KR20110124105A

KR20110124105A - Ｂｍｉ１ 유전자의 도입에 의한 리프로그래밍의 과정을 통한 상배엽 줄기세포 유사세포 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 역분화 줄기세포

Info

Publication number: KR20110124105A
Application number: KR1020100043700A
Authority: KR
Inventors: 유승권; 문재희; 김준성; 윤병선; 이중한; 전은경; 허준석; 김지현; 황지혜; 권수현
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2010-05-10
Filing date: 2010-05-10
Publication date: 2011-11-16
Also published as: KR101145376B1

Abstract

본 발명은 ⅰ) Bmi1(B cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1) 단백질 또는 Bmi1 단백질을 코딩하는 핵산분자를 체세포에 도입하는 단계; 및 ⅱ) bFGF를 포함하는 신경줄기세포 배양조건에서 배양하는 단계를 포함하여 리프로그래밍 과정을 통해 체세포로부터 상배엽 줄기세포 유사세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 기존의 역분화 유도 주요인자인 4개 유전자 (Oct4, Sox2, Klf4, and C-Myc/Oct4, Sox2, Nanog, Lin28) 외에 새로운 인자의 도입에 의한 역분화 유도 방법을 제시하고 배양조건을 조절하여 전분화능을 갖는 상배엽 줄기세포 유사세포를 제공할 수 있는 이점이 있다.

Description

Ｂｍｉ１ 유전자의 도입에 의한 리프로그래밍의 과정을 통한 상배엽 줄기세포 유사세포 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 역분화 줄기세포{Method of manufacturing induced epiblast stem cells with Bmi1 and induced pluripotent stem cells using the same}

본 발명은 Bmi1 유전자의 도입에 의한 리프로그래밍의 과정을 통한 상배엽 줄기세포 유사세포 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 역분화 줄기세포에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 체세포에 Bmi1 유전자를 도입하고 배양조건을 조절하여 리프로그래밍 과정을 통해 상배엽 줄기세포 유사세포를 제조하는 새로운 방법 및 그 방법에 의해 제조된 전분화능을 갖는 역분화 줄기세포에 관한 것이다.

줄기세포는 정상적인 체세포와 다르게 무한히 분열할 수 있는 능력을 가지며 적합한 환경 조건 아래에서 특정 세포로 분화하는 능력을 가진다. 그 분화 능력은 줄기세포의 특성에 따라 전분화능(pluripotency), 다분화능(multipotency), 또는 단일분화능(unipotency) 으로 정의되어진다. 따라서 줄기세포를 배양을 통해 증식시킨 후 특정 세포로 분화를 시키는 기술은 세포 치료라는 측면에서 여러 질병을 치료할 수 있는 잠재력을 가지고 있다 할 수 있다.

조혈줄기세포(hematopoietic stem cell), 골수줄기세포(bone marrow stem cell), 신경 줄기세포(neural stem cell) 등의 줄기세포는 성체에서도 존재하므로 환자 본인으로부터 추출할 수 있어 질병 치료 시 면역 거부반응이라는 문제점을 극복할 수 있는 장점이 있다. 이러한 장점은 기존의 장기이식에서 장기 제공자의 확보가 어려웠던 부분을 극복할 수 있다.

하지만, 지금까지 알려진 견해에 따르면 성체줄기세포는 단지 다분화능으로, 분화할 수 있는 능력에 한계를 가진다. 이는 곧 조직 특이줄기세포는 같은 조직유형의 세포로만 분화할 수 있다는 것인데, 중추신경계(central nervous system) (Science 255, 1707-1710 1992; Science 287, 1433-1438 2000), 골수(bone marrow) (Science 276, 71-74, 1997; Science 287, 1442-1446, 2000; Science 284, 143-147, 1999), 망막(retina) (Science 287, 2032-2036, 2000)와 골격근(skeletal muscle) (Proc. Natl Acad. Sci. USA 96, 14482-14486, 1999; Nature 401, 390-394, 1999)에서 분리된 줄기세포는 분화능력 역시 유사조직 계통으로만 분화가 가능하다는 것을 의미한다. 그 예로 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell)는 혈액에 관련된 세포로, 신경줄기세포(neural stem cell)는 신경세포(neuron) 또는 신경아교세포(glial cell)로, 골수줄기세포(bone marrow stem cell)는 중배엽세포(mesodermal cell) 로 분화가 가능하다. 뿐만 아니라 이론적으로 무한히 증식 가능한 성체줄기세포이지만, 현재까지의 보고로는 이러한 성체줄기세포를 인 비트로(in vitro) 상에서 증식시키는데 어려움이 있으며 실제 환자로부터 많은 양의 세포를 분리해 내는 것 또한 어렵다.

