ES2649396T3

ES2649396T3 - Métodos y composiciones para expandir, identificar, caracterizar y mejorar la potencia de células progenitoras restringidas gliales derivadas de mamíferos

Info

Publication number: ES2649396T3
Application number: ES10830580.6T
Authority: ES
Inventors: Robert Sandrock; James T. Campanelli; Deborah A. Eppstein
Original assignee: Q Therapeutics Inc
Current assignee: Q Therapeutics Inc
Priority date: 2009-11-12
Filing date: 2010-11-09
Publication date: 2018-01-11
Anticipated expiration: 2030-11-09
Also published as: US10351823B2; JP2013510570A; NO2499238T3; EP3269803A3; JP6346629B2; CA2780541A1; HK1174953A1; JP5952737B2; EP2499238B1; EP3269803A2; WO2011059952A1; PL2499238T3; JP2016146831A; DK2499238T3; AU2010319680A1; AU2010319680B2; US20190032010A1; CN102686721B; EP2499238A1; EP2499238A4

Abstract

Un método para fabricar células progenitoras restringidas gliales (GRP) de mamíferos, comprendiendo dicho método: (a) la clasificación in vitro de células reactivas con A2B5 a partir de una fuente de tejido de mamífero capaz de generar células positivas de A2B5; (b) el cultivo de las células positivas de A2B5 durante al menos 10 días in vitro (DIV) sobre un sustrato; y (c) la recolección de las células cultivadas.

Description

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DESCRIPCION

Metodos y composiciones para expandir, identificar, caracterizar y mejorar la potencia de celulas progenitoras restringidas gliales derivadas de mairnferos

Esta patente reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de EE.UU. de n° de serie 61/326.799, presentada el 22 de abril de 2010, y de la solicitud provisional de EE.UU. de n° de serie 61/260.441, presentada el 12 de noviembre de 2009.

Campo de la invencion

La presente invencion proporciona metodos de fabricacion de una poblacion de celulas progenitoras restringidas gliales (GRP) derivadas de mai^eras con fenotipos celulares potencialmente no previstos disminuidos y/o una desviacion estandar disminuida de las celulas de la poblacion, asf como metodos para el uso de estas celulas. Se proporciona tambien en la presente invencion un panel de anticuerpos para caracterizar GRP y un metodo para su uso en la caracterizacion de celulas GRP.

Antecedentes de la invencion

Las celulas progenitoras restringidas gliales (GRP) se definen por su reactividad con el anticuerpo A2B5, que reconoce un subconjunto de gangliosidos de serie c (Dietrich et al., Glia 2002 40: 65-77; Rao y Mayer-Proschel, Dev. Biol. 1997 188: 48-63; Saito et al., J. Neurochem. 2001 78: 64-74; Windrem et al., Nat. Med. 2004 10:93-97). Otras caractensticas antigenicas de las GRP incluyen una expresion moderada del marcador astrodtico protema acida fibrilar glial (GFAP) y una baja expresion de los marcadores neuronales E-CAM (N-CAM polisialado o PSA-NCAM) y tubulina p-lll (TuJ1) Dietrich et al., Glia 2002 40: 65-77; Rao y Mayer-Proschel, Dev. Biol. 1997 188:48-63).

En el momento en que se afslan las GRP, se han diferenciado ya endogenamente mas alla de citoblastos neurales hasta celulas comprometidas de linaje restringido. No se ha observado que las GRP induzcan o produzcan teratomas.

Una categona muy importante de neuronas en el cerebro y la medula espinal comprende aquellas cuyos axones estan envainados en mielina. Cuando se dana esta vaina de mielina, se destruyen los oligodendrocitos, cuyos procesos vitales constituyen la capa de mielina aislante alrededor de los ejes neuronales. Las neuronas desmielinizadas no pueden conducir apropiadamente senales y eventualmente moriran.

Cuando el dano es incompleto, se activan los mecanismos de reparacion endogena dando como resultado la remielinizacion y la vuelta parcial o total de la funcion (Lassmann et al., Mult. Scler. 1997 3: 133-136; Prineas y Connell, Ann. Neurol. 1979 5: 22-31). Esto demuestra el punto cntico de que la remielinizacion puede conducir de hecho a una restauracion de la funcion. Sin embargo, la mayona de pacientes que experimentan desmielinizacion debido a diversas enfermedades o traumatismos no experimentan suficiente remielinizacion endogena (Prineas et al., Ann. Neurol. 1993 33: 137-151), y a pesar de muchas necesidades y esfuerzos, se han hecho pocos progresos en el desarrollo de productos que puedan ayudar a restaurar la funcion perdida. Esto puede atribuirse parcialmente a las multiples senales e intrincadas interacciones intercelulares que deben ocurrir para efectuar la regeneracion de los oligodendrocitos productores de mielina danados in vivo. Es significativo que se haya demostrado que la terapia celular resultante en remielinizacion es beneficiosa en modelos animales de desmielinizacion.

Totoiu et al. (Exp. Neurol. 2004 187: 254-265) resenaron beneficios de implantes locales de GRP de murido en el tratamiento de lesiones de medula espinal en un modelo de EM de murido inducida vmca. Las GRP migraban y se diferenciaban en oligodendrocitos, dando como resultado una remielinizacion que pareda estar asociada con la preservacion axonal. Observaron tambien una locomocion mejorada. Estudios posteriores (Hardison et al. Exp. Neurol. 2006 197: 420-429) demostraron que las GRP de murido eran capaces de sobrevivir y remielinizarse en presencia tanto de linfocitos T inflamatorios como macrofagos.

