cualquier procedimiento conocido para analizar una diferencia fenotípica entre células y puede efectuarse a nivel de DNA, mRNA, cDNA o de polipéptido. El cribado diferencial y el cribado genético son dos de las citadas técnicas. Una sustancia identificada a través de los procedimientos de cribado descritos en el presente documento puede ser utilizada como sustancia de prueba en cualquiera de los restantes procedimientos de cribado descritos en el presente documento.

Un procedimiento de cribado puede utilizar una matriz de expresión nucleica, por ejemplo, una matriz de expresión de cDNA de ratón. En este planteamiento, una matriz de diferentes moléculas de ácido nucleico es dispuesta sobre un filtro, por ejemplo, mediante la reticulación del ácido nucleico con el filtro. Se obtiene una solución o extracto de prueba y se marca el ácido nucleico que contiene, por ejemplo, a través de fluorescencia. La solución o el extracto es posteriormente aplicado al ácido nucleico sobre el filtro. Se determina la hibridación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico sobre el filtro y se compara con la hibridación alcanzada con una solución control. Una diferencia entre la hibridación obtenida con las muestras de prueba y control resulta indicativa de una diferente contenido en ácido nucleico. Para información adicional sobre matrices de ácido nucleico, ver www.clontech.com.

Un procedimiento de cribado puede incluir la comparación de células parentales C17.2 con células C17.2 que expresan Nurr1 por encima de los niveles basales, por ejemplo, para identificar genes objetivo de Nurr1 y/o el(los) receptor(es) para el factor o factores que son suministrados por o derivan de astrocitos de Tipo 1 del mesencéfalo ventral y los cuales inducen un destino dopaminérgico en células progenitoras neurales o en células madre neurales que expresan Nurr1 pro encima de los niveles basales. Una vez identificado(s) el(los) gen(es) objetivo y/o el(los) receptor(es), los mismos pueden ser aislados y/o purificados y/o clonados y utilizados en procedimientos de cribado en busca del propio(s) factor o factores, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad.

Un procedimiento de cribado puede incluir la purificación y/o el aislamiento de una sustancia o sustancias a partir de una mezcla. El procedimiento puede incluir la determinación de la capacidad de una o mas de las fracciones de la mezcla para interaccionar con una célula progenitora neural o con una célula madre neural que expresa Nurr1 por encima de los valores basales, por ejemplo, la capacidad de unión a y/o de inducir un destino dopaminérgico en la citada célula progenitora neural o en la célula madre neural. La purificación y/o el aislamiento puede utilizar cualquier procedimiento conocido por parte de los expertos en la materia.

Un procedimiento de cribado puede utilizar un promotor inducible, unido operativamente a ácido nucleico que codifica para una sustancia de prueba. La citada construcción es incorporada en una célula huésped y una o más de las propiedades de esa célula, bajo las condiciones permisivas y no permisivas del promotor, son determinadas y comparadas. La propiedad determinada puede ser la capacidad de la célula huésped para inducir un fenotipo dopaminérgico en una célula progenitora neural o en una célula madre neural que expresa Nurr1 por encima de los niveles basales. Una diferencia en esa capacidad de la célula huésped entre las condiciones permisivas y no permisivas indica que la sustancia de prueba puede ser capaz, ya sea en solitario o en combinación, de inducir un destino dopaminérgico en una célula progenitora neural o en una célula madre neural que expresa Nurr1 por encima de los niveles basales.

El formato preciso de cualquiera de los procedimientos de cribado de la presente invención puede ser modificado por parte de los expertos en la materia utilizando sus habilidades y conocimientos rutinarios.

Un factor o factores identificados a través de uno de los procedimientos proporcionados a través de la invención puede(n) ser aislado(s) y/o purificado(s) y/o investigado(s) adicionalmente. Pueden ser manufacturados.

Un factor identificado a través de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento puede ser formulado en una composición farmacéutica, medicamento, fármaco u otra composición que comprende tal factor (composición ésta que puede incluir una célula progenitora neural o una célula madre neural que expresa Nurr1 por encima de los niveles basales) o utilizado para inducir que células progenitoras neurales o células madre neurales que expresan Nurr1 por encima de los niveles basales adopten un fenotipo dopaminérgico, o el citado factor o composición puede ser utilizado en un método de tratamiento médico o en un método que comprende la administración del citado factor o composición a un paciente, por ejemplo para el tratamiento (que puede incluir un tratamiento preventivo) de una dolencia médica asociada con daño, por ejemplo, a pérdida de, o un trastorno en neuronas dopaminérgicas, por ejemplo, para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson o de otra enfermedad neurodegenerativa, o el citado factor puede ser utilizado en la fabricación de una composición, medicamento o fármaco para la administración, por ejemplo, para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson o de otros, (por ejemplo, trastornos neurodegenerativos) y un procedimiento para la preparación de composiciones farmacéuticas que comprenden el mezclado del citado factor con un excipiente, vehículo soporte farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, con otros ingredientes.

En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona un procedimiento para cribado dirigido a la búsqueda de una sustancia que modula la capacidad que tienen los astrocitos de Tipo 1 del mesencéfalo ventral de inducir un destino dopaminérgico en células progenitoras neurales o en células madre neurales que expresan Nurr1 por encima de niveles basales.

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El citado procedimiento puede incluir uno o más de:

(i)

co-cultivar astrocitos de Tipo 1 con células progenitoras neurales o con células madre neurales que expresan Nurr1 por encima de niveles basales, en presencia de una o más de las sustancias de prueba;

(ii)

poner en contacto células progenitoras neurales o células madre neurales que expresan Nurr1 por encima de niveles basales con uno o más de los factores identificados mediante un procedimiento de cribado proporcionado por la invención, que se ha identificado como capaz de inducir un fenotipo dopaminérgico en las citadas células, teniendo lugar el citado contacto en presencia de una o más sustancias de prueba;

(iii)

analizar la proporción de células progenitoras o de células madre que adoptan un destino dopaminérgico;

(iv)

comparar la proporción de células progenitoras o de células madre que adoptan un destino dopaminérgico con el número de células progenitoras o de células madre que adoptan un destino dopaminérgico en un medio y en unas condiciones de reacción comparables, en ausencia de la(s) sustancia(s) de prueba. Una diferencia en la proporción de neuronas dopaminérgicas entre los co-cultivos tratados y los no tratados resulta indicativa de un efecto modulador de la(s) sustancia(s) de prueba relevante(s).

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El citado procedimiento de cribado puede incluir:

(i)

co-cultivar astrocitos de Tipo 1 con células progenitoras neurales o con células madre neurales que expresan Nurr1 por encima de niveles basales, en presencia de una o más de las sustancias de prueba;

(ii)

analizar la proporción de células progenitoras o de células madre que adoptan un destino dopaminérgico;

(iii)

comparar la proporción de células progenitoras o de células madre que adoptan un destino dopaminérgico, con el número de células progenitoras o de células madre que adoptan un destino dopaminérgico en un medio y unas condiciones de reacción comparables, en ausencia de la(s) sustancia(s) de prueba.