전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell)는 앞에서 열거한 성체줄기세포가 가지고 있던 여러 가지 단점들을 극복해 줄 수 있는 훌륭한 자원이다. 이 세포는 인체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화가 가능하며 인비트로(in vitro) 상에서 무한히 증식이 가능하다. 현재까지 알려진 전분화능 줄기세포로는 배아줄기세포(embryonic stem cell), 배아생식세포(embryonic germ cell), 배아종양세포(embryonic carcinoma cell)가 있으며 그 중 배아줄기세포는 가장 많은 연구가 이루어져 특정 세포들로의 분화 방법 및 동물질병 모델 연구한 기능성 검증과 임상 이용시 다양한 질병들에 대한 치료 가능성을 보여주었다.

하지만 이러한 배아줄기세포 역시 성체줄기세포처럼 임상이용을 위해 극복해야만 하는 단점들이 존재한다. 우선, 배아줄기세포를 얻기 위해서는 수정된 배아를 파괴해야 하므로 윤리적인 문제점을 가지고 있으며 배아줄기에서 분화된 세포를 환자에 이식했을 경우 면역 거부반응이 일어난다는 문제점을 가지고 있다.

때문에 배아줄기세포의 이러한 문제점들을 극복하기 위해서 다양한 접근 방법이 시도되었는데 그 중 가장 각광을 받은 것이 분화된 세포에서 미분화된 세포로의 역분화 유도 (reprogramming) 이다. 역분화는 분화된 세포를 이용하여 배아줄기세포와 같은 전분화능 줄기세포를 만들어내는 것을 총칭하며, 이러한 방법으로는 1) 핵치환 (nuclear transfer), 2) 핵융합 (cell fusion), 3) 세포추출물 처리 (cell extract treatment), 그리고 4) 유전자 도입을 통한 역분화(induced pluripotent stem cell;iPS cell) 기술이 있다 (Cell 132, 567-582, 2008).

iPS cell 기술은 현재까지 연구되어 오던 어떤 기술보다 배아줄기세포에 가까운 세포를 만들어 내는데 성공했으며 이러한 결과와 기작을 증명하기 위해 처음 기술이 발표되었던 2006년 이후 현재까지 수많은 연구 논문들이 쏟아져 나오고 있는 실정이다. 기본적으로는 마우스 또는 인간의 체세포에 4개의 유전자 (역분화 유도인자; Oct4, Sox2, Klf4, and C-Myc/Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)를 도입한 후 배아줄기세포 배양조건에서 장기간 배양 했을 경우 배아줄기세포와 유사한 특성의 줄기세포가 확립될 수 있었으며 이는 배아줄기세포와의 유전자발현 (gene expression), 후성학적 특성 (epigenetics), 인 비트로/인 비보 (in vitro/in vivo) 에서의 삼배엽성 분화 능력 (three germ layer differentiation), 테라토마 (teratoma) 형성 능력, 키메라 마우스 생성 (chimeric mouse generation) 그리고 키메라 마우스의 생식 가능 (germline transmission) 등의 특성이 상당히 유사한 것으로 증명되었다 (Cell 126, 663-676, 2006; Science 318, 1917-1920, 2007).

하지만, 이러한 역분화 과정의 기작은 역분화 유도를 위해 사용된 유전자의 수가 너무 많아 자세한 기작을 규명하기 어렵기 때문에 현재까지 밝혀진 수준이 미미한 상태이다. 또한, 역분화 유도기술이 확립이 되었음에도 실제 치료적용을 위해서는 기술적으로 간편하고 효율이 높은 방법을 계속해서 개발해야만 하고 이렇게 개발된 기술들은 모두 효율과 안전성 측면에서 평가되어야 한다.

