CN109666623B

CN109666623B - 一种三维视网膜组织的冷冻保存及复苏方法

Info

Publication number: CN109666623B
Application number: CN201811451304.4A
Authority: CN
Inventors: 葛坚; 罗子明; 冼碧琨; 李凯婧; 叶美芳
Original assignee: Zhongshan Ophthalmic Center
Current assignee: Zhongshan Ophthalmic Center
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2022-07-26
Anticipated expiration: 2038-11-30
Also published as: WO2020107911A1; CN109666623A

Abstract

本发明公开了一种三维视网膜组织的冷冻保存及复苏方法。该方法的冻存步骤主要为：选取适合冻存的三维视网膜组织，悬浮于RDM培养液，然后转移至冻存管，按等体积比加入2×冷冻保存液，待三维视网膜组织沉至管底后吸走部分的上清液，密封冻存管，置于‑80℃中过夜降温，再移入液氮中保存；最后将保存的视网膜组织解冻复苏即可置于培养箱进行悬浮培养。本发明提供的方法可重复性好，成功率高，复苏成活率可高达80～90％，使得三维视网膜组织的发育进程可控、保存运输可靠，并保证复苏的组织结构完整、活性良好。

Description

一种三维视网膜组织的冷冻保存及复苏方法

技术领域

本发明涉及干细胞诱导分化及组织冷冻保存技术领域，具体涉及一种由人多能干细胞诱导分化获得的三维视网膜组织的冷冻保存及复苏方法。

背景技术

目前，干细胞再生技术的突破为难治性疾病的发病机制、新药开发和细胞治疗等研究带来了前所未有的机遇。其中，体外诱导人多能干细胞(hPSC)向具有三维结构的视网膜组织分化的关键技术先后取得突破，成为干细胞体外再生器官的领跑者，相关的临床实验也正在紧锣密鼓的进行。

再生所得的视网膜组织是具有紧密的、三维立体结构的组织器官，并且从发育学上来说是神经系统的一部分。组织器官冷冻保存是目前医学界的众多难题之一，更何况神经细胞对温度的敏感性更高。因此，视网膜组织冷冻保存亦是视觉干细胞再生领域的一大难题。此外，组织保存、运输是制约再生技术走向临床应用的关键环节。实际应用中，无法做到每一家医院都配备GMP实验室，因此制备完成的移植供体组织必须有妥善的保存以及运输方法。视网膜组织的诱导分化需要较长的周期，尤其是光感受器细胞的发育，更需要长达数月的培养。因此，临床应用中，“现用现分化”的方法不切实际。可靠的冷冻保存的技术可以供给GMP实验室提前储备所需的移植供体组织，方便临床移植手术。

成功的冷冻保存不仅要求组织内细胞存活，对于视网膜组织，更重要的是保持其固有的视网膜层状结构以及神经轴突的完整性。现有文献报道的两种冻存方法分别是Nakano,T.等人提出的玻璃化冻存法(Nakano T,Ando S,Takata N,Kawada M,Muguruma K,Sekiguchi K,et al.Self-formation of optic cups and storable stratified neuralretina from human ESCs.Cell stem cell.2012；10(6):771-85.)以及Reichman,S.等人提出的程序降温冻存法(Reichman S,Slembrouck A,Gagliardi G,Chaffiol A,Terray A,Nanteau C,et al.Generation of Storable Retinal Organoids and RetinalPigmented Epithelium from Adherent Human iPS Cells in Xeno-Free and Feeder-Free Conditions.Stem cells.2017；35(5):1176-88.)。但这两种冻存方法都存在重复性较差、成功率不高、复苏后恢复时间长、复苏后视网膜组织结构紊乱以及神经轴突断裂等问题。

目前三维视网膜组织仍未有令人满意的冷冻保存及复苏方法，既有的报道均存在无法成功复苏或复苏后组织结构功能恢复不佳的问题，严重制约了三维视网膜组织在药物筛选、基因操作及细胞替代治疗方面的应用。妥善保存或实现人为控制视网膜组织发育阶段是实现干细胞诱导分化下游应用的必经途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种可靠的三维视网膜组织的冷冻保存及复苏方法，使得三维视网膜组织的发育进程可控、保存运输可靠，并保证复苏的组织结构完整、活性良好。