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El citado procedimiento de cribado puede incluir:

(i)

poner en contacto células progenitoras neurales o células madre neurales que expresan Nurr1 por encima de niveles basales con uno o más de los factores identificados mediante un procedimiento de cribado proporcionado por la invención, que se ha identificado como capaz de inducir un fenotipo dopaminérgico en las citadas células, teniendo lugar el citado contacto en presencia de una o más sustancias de prueba;

(ii)

analizar la proporción de células progenitoras o de células madre que adoptan un destino dopaminérgico;

(iii)

comparar la proporción de células progenitoras o de células madre que adoptan un destino dopaminérgico, con el número de células progenitoras o de células madre que adoptan un destino dopaminérgico en un medio y en unas condiciones de reacción comparables, en ausencia de la(s) sustancia(s) de prueba.

Después de la identificación de una sustancia que modula la actividad inductiva, la sustancia puede ser investigada adicionalmente. La misma puede ser fabricada y/o utilizada en la preparación, a saber, en la fabricación o formulación de una composición tal como un medicamento, una composición farmacéutica o un fármaco. Cualquiera de las sustancias objeto de prueba para determinar su actividad moduladora puede ser un compuesto químico de tipo natural o sintético.

Aspectos y realizaciones de la presente invención serán ahora objeto de ilustración, a título de ejemplo, con relación a las figuras que se acompañan. Nuevos aspectos y realizaciones resultarán evidentes para los expertos en la materia.

Breve descripción de las Figuras

La Figura 1 demuestra la caracterización de los clones Nurr1-C17.2.

La Figura 1A muestra la velocidad proliferativa residual de los clones parentales Nurr1- y la de los clones control C17.2 simulado. El %BrdU+ indica el porcentaje de células que incorporan BrdU después de seis horas de pulsación en medios exentos de suero.

La Figura 1B muestra que la expresión de Nurr1 incrementa de forma significativa el destino neuronal en medios exentos de suero. El %TuJ1+/%BrdU- indica el porcentaje de células que expresaban \beta-tubulina III pero que no incorporaban BrdU.

La Figura 1C muestra que el co-cultivo de dos de los clones con células del mesencéfalo ventral E16 incrementa de forma significativa el destino dopaminérgico. El %TH+ indica el porcentaje de células C17.2 con tirosina-hidroxilasa positiva.

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La Figura 2 muestra el papel de retinoides, bFGF, y la proliferación en la inducción de neuronas dopaminérgicas procedentes de líneas celulares progenitoras neurales o de líneas celulares madre neurales que sobreexpresan Nurr1, en co-cultivos de mesencéfalo ventral.

La Figura 2A muestra los efectos de SR11237, bFGF, y EGF sobre la inducción dopaminérgica. El %TH+ indica el porcentaje de células C17.2 en co-cultivo que expresan tirosina-hidroxilasa. (C) co-cultivos de células E16 VM con células C17.2 parentales o con células 42 de clones Nurr1-C17.2; (SR) co-cultivo mas SR11237; (F) co-cultivo más bFGF; (\alphaF) co-cultivo más anticuerpo bloqueante para co-cultivo bFGF más EGF.

La Figura 2B muestra la unión entre la proliferación y la inducción dopaminérgica. El %TH+ indica el porcentaje de células C17.2 después de co-cultivo para 9 DIV que expresan tirosina-hidroxilasa. El %BrdU+ indica el porcentaje de aquellas células que incorporan BrdU.

La Figura 3 muestra que los astrocitos VM de Tipo i inducen un fenotipo dopaminérgico en una línea de células madre neurales que sobre-expresa Nurr1 (Nurr1-C17.2-clon 42). El %TH+ indica el porcentaje de células clon 42 que expresan la tirosina-hidroxilasa. (E16 VM) co-cultivo de clone 42 con células de mesencéfalo ventral E16; (Tot) co-cultivo con células primarias totales; (Ad+) co-cultivo con fracción celular adherente; (Ad-) co-cultivo con fracción celular no adherente; (T1A) co-cultivo con astrocitos de Tipo 1; (P1 T1A) co-cultivo con astrocitos de Tipo 1 de día postnatal, procedentes de mesencéfalo ventral. (Inserto) inserto que separa células de clone 42 de células P1 T1A en co-cultivo; (CTX) co-cultivo con corteza; (HC) co-cultivo con hipocampo; (SC) co-cultivo co médula espinal.

La Figura 4 muestra el análisis mediante HPLC de sobrenadantes recogidos a partir de co-cultivos de astrocitos de Tipo 1 del mesencéfalo ventral (TIA) con, o bien células Nurr1-C17.2-clon 42 (C42) despolarizadas con KCl, o con células C17.2 (C17.2) parentales despolarizadas con KCl, co-cultivos (+SR+bFGF) más de bFGF y SR11237.

La Figura 5 muestra que la actividad temprana de Nurr1 produce cambios de larga duración en la expresión genética en células C17.2. Unidades relativamente ligeras (RLU) indican la expresión de luciferasa a partir de un indicador NBRE-luciferasa activado por Nurr1.

Descripción detallada Procedimientos Líneas celulares que sobreexpresan Nurr-1

Células C17.2 fueron cotransfectadas con un vector de expresión CMX-Nurr1 (Perlmann, T. et al. Genes Dev. 9, 769-782 (1995)) y plásmidos de resistencia a PGK-puromicina (clones Nurr1) o un PGK-puromicina en solitario (clones simulados). Para ensayos de indicador, células parentales C17.2 fueron transfectadas con el vector de expresión Nurr1, el plásmido indicador (el triplete de elemento respuesta (NBRE) que se une a NGFIB aguas arriba del promotor mínimo TK fusionado a luciferasa de luciérnaga) y un plásmido pRSV-fosfatasa alcalina, a una relación 2:1:2.

Se seleccionaron cincuenta clones transfectados Nurr1 para determinar la resistencia a puromicina, se aislaron y amplificaron y se analizó la expresión Nurr1 mRNA a través de ensayo de protección RNasa (RPA). Los ensayos se llevaron a cabo utilizando un kit RPAII Ribonuclease Protection Assay (Ambion), siguiendo las instrucciones del fabricante. Una sonda de 288 bp antisentido Nurr1 cRNA, que se extiende entre los nucleótidos 1798-2086 de la secuencia Nurr1 cDNA de ratón (Law, S.W. et al., Mol. Endocrinol. 6, 2129-2135 (1992)), fue transcrita con T7 (procedente de un Nurr1 cDNA clonado en el sitio EcoRI/Xhol del vector PBS-KS+, linearizado con EcoRI) y marcada con (\alpha-32P)CTP (Amersham). Los fragmentos de cRNA protegidos fueron separados sobre PAGE al 4%, en condiciones de desnaturalización. La intensidad de la señal fue analizada con un Phosphoimager MD Storm 840 y la señal de Nurr1 estandarizada con el contenido de GAPDH en cada una de las muestras.