최근 발표된 연구 결과에 따르면, 암억제 유전자인 p53의 비활성화 (inactivation)는 iPS 세포의 생성 효율을 증가시킨다고 보고되었다 (Nature 460, 1132-1135, 2009). p53유전자는 Ink4a/Arf locus에 의해 조절되는데 이 locus는 선택적 스플라이싱 (alternative splicing)에 의해 발현이 조절되며 Arf 에 의해 생성된 p19^Arf 는 p53유전자를, Ink4a에 의해 생성된 p16^Ink4a 는 Rb 유전자의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이 두 가지 유전자 p16^Ink4a 와 p19^Arf 의 발현을 억제 시킨 경우 p19^Arf 만을 억제시킨 경우 보다 iPS 생성 효율이 증가되었다는 보고도 있다 (Nature, 460, 1140-1144, 2009).

Polycomb group(PcG) 단백질은 후생유전학적 유전자 억제자 (epigenetic gene silencer)로써 PcG 단백질의 하나인 Bmi1은 p16^Ink4a 와 p19^Arf의 발현을 억제 시킴으로써 p53과 Rb의 발현을 억제시킨다고 보고 되어있다 (Genes Dev, 2678-2690, 1999). 또한 Bmi1은 염색질(chromatin)의 구조를 변화시켜 타겟 유전자의 발현을 억제한다고 알려져 있으며 이러한 특성으로 인해 신경줄기세포 (neural stem cell) 및 조혈줄기세포 (hematopoietic stem cell)의 자가재생 (self-renewal)에서 중요한 역할을 수행한다고 알려져 있다. 이에 따라 본 발명자들의 기존 연구에서는 마우스의 성상세포(astrocyte)에 Bmi1을 과발현(overexpression) 시켜 신경줄기세포(neural stem cell)로의 역분화에 성공했음을 보고 하였으며 이렇게 역분화된 신경줄기세포의 특성은 실제 마우스에서 분리한 신경줄기세포와 상당 부분 유사하였는데 그 중 역분화 유도인자 중 하나이자 신경줄기세포의 자가재생에 중요한 역할을 하는 유전자인 Sox2의 발현이 증가됨을 확인하였다 (Biochem Biophys Res Commun. 371, 267-272, 2008).

일반 체세포의 경우 역분화를 하기 위해서는 4개 (Oct4, Sox2, Klf4, C-Myc) 혹은 3개(Oct4, Sox2, Klf4)의 유전자가 필요하지만 이 유전자를 내재적으로 발현(endogenously expression) 하는 세포에 한해서는 유전자의 도입이 추가적으로 필요하지는 않은 것으로 알려져 있다. 그중 대표적인 것이 마우스/사람의 신경줄기세포에 Oct4유전자 하나만을 도입하여 역분화 줄기세포를 확립했다는 연구 결과이며 이는 신경줄기세포가 내재적으로 Sox2, Klf4, C-Myc을 발현하기 때문이다 (Nature, 461, 649-653, 2009).

그러나 아직까지 기존의 역분화 유도인자인 4개의 유전자 이외에 Bmi1이라는 새로운 인자의 도입만으로 상배엽 줄기세포와 유사한 특성을 가진 전분화능을 가진 역분화 줄기세포를 제조하는 방법에 대해 알려진 바가 없다.