El raton shiverer, que exhibe defectos en la produccion de mielina normal debido a una mutacion en el gen que codifica la protema basica mielina, es un modelo para estudiar el efecto de trasplantes de celulas exogenas sobre la produccion de mielina. La demostracion de la produccion de mielina por trasplantes celulares en shiverer es relevante para muchas enfermedades desmielinizantes, incluyendo MT y EM, asf como aquellas de desmielinizacion. Se ha mostrado que las GRP humanas son capaces de una mielinizacion extendida y de alta eficacia del cerebro de raton shiverer despues de xenoinjerto perinatal (Windrem et al., Nat. Med. 2004 10: 93-97). Se demostro la diferenciacion en tipos celulares apropiados regionalmente (astrocitos y oligodendrocitos) sin evidencia de tumores. Estos estudios se extendieron para mostrar la remielinizacion tanto de cerebro como de medula espinal, que esta acompanada de un rescate fenotfpico sustancial en un subconjunto de los animales implantados (Windrem et al., Cell Stem Cell 2008 2: 553-565).

Compendio de la invencion

Un aspecto de la presente invencion se refiere a metodos para fabricar celulas progenitoras restringidas gliales (GRP) de marnfferos, como se declara en las reivindicaciones adjuntas a la presente.

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Otro aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo para disminuir los fenotipos celulares no previstos en una poblacion de celulas GRP y/o disminuir las desviaciones estandares en las celulas de la poblacion de celulas GRP, como se declara en las reivindicaciones adjuntas a la presente.

La presente solicitud divulga un panel de anticuerpos para caracterizar celulas GRP que comprenden anticuerpos de gangliosidos de serie c (usando anticuerpo A2B5), GFAP y uno o mas anticuerpos seleccionados del grupo consistente en Oligl, Olig2, O1, PDGFR-a, nestina, NG2, PSA-NCAM, TuJ1, Ki-67 y NeuN, y metodos para caracterizar celulas como celulas GRP con este panel de anticuerpos.

La presente solicitud divulga tambien perfiles de expresion genica utiles en la caracterizacion de celulas GRP.

La presente invencion divulga tambien un metodo para fabricar celulas neurales de mairnfero desprovistas de celulas positivas de A2B5.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a metodos para generar celulas precursoras de astrocitos, astrocitos, celulas precursoras de oligodendrocitos y/u oligodendrocitos, como se declara en las reivindicaciones adjuntas a la presente.

La presente solicitud divulga metodos para el uso de estas celulas GRP de mamfferos fabricadas para aumentar la remielinizacion de neuronas en un mamffero que padece una enfermedad, trastorno, lesion o dano asociado a la desmielinizacion de neuronas.

La presente solicitud divulga metodos para el uso de estas celulas GRP de mamfferos fabricadas para reducir la formacion de cicatrices gliales.

La presente solicitud divulga metodos para el uso de estas celulas GRP de mamfferos fabricadas en el tratamiento de enfermedades o trastornos neurodegenerativos o dano o lesion del sistema nervioso o una parte del mismo en mamfferos.

Breve descripcion de las figuras

Las Figuras 1A, 1B y 1C muestran curvas de crecimiento a escala piloto de tres preparaciones celulares independientes fabricadas de acuerdo con la presente invencion.

Las Figuras 2A y 2B muestran curvas de crecimiento a escala de produccion de celulas fabricadas de acuerdo con la presente invencion.

Las Figuras 3A y 3B muestran una comparacion de la viabilidad celular en suspension frente a superficies tratadas con poli-L-ornitina (Figura 3B), asf como la viabilidad en cada pasada y la recoleccion final (Figura 3A).

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion proporciona metodos para la fabricacion de celulas progenitoras gliales (GRP) de mamfferos. Se hace referencia tambien a las GRP como celulas precursoras restringidas gliales o celulas progenitoras gliales en la bibliograffa.

Las celulas GRP de mamfferos de la presente invencion pueden derivar de cualquier fuente de tejido de mamffero capaz de generar celulas positivas de A2B5s. Los ejemplos de tales fuentes de tejido de mamffero incluyen, sin limitacion, fuentes embrionarias/fetales y adultas (incluyendo de todas las edades despues del nacimiento), todas de tejidos que incluyen, pero sin limitacion, neural, de cerebro, medula espinal, nervio optico, epitelio olfatorio, endocrino, de piel, musculo, grasa, conectivo, de placenta, sangre de cordon, sangre, medula osea, hueso, citoblastos embrionarios y celulas pluripotentes inducidas. Se entiende que capaz de generar celulas positivas de A2B5 incluye fuentes de tejido de mamffero diferenciadas en celulas positivas de A2B5, fuentes de tejido de mamffero desdiferenciadas en celulas positivas de A2B5, asf como fuentes de tejido de mamnfero desdiferenciadas y diferenciadas entonces en celulas positivas de A2B5.

Las celulas progenitoras restringidas gliales (GRP) de mamfferos se fabrican de acuerdo con la presente invencion mediante clasificacion in vitro de celulas reactivas con A2B5 de una fuente de tejido de mai^ero capaz de generar celulas positivas de A2B5. Se cultivan entonces durante al menos 10 dfas in vitro (DIV) las celulas positivas de A2B5 sobre un sustrato. Se recolectan entonces las celulas cultivadas.