Cultivo celular y tratamientos

Células madre neurales C17.2 (Snyder, E.Y. et al., Cell 68, 33-51 (1992)) fueron mantenidas y hechas pasar tal y como se ha indicado anteriormente (Snyder, E.Y. et al. Cell 68, 33-51 (1992)). Mesencéfalos ventrales procedentes de embriones de rata E16 fueron diseccionados, mecánicamente disociados y colocados en placas, a una densidad final de 1x10^{5} células/cm^{2} sobre pocillos de cultivo recubiertos con poli-D-lisina, en un medio exento de suero definido (N_{2}, comprendiendo una mezcla 1:1 de F12 y DMEM conteniendo insulina (10 ng/ml), transferrina (100 \mug/ml), putrescina (100 \muM), progesterona (20 nM), selenio (30 nM), glucosa (6 mg/ml) y sueroalbúmina bovina (1 mg/ml)). Transcurridas 24 horas in vitro, los co-cultivos fueron iniciados mediante ubicación directa en placa de 2,5-5 x 10^{4} células derivadas de C17.2 en cultivos primarios; todos los cultivos utilizaron este punto como 0 DIV. Esta secuencia de ubicación en placa y la relación de células primarias/células C17.2 dio lugar a los cultivos más sanos, si bien la variación de los números de las células C17.2 en 10 veces su rango no afectaba de forma significativa a la proporción de células TH+ observada. Los astrocitos de Tipo 1 purificados fueron obtenidos a partir de cultivos gliales mezclados, derivados de diversas regiones de ratas P1, según un protocolo estándar (McCarthy, K.D. et al. J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980)). Una vez reubicadas en placas de 6 o 12 pocillos, los astrocitos fueron cultivados hasta confluencia en medio conteniendo suero y cambiados a medio N2. Después de 3-5 DIV, los co-cultivos fueron iniciados en N2 fresco, tal y como se ha descrito anteriormente. Todos los factores fueron añadidos a la vez, en el inicio del co-cultivo (las concentraciones son anotadas en los Resultados y Discusión), con la excepción de la 5-bromodesoxiuridina (BrdU), la cual fue añadida 4-6 horas antes de la fijación. Los cultivos fueron mantenidos en una incubadora con 95% de aire, 5% de CO_{2} a 37ºC y fijados después de determinados períodos de tiempo con paraformaldehido 4% durante 45 min., para análisis inmunocitoquímico.

Análisis inmunocitoquímico y HPLC

Cultivos fijados fueron incubados con uno de los siguientes anticuerpos, diluidos adecuadamente en solución salina tamponada con fosfato (PBS) conteniendo sueroalbúmina bovina 1% y Triton-X 100 0,3%:anti-BrdU de ratón, 1:50 (DAKO, Denmark), anti-\beta-tubulina de ratón, Tipo III (TuJ1),1: 250 (Sigma), anti-TH de ratón, 1:1000 (Incstar, USA), anti-\beta-galactosidasa de conejo, 1:250 (Cappel, USA) antiGFAP de conejo, 1:500 (DAKO, Denmark), anti-AHD-2 de conejo, 1:4000. Las incubaciones fueron efectuadas, o bien a 4º durante el transcurso de una noche, o a temperatura ambiente durante 1 hora. Ambos procesos proporcionaban los mismos resultados. Después del lavado, los cultivos fueron incubados durante entre 1-3 horas con anticuerpos secundarios adecuados (IgG anti-ratón de caballo biotinilada o IgG anti-conejo de cabra, Vector, USA), 1:100, en el mismo tampón de dilución. El inmunoteñido fue visualizado con el kit de inmunoperoxidasa de Vector Laboratory ABC, utilizando o bien sustrato AEC (rojo) o sustrato SG (gris). El marcado doble fluorescente de la \beta-galactosidasa (\beta-gal) fue llevado a cabo mediante la sustitución del biotinilado secundario con anticuerpo conjugado con FITC (Vector, USA), 1:100. Los datos inmunicitoquímicos cuantitativos representan promedios y errores estándar a partir de 100-500 células contadas en cada uno de 3-6 pocillos separados, a partir de 2-4 experimentos. Para la cuantificación de la expresión TH en co-cultivos de células primarias y de células derivadas de C17.2, se visualizó la TH con el sustrato AEC de campo claro, mientras que la \beta-gal fue valorada utilizando FITC, por lo que la totalidad de datos expresados como "%TH+" representa el número de TH+/\beta-gal+dividido por las células \beta-gal positivas totales.

Para análisis de liberación de dopamina, co-cultivos grandes (10 cm) conteniendo aproximadamente 1 millón de células Nurr1-C17.2-c42 ó células parentales C17.2 con P1 VM T1A, fueron tratados con 200 \mul de KCl 50 mM en PBS/citrato sódico 0,1 M, durante 5 minutos, mientras se estaba girando. Los sobrenadantes fueron sometidos a ensayo inmediatamente para determinar el contenido en dopamina, utilizando cromatografía líquida a elevada presión (HPLC). Las muestras fueron separadas con una columna de fase inversa C-18, eluidas con acetonitrilo y detectadas electroquímicamente. Los resultados fueron verificados con un estándar conteniendo dopamina, DOPAC, 5-HT y 5-HIAA.

Cultivos a largo plazo y trasplante

Las células parentales C17.2 o las células C17.2-Nurr1-c42 fueron cultivadas en co-cultivos de insertos grandes (10 cm.) con astrocitos de tipo VM durante 8 días, en presencia de bFGF (10 ng/ml) y SR11237 (1 \muM). Las células fueron entonces retiradas del inserto por tripsinización, pelletizadas y re-suspendidas, a una concentración de 100.000 células/\mul, en sus propios medios de acondicionamiento; una alícuota de esta mezcla fue entonces aplicada a una placa de cultivo celular de 6 pocillos tratada con poli-D-lisina, conteniendo medio N2, mientras que el resto fue utilizado para trasplante. Ratones CD1 adultos (25-30 gramos) enjaulados y tratados según las guidelines de la Comunidad Europea (86/609/EEC) fueron anestesiados con pentobarbital (60 mg/Kg i.p.), 25.000 células fueron inyectadas estereotaxicalmente en el cuerpo estriado, en cada una de las siguientes coordenadas (en mm): AP (bregma)= 0,56, L= 1,9, DV(dura)= -2,55 y -2,75, con la barra de incisión a -3. Doce días después de aplicar el injerto, los ratones fueron prefusionados transcardialmente con paraformaldehido 4%. Los cerebros fueron postfijados durante 2 horas, incrustados en sacarosa 10% durante más de 1 día y congelados en isopentano enfriado con hielo seco. Secciones de criostato de 14 micras fueron procesadas para determinar la inmunohistoquímica de TH, utilizando anti-TH de ratón (Incstar, Minnesota, USA) 1:1000, y rodamina anti-ratón de burro (Jackson, Pennsylvania, USA) 1:100 anticuerpos. Las células TH positivas fueron fotografiadas utilizando una cámara Hamamatsu, unida a un microscopio Zeiss Axioplan 2.