本发明通过以下技术方案来实现：

本发明的三维视网膜组织的冷冻保存方法，包括以下步骤：

选取三维视网膜组织，将其悬浮于RDM培养液中，得到三维视网膜组织悬液，然后将三维视网膜组织悬液转移至冻存管中，缓慢加入冷冻保存液并振荡混匀，冷冻保存；

所述的RDM培养液为DMEM混合培养基中添加有B27、NEAA和Antibiotic-Antimycotic的溶液；

所述的冷冻保存液含有DMSO、蔗糖、FBS和Blebbistatin。

优选，所述的RDM培养液为DMEM混合培养基中添加有2％(v/v)B27、1％(v/v)NEAA和1％(v/v)Antibiotic-Antimycotic的溶液，所述的DMEM混合培养基为DMEM/F12与DMEM按体积比3:2组成；所述的冷冻保存液含3M DMSO、0.3M蔗糖、20％(v/v)FBS和20μMBlebbistatin，溶剂为水。

优选，所述的三维视网膜组织是结构清晰、卵圆形、边界清楚、透光性好、神经视网膜层厚度较大的三维视网膜组织。

优选，所述的加入冷冻保存液，其加入体积量是与悬液相同的体积。

优选，选取三维视网膜组织，将其悬浮于RDM培养液中，得到三维视网膜组织悬液，每500微升悬液中含有5～10个三维视网膜组织，然后将悬液转移至冻存管，在冰上平衡处理后，加入与悬液等体积的冷冻保存液并振荡，混匀，待三维视网膜组织沉至管底后吸走部分上清液，再放入梯度降温盒中于-80℃降温，然后再将冻存管移入液氮中保存。

本发明还提供一种冷冻保存的三维视网膜组织的复苏方法，该复苏方法是将上述的冷冻保存的三维视网膜组织取出，缓慢置换到复苏培养液中复苏；

所述的复苏培养液为DMEM混合培养基中添加有B27、NEAA、Antibiotic-Antimycotic和FBS的溶液。

优选，将上述冷冻保存的三维视网膜组织取出，加入到复苏培养液中于37℃快速化冻并振荡混匀液体进行复苏，得到三维视网膜组织悬液，然后再取出部分三维视网膜组织悬液再加入到复苏培养液中于37℃快速化冻并振荡混匀液体进行复苏，如此逐级复苏。

优选，所述的复苏培养液为DMEM混合培养基中添加有2％(v/v)B27、1％(v/v)NEAA、1％(v/v)Antibiotic-Antimycotic、20％(v/v)FBS的溶液，所述的DMEM混合培养基为DMEM/F12与DMEM按体积比3:2组成，所述的DMEM/F12培养基为DMEM培养基和F12培养基按1:1体积比混合。

本发明还提供了一种三维视网膜组织的冷冻保存溶液，所述的冷冻保存溶液是在RDM培养液中加入3M DMSO、0.3M蔗糖、20％(v/v)FBS和20μM Blebbistatin，混合制得。

上述的单位％(v/v)表示体积分数。

本发明所用到的三维视网膜组织可由Zhong XF等人公开的研究成果(Zhong X,Gutierrez C,Xue T,Hampton C,Vergara MN,Cao LH,et al.Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from humaniPSCs.Nature communications.2014；5:4047.)中诱导获得。冻存前，应选取结构清晰、卵圆形、边界清楚、透光性好、神经视网膜层厚度较大的三维视网膜组织作为适合冻存的对象。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

(1)本发明为三维视网膜组织的保存、复苏、再应用提供了可能。目前，三维视网膜组织在视网膜发育研究、药物筛选、疾病模型构建及细胞替代治疗中均有广泛的运用前景，但无法冷冻保存制约其临床应用。本发明解决了该问题，使分化获得的三维视网膜组织可以冷冻保存，在需要使用时再进行复苏使用，同时亦可实现不同GMP实验室之间以及GMP实验室与临床手术室之间的安全转运。