En una realizacion de la presente invencion, el metodo comprende disociar tejido neural de marnffero tal como, pero sin limitacion, tejido de prosencefalo de cadaver fetal, tejido de medula espinal de cadaver fetal, tejido de cerebro o medula espinal de biopsia de mamffero o similar en una suspension celular. En una realizacion, el tejido neural de mamffero se obtiene despues del cierre del tubo neural. Para GRP humanas, el tejido neural obtenido despues del cierre del tubo neural, por ejemplo en tejidos de aproximadamente 14 a aproximadamente 24 semanas gestacionales, se ha demostrado que procura un producto consistente. Se practica la disociacion enzimatica, mecanicamente o tanto enzimatica como mecanicamente de acuerdo con metodos conocidos.

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Las celulas reactivas con anticuerpo A2B5 pueden aislarse mediante diversos medios conocidos por los especialistas en la materia. Por ejemplo, en una realizacion, se afslan las celulas reactivas con anticuerpo A2B5 usando clasificacion celular activada magnetica. Por ejemplo, las celulas pueden pasarse por una columna despues de un marcaje sencillo con anticuerpo A2B5 usando la tecnologfa de perlas magneticas Miltenyi o la tecnolog^a de perlas magneticas Dynal u otras tecnologfas de separacion de anticuerpo adecuadas conocidas. Como alternativa, las celulas positivas de anticuerpo pueden capturarse usando clasificacion celular activada por fluorescencia o inmunoadsorcion mediante metodos estandares. La columna (o FACS o discos de inmunoadsorcion) enriquece las celulas A2B5(+) y reduce las celulas A2B5(-). El paso por una columna o columnas adicionales (o un FACS o disco o discos de inmunoadsorcion adicionales) reduce eficazmente las celulas positivas intermedias y enriquece las celulas altamente positivas.

Se cultiva entonces la poblacion positiva de A2B5 durante al menos 10 dfas in vitro (DIV), por ejemplo aproximadamente 10-20 DlV, 15-20 DlV, al menos 20 DIV y/o hasta 100 DIV o mas, o al menos dos pasadas, y se recolectan y congelan las celulas cultivadas.

Este proceso de fabricacion difiere de procesos de fabricacion anteriormente descritos en que se usa un metodo de clasificacion de celulas deseadas con un solo anticuerpo y el crecimiento se extiende desde 6 DIV sin pasada hasta un crecimiento de hasta 2 pasadas o mas de 6 DIV, por ejemplo aproximadamente 10-20 DIV, 15-20 DIV, al menos 20 DIV o hasta 100 DIV o mas. Ademas, las celulas se hacen crecer no en suspension, sino en lugar de ello sobre un sustrato para adherencia de las celulas.

Los ejemplos de sustratos incluyen, pero sin limitacion, poli-L-ornitina, poli-L-Iisina y moleculas de matriz extracelular recombinantes o naturales o fragmentos de las mismas tales como, pero sin limitacion, laminina, fibronectina y CELLstart™ (sustrato exento de productos xenogenicos para la adhesion y expansion de citoblastos embrionarios, mesenquimaticos y neurales humanos, Invitrogen Corporation, Carlsbad, cA).

Las curvas de crecimiento, rendimientos y fenotipos definidos inmunologicamente de celulas fabricadas de acuerdo con el metodo de la presente invencion exhiben una variabilidad ajustada y fenotipos celulares no previstos disminuidos sin alterar su capacidad terapeutica.

La microscopfa de contraste de fases revelaba un fenotipo morfologico estable antes de la primera pasada (6 DIV), al final de la segunda pasada (20 DIV; recoleccion) y hasta 100 dfas in vitro. Esta morfologfa de bipolar a multipolar es consistente entre preparaciones con tres preparaciones celulares independientes.

Se representan curvas de crecimiento a escala piloto de celulas fabricadas de acuerdo con la presente invencion en la Figura 1A a 1C. Se muestran tres preparaciones celulares independientes en las Figuras 1A, 1B y 1C, respectivamente, como en la comparacion de crecimiento sobre plastico no tratado (“suspension”) y crecimiento sobre plastico de cultivo de tejido tratado con poli-L-ornitina. Las preparaciones celulares crecidas sobre matraces recubiertos de sustrato exhibfan una pendiente aumentada y una eficacia de siembra aumentada.

Se representan curvas de crecimiento a escala de produccion en las Figuras 2A y 2B. Estas curvas son similares a la escala piloto y demuestran que las celulas recolectadas a 20 DIV no estan cercanas a la senescencia.

Se valoro la viabilidad celular mediante el metodo de exclusion con azul de tripano. Se muestra la comparacion de la viabilidad en suspension frente a superficies tratadas con poli-L-ornitina en la Figura 3B, mientras que se muestra la viabilidad en cada pasada y la recoleccion final en la Figura 3A. En todos los casos, los valores medios de viabilidad superaban el 90 %.

Se inmunofenotiparon celulas fabricadas de acuerdo con la presente invencion usando un panel de anticuerpos que reconocen fenotipos deseados (progenitores restringidos gliales y su progenie) asf como fenotipos celulares no previstos contaminantes potenciales (progenitores neuronales, neuronas, microglia y celulas endoteliales). Los anticuerpos en este panel se eligen de A2B5, GFAP, PDGFR-a, Olig1, Olig2, O1, nestina, NG2, PSA-NCAM, TuJ1, Ki-67 y/o NeuN. El inmunofenotipado con este panel unico de anticuerpos mostraba una disminucion de los fenotipos celulares potencialmente no previstos (PSA-NCAM y TuJ1) a mas de 6 DIV frente a 6 DIV, asf como una disminucion de las desviaciones estandares en celulas producidas de acuerdo con el metodo de la presente invencion.