Resultados y discusión Expresión de Nurr1 por encima de niveles basales en células madre neurales multipotentes

Los inventores utilizaron un clon bien caracterizado de células madre neurales multipotentes denominadas C17.2 (Snyder, E.Y. et al., Cell 68, 33-51 (1992)). Derivadas inicialmente de cerebelo de ratón en desarrollo, las células C17.2 han sido inmortalizadas con v-myc, contienen un indicador lacZ, poseen la capacidad de diferenciación entre neuronas, astrocitos y oligodendrocitos in vitro e in vivo y, tras ser trasplantadas al cerebro en desarrollo, adoptan fenotipos neuronales regionalmente apropiados (Snyder, E.Y. et al. Cell 68, 33-51 (1992); Snyder, E.Y. et al., Nature 374, 367-370 (1995)). Además, los mismos factores sencillos conocidos por dirigir la diferenciación de las células madre primarias desde el sistema nervioso central adulto y fetal (Johe, K.K. et al. Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996)), dirigen la diferenciación de las células C17.2 in vitro.

Las células C17.2 fueron transfectadas de forma estable, tal y como se describe más adelante y cincuenta clones Nurr1 fueron analizados para determinar la expresión transgénica, a través de ensayo de protección de RNasa (RPA). Diversos clones Nurr1 sobreexpresaron el transgén, de los cuales los cinco expresores más elevados fueron seleccionados para análisis. Estos cinco clones seleccionados expresaron niveles de Nurr1 mucho más elevados de Nurr1 que las células C17.2 parentales o las células del mesencéfalo ventral, cerebelo o corteza. Se seleccionaron también 8 clones simulados control, elegidos al azar. La totalidad de los clones Nurr1 se comportó de forma similar a los clones simulados y a los clones parenteles en medio que contenía suero, sin diferencias obvias en la velocidad de crecimiento o en la morfología.

Capacidad diferenciadora de los clones que sobreexpresan Nurr1

Para definir la capacidad diferenciadora y el destino fenotípico de los clones que sobreexpresan Nurr1, los inventores examinaron el comportamiento de los clones después de paso a baja densidad en medios definidos, exentos de suero (condiciones que permiten la diferenciación). En estas condiciones, la línea celular parental empieza a diferenciarse, por lo que después de transcurridos entre 4-5 días in vitro (DIV), entre el 80 y el 85% de la población es post-mitótica (a saber, BrdU negativa, tras impulso extendido), mientras que aproximadamente entre el 20 y el 30% de las células post-mitóticas adoptan un destino neuronal, juzgado a través de la expresión de \beta-tubulina III (TuJ1).

Los efectos de Nurr1 sobre la capacidad de diferenciación, medidos a través de la incorporación de BrdU 10 \muM tras 6 horas de impulso en medios exentos de suero, fueron variados. Si bien existía una tendencia hacia una diferenciación incrementada dentro de los clones Nurr1, no se observó ningún efecto claro del transgén en este proceso (Fig. 1A). No obstante, los efectos de Nurr1 sobre el destino de las células post-mitóticas eran claros y robustos (Fig. 1B). La expresión del transgén Nurr1 incrementaba de forma significativa el destino neuronal en medios exento de suero, tal y como se juzga a través de la expresión de la \beta-tubulina III (TuJ1), hasta un promedio del 68% de las células post-mitóticas a través de los cinco clones (efecto global del transgén Nurr1 versus el simulado, ^{*}P< 0,0001 a través de 2 vías ANOVA). En cuatro de los cinco clones Nurr1, la inmensa mayoría de las células post-mitóticas (más del 60%) adoptaron un destino neuronal, un fenómeno no observado en ninguno de los clones simulados.

Si bien Nurr1 parece restringir la línea celular C17.2 a linajes neuronales, el destino neuroquímico de estas neuronas no era dopaminérgico, dado que no se detectó una inmunorreactividad a tirosina-hidroxilasa significativa (TH, un marcador para neuronas dopaminérgias) en ninguno de los clones Nurr1, bajo estas condiciones.

Inducción de clones que sobreexpresan Nurr1 hacia el destino dopaminérgico

Los inventores trataron los clones Nurr1 con una diversidad de factores tróficos, mitógenos, citoquinas y otros agentes conocidos por ser importantes en la proliferación (factor de crecimiento de fibroblasto (bFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de tipo insulina, suero de ternera fetal), en la diferenciación (ácido retinoico, dopamina, forscolina, erizo sónico) y en supervivencia (factor neurotrófico derivado de línea celular glial, factor neurotrófico derivado del cerebro, neurotrofina-3, factor neurotrófico ciliar) de neuronas dopaminérgicas endógenas. Ninguno de estos factores inducía la expresión de TH en ninguno de los clones, en solitario o combinados.

Los clones Nurr1 fueron co-cultivados in vitro con cultivos primarios derivados de mesencéfalo ventral de rata E16, la edad y la región donde nacieron las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra (Altman, J. et al. Neurogenesis and Neuronal Migration in the Rat Nervous System, 2nd edition (ed. Paxinos, G. Academic Press, San Diego), p. 1054 (1995)). Bajo estas condiciones, un porcentaje significativo de células procedentes de dos de las líneas Nurr1 (los clones con la capacidad proliferativa más elevada, clones 4 y 42) mostraron cantidades medibles de inmunorreactividad a TH (Fig. 1C, ^{*}P<0,0001, interacción de transgén vs. clon a través de dos vías ANOVA). El teñido observado en la línea padre C17.2 o en cualquiera de las líneas de control simulado era escaso o nulo. La microscopía por contraste de fase de los co-cultivos reveló agrupaciones de células TH+ derivadas de clon Nurr1.

Colectivamente, estas observaciones sugirieron que uno o más de los factores locales derivados de los cultivos primarios interaccionaban directa o indirectamente con Nurr1 para inducir neuronas que expresaban Nurr1. La expresión de TH quedaba limitada a una subpoblación minoritaria dentro de una fracción de los clones Nurr1.

Tratamiento de co-cultivos con SR11237, bFGF y EGF

El tratamiento de co-cultivos del clon Nurr1 con la expresión más elevada de TH (clon 42) y de las células VM primarias, con combinaciones de los factores mencionados anteriormente resultaba generalmente ineficaz a la hora de incrementar la expresión de TH, con tres importantes excepciones: el análogo sintético retinoide SR11237, bFGF y EGF (Fig 2A).

La adición de SR11237 (a 1\mul) de SR11237 y de bFGF (a 10 ng/ml) a las células 17.2 parentales en co-cultivo no inducía la expresión de TH, no obstante, cada una de estas moléculas inducía la expresión de TH en 40-60% de la población de clon 42 en Nurr1-C17.2, cuando se añadían a co-cultivos en medios exentos de suero. Los efectos de bFGF podían ser sustituidos por EGF. Además, los efectos de SR11237 y de bFGF o de EGF resultaban aditivos a dosis de saturación (hasta el 90% LacZ+ era TH+), sugiriendo que los mismos podían actuar a través de distintos mecanismos.