(2)三维视网膜组织实现有效保存后，使得实验室内生产病人特异的临床级别视网膜组织，供给临床治疗变为可能。这将可能使数千万的视网膜退行疾病患者收益(视网膜退行疾病指视网膜细胞变性死亡，功能丧失所致的多种疾病的总称，包括视网膜色素变性，老年黄斑变性，晚期青光眼，视神经病变等)。

(3)本发明方案保存的视网膜组织大大减轻了目前“现用现分化”造成的材料、人力及时间浪费。

(4)本发明方案所述的冻存方法可重复性好，成功率高，若挑选结构完善的三维视网膜组织冻存，其复苏成活率可高达80％～90％。

(5)本发明方案中视网膜组织复苏当时即可恢复清晰的组织结构(以往方案中组织需要至少1周时间方能恢复清晰结构)，同时神经细胞及其轴突的结构完整清晰。

附图说明

图1为冻存前的三维视网膜组织，其中，黑色圈内的部分为适合冻存的组织。

图2为完成复苏操作后当时的三维视网膜组织。

图3为复苏后第一天的三维视网膜组织。

图4为复苏后第十天的三维视网膜组织。

图5为复苏后5-7周的三维视网膜组织的切片染色，本时期发育的各视网膜细胞类型具备。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1三维视网膜组织的冻存

(1)细胞：BC1-GFP(为血液来源的诱导多能干细胞)诱导分化获得的三维视网膜组织(分化第6周)，具体制备方法可参考Zhong X,Gutierrez C,Xue T,Hampton C,VergaraMN,Cao LH,et al.Generation of three-dimensional retinal tissue withfunctional photoreceptors from human iPSCs.Nature communications.2014；5:4047.

(2)试剂及耗材：

①RDM培养基：DMEM/F12(C11330500BT,Gibco,4℃),DMEM(Gibco,C11995500BT,4℃)，B27(12587010,Gibco,-20℃)，NEAA(11140-050,Gibco,4℃)，Antibiotic-antimycotic(15240,Gibco,-20℃)；

②DMSO：D4540,Sigma-Aldrich,室温；

③蔗糖：S0389,Sigma-Aldrich,室温；

④Blebbitatin：B0560,Sigma-Aldrich,-20℃；

⑤FBS(小牛血清)：10099-141，Gibco，-20℃；

⑥小皿：430165，Corning；

⑦冻存管：363401PK,Thermo Fisher。

(3)仪器：

⑧Mr.Frosty^TM梯度降温盒：Thermo Fisher,5100-0001；

⑨CO₂培养箱：SANYO，MCO-20A1C；

⑩倒置显微镜：Thermo Fisher,AMEX1000；

-80℃冰箱：Thermo Fisher Scientific,TSE400V；

液氮罐：TAYLOR-WHARTON,LS750。

(4)溶液组成及配制：

RDM培养液的组成：DMEM混合培养基中添加有2％(v/v)B27、1％(v/v)NEAA和1％(v/v)Antibiotic-Antimycotic，DMEM混合培养基为DMEM/F12:DMEM＝3:2(v/v)；配制为：将DMEM/F12和DMEM按体积比3:2混合制得DMEM混合培养基，然后往DMEM混合培养基中加入B27、NEAA、Antibiotic-Antimycotic，混匀，应用滤膜过滤除菌，保存于4℃或-20℃的冰箱中。

2×冷冻保存液的组成：3M二甲基砜、0.3M蔗糖、20％(v/v)小牛血清和20μMBlebbistatin，溶剂水，配制方法为：将二甲基砜、蔗糖、小牛血清、Blebbistatin和水混匀过滤除菌，-20℃保存。

(5)冻存步骤：

选取适合冻存的三维视网膜组织(其形态见图1所示)，悬浮于RDM培养液中，得到三维视网膜组织悬液；将500μL含5-10个三维视网膜组织悬液转移至冻存管中，放置于冰盒上平衡5min，缓慢逐滴滴加2×冷冻保存液(分别在1min内均匀滴加200μL、200μL、100μL，一边滴加一边轻轻振荡冻存管)，将冻存管放置于冰盒上平衡5min；随后，吹打一次管内液体使其充分混匀，待三维视网膜组织沉至管底后吸走500μL的上清液，密封冻存管，将冻存管放入Mr.Frosty^TM梯度降温盒中于-80℃冰箱中过夜降温，第二天将冻存管移入液氮中保存。