본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 마우스의 체세포에 Bmi1 유전자를 도입하고, 배양 조건을 조절하였을 때, 생식세포 (germ cell)에서 발현되는 유전자들이 발현되는 것을 확인할 수 있었고, 이 때 동시에 배아줄기세포에서 발현되는 유전자들이 발현되고 있는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 토대로 하여 Bmi1 유전자가 역분화 유도에 관여하고 있다는 것을 증명할 수 있었고, 이와 같이 유도된 세포가 형태 (morphology) 측면에서는 배아줄기세포와 차이를 보이고 있지만, 유전자 발현을 비롯한 특성이 배아줄기세포와 유사한 특성을 지니고 있는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 LIF pathway에 의해 조절되는 것이 아니라 bFGF pathway에 의해 조절되고 있는 것을 확인할 수 있었고, 그와 비롯한 특성들이 상배엽 줄기세포 (epiblast stem cells)와 같은 특성을 지니고 있는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같이 확립된 세포들은 유전자발현 (gene expression), 후성학적 특성 (epigenetics), 인 비트로/인 비보 (in vitro/in vivo)에서의 삼배엽성 분화 능력 (three germ layer differentiation), 테라토마 (teratoma) 형성 능력, 키메라 마우스 생성(chimeric mouse generation)이 마우스 배아줄기세포와 매우 유사함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 체세포에 Bmi1 유전자를 도입하고 배양조건을 조절하여 리프로그래밍 과정을 통해 상배엽 줄기세포 유사세포를 제조하는 새로운 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 전분화능을 갖는 역분화 줄기세포인 상배엽 줄기세포 유사세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태로서, 본 발명은 ⅰ) Bmi1 (B cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1) 단백질 또는 Bmi1 단백질을 코딩하는 핵산분자를 체세포에 도입하는 단계 및 ⅱ) bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)를 포함하는 신경줄기세포 배양조건에서 배양하는 단계를 포함하여 구성되는 체세포로부터 상배엽 줄기세포 유사세포를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "상배엽 줄기세포(epiblast stem cell, EpiSC) 유사 세포"는 전분화성을 가지는 세포를 의미하며, 형질전환 없는 증식, 무한증식, 자가-재생산 및 3종류의 모든 배아 층으로부터 유래된 어떠한 세포로 발달할 수 있는 능력을 포함하는 상배엽 줄기세포의 특성을 의미하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서 상배엽 줄기세포 유사세포는 상배엽 줄기세포, 유도된 전분화성 줄기세포, 또는 유도 만능 줄기세포로도 기술되기도 한다.

본 발명의 상배엽 줄기세포 유사세포를 유도함에 있어서, 출발 체세포의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 임의의 체세포를 이용할 수 있다. 예를 들어, 태아기(embryonic period)의 체세포 이외에 성숙한(matured) 체세포를 이용해도 된다. 상배엽 줄기세포 유사세포를 질병의 치료에 이용하는 경우에는 환자로부터 분리된 체세포를 이용하는 것이 바람직하며, 예를 들어, 질병에 관여하는 체세포나 질병치료에 관여하는 체세포 등을 이용할 수 있다. 바람직하게는 상기 체세포는 섬유아세포이며, 본 발명에서 섬유아세포는 인간과 마우스, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 유래의 모든 섬유아세포를 포함한다.

섬유아세포 세포는 배지에서 배양한 후 사용될 수 있는데, 상기 섬유아세포를 배양하는 배지는 당해 분야에서 섬유아세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 모두 포함한다. 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 DMEM (high glucose, w/o sodium pyruvate) + 10% FBS (Fetal bovine serum) + 0.1mM non-essential amino acid + 1% penicilin/streptomycin + 0.1mM β-mercaptoethanol) 배지에서 배양하였다.

본 발명의 Bmi1은 단백질 또는 이의 단백질을 코딩하는 핵산의 형태로 제공된다. 본 발명의 Bmi1은 인간과 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 유래의 모든 Bmi1를 포함하며, 바람직하게는 인간 Bmi1이다. 또한, 상배엽 줄기세포 유사세포로의 역분화에 사용되는 본 발명의 Bmi1 단백질은 이의 야생형(wild type)의 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 Bmi1 단백질의 변이체를 포함한다.

상기 Bmi1 단백질의 변이체란 Bmi1의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 상기 변이체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이거나 필요에 의해서 단백질의 물리 화학적 성질이 변형된 변이체일 수 있다. 물리, 화학적 환경에 대한 구조적 안정성이 증대되거나 생리학적 활성이 증대된 변이체이다.

바람직하게는, Bmi1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산의 형태로 제공된다.

상기 Bmi1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 야생형 또는 상기한 바와 같은 변이체 형태의 Bmi1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로서, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 천연에서 분리되거나 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다.

상기한 Bmi1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자(게놈, cDNA) 또는 RNA 분자일 수 있다.

