JP2016146831A - 哺乳動物由来グリア制限前駆細胞を増大、同定、特徴付けおよび能力増強するための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】A2B5陽性細胞のない哺乳動物のグリア制限前駆細胞(GRP)を生産する方法であって、前記方法が(a)A2B5陽性細胞を産生する能力がある哺乳動物組織源からA2B5抗体反応性細胞を単離すること;(b)該A2B5陽性細胞を基質上で6日を超えるin vitro培養日数(DIV)培養すること;及び(c)該培養細胞を回収することを含む、前記方法。アストロサイト及び/又はオリゴデンドロサイトの産生のための使用方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、哺乳動物由来のグリア制限前駆細胞(GRP)集団であって、可能性のある意図しない細胞表現型が減少した、および/または該集団の細胞における標準偏差が減少した集団の生産方法ならびにこれら細胞の使用方法を提供する。また、本発明では、GRPを特徴付けるための抗体パネルおよびGRP細胞の特徴付けにおけるその使用方法が提供される。
グリア制限前駆細胞(GRP)は、C−シリーズガングリオシドのサブセットを認識する、A2B5抗体とそれらの反応性によって定義される(Dietrich et al., Glia 2002 40:65-77; Rao and Mayer-Proschel, Dev. Biol. 1997 188:48-63; Saito et al., J. Neurochem. 2001 78:64-74; Windrem et al., Nat. Med. 2004 10:93-97)。GRPの他の抗原性の特徴は、アストロサイトマーカーのグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)の中程度の発現およびE−CAM(ポリシアル化N−CAMまたはPSA−NCAM)およびβ−IIIチューブリン(TuJ1)の神経細胞マーカーの低い発現を包含する(Dietrich et al., Glia 2002 40:65-77; Rao and Mayer-Proschel, Dev. Biol. 1997 188:48-63)。
脳および脊髄におけるニューロンの非常に重要なカテゴリーには、軸索がミエリンで覆われているニューロンが含まれる。このミエリン鞘が損傷した場合、その生きた突起がニューロンの軸索周辺の絶縁するミエリン層を構成するオリゴデンドロサイトが破壊される。脱髄した(demyelinated)ニューロンは、適切にシグナルを伝導することができず、最終的には死滅する。
本発明の別の側面は、GRP細胞集団における意図しない細胞の表現型を減少させる、および/またはGRP細胞集団の細胞における標準偏差を減少させる方法に関する。
本発明の別の側面は、(A2B5抗体を用いる)C−シリーズガングリオシドに対する抗体、GFAPに対する抗体、ならびにOlig1、Olig2、O1、PDGFR−α、ネスチン、NG2、PSA−NCAM、TuJ1、Ki−67およびNeuNからなる群から選択される1または2以上の抗体を含む、GRP細胞の特徴付けのための抗体パネル、およびこの抗体パネルで細胞をGRP細胞として特徴付ける方法に関する。
本発明の別の側面は、A2B5陽性細胞のない哺乳動物神経細胞の生産方法に関する。
本発明の別の側面は、これら生産された哺乳動物GRP細胞の、アストロサイトおよび/またはオリゴデンドロサイトの産生のための使用方法に関する。
本発明の別の側面は、これら生産された哺乳動物GRP細胞の、グリア性瘢痕の形成を減少させるための、これら生産される哺乳動物GRP細胞の使用方法に関する。
さらに本発明の別の側面は、これら生産された哺乳動物GRP細胞の、哺乳動物における神経変性疾患もしくは障害または神経系もしくはその一部への損傷もしくは傷害の処置における使用方法に関する。
本発明は、哺乳動物グリア前駆細胞(GRP)の生産方法を提供する。GRPは、文献においてはグリア制限前駆細胞またはグリア前駆細胞とも呼ばれる。
本発明の哺乳動物GRP細胞は、A2B5陽性細胞を産生する能力があるあらゆる哺乳動物組織源に由来し得る。かかる哺乳動物組織源の例は、限定することなく、胚性/胎性、および(生後すべての年齢を包含する)成体の給源を含み、いずれも、限定することなく、神経組織、脳組織、脊髄組織、視神経組織、嗅上皮組織、内分泌組織、皮膚組織、筋肉組織、脂肪組織、結合組織、胎盤組織、臍帯血、血液、骨髄組織、骨組織、胚性幹細胞、および誘導多能性細胞(induced pluripotent cells)を包含する組織由来である。A2B5陽性細胞の産生能によって、A2B5陽性細胞に分化した哺乳動物組織源、A2B5陽性細胞に脱分化した哺乳動物組織源、および脱分化した後にA2B5陽性細胞に分化した哺乳動物組織源を包含することを意味する。