El SR11237 estimula específicamente a los receptores retinoides RXR (Lehmann, J.M. et al. Science 258, 1944-1946 (1992)), en relación con los cuales se ha demostrado que heterodimerizan con Nurr1 para formar complejos iniciadores de la transcripción (Perlmann, T. et al., Genes Dev. 9, 769-782 (1995)). Esta observación, junto con observaciones de que la totalidad del ácido trans-retinoico quedaban sin efecto, sugieren que puede resultar implicada una interacción funcional entre Nurr1, los receptores RXR y células VM primarias.

Se ha demostrado previamente que los retinoides y el FGF juegan un papel en el desarrollo neuronal dopaminérgico normal (Ye, W. et al. Cell 93, 755-766 (1998); Eichele, G. Trends Genet 13, 343-345 (1997); Krezel, W. Science 279, 864-867 (1998)). No obstante, a pesar de que estos factores incrementan la proporción de células que expresan TH, tal y como se ha comentado anteriormente, los inventores han demostrado que los efectos de estos factores sobre Nurr1-C17.2-(c42) parecen ser moduladores. El antagonismo con o bien anticuerpos bloqueadores o con antagonistas específicos RAR o RXR no evitaba la expresión de TH basal de c42 en co-cultivos (a saber, aproximadamente el 10%, Fig. 1C). El antagonismo de erizo sónico, utilizando anticuerpos bloqueadores, resultó también ineficaz para evitar la expresión TH basal. Así pues, el único requisito obligatorio para la inducción de un fenotipo dopaminérgico en c42 parece ser la exposición a señales derivadas de células mesencefálicas ventrales primarias.

Tratamiento previo de clones con bFGF y EGF

El bFGF y el EGF son ambos directamente mitógenos para las células C17.2 (Kitchens, D.L. et al., J. Neurobiol. 25 (7), 797-807 (1994)), pero se ha averiguado que después de tratamiento prolongado con cualquier factor en medio exento de suero (SFM), la proliferación de base de la mayor parte de las líneas clonales permanecía inesperadamente elevada después del paso en SFM en solitario. Además, resultó sorprendente que los clones Nurr1 con la cantidad más elevada de proliferación residual en medio exento de suero (clones 4 y 42), demostraron un expresión significativa de TH en co-cultivos.

Los inventores razonaron que el incremento en la proliferación de otros clones Nurr1 debería incrementar el número de neuronas que expresan TH. Los clones Nurr1 fueron tratados previamente con bFGF para 5 DIV, con anterioridad a la división y a la recolocación en placas en cultivos mesencefálicos ventrales primarios. Se ensayaron cultivos hermanos, tanto para proliferación después de tratamiento previo como para expresión de TH después de co-cultivo para 9 DIV. Este procedimiento permitió el examen selectivo de los efectos de bFGF sobre los clones Nurr1 y eliminó los efectos mitogénicos de bFGF sobre células primarias, al igual que su efecto trófico indirecto sobre las neuronas primarias dopaminérgicas.

El marcado con BrdU de clones Nurr1 tratados previamente con bFGF se incrementó a las 24 horas del paso de las células en co-cultivo, en comparación con células directamente divididas en medio que contiene suero (desplazamiento hacia la derecha de clones individuales sobre el eje X, Fig. 2B). Concomitante con este incremento en la proliferación, se observaron incrementos proporcionales en el porcentaje de células TH positivas en todos los clones Nurr1 (desplazamiento hacia arriba de los clones sobre el eje Y, Fig. 2B), alcanzando hasta un 45% de TH+ (clon 42). De hecho, los análisis de regresión indican una relación linear significativa (r^{2}= 0,890 por regresión) entre la capacidad proliferativa de los clones que sobreexpresan Nurr1 en el inicio del co-cultivo y la propensión a expresar TH después de la diferenciación dentro, al igual que entre, clones individuales después de 9 DIV.

Por lo tanto, los resultados mencionados anteriormente sugieren que los clones que sobreexpresan Nurr1 deben ser preferiblemente mitóticos, cuando son puestos en contacto con células VM primarias o con uno o más factores suministrados por o derivados de células VM primarias, a saber, que una importante diferencia frente a un destino dopaminérgico en los clones Nurr1 reside en su capacidad proliferativa.

Se proporciona nuevo soporte a través de la observación de que, en el momento en el que la mayoría de células c42 que expresan TH empiezan a aparecer en el co-cultivo (6 DIV), casi la totalidad de ellas son todavía mitóticas (BrdU positivo después de impulso agudo a 6 DIV. No obstante, después de un tratamiento similar de los co-cultivos a 9 DIV, la inmensa mayoría de células TH+ son BrdU negativas, sugiriendo la retirada del ciclo celular después de inducción de expresión de TH medible.

Estudios previos que examinan la adopción de destino fenotípico durante el desarrollo de la corteza cerebral (McConnell, S.K. et al., Science 254, 282-285 (1991)) y de la médula espinal (Ericson, J. et al. Cell 87, 661-673 (1996)), han demostrado que la exposición de neuroblastos no comprometidos a factores locales restringidos en el espacio, induce fenotipos específicos dentro de estas poblaciones, pero esta inducción es contingente tras exposición continua hasta incluir la fase S terminal del neuroblasto. Un mecanismo similar puede conllevar las siguientes
observaciones.

Análisis de la señal inductora procedente de células mesencefálicas ventrales primarias

Los cultivos de mesencéfalo ventral primario contienen habitualmente una mezcla de neuronas dopaminérgicas y de otras neuronas, astrocitos, oligodendrocitos, al igual que elementos no neurales variados, tales como microgliagles, células endoteliales y fibroblastos. Para identificar la fuente de actividad promotora de TH, los inventores llevaron a cabo una separación cruda de las células primarias basada en la adherencia; la población rápidamente adherente fue enriquecida en elementos gliales y no neurales, mientras que la población no adherente, consistía principalmente en neuronas, precursores de oligodendrocitos y en unos pocos astrocitos.

El co-cultivo de estas fracciones con c42 demostró que la mayoría de la actividad inductora de TH estaba contenida dentro de la población rápidamente adherente de las células de mesencéfalo ventral E16 (Fig.3). Los inventores prepararon entonces cultivos purificados de astrocitos de Tipo 1 procedentes de mesencéfalo ventral E16 y demostraron que T1A era la fuente de suministro de la actividad inductora de TH: en ausencia de cualquier factor añadido, el número de células dopaminérgicas derivadas de la línea célular Nurrrr1-c42 se incrementaba de forma dramática. Además, esta actividad no quedaba restringida al desarrollo temprano, dado que astrocitos aislados a partir de VM de ratas recién nacidas inducían números equivalentes de células c42 TH positivas (aproximadamente el 70%)(Fig 3).