实施例2三维视网膜组织的复苏

(1)复苏培养液的组成及配制：

复苏培养液的组成：DMEM混合培养基中添加有2％(v/v)B27、1％(v/v)NEAA、1％(v/v)Antibiotic-Antimycotic和20％(v/v)小牛血清，DMEM混合培养基为DMEM/F12:DMEM＝3:2(v/v)；配制为：将DMEM/F12和DMEM按体积比3:2混合制得DMEM混合培养基，然后往DMEM混合培养基中加入B27、NEAA、Antibiotic-Antimycotic、小牛血清，混匀，应用滤膜过滤除菌，保存于4℃或-20℃的冰箱中，其中在4℃保存1个月，-20℃保存6个月，使用前37℃水浴复温。

(2)复苏步骤：

从液氮中取出实施例1保存的冻存管(含三维视网膜组织)，迅速加入1.3mL 37℃的复苏培养液，置于37℃水浴中快速化冻并振荡混匀液体；小心吸出700μL三维视网膜组织悬液至小皿中，在2min内逐滴往小皿中缓慢滴加1mL 37℃的复苏培养液，一边滴加一边轻轻振荡混匀，室温下平衡5min；随后吸出1mL液体，再次缓慢滴加1mL 37℃的复苏培养液，一边滴加一边轻轻振荡混匀，室温下平衡5min，如此共滴加4mL 37℃的复苏培养液；随后将三维视网膜组织小心吸至盛有单纯的复苏培养液的1％琼脂糖包被的小皿中，放入培养箱进行悬浮培养。

其中，完成复苏操作后当时的三维视网膜组织形态见图2所示，复苏后第1天的三维视网膜组织形态见图3所示，复苏后第10天的三维视网膜组织形态见图4所示。

同时，对复苏后5-7周的三维视网膜组织进行切片染色，可见该时期发育的各视网膜细胞类型具备，具体见图5所示。经统计，按照本发明的方法进行复苏，其复苏成活率可高达80％-90％。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种三维视网膜组织的冷冻保存方法，其特征在于，包括以下步骤：

选取三维视网膜组织，将其悬浮于RDM培养液中，得到三维视网膜组织悬液，每500微升悬液中含有5~10个三维视网膜组织，然后将悬液转移至冻存管，在冰上平衡处理后，加入与悬液等体积的冷冻保存液并振荡，混匀，待三维视网膜组织沉至管底后吸走部分上清液，再放入梯度降温盒中于-80 ℃降温，然后再将冻存管移入液氮中保存；

所述的RDM培养液为DMEM混合培养基中添加有2% v/v B27、1% v/v NEAA和1% v/vAntibiotic-Antimycotic 的溶液，所述的DMEM混合培养基为DMEM/F12与DMEM 按体积比3:2组成；

所述的冷冻保存液含3 M DMSO、0.3 M蔗糖、20% v/v FBS和20 μM Blebbistatin，溶剂为水。

2.根据权利要求1所述的冷冻保存方法，其特征在于，所述的三维视网膜组织是结构清晰、卵圆形、边界清楚、透光性好、神经视网膜层厚度较大的三维视网膜组织。

3. 一种冷冻保存的三维视网膜组织的复苏方法，其特征在于，将权利要求1冷冻保存的三维视网膜组织取出，加入到复苏培养液中于37 ℃快速化冻并振荡混匀液体进行复苏，得到三维视网膜组织悬液，然后再取出部分三维视网膜组织悬液再加入到复苏培养液中于37 ℃快速化冻并振荡混匀液体进行复苏，如此逐级复苏；

所述的复苏培养液为DMEM混合培养基中添加有2% v/v B27、1% v/v NEAA、1% v/vAntibiotic-Antimycotic、20% v/v FBS的溶液，所述的DMEM混合培养基为DMEM/F12与DMEM按体积比3:2组成。