Por consiguiente, otro aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo para disminuir los fenotipos celulares potencialmente no previstos en una poblacion de celulas GRP y/o disminuir las desviaciones estandares en celulas de la poblacion de celulas GRP, que comprende recolectar celulas durante al menos 10 DIV. Se determina la disminucion de los fenotipos celulares potencialmente no previstos y/o la disminucion de las desviaciones estandares en celulas por comparacion con celulas recolectadas a los 6 DIV.

Se ha encontrado tambien que congelar y descongelar una poblacion de celulas GRP disminuye adicionalmente el fenotipo no previsto. Aunque se retienen los fenotipos deseables A2B5, GFAp y Ki-67 tras congelacion/descongelacion, se reducen los marcadores de fenotipos celulares no previstos (PSA-NCAM y TuJ1) en >50 %.

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Por consiguiente, la presente invencion divulga un metodo para disminuir los fenotipos celulares potencialmente no previstos en una poblacion de celulas GRP que comprende congelacion y descongelacion de la poblacion de celulas GRP.

La poblacion de celulas GRP se fabrica de acuerdo con la presente invencion y ademas se congela y descongela despues de la recoleccion.

Como se entendera por el especialista en la materia tras la lectura de esta divulgacion, sin embargo, pueden usarse metodos alternativos para la fabricacion de las GRP antes de la congelacion. Por ejemplo, en una realizacion, se fabrica la poblacion de celulas GRP mediante un metodo en el que se cultivan celulas positivas de A2B5 durante 6 DIV o menos. Se recolectan entonces las celulas cultivadas y se congelan. Despues de descongelar, las celulas pueden cultivarse durante 3 o mas dfas adicionales in vitro (DIV), aumentando el numero de celulas.

Ademas, el inmunofenotipado con este panel seleccionado de anticuerpos proporciona un medio fiable util para caracterizar este producto terapeutico celular. Por tanto, otro aspecto de la presente invencion se refiere a este panel de anticuerpos para caracterizar celulas GRP que comprende A2B5, GFAP y uno o mas anticuerpos seleccionados del grupo consistente en Oligl, Olig2, O1, PDGFR-a, nestina, NG2, PSA-NCAM, TuJ1, Ki-67 y NeuN y a metodos para caracterizar celulas como celulas GRP y/o documentar la pureza de la poblacion celular con este panel de anticuerpos. En una realizacion, se caracterizan las celulas usando el panel de anticuerpos sembrando en primer lugar las celulas segun protocolos estandares sobre cubreobjetos o en portaobjetos multicamerales o similares, dejando crecer durante una noche en condiciones de cultivo de tejido estandares y fijando entonces y tinendo segun procedimientos estandares. Las celulas inmunopositivas se identifican usando metodos de microscopfa estandares, y los porcentajes de celulas positivas de cada anticuerpo se definen respecto al numero total de celulas (como se define por una tincion pan-nuclear: DAPI o similar). El siguiente inmunofenotipo usando este panel de anticuerpos es indicativo de una poblacion de celulas de mamffero que son GRP: una mayona de celulas son positivas de A2B5 y una o mas de GFAP, nestina, NG2, PDGFR-a, Oligl, Olig2 y O1 y una mayona de celulas son negativas de uno o mas de PSA-NCAM, TUJ1, PECAM, CD68 y NeuN. Se entiende por “mayona”, como se usa en la presente memoria, que mas de un 50 % de las celulas sean positivas o negativas del anticuerpo seleccionado.

Ademas de la caracterizacion inmunocitoqmmica del producto celular, se han identificado las dianas genicas cuya expresion se correlaciona con los diferentes tipos de celulas que pueden encontrarse en los aislamientos celulares. Se recogieron los datos de expresion genica de celulas no purificadas, celulas GRP recolectadas a los 6 DIV originarias de tejidos cerebrales y celulas GRP producidas de acuerdo con el metodo de la presente invencion. Aproximadamente 375 genes mostraron cambios de al menos 5 veces en el nivel de expresion (niveles crecientes y decrecientes) con un valor de P < 0,01 entre las celulas GRP recolectadas a los 6 DIV y celulas no purificadas. Usando estos datos, pueden generarse perfiles de expresion genica y evaluarse mediante tecnicas tales como analisis de chip/matriz, PCR-TI multiplexada y PCRc como medio para identificar poblaciones celulares.