Las células Nurr1-C17.2-c42 fueron tratadas con medios acondicionados para astrocitos de Tipo 1 o con fragmentos de membrana, respectivamente. No obstante, ninguno de estos tratamientos inducía un incremento significativo en el número de células que expresan TH, sugiriendo que esta actividad inductora era altamente lábil. Los inventores co-cultivaron astrocitos con células Nurr1-C17.2-c42, pero separaron espacialmente las dos poblaciones (por aproximadamente 1 mm), a través de un inserto microporoso (una membrana porosa de 0,4 \mum). El inserto permitía el paso libre de macromoléculas pero evitaba el contacto entre las dos poblaciones. En este entorno, se indujo la expresión de TH en las células Nurr1-C17.2-c42 a un nivel equivalente al del co-cultivo directo (Fig 3). Estos resultados proporcionaron la indicación de que los astrocitos de Tipo 1 del mesencéfalo ventral secretan un factor difusible altamente volátil, que interacciona con líneas que sobreexpresan Nurr1 para inducir la expresión de TH.

Actividad inductora de T1A procedente de otras regiones del cerebro

Los inventores examinaron después si la actividad inductora quedaba restringida a los astrocitos de Tipo 1 procedentes del mesencéfalo ventral. Se aislaron T1A procedentes de diversas regiones del cerebro, las cuales contenían poblaciones de células que expresaban Nurr1 durante el desarrollo (Zetterström, R.H. et al, Mol. Brain Res. 41, 111-120 (1996)). No se observó incremento en el número de células inmunorreactivas frente a TH en c42, en comparación con las células parentales C17.2, cuando se efectuaron co-cultivos con T1A procedente de otras regiones del cerebro, incluyendo la corteza cerebral, el hipocampo o la médula espinal (Fig.3). Esto indica que a través de los astrocitos de Tipo 1 del mesencéfalo ventral se produce, de forma específica y selectiva, un factor inductor de TH putativo.

No obstante, las células c42 resultaron afectadas por astrocitos procedentes de estas regiones. Las células de esta línea desarrollaron morfologías distintas, de tipo neuronal, únicas para cada una de las regiones. No obstante, bajo las mismas condiciones, la línea parental C17.2 tendía a mostrar una mezcla uniforme de morfologías poliglonales, bipolares y tripolares. Colectivamente, estos datos sugieren que los astrocitos procedentes de distintas regiones del cerebro secretan factores únicos o combinaciones de factores únicos, que interaccionan con las células que expresan Nurr1 para producir fenotipos neuronales específicos y quizás regionalmente apropiados. La confirmación se obtiene mediante la identificación de los fenotipos neuronales que se producen en los co-cultivos. Se utilizan marcadores neuronales específicos, tales como NPY, sustancia P, Ach e Islet 1. Mediante injerto intracerebro-ventricular, en el estadio embrionario temprano para permitir de integración de células C17.2 que expresan Nurr1 por encima de los valores basales, se obtiene un apoyo adicional. Los fenotipos neuronales originados por estas células son determinados mediante la expresión de lacZ e inmunohistoquímica frente a un marcador neuronal específico.

El mecanismo de inducción dopaminérgica

Los inventores compararon la actividad de Nurr1 en células C17.2 poco tiempo después de transfección con actividad Nurr1 en clones C17.2-Nurr1 establecidos. Averiguaron que se detectaba una actividad transactivacional Nurr1 significativa a las 36 horas posteriores a la cotransfección del vector de expresión Nurr1 y un indicador NBRE-luciferasa sensible a Nurr1 en células C17.2. No se observó un incremento significativo en la actividad transactivacional Nurr1 basal después de la transfección del indicador en clones C17.2-Nurr1 proliferativos, estables (cultivados en suero) (Figura 5), o después de la transfección en clones diferenciados, obtenidos tras pasar por medio exento de suero.

Estos datos indican que Nurr1 no tiene actividad durante la diferenciación neuronal de clones C17.2-Nurr1 estables y sugiere que niveles elevados transitorios tempranos de actividad Nurr1 pueden haber dado lugar a competencia de larga duración de los clones Nurr1 para convertirse en dopaminérgicos.

Cambios en la expresión genética en clones Nurr1

Los inventores examinaron los cambios en la expresión genética en los clones Nurr1. Se examinaron los niveles de GFR\alpha1 y GFR\alpha2 mRNA en clones Nurr1 y en clones simulados, utilizando ensayos de protección RNasa (receptor \alpha1 de la familia GDNF; GDNF hace referencia a Factor Neurotrópico Derivado de línea celular Glial). Los clones C17.2 y los clones simulados examinados expresaban niveles elevados de GFR\alpha1 mRNA y niveles muy bajos del receptor relacionado GFR\alpha2. Por el contrario, la totalidad de clones Nurr1 mostraba el perfil contrario, a saber, niveles muy bajos de GRF\alpha1 y niveles muy altos de GFR\alpha2 mRNA, sugiriendo que, en las células C17.2, el Nurr1 no induce directamente el fenotipo TH+ sino que más bien actúa indirectamente, mediante la producción de sobrerregulación o infrarregulación estable de proteínas relevantes. De este modo, el Nurr1 puede dotar a las células multipotentes de la competitividad necesaria para responder ante factores específicos, incluyendo los derivados de astrocitos de mesencéfalo ventral.

Los efectos de la actividad Nurr1 sobre el patrón de la expresión genética, son investigados adicionalmente mediante el análisis de la expresión de genes importantes para la especificación de neuronas del mesencéfalo y de fenotipos ventrales (por ejemplo, genes Shh, Patch, Smo, Gli, Hes, FGF8, Ptx3, genes Pax, Engrailed 1 y 2) y genes importantes para la neurogénesis y la diferenciación (por ejemplo, Noggin, Chordin, Follistatin, Mash 1, Math 1, NeuroD, Neurogenin 1-3, Notchl-3, Delta, Serrate y Myt 1).

El fenotipo dopaminérgico

La ganancia en la expresión de TH representaba la adopción de un fenotipo dopaminérgico legítimo dentro de la línea Nurr1-C17.2-c42. A través de convenio, la capacidad de liberación de dopamina como respuesta a despolarización de membrana constituye el criterio vital para la designación de un fenotipo neuroquímico como dopaminérgico.

Co-cultivos de líneas c42 o de líneas parentales y de astrocitos VM fueron, de este modo, tratados adecuadamente con KCl 50 mM y los sobrenadantes fueron sometidos a ensayo para determinar el contenido en monoamina y se detectó su metabolito DOPAC en co-cultivos que contenían c42, con liberación incrementada detectada en co-cultivos tratados con factores que refuerzan la diferenciación dopaminérgica, por ejemplo, SR11237 y bFGF, correlacionado de este modo la liberación de dopamina con el número de células que expresan TH (Fig. 4). No se observó liberación de dopamina en la línea parental. Por tanto, las células Nurr1-C17.2-c42 que expresan la TH pueden ser consideradas verdaderamente dopaminérgicas.