位相差顕微鏡観察は、最初の継代(6DIV)の前、2回目の継代(20DIV、回収)の終わり、および100日までのin vitro培養日数で、安定した形態学的表現型を明らかにした。この双極性から多極性の形態は、3つの独立した細胞調製物において調製物間で一定である。
細胞生存率は、トリパンブルー色素排除試験法(trypan blue exclusion method)によって評価された。懸濁液対ポリ−L−オルニチン処理表面の生存率の比較を図3Bに示し、各継代および最終的な回収における生存率を図3Aに示す。すべての場合において、平均生存率の値は90%を超える。
したがって、本発明の別の側面は、GRP細胞集団の凍結および解凍を含む、GRP細胞集団における可能性のある意図しない細胞表現型を減少させる方法に関する。
しかしながら、本開示を読んだ当業者が理解するように、凍結前のGRP細胞を生産する代替方法が使用できる。例えば、一態様において、A2B5陽性細胞が6DIVまたはそれ未満で培養される方法によって、GRP細胞集団が生産される。培養細胞は、その後回収および凍結される。解凍後、細胞数を増加させるために、細胞は3日または4日以上の追加のin vitro培養日数(DIV)培養することができる。
Claims (48)
- 哺乳動物のグリア制限前駆細胞(GRP)を生産する方法であって、該方法が
(a)A2B5陽性細胞を産生する能力がある哺乳動物組織源からA2B5抗体反応性細胞を単離すること;
(b)該A2B5陽性細胞を基質上で6日を超えるin vitro培養日数(DIV)培養すること;および
(c)該培養細胞を回収すること
を含む、前記方法。 - A2B5抗体反応性細胞が、磁気活性化細胞分離を用いて単離される、請求項1に記載の方法。
- 細胞が、A2B5抗体反応性細胞を単離するために、磁気ビーズを含むカラムに2回または3回以上通される、請求項2に記載の方法。
- A2B5抗体反応性細胞が、蛍光活性化細胞分離またはイムノパニングを用いて単離される、請求項1に記載の方法。
- 細胞が、蛍光活性化細胞分離またはイムノパニングディッシュに2回または3回以上通される、請求項4に記載の方法。
- 細胞が10〜20DIV培養される、請求項1に記載の方法。
- 細胞が15〜20DIV培養される、請求項1に記載の方法。
- 細胞が少なくとも20DIV培養される、請求項1に記載の方法。
- 細胞が100DIVまたはそれを超えて培養される、請求項1に記載の方法。
- 哺乳動物のグリア制限前駆細胞(GRP)を生産する方法であって、該方法が
(a)哺乳動物の神経組織を細胞懸濁液に解離すること;
(b)A2B5抗体反応性細胞を単離すること;
(c)該A2B5陽性細胞を基質上で6日を超えるin vitro培養日数(DIV)培養すること;および
(c)該培養細胞を回収すること
を含む、前記方法。 - 哺乳動物の神経組織が、神経管閉鎖後の哺乳動物から得られる、請求項10に記載の方法。
- 哺乳動物の神経組織が、胎児死体の前脳組織、胎児死体の脊髄組織、哺乳動物の脳生検組織または脊髄生検組織である、請求項10に記載の方法。
- 哺乳動物がヒトであり、神経組織が妊娠約14〜24週の胎児死体の前脳組織である、請求項10に記載の方法。
- 神経組織を解離することが酵素的に行われる、請求項10に記載の方法。
- 神経組織を解離することが機械的に行われる、請求項10に記載の方法。
- 神経組織を解離することが酵素的および機械的に行われる、請求項10に記載の方法。
- A2B5抗体反応性細胞が、磁気活性化細胞分離を用いて単離される、請求項10に記載の方法。
- 細胞が、A2B5抗体反応性細胞を単離するために、磁気ビーズを含むカラムに2回または3回以上通される、請求項17に記載の方法。
- A2B5抗体反応性細胞が、蛍光活性化細胞分離またはイムノパニングを用いて単離される、請求項10に記載の方法。
- 細胞が、蛍光活性化細胞分離またはイムノパニングディッシュに2回または3回以上通される、請求項19に記載の方法。
- 細胞が10〜20DIV培養される、請求項10に記載の方法。
- 細胞が15〜20DIV培養される、請求項10に記載の方法。
- 細胞が少なくとも20DIV培養される、請求項10に記載の方法。
- 細胞が100DIVまたはそれを超えて培養される、請求項10に記載の方法。
- GRP細胞集団における可能性のある意図しない細胞表現型を減少させる、および/またはGRP細胞集団の細胞における標準偏差を減少させる方法であって、該方法が、
(a)A2B5陽性細胞を産生する能力がある哺乳動物組織源からA2B5抗体反応性細胞を単離すること;および
(b)該A2B5陽性細胞を基質上で6日を超えるin vitro培養日数(DIV)培養すること
を含む、前記方法。 - 回収した細胞を凍結および解凍することをさらに含む、請求項25に記載の方法。
- GRP細胞集団における可能性のある意図しない細胞表現型を減少させる、および/またはGRP細胞集団の細胞における標準偏差を減少させる方法であって、該方法が
(a)哺乳動物の神経組織を細胞懸濁液に解離すること;