Se divulga tambien en la presente solicitud un metodo para fabricar celulas neurales de mairnfero desprovistas de celulas positivas de A2B5. En este metodo, se afslan celulas reactivas con el anticuerpo A2B5 de una fuente de tejido de mamffero capaz de generar celulas positivas de A2B5. Se recolectan entonces las celulas que permanecen despues de la retirada de las celulas reactivas con el anticuerpo A2B5. En una realizacion de este metodo, se cultivan las celulas durante uno o mas dfas in vitro (DIV) sobre un sustrato. En este metodo, opcionalmente en las celulas recolectadas pueden agotarse ademas ciertos tipos celulares por congelacion y descongelacion de la poblacion celular.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo para generar celulas precursoras de astrocitos, astrocitos, celulas precursoras de oligodendrocitos y/u oligodendrocitos a partir de las GRP fabricadas de acuerdo con la presente invencion. En este metodo, las celulas GRP fabricadas de acuerdo con la presente invencion se cultivan en condiciones que promuevan la diferenciacion en astrocitos y/u oligodendrocitos. En una realizacion, se cultivan las celulas GRP en condiciones que promuevan la diferenciacion en astrocitos. Dos ejemplos no limitantes de formulaciones de medios que promueven la diferenciacion en astrocitos incluyen: 1) crecimiento de GRP en DMEM/F12, suplemento N1 o N2, FGF basico o BMP4, con estos factores de crecimiento presentes en el intervalo de ng/ml o el intervalo de 10-100 ng/ml; y 2) DMEM/F12, suplemento N1 o N2, FBS al 1-10 % y FGF basico en el intervalo de ng/ml o el intervalo de 10-100 ng/ml. En otra realizacion, se cultivan las celulas GRP en condiciones que promuevan la diferenciacion en oligodendrocitos. Dos ejemplos no limitantes de formulaciones de medios y condiciones que promueven la diferenciacion en oligodendrocitos incluyen: 1) crecimiento de GRP en medio DMEM/F12 que carece de factores de crecimiento durante 2 dfas y transferencia de celulas a un medio DMEM/F12 suplementado con N2 o PDGF-AA, presentes en el intervalo de ng/ml o el intervalo de 10-100 ng/ml, y T3 en el intervalo de 1-100 nM; y 2) crecimiento de GRP en medio DMEM/F12 suplementado con N2 o T3 en el intervalo de 100 nM, N-acetilcistema en el intervalo de 10 pg/ml y PDGF-AA y CNTF en el intervalo de ng/ml o el intervalo de 10100 ng/ml.

Se practicaron experimentos que confirmaron que las GRP preparadas de acuerdo con el metodo de la presente invencion exhiben parametros de expresion definidos y reproducibles de antfgenos seleccionados, y son consistentes en su capacidad de diferenciarse en astrocitos y oligodendrocitos, pero no neuronas, en un entorno in

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vivo tambien. Ademas, los experimented mostraron que estas GRP exhibfan caractensticas de supervivencia, migracion y diferenciacion celular en oligodendrocitos productores de mielina as^ como astrocitos en modelos animales. En conjunto, estos estudios demuestran que las GRP fabricadas de acuerdo con el metodo de la presente invencion se integran exitosamente, se diferencian en oligodendrocitos y astrocitos y remielinizan axones en tejido neural demielinizado del cerebro y la medula espinal.

Por tanto, la presente solicitud divulga tambien metodos para usar celulas GRP fabricadas de acuerdo con la presente invencion para producir astrocitos y oligodendrocitos in vivo en marnfferos y para aumentar la remielinizacion de neuronas en un mamffero que padece una enfermedad, trastorno, lesion o dano asociado a la desmielinizacion de neuronas. Pueden administrarse entre 0,01 y 100 millones de celulas por trasplante parenquimatico directo usando cateteres o agujas familiares para neurocirujanos especialistas en la materia, que implica una o mas inyecciones. Estos trasplantes pueden practicarse despues de acceder al tejido neural directamente mediante el uso de una trepanacion o laminectoirna. Como alternativa, los trasplantes pueden practicarse en la medula espinal mediante suministro percutaneo guiado por TAC sin necesidad de acceso visual directo del tejido diana neural por un radiologo de intervencion especialista en la materia. Adicionalmente, pueden administrarse celulas al lfquido cefalorraqmdeo (LCR) tal como por puncion lumbar u otros metodos adecuados en lugar de directamente en el parenquima. Las celulas pueden administrarse tambien por administracion intravenosa para ciertas enfermedades. Finalmente, se estan realizando actualmente varios ensayos clmicos con otros tipos de celulas neurales para estas enfermedades. Pueden adaptarse rutinariamente por los especialistas en la materia protocolos y procedimientos similares usados en estos ensayos clmicos con otras celulas neurales para uso con las GRP fabricadas de acuerdo con la presente invencion.

Se demostro la supervivencia, migracion, proliferacion y diferenciacion de GRP humanas fabricadas de acuerdo con la presente invencion, cuando se xenoinjertaban en los cerebros de raton shiverer, un modelo de comportamiento glial in vivo (Nave, J. Neurosci, Res. 1994 38: 607-612). El raton shiverer posee una mutacion recesiva autosomica que da como resultado la incapacidad de estos ratones de desarrollar protema basica de mielina (MBP). Los oligodendrocitos endogenos formados en el SNC de ratones shiverer no consiguen ensamblar mielina compactada (Privat et al., Neurosci. Lett. 1979 12: 107-112). Para maximizar la supervivencia del injerto, se desarrollo una cepa de raton shiverer que porta tambien una mutacion recesiva autosomica en el gen Rag2 que codifica una protema esencial para la generacion de linfocitos B y T maduros, y por lo tanto exhibe inmunodeficiencias mediadas por celulas (Shinkai et al., Cell 1992 68: 855-867). Se implantaron en ratones inmunodeficientes shiverer/rag2 homocigoticos dobles recien nacidos 100.000 GRP humanas en un solo sitio orientado a la zona subventricular. 8 o 12 semanas despues del implante, se sacrificaron los animales y se valoro inmunocitoqmmicamente la supervivencia y distribucion de las GRP humanas y su progenie. La distribucion generalizada de celulas humanass documenta la capacidad de las GRP humanas de sobrevivir y migrar en este modelo inmunocomprometido geneticamente. Se han observado resultados similares en la supervivencia, migracion y diferenciacion in vivo en shiverer/rag2 tanto con GRP de 6 DIV como de 20 DIV.