La línea celular Nurr1-C17.2-c42 que expresaba la TH era de tipo dopaminérgico de mesencéfalo ventral. Las células Nurr1-C17.2-c42 en co-cultivo adquirían una inmunorreactividad para la aldehído-deshidrogenasa-2 (AHD-2; Fig. 4), un enzima expresado de forma selectiva en los precursores dopaminérgicos en desarrollo dentro del mesencéfalo ventral (MsCaffery, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7772-7776 (1994)). Las mismas también expresaban c-ret mRNA, el receptor de señalización para GDNF (Trupp, M. et al., Nature 381, 785-789 (1996); Jing, S.Q. et al., Cell 85, 1113-1124 (1996)), el cual está presente en las neuronas dopaminérgicas (Trupp, M. et al., Nature 381, 785-789 (1996)). Además, las células c42 TH positivas demostraron respuestas similares frente a factores con efectos neurotróficos conocidos sobre progenitores dopaminérgicos (Studer, L. et al. Nature Neuroscci. 1, 290-295 (1998)) y neuronas dopaminérgicas mesencefálicas ventrales primarias in vitro (Hyman, C et al., J. Nature Neurosci. 14, 335-347 (1994); Lin, H et al., Science 260, 1130-1173 (1993)) (Fig. 4). Los co-cultivos fueron tratados primero con SR11237 y bFGF para inducir un fenotipo dopaminérgico, después de lo cual los medios fueron cambiados a N2, con o sin diversos factores de crecimiento. En el 9 DIV bFGF y neurotrofina-3 (NT-3 30 ng/ml) se incrementaba destacadamente el número de células TH+ en el cultivo, en comparación con la condición control N2; Factor Neurotrófico Derivado de Factor (BDNF, 30 ng/ml), Factor Neurotrófico Ciliar (CNTF, 10 ng/ml) y Factor Neurotrófico Derivado de línea celular Glial (GDNF, 10 ng/ml), inducían neuritogénesis y/o hipertrofia en neuronas dopaminérgicas derivadas de Nurr1-c42. Por tanto, el comportamiento de células c42 que expresan TH transcurre en paralelo con el de neuronas endógenas de la sustancia negra, por lo que estas células son neuronas dopaminérgicas de tipo mesencéfalo ventral.

Estabilidad de neuronas dopaminérgicas inducidas

Los inventores valoraron la estabilidad a largo plazo de los fenotipos dopaminérgicos inducidos in vitro e in vivo, particularmente después de la eliminación de los factores inductores derivados de astrocito. Células c42 fueron co-cultivadas en insertos con astrocitos de Tipo 1 VM durante 8 días, eliminadas de los insertos y reubicadas en placas en medio N2 definido sin factores adicionales, durante 14 días. Si bien se observó alguna atrición adicional en las dos semanas subsiguientes a la eliminación del co-cultivo, un número significativo de células mostró un fenotipo dopaminérgico altamente maduro, incluyendo procedimientos largamente maduros, cuerpos celulares hipertróficos e intensos niveles de inmunorreactividad a TH.

Células c42 procedentes de co-cultivos paralelos fueron también inyectadas, por medio de cirugía, en el cuerpo estriado de ratón adulto y se dejaron madurar durante un período de 12 días, en ausencia de factores trópicos adicionales o de células de apoyo (a saber, astrocitos, oligodendrocitos, u otras neuronas). A pesar de que en estas condiciones se perdieron células, un pequeño pero significativo número de células dopaminérgicas derivadas de c42 mostró un elevado nivel de diferenciación y una integración aparente en el tejido huésped. En ninguno de los experimentos a largo plazo in vitro o in vivo se encontraron células TH+ derivadas de la línea parental C17.2. Por tanto, la observación de que algunas células c42 mantenían o incluso incrementaban la expresión de TH después de la eliminación de factores derivados de Tipo 1 muestra que, después de la inducción dopaminérgica, su fenotipo es estable. Dado que tan solo un pequeño número de células TH+ supervivientes pudo ser detectado, se requieren factores trópicos aplicados de forma exógena o células de apoyo para la supervivencia a largo plazo.

Tratamiento de enfermedad neurodegenerativa

La confirmación de la capacidad de las neuronas derivadas de c17.2 para tratar una enfermedad neurodegenerativa se obtiene utilizando un modelo in vivo de enfermedad de Parkinson. Los falsos neurotransmisores 6-hidroxidopamina (6-OHDA) o MP-TP son específicamente tomados por las neuronas y conducen a tensión oxidativa y a pérdida de neuronas dopaminérgicas y noradrenérgicas.

Las células Nurr1-c17.2 que han sido diferenciadas en neuronas dopaminérgicas in vitro, son implantadas de forma quirúrgica en la sustancia negra o en el cuerpo estriado de ratones tratados con 6-OHDA. La capacidad que tienen estas células para integrarse y diferenciarse completamente es evaluada morfológicamente a través de teñido \beta-gal, inmunohistoquímica de TH e hibridación in situ para transportadores de dopamina y receptores de dopamina.

La capacidad que tienen las células Nurr1-c17.2 no diferenciadas para diferenciarse espontáneamente in vivo hacia el fenotipo dopaminérgico es valorada mediante la aplicación de injerto intraestrial o intranigral de las citadas células en animales tratados con 6-OHDA. El fenotipo dopaminérgico es detectado tal y como se ha descrito anteriormente.

La capacidad que tienen las células Nurr1-c17,2 injertadas en el cuerpo estriado o en la sustancia negra para rescatar las asimetrías motoras inducidas por tratamiento unilateral con 6-OHDA, es confirmada por la valoración del comportamiento circular en las pruebas con apomorfina y anfetamina (Schwarting, R.K., et al. (1996) Progress in Neurobiology, 50(2-3), 275-331).

Resumen

En conclusión, los resultados presentados en el presente documento demuestran que la expresión de Nurr1 por encima de los niveles basales en células progenitoras neurales o en células madre neurales induce un destino neuronal. Además, los astrocitos de Tipo 1 del mesencéfalo ventral, pero no los procedentes de otras regiones del cerebro, liberan uno o más factores solubles, los cuales inducen el que células progenitoras neurales o células madre neurales obtenidas originariamente de una región del cerebro no dopaminérgica y que expresan niveles basales por encima de Nurr1, se desarrollen como neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo ventral. Por lo tanto, a partir de células progenitoras neurales o de células madre neurales, a través de un proceso que incluye la expresión de Nurr1 por encima de niveles basales en las células y la puesta en contacto de las mismas con uno o más factores suministrados o derivados de astrocitos de Tipo 1 del mesencéfalo ventral, pueden generarse neuronas dopaminérgicas. Además, los resultados sugieren que los astrocitos primarios pueden ser la fuente de señales requeridas para la inducción de fenotipos neuronales regionalmente apropiados en múltiples estructuras cerebrales.