(b)A2B5抗体反応性細胞を単離すること;
(c)該A2B5陽性細胞を基質上で6日を超えるin vitro培養日数(DIV)培養すること;および
(c)該培養細胞を回収すること
を含む、前記方法。 - 回収した細胞を凍結および解凍することをさらに含む、請求項25に記載の方法。
- GRP細胞集団における可能性のある意図しない細胞表現型を減少させる方法であって、GRP細胞集団を凍結および解凍することを含む、前記方法。
- GRP細胞集団が、凍結前に6DIVまたはそれ未満培養される、請求項29に記載の方法。
- 解凍したGRP細胞集団を、3日または4日以上の追加のin vitro培養日数(DIV)培養することをさらに含む、請求項29に記載の方法。
- 解凍したGRP細胞集団を、3日または4日以上の追加のin vitro培養日数(DIV)培養することをさらに含む、請求項30に記載の方法。
- A2B5陽性細胞が欠損した哺乳動物の神経細胞を生産する方法であって、該方法が
(a)A2B5陽性細胞を産生する能力がある哺乳動物組織源からA2B5抗体反応性細胞を単離すること;
(b)A2B5抗体反応性細胞を除去した後に残る細胞を回収すること、
を含む、前記方法。 - 細胞が、基質上で1日または2日以上のin vitro培養日数(DIV)培養される、請求項33に記載の方法。
- 細胞が、細胞集団の凍結および解凍によって、一部の細胞型をさらに欠損させられる、請求項33に記載の方法。
- A2B5抗体反応性細胞が、磁気活性化細胞分離を用いて単離される、請求項33に記載の方法。
- 細胞が、A2B5抗体反応性細胞を単離するために、磁気ビーズを含むカラムに2回または3回以上通される、請求項36に記載の方法。
- A2B5抗体反応性細胞が、蛍光活性化細胞分離またはイムノパニングを用いて単離される、請求項33に記載の方法。
- 細胞が、蛍光活性化細胞分離またはイムノパニングディッシュに2回または3回以上通される、請求項38に記載の方法。
- A2B5に対する抗体、GFAPに対する抗体、ならびにOlig1、Olig2、O1、PDGFR−α、ネスチン、NG2、PSA−NCAM、TuJ1、Ki−67およびNeuNからなる群から選択される1または2以上の抗体を含む、GRP細胞を特徴付けるための抗体パネル
- 請求項40に記載の抗体パネルで細胞集団を免疫表現型分類することを含む、細胞をGRP細胞として同定または特徴付ける方法であって、大部分の細胞が、A2B5と、GFAP、ネスチン、NG2、PDGFR−α、Olig1、Olig2およびO1の1または2以上とに陽性であり、大部分の細胞が、PSA−NCAM、TUJ1、PECAM、CD68およびNeuNの1または2以上に陰性である、前記方法。
- アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞および/またはオリゴデンドロサイトへの分化を促進する条件下で、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法に従って生産されたGRP細胞を培養することを含む、アストロサイト前駆細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞および/またはオリゴデンドロサイトを産生する方法。
- GRP細胞が、アストロサイト前駆細胞および/またはアストロサイトへの分化を促進する条件下で培養される、請求項42に記載の方法。
- GRP細胞が、オリゴデンドロサイト前駆細胞および/またはオリゴデンドロサイトへの分化を促進する条件下で培養される、請求項42に記載の方法。
- GRP細胞が、アストロサイトおよび/またはアストロサイト前駆細胞ならびにオリゴデンドロサイト前駆細胞および/またはオリゴデンドロサイトへの分化を促進する条件下で培養される、請求項42に記載の方法。
- 哺乳動物においてアストロサイトおよびオリゴデンドロサイトを産生する方法であって、該方法が、該哺乳動物に請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法に従って生産された哺乳動物GRP細胞を投与することを含む、前記方法。
- ニューロンの脱髄に関連する疾患、障害、傷害または損傷を患う哺乳動物におけるニューロンの再ミエリン化を増加する方法であって、該方法が、該哺乳動物に請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法に従って生産された哺乳動物GRP細胞を投与することを含む、前記方法。
- 哺乳動物における神経変性疾患もしくは障害または神経系もしくはその一部への傷害もしくは損傷を処置する方法であって、該方法が、該哺乳動物に請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法に従って生産された哺乳動物GRP細胞を投与することを含む、前記方法。
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