상기 Bmi1 단백질을 코딩하는 핵산은 당 분야의 공지 방법, 예를 들어 벡터 형태의 네이키드 DNA로 세포내로 도입하거나(Wolff et al. Science,1990: Wolffet al. J Cell Sci. 103:1249-59, 1992), 리포좀(Liposome), 양이온성 고분자(Cationic polymer)등을 이용하여 세포내로 도입될 수 있다. 리포좀은 유전자 도입을 위하여 DOTMA나 DOTAP 등의 양이온성 인지질을 혼합하여 제조한 인지질 막으로, 양이온성의 리포좀과 음이온성의 핵산이 일정 비율로 혼합하면 핵산-리포좀 복합체가 형성된다.

본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 재조합벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 바람직하게는, 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus) MLV(Murineleukemia virus) ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associatedvirus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 등에서 유래한 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, Bmi1 유전자의 경우 MLV-기반-바이러스 벡터 (Moloney leukemia virus based virusvector)로 푸로마이신에 대한 선별마커를 포함하는 pBabe puro 벡터를 이용하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, pBabe puro 벡터에 Bmi1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(NCBI accession No. L13689)을 삽입하여 제조한 벡터(pBabe puro Bmi1)를 광범위한 포유류 숙주세포에 감염이 가능한 고역가바이러스를 생성하는 패키징 세포인 PT67 세포에 형질전환시켜 Bmi1 단백질을 발현하는 바이러스를 제조하여 섬유아세포를 감염시켰다.

상기 방법의 (ⅱ) 단계의 신경줄기세포 배양 조건은 당해 분야에서 신경줄기세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 모두 포함한다. 다만 bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)를 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 EGF (Epidermal Growth Factor)을 제외하고 bFGF만을 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 DMEM/F12 + B27 + N2 + 1% penicillin/streptomycin + 20 ng/ml bFGF를 이용하였다. 상기 배양조건에서 배양하였을 때, 생식세포(germ cell)와 같은 세포가 형성된다 (도 1a 및 도 1b 참조). 본 발명에 있어서는 LIF pathway가 아니라 bFGF pathway를 통해 역분화된 줄기세포가 조절되고 있음이 확인되었다 (도 2a - 도 2e 참조).

구체적인 일 양태에 의하면, 본 발명은 상기 단계 ⅱ)에서 7일 이상 배양하는 것을 특징으로 한다. 상기 배양기간을 거쳐야 배아줄기세포에서 발현되는 주요 유전자들의 발현과 유사한 발현양상을 보이고 세포치료 등으로 사용시 분화효율을 높일 수 있다.

구체적인 일 양태에 의하면, 본 발명은 ⅲ) Oct4가 발현된 세포를 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기와 같이 Oct4가 발현된 세포를 선별하면 상배엽 줄기세포 유사세포를 세포치료에 이용할 때 분화효율을 보다 높일 수 있는 이점이 있다. 상기 Oct4가 발현된 세포를 선별하는 방법은 다양한 공지의 방법을 이용할 수 있으나, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 Oct4-ⓟ-GFP를 도입하고 GFP가 발현되는 세포를 선별하는 과정을 거쳐 Oct4-포지티브 (Oct4-positive)한 역분화 줄기세포를 확립하였다 (참고문헌 Nature 448, 318-324).

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 상배엽 줄기세포 유사세포를 제공한다.

본 발명의 역분화 방법으로 제조된 상배엽 줄기세포 유사세포는 유전자발현 (gene expression), 후성학적 특성 (epigenetics), 인 비트로/인 비보 (in vitro/in vivo)에서의 삼배엽성 분화 능력 (three germ layer differentiation), 테라토마 (teratoma) 형성 능력, 키메라 마우스 생성(chimeric mouse generation)이 마우스 배아줄기세포와 매우 유사한 것을 확인하였다.

본 발명의 상배엽 줄기세포 유사세포는 다양한 타입의 세포를 제공하는 좋은 소스(source)이다. 예를 들면, 상기 상배엽 줄기세포 유사세포는 세포 분화를 위한 조건의 배지에서 배양하여 조혈세포, 신경세포, 베타세포, 간세포, 연골세포, 상피세포, 요로 세포 및 이의 유사 세포로 분화 유도될 수 있다.