Los procedimientos descritos en el presente documento, los cuales sacan partido de la capacidad multipotencial de las células progenitoras neurales o de las células madre neurales, genes de selección tales como Nurr1 y astrocitos primarios, proporcionan la producción de neuronas de un fenotipo neuroquímico deseado como fuente material para el trasplante neuronal en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. La inducción de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo puede ser utilizada en una estrategia de sustitución para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es tan solo para la conveniencia del lector. La misma no forma parte del documento de patente europea. A pesar de que se ha puesto gran empeño en la compilación de las referencias, no puede excluirse la existencia de errores o de omisiones y la EPO rechaza cualquier tipo de responsabilidad en este sentido.

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Claims (24)

1. Procedimiento para la producción de neuronas dopaminérgicas, mediante la inducción de un destino neuronal dopaminérgico en una célula progenitora neural o en una célula madre neural, que comprende:

la expresión de Nurr1 por encima de los niveles basales dentro de la célula, y

la puesta en contacto de la célula con uno o más factores obtenibles a partir de un astrocito de Tipo 1 del mesencéfalo ventral, obteniéndose de este modo neuronas dopaminérgicas.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende la puesta en contacto de la célula con FGF8.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende la transformación de una célula progenitora neural o de una célula madre neural con Nurr1.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende el co-cultivo de la célula progenitora neural o la célula madre neural con un astrocito de Tipo 1 del mesencéfalo ventral.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el astrocito de Tipo 1 es inmortalizado o es de una línea celular de astrocito.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la citada célula es mitótica, cuando la misma es puesta en contacto con los citados uno o más factores.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la citada célula es puesta adicionalmente en contacto con uno o más agentes seleccionados de entre el grupo que comprende: factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), un activador del receptor X retinoide (RXR) y 9-cis retinol.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la citada célula es puesta adicionalmente en contacto con un miembro de la familia FGF de factores de crecimiento.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la citada célula es puesta en contacto con bFGF o EGF y SR11237.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la célula progenitora neural o la célula madre neural es tratada previamente con bFGF y/o con EGF, con anterioridad a su puesta en contacto con uno o mas factores obtenibles a partir de astrocito de Tipo 1 del mesencéfalo ventral.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además la formulación de neuronas dopaminérgicas en una composición que comprende uno o más componentes adicionales.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la composición comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además el uso de neuronas dopaminérgicas en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un individuo.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el medicamento está destinado a ser implantado en el cerebro del individuo.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el individuo padece la enfermedad de Parkinson.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además:

(i)

el tratamiento de una neurona dopaminérgica con una toxina para la citada neurona dopaminérgica;

(ii)

la separación de la neurona dopaminérgica de la toxina;

(iii)

la puesta en contacto de la neurona dopaminérgica tratada con un agente de prueba o con agentes de prueba;

(iv)

la determinación de la capacidad que tiene la neurona dopaminérgica de recuperarse de la toxina;

(v)

la comparación de la citada capacidad de la neurona dopaminérgica de recuperarse de la toxina con la capacidad de una neurona dopaminérgica de recuperarse de una toxina en ausencia de contacto con el agente de prueba o con los agentes de prueba.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende adicionalmente:

(i)

el tratamiento de una neurona dopaminérgica con una toxina para la neurona dopaminérgica, en presencia de un agente de prueba o de agentes de prueba;

(ii)

la determinación de la capacidad que tiene la neurona dopaminérgica para tolerar la toxina;

(iii)

la comparación de la citada capacidad que tiene la neurona dopaminérgica para tolerar la toxina con la capacidad que tiene una neurona dopaminérgica para tolerar la toxina en ausencia de contacto con el agente o agentes de prueba.

18. Procedimiento de cribado para detectar un receptor o receptores para el factor o factores que son obtenibles a partir de astrocitos de Tipo 1 del mesencéfalo ventral y que inducen un destino dopaminérgico en células progenitoras neurales o en células madre neurales que expresan Nurr1 por encima de los niveles basales, comprendiendo el procedimiento la comparación de células progenitoras neurales o células madre neurales, con o sin la expresión de Nurr1 por encima de los niveles basales dentro de las células progenitoras neurales o las células madre neurales, para identificar el citado receptor o receptores.

19. Procedimiento de cribado para determinar un factor o factores los cuales, ya sea en solitario o en combinación, inducen un destino dopaminérgico en una célula progenitora neural o en una célula madre neural que expresa Nurr1 por encima de los valores basales, que comprende:

(a)

la puesta en contacto de moléculas astrocito de Tipo 1 con una célula progenitora neural o con una célula madre neural que expresa Nurr1 por encima de los valores basales, contacto éste que puede dar lugar a interacción entre las moléculas astrocito de Tipo 1 y la célula progenitora neural o la célula madre neural; y

(b)

la determinación de la interacción entre las moléculas astrocito de Tipo 1 y la célula progenitora o la célula madre.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, que comprende la comparación de moléculas astrocito de Tipo 1 del mesencéfalo ventral con las de células neurales que son incapaces de inducir un destino dopaminérgico en células progenitoras neurales o en células madre neurales que expresan Nurr1 por encima de los niveles basales.

21. Procedimiento de cribado para determinar un factor o factores que, ya sea en solitario o en combinación, inducen un destino dopaminérgico en una célula progenitora neural o en una célula madre neural que expresa Nurr1 por encima de niveles basales, comprendiendo el procedimiento el cultivo de una célula progenitora neural o de una célula madre neural que expresa Nurr1 por encima de los valores basales en presencia de moléculas de astricto y el análisis de la citada célula para determinar la diferenciación en un fenotipo dopaminérgico.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, que comprende la comparación de astrocitos de Tipo 1 del mesencéfalo ventral con células neurales que son incapaces de inducir un destino dopaminérgico en células progenitoras neurales o en células madre neurales que expresan Nurr1 por encima de los niveles basales.

23. Procedimiento según la reivindicación 21, que comprende un cribado de expresión diferencial.

24. Procedimiento de cribado para determinar una sustancia que modula la capacidad de atrocitos de Tipo 1 del mesencéfalo ventral o de una molécula o moléculas de los citados astrocitos, para inducir un destino dopaminérgico en células progenitoras neurales o en células madre neurales que expresan Nurr1 por encima de niveles basales, comprendiendo el procedimiento:

(i)

el co-cultivo de astrocitos de Tipo 1 con células progenitoras neurales o células madre neurales que expresan Nurr1 por encima de niveles basales, en presencia de una o más sustancias de prueba; o

(ii)

la puesta en contacto de células progenitoras neurales o de células madre neurales que expresan Nurr1 por encima de los niveles basales con una o más moléculas de astrocitos de Tipo 1, capaces de inducir un fenotipo dopaminérgico en las citadas células, teniendo lugar el citado contacto en presencia de una o más sustancias de prueba; y

(iii)

el análisis de la proporción de células progenitoras o células madre que adoptan un destino dopaminérgico;

(iv)

la comparación de la proporción de células progenitoras o de células madre que adoptan un destino dopaminérgico con el número de células progenitoras o células madre que adoptan un destino dopaminérgico en condiciones y medio de reacción comparables, en ausencia de sustancia(s) de prueba.