Se valoro inmunocitoqmmicamente el potencial de diferenciacion de las GRP humanas in vivo en secciones cerebrales de estos ratones. Se sacrifico un grupo de ratones a las 8 semanas despues del implante, mientras que se sacrifico otro grupo por razones humanitarias en el momento en que el deterioro neurologico daba como resultado una deambulacion notablemente alterada y episodios frecuentes de convulsiones sostenidas (tfpicamente de 12 a 18 semanas postnatal). Se tineron secciones cerebrales con anticuerpos antiprotema basica de mielina (MBP; no se observa expresion de MBP intacta reconocida por este anticuerpo en ratones shiverer, por tanto la expresion de MBP es unicamente de GRP humanas implantadas) y anti-GFAP humana (que no reconoce GFAP de murido). Aunque la cuantificacion de los numeros de astrocitos y oligodendrocitos no era factible, se confirmo que se generaban los dos tipos celulares a partir de GRP humanas in vivo midiendo el area de inmunorreactividad de MBP y GFAP in vivo despues del sacrificio. Estos datos detallan la capacidad de las GRP humanas de la presente invencion de diferenciarse en los fenotipos celulares apropiados.

Se llevo a cabo tambien una tincion dual de las secciones cerebrales usando anticuerpos contra NeuN, una protema expresada en la mayona de las neuronas, y antfgeno nuclear humano (HuNA). Se recogieron estos datos de los mismos animales usados para determinar la expresion de MBP y GFAP. Las GRP humanas en un animal sacrificado a las 8 semanas se concentraban cerca del cuerpo calloso y se observaron menos de un 0,3 % de celulas positivas dobles de HuNA/NeuN. La capacidad de estas celulas de diferenciarse en glfa y no neuronas es relevante para el uso en enfermedades neurodegenerativas, en las que se ha resenado ramificacion axonal aberrante asociada con hipersensibilidad de tipo alodinia cuando se han usado citoblastos neurales (que dan lugar tanto a neuronas como glfa) como terapia celular (Hofstetter et al. Nat. Neurosci. 2005 8: 346-353; Macias et al., Exp. Neurol. 2006 201:335348).

Se valoro tambien la supervivencia y distribucion celular de GRP humanas despues de administracion intramedula espinal en ratas. Se implantaron sesenta mil (60.000) GRP humanas en un volumen de 1 pl en las medulas espinales de 12 ratas atfmicas al nivel de C-4. Se sacrificaron 4 animales en cada uno de los tres puntos temporales (1, 4 y 12 semanas despues del implante). Se perfundieron los animales con paraformaldetndo en el sacrificio, se recolectaron sus medulas espinales y se analizo en 1 cm de medula cervical la presencia de GRP humanas usando la tincion con anticuerpo HuNA de secciones transversales. No se detectaron masas proliferantes en las medulas espinales de ratas atfmicas implantadas con celulas humanas despues de 1, 4 y 12 semanas despues del implante.

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Se observo la supervivencia de celulas humanas implantadas en los puntos temporales de 4 y 12 semanas. Estaban presentes GRP humanas a lo largo de la seccion de area transversal de la medula espinal, con la densidad celular maxima observada en la columna dorsal donde se practicaron las inyecciones. 1 de 4 animales a 1 semana despues del implante y 4 de 4 animales a las 4 y 12 semanas despues del implante teman GRP humanas presentes tras necropsia. A las 4 semanas, aproximadamente 2/3 de las secciones analizadas teman GRP humanas (extension rostrocaudal de 0,63 cm) y las 12 semanas todas las secciones analizadas teman GRP humanas (extension rostrocaudal de 1 cm).

Se determino la supervivencia y distribucion celular de GRP humanas preparadas de acuerdo con el proceso de la presente invencion despues de la administracion intramedula espinal de dos dosificaciones celulares diferentes. No se detectaron anormalidades de la medula espinal por necropsia macroscopica a los 28 dfas despues del implante. El analisis inmunocitoqmmico usando anticuerpos HuNA y Ki-67 no revelo masas proliferantes en las medulas espinales de ratas atimicas a la dosis de 800.000 o 1.200.000 GFP humanas totales/animal. La GRP humanas estaban presentes a lo largo del area de seccion transversal de la medula espinal, con la densidad celular maxima observada en la columna dorsal donde se practicaron las inyecciones. La colocalizacion de HuNA/ Ki-67 era muy baja en los animales inyectados con 800.000 celulas totales y se detectaron GRP humanas en todas las secciones tenidas con anticuerpo HuNA sobre todo el segmento de medula espinal de 1 cm que se analizo. La densidad de celulas GRP humanas en la medula espinal de ratas inyectadas con 1.200.000 celulas totales era demasiado alta para conteo manual; sin embargo, la valoracion visual de la colocalizacion de HuNA/Ki-67 era similar a la observada en los animales de baja dosificacion.

Se han establecido las condiciones para inducir una lesion desmielinizada inflamatoria focal en la medula espinal de ratas de Lewis. Este modelo animal imita la patologfa de la mielitis transversal en seres humanos y se uso para definir la capacidad de las GRP humanas trasplantadas producidas de acuerdo con la presente invencion de sobrevivir en la cercama de la lesion desmielinizada focal inducida. El modelo de rata esta basado en un modelo publicado (Kerschensteiner et al., Am. J. Pathol. 2004 164: 1455-1469) que se ha modificado para inducir mas fiablemente evidencias clmicas e histologicas de desmielinizacion inflamatoria focal. Se inmunizaron ratas de Lewis adultas con glicoprotema oligodendrocftica de mielina (MOG) suspendida en adyuvante incompleto de Freund, seguido 10 dfas despues de laminectoirna de T9 e inyeccion de un coctel de factor de necrosis tumoral a, interleucina 6, interferon a y bromuro de etidio (EtBr). Se observo inflamacion focal en la columna dorsal de una rata de Lewis 4 dfas despues de la inyeccion del coctel. Se resolvio la inflamacion activa en gran medida 10-14 dfas despues de la inyeccion de las citocinas y EtBr; sin embargo, persistfa una desmielinizacion extensa de la region. Se detectaron GRP humanas implantadas en esta region a las 3, 8 y 14 semanas despues del implante con una dispersion rostrocaudal de hasta 13 mm, demostrando que pueden sobrevivir en lesiones desmielinizadas.