상배엽 줄기세포 유사세포가 분화하기 위한 배지 조건 및 방법은 Palacios, et al., PNAS. USA, 92:7530-7537(1995), Pedersen, J. Reprod. Fertil. Dev., 6;543-552(1994), 및 Bain et al., Dev. Biol, 168:342-357(1995)에 개시되어 있다. 상기 상배엽 줄기세포 유사세포는 이식을 통해서 수많은 치료에 응용될 수 있다. 상기 상배엽 줄기세포 유사세포는 당뇨병, 파킨스병, 알츠하이머병, 암, 척수 손상, 다발성 경화, 근위축성 측삭 경화증(루게릭병), 근이영양증, 간 질환, 고 콜레스테롤 혈증, 심장 질환, 연골 대체, 창상, 족부 궤양, 위장병, 혈관질환, 신장 질환, 요로 질환, 노화관련 질환 및 상태와 같은 수많은 질병 또는 질환 치료에 응용할 수 있다. 그 외, 본 발명의 상배엽 줄기세포 유사세포는 약물개발 시 평가 등에도 응용될 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 의하면 Bmi1만을 도입하고 배양조건을 조절하여 체세포를 전분화능을 가진 역분화 줄기세포로 유도할 수 있다. 따라서 본 발명에 의하면 도입되는 역분화 인자인 유전자의 수를 최소화하여 유전자 도입에 따른 여러 가지 문제점을 해결할 수 있는 효과를 도모할 수 있다.

또한, 본 발명에 의해 역분화된 상배엽 줄기세포 유사세포는 예를 들어, 심근세포, 인슐린 생산세포, 또는 신경세포 등의 세포로 분화하여 심부전, 인슐린의존성 당뇨병, 파킨슨병이나 척수손상 등 다양한 질환에 대한 줄기세포 이식요법에 이용할 수 있으며, 사람배아를 이용하는 윤리적 문제나 이식 후의 거절반응을 회피할 수 있으므로 극히 유용하다.

나아가, 본 발명에 의해 유도 전분화성 줄기세포를 분화시켜서 생기는 각종 세포(예를 들어, 심근세포, 간세포 등)는 화합물, 약제, 독물 등의 약효나 독성을 평가하기 위한 시스템으로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 의해 Bmi1 유전자가 도입된 마우스 체세포를 배양 조건을 바꾸어 주었을 때 생식세포 (germ cell)와 같은 세포가 형성되는 것을 나타내는 도면이다.
도 1a는 본 발명에 의해 Bmi1 유전자가 도입된 마우스 체세포를 배양 조건을 바꾸어 주었을 때 생식세포 (germ cell)와 같은 세포의 모양이 형성되는 것을 나타내는 도면이다.
도 1b는 본 발명에 의해 Bmi1 유전자가 도입된 마우스 체세포를 배양 조건을 바꾸어 주었을 때 생식세포 (germ cell)와 같은 유전자 발현을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명에 의해 Bmi1 유전자가 도입된 세포를 역분화로 유도할 수 있는 배양 조건에 bFGF가 중요한 역할을 하고 있다는 것을 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명에 의해 bFGF가 포함된 조건에서 역분화 유도를 하였을 때 배아줄기세포에서와 같이 유전자 발현 양상을 보이는 것을 RT-PCR 및 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2c 및 도 2d는 본 발명의 역분화 과정 중에 bFGF pathway 가 중요한 역할을 하고 있는 것을 하위 조절인자들의 발현 양상 및 이를 저해 (inhibition)하는 화학물질의 처리를 통해 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2e는 본 발명에 의해 bFGF가 있는 조건에서 형성되는 스피어 (spheres)의 수가 현저히 많이 증가하고 있고, 상기 사용한 화학물질로 pathway 관련 분자 (molecules)를 저해 (inhibition)하였을 때 스피어 (spheres)의 형성이 줄어들고 있는 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명에 의해 Bmi1 유전자가 도입된 세포를 다양한 배양 조건에서 배양하였을 때 역분화 유도의 최적의 조건을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3a는 배양 조건을 다양하게 하였을 때의 세포의 모양 및 유전자 발현 양상을 배아줄기세포와 비교하여 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3b는 ECM (extracellular matrix)에 의한 영향을 확인하기 위해 다양한 ECM 처리 조건에서 세포를 배양하고 세포의 모양의 변화 및 유전자 발현 양상을 비교 분석한 결과를 보여주는 도면이다.
도 4는 도 3의 실험 결과를 통해 확립된 본 발명에 의한 최적의 조건에서 역분화 유도를 하였을 때 유전자가 발현되는 시기를 분석한 결과를 보여주는 도면이다.
도 4a는 날짜별로 확인한 결과 7일째부터 대부분의 유전자들이 발현이 되고 있는 것을 확인한 도면이다.
도 4b는 본 발명에 의해 Bmi1 유전자를 도입하고 해당하는 항생제로 선별한 세포와 그렇지 않은 세포의 경우 역분화 유도 전의 세포의 수에 따라 형성되는 역분화 줄기세포의 수도 차이나는 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명에 의한 역분화 줄기세포를 배아줄기세포와 비교하여 특성을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5a는 RT-PCR의 방법을 통해 유전자 발현 양상을 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5b 및 도 5c는 면역화학염색법 및 유세포 분석방법을 통해 배아줄기세포에서 발현되는 대표적인 마커들이 발현이 되고 있는 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5d는 전체적인 유전자 발현 (Global gene expression) 양상을 배아줄기세포와 역분화 줄기세포를 비교 및 분석하여, 유사성이 높은 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5e는 크로마틴 면역침강 (Chromatin immunoprecipittion) 방법을 통해 주요 유전자들의 histone H3의 status를 확인하였고, 그 결과 본 발명에 의한 역분화 줄기세포는 배아줄기세포와 같이 아세틸화 (acetylation)되어 있는 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5f는 바이설파이트 시퀀싱 (Bisulfite sequencing) 방법을 통해 주요 유전자들의 프로모터 부위가 탈메틸화 (demethylation) 되어 가는 경향을 보이고 있는 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명에 의해 확립된 역분화 줄기세포가 인 비트로 (in vitro)와 인 비보 (in vivo)에서 삼배엽성 세포로의 분화 유도가 가능한지 여부를 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 6a 내지 도 6f는 인 비트로 (in vitro)에서 각각에 해당하는 세포로의 유도 조건을 준 후 유도되는 세포들을 각각 대표적인 마커들의 발현을 면역화학염색법을 통해 확인하고, 이때의 세포에서 대표적인 유전자들이 발현이 되고 있는 것을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6g는 인 비보 (in vivo)에서 테라토마 (teratoma)가 형성이 되는지를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명에 의해 역분화에 Bmi1 유전자가 중요한 역할을 하고 있다는 것을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7a는 Bmi1 유전자의 발현을 조절할 수 있는 Tet-On system을 사용하여 독시싸이클린 (doxycyclin)으로 유도 (induction)를 하면서 역분화 유도를 하였다. 