Se valoro tambien la supervivencia de GRP humanas producidas de acuerdo con la presente invencion en un entorno inflamatorio que imita el de esclerosis multiple. Se inyectaron a ratas agutf oscuro hembra (150-175 gramos de peso corporal) 10 mg de MOG en adyuvante de Freund incompleto en la base de la cola. Las ratas desarrollaron enfermedad clmica (puntuacion de EAE de 2,5-3,0; paresis de miembros posteriores) a los 10-12 dfas despues de inmunizacion. Empezando dos dfas antes del implante de celula GRP humanas, y diariamente despues de ello, se inyectaron a las ratas ciclosporina A a 10 mg/kg IP. Se practicaron laminectomnas a nivel toracico (T8-T9) y cada animal recibio una sola inyeccion de aproximadamente 150.000 GRP humanas en 2 pl de solucion salina en la columna dorsal. Se implantaron en los animales GRP humanas a los 2 o 7 dfas despues de los smtomas de enfermedad. Se sacrificaron los animales 1 semana, 2 semanas y 4 semanas despues del implante. Se detectaron las celulas GRP humanas injertadas usando anticuerpo HuNA en secciones transversales de 40 pm de medula espinal cerca del sitio de implante. Se uso anticuerpo OX42 para detectar CD11b sobre la superficie de microglias activadas de hospedador que estan presentes durante una respuesta inflamatoria. Se uso tincion con hematoxilina y eosina (H y E) para determinar la infiltracion de macrofagos y microglia. La tincion con HuNA se localizaba estrechamente con la inmunotincion con OX42 1 semana despues del trasplante. Una tincion con H y E pronunciada alrededor del sitio de inyeccion es tambien indicativa de infiltracion del hospedador de macrofagos y microglia. A las 2 semanas despues del trasplante, no se observaba ya colocalizacion de HuNA con la inmunotincion de OX42, mientras que se segrna observando tincion con H y E, aunque menos pronunciada. Las GRP humanas trasplantadas eran capaces de sobrevivir en la medula espinal de rata Da/EAE hasta 12 semanas, el punto temporal mas largo valorado, despues de inyeccion tanto 2 dfas como 7 dfas despues del inicio de la enfermedad. Por tanto, las GRP humanas eran capaces de sobrevivir en condiciones que imitan aquellas encontradas en lesiones inflamatorias de esclerosis multiple humana.

La eficacia demostrada en la presente memoria de las celulas GRP fabricadas de acuerdo con la presente invencion en multiples modelos animales para enfermedades o trastornos neurodegenerativos relacionados con celulas gliales es indicativa de su utilidad en el tratamiento o alivio de smtomas de estas enfermedades o trastornos neurodegenerativos. Se ha mostrado que las celulas gliales desempenan papeles importantes en la patogenesis de la enfermedad neurodegenerativa esclerosis lateral amiotrofica (ELA) (Howland et al. PNAS 99, 1105, 1995; Clement et al. Science 302, 113, 2003; Rothstein et al. Ann. Neurol. 38, 73, 1995). Los astrocitos desempenan muchas funciones importantes en el SNC, incluyendo regulacion cerebrovascular, modulacion de la transmision sinaptica (p.ej., transporte de glutamato) asf como otros efectos que incluyen la liberacion de factores de crecimiento y la provision de soporte trofico para neuronas asf como glfa. Las celulas gliales pueden reducir o prevenir tambien la

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formacion de astrocitos reactivos, que causan efectos nocivos en muchas enfermedades neurodegenerativas, y las celulas gliales pueden reducir los niveles de cicatrizacion glial tal como aparece en lesion de medula espinal y varias enfermedades neurodegenerativas. Ademas, se ha demostrado que el trasplante de celulas gliales normales, que posteriormente se diferencian en astrocitos, en un modelo de rata de ELA, es neuroprotector en este modelo (Lepore et al. Nature Med. 11, 1294, 2008). Estos datos indican el beneficio terapeutico de los progenitores gliales en un modelo de enfermedad neurodegenerativa, y estudios adicionales indican que la terapia con celulas progenitoras gliales sera beneficiosa en otras enfermedades o trastornos neurodegenerativos incluyendo, pero sin limitacion, enfermedades de Parkinson, Alzheimer, Huntington y Alexander (Maragakis y Rothstein Nature Clinical Practice Neurology 2, 679, 2006), esclerosis multiple (Windrem et al. Cell Stem Cell. junio de 2008 5; 2(6): 553-65, Hardison et al. Exp Neurol. febrero de 2006; 197(2): 420-9), otras enfermedades desmielinizantes (Duncan, J Inherit Metab Dis. 2005; 28(3) :357-68) y lesion de medula espinal (Keirstead et al. J Neurosci. mayo de 2005 11; 25 (19): 4694705, Mitsui et al. J Neurosci. octubre de 2005 19; 25(42): 9624-36.

Por consiguiente, la presente solicitud divulga metodos para el uso de celulas GRP de mairnferos fabricadas de acuerdo con la presente invencion en el tratamiento de enfermedades o trastornos neurodegenerativos relacionados con celulas gliales en mamfferos, asf como lesiones o dano en el sistema nervioso o una porcion del mismo. Se entiende por lesion o dano incluir la lesion o dano inducido por cualquier causa incluyendo, pero sin limitacion, traumatismo, farmacos, radiacion y lesion o dano inmunomediado. Adicionalmente, se espera que al suministrar celulas gliales sanas que producen factores de crecimiento asociados, etc., las celulas de la presente invencion seran utiles para tratar enfermedades o trastornos neurodegenerativos asf como lesiones del sistema nervioso en mamfferos no espedficamente relacionados con celulas gliales. En estos metodos de tratamiento, pueden administrarse entre 1 y 100 millones de celulas fabricadas de acuerdo con la presente invencion mediante trasplante parenquimatico directo usando cateteres o agujas familiares para los neurocirujanos especialistas en la materia. Estos trasplantes pueden practicarse despues de acceder al tejido neural directamente mediante el uso de una trepanacion o laminectomfa. Como alternativa, los trasplantes pueden practicarse en la medula espinal mediante suministro percutaneo guiado por TAC sin necesidad de acceso visual directo al tejido diana neural por un radiologo de intervencion especialista en la materia. Adicionalmente, las celulas pueden administrarse al LCF mediante puncion lumbar en lugar de directamente al parenquima. Finalmente, se estan realizando varios estudios clmicos con otros tipos de celulas neurales para estas enfermedades. Pueden adaptarse rutinariamente por los especialistas en la materia protocolos y procedimientos similares usados en estos ensayos clmicos para uso con las GRP fabricadas de acuerdo con la presente invencion.

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Un metodo para fabricar celulas progenitoras restringidas gliales (GRP) de mai^eras, comprendiendo dicho metodo:

(a) la clasificacion in vitro de celulas reactivas con A2B5 a partir de una fuente de tejido de mairnfero capaz de generar celulas positivas de A2B5;

(b) el cultivo de las celulas positivas de A2B5 durante al menos 10 dfas in vitro (DIV) sobre un sustrato; y

(c) la recoleccion de las celulas cultivadas.
2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que se afslan celulas reactivas con A2B5 usando clasificacion celular activada magnetica o usando clasificacion celular activada por fluorescencia o inmunoadsorcion, preferiblemente en el que se pasan las celulas dos o mas veces por una columna que comprende perlas magneticas para aislar celulas reactivas con el anticuerpo A2B5 o una clasificacion celular activada por fluorescencia o disco de inmunoadsorcion.
3. El metodo de la reivindicacion 1, en el que las celulas se cultivan durante 10-20 DIV, preferiblemente 15-20 DIV, mas preferiblemente al menos 20 DIV, aun mas preferiblemente durante 100 DIV o mas.
4. Un metodo para fabricar celulas progenitoras restringidas gliales (GRP) de mai^eras segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo dicho metodo:

(a) disociar, preferiblemente enzimatica y/o mecanicamente, tejido neural de marnffero en una suspension celular;

(b) clasificar in vitro las celulas reactivas con A2B5 de la suspension celular;

(c) cultivar las celulas positivas de A2B5 durante al menos 10 dfas in vitro (DIV) sobre un sustrato; y

(d) recolectar las celulas cultivadas.
5. El metodo de la reivindicacion 4, en el que el tejido neural de mai^ero, preferiblemente tejido de prosencefalo de cadaver fetal, tejido de medula espinal de cadaver fetal o tejido de cerebro o medula espinal de biopsia de mai^ero, se obtema de un marnffero despues del cierre del tubo neural.
6. Un metodo para disminuir los fenotipos celulares potencialmente no previstos seleccionados de

progenitores neuronales, neuronas, microglia y celulas endoteliales en una poblacion de celulas GRP y/o disminuir las desviaciones estandares en celulas de la poblacion de celulas GRP a mas de 6 dfas in vitro (DIV) en comparacion con celulas recolectadas a los 6 dfas in vitro (DIV), comprendiendo dicho metodo:

(a) clasificar in vitro las celulas reactivas con A2B5 de una fuente de tejido de marnffero capaz de generar celulas positivas de A2B5; y

(b) cultivar las celulas positivas de A2B5 durante al menos 10 dfas in vitro (DIV) sobre un sustrato.
7. El metodo segun la reivindicacion 6, comprendiendo dicho metodo:

(a) disociar tejido neural de mai^ero en una suspension celular;

(b) clasificar in vitro las celulas reactivas con A2B5 de la suspension celular;

(c) cultivar las celulas positivas de A2B5 durante al menos 10 dfas in vitro (DIV) sobre un sustrato; y

(d) recolectar las celulas cultivadas.
8. Un metodo para generar celulas precursoras de astrocitos, astrocitos, celulas precursoras de

oligodendrocitos y/u oligodendrocitos que comprende fabricar celulas progenitoras restringidas gliales (GRP) de marnfferos, comprendiendo las etapas de metodo:

(a) clasificar in vitro las celulas reactivas con A2B5 de una fuente de tejido de marnffero capaz de generar celulas positivas de A2B5;

(b) cultivar las celulas positivas de A2B5 durante al menos 10 dfas in vitro (DIV) sobre un sustrato; y

(c) recolectar las celulas cultivadas; y

posteriormente cultivar las celulas GRP en condiciones que promuevan la diferenciacion en celulas precursoras de astrocitos, astrocitos, celulas precursoras de oligodendrocitos y/u oligodendrocitos.