이와 같이 확립된 역분화 줄기세포의 경우에도 배아줄기세포에서와 같은 유전자 발현 양상을 보이고 있는 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7b 및 도 7c는 유세포 분석 방법 및 면역화학염색법을 통해 대표적인 마커들이 발현되는 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7d는 주요 유전자들의 프로모터 부위가 탈메틸화 (demethylation)되어 가는 경향을 보이고 있는 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명에 의한 역분화 줄기세포를 homogenous population으로 단세포 클론 (single cell clone)을 만든 후에 배아줄기세포와 특성을 비교 분석한 결과를 나타낸 것으로 배아줄기세포에서 발현되는 유전자들이 발현되고 있는 것을 확인한 도면이다.
도 8a 내지 도 8e는 본 발명에 의한 역분화 줄기세포에서 배아줄기세포에서 발현되는 유전자들뿐만 아니라 상배엽 (epiblast), 삼배엽 및 생식세포 (germ cell)에서 특이적으로 발현되는 유전자들이 발현되고 있는 것을 RT-PCR 및 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8f는 본 발명에 의한 역분화 줄기세포가 인 비보 (in vivo)에서 테라토마 (teratoma)의 형성유무를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8g 및 도 8h는 상기 도 8f와 같이 키메라 마우스 (chimera mouse)가 형성되지 않는 이유를 확인하기 위해 8 cell stage에 세포를 이식을 한 후 BL stage에서 확인을 하니 integration이 되지 않고 있고, 결국 배아줄기세포를 형성하지 못하는 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9a는 확립된 역분화 줄기세포가 키메라 (chimera)를 형성하지 못하는 문제에 대해 보완할 수 있는 방법으로 Oct4-ⓟ-GFP를 도입을 하고 GFP가 발현되는 세포를 선별하는 과정을 거쳐 Oct4-포지티브 (Oct4-positive)한 역분화 줄기세포를 확립하는 과정 및 결과를 보여주는 도면이다.
도 9b 및 도 9c는 도 9a에서와 같이 확립된 역분화 줄기세포를 배아줄기세포와 비교하였을 때 배아줄기세포에서 발현되는 마커들이 발현이 되고 있는 것을 면역화학염색법 및 유세포 분석 방법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9d는 도 9a에서와 같이 확립된 역분화 줄기세포에서, RT-PCR의 방법을 통해 주요 유전자들의 발현이 배아줄기세포와 유사하게 나타나고 있는 것을 확인한 도면이다.
도 9e는 도 9a에서와 같이 확립된 역분화 줄기세포에서, Real-time PCR의 방법을 통해 기존의 역분화 줄기세포보다 Oct4와 Sox2의 발현이 높게 나타나고 있는 것을 확인한 도면이다.
도 9f는 도 9a에서와 같이 확립된 역분화 줄기세포에서, 바이설파이트 시퀀싱 (Bisulfite sequencing) 방법을 통해 주요 유전자의 프로모터 부위가 탈메틸화 (demethylation) 되고 있는 경향을 보이고 있는 것을 나타낸 도면이다.
도 9g는 도 9a에서와 같이 확립된 역분화 줄기세포가, 인 비보 (in vivo)에서 테라토마 (teratoma)를 형성하는 것을 H&E stain 및 면역화학염색법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9h는 도 9a에서와 같이 확립된 역분화 줄기세포가, 키메라 (chimera)를 형성하는 것을 털의 색 (coat color) 및 게놈 DNA PCR (genomic DNA PCR)의 방법을 통해 분석하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명에 의해 확립된 조건을 신생자 및 성체 마우스 (neonatal and adult mouse)에서 분리한 체세포에 적용을 하여 역분화 유도를 한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10a는 배아줄기세포, 상배엽, 삼배엽과 유사하게 유전자 발현 양상을 보이는 것을 RT-PCR의 방법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10b는 대표적인 마커들의 발현을 면역화학염색법을 통해 확인한 결과 본 발명에 의한 역분화 줄기세포들에서 배아줄기세포와 유사하게 나타나고 AP 염색에서도 포지티브 (positive)하게 나타나고 있는 것을 확인한 도면이다.
도 10c는 본 발명에 의한 역분화 줄기세포에서 텔로머라제 활성 (telomerase activity)이 배아줄기세포와 비슷하게 나타나고 있는 것을 확인한 도면이다.
도 10d는 본 발명에 의한 역분화 줄기세포에서 주요 유전자들의 프로모터 부위가 탈메틸화 (demethylation) 되어 가는 경향을 보이고 있는 것을 확인한 도면이다.
도 10e는 본 발명에 의한 역분화 줄기세포가 인 비보 (in vivo)에서 테라토마 (teratoma)가 형성되는 지를 H&E stain과 면역화학염색법을 통해 확인한 결과를 나타내는 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 마우스 체세포의 배양 및 Bmi1 유전자 도입

상배엽 줄기세포 유사세포를 제조하기 위해, 마우스 체세포를 이용하였다. 마우스 체세포는 ICR 스트레인 마우스(ICR strain mouse)가 임신한지 13.5일째가 되었을 때의 배아(embryo)를 준비하고 DMEM (high glucose, w/o sodium pyruvate) + 10% FBS (Fetal bovine serum) + 0.1mM non-essential amino acid + 1% penicilin/streptomycin + 0.1mM β-mercaptoethanol) 배지의 조직배양 플라스크(tissue culture flask)에서 배양을 한 후에 3 계대(3rd passage)가 되었을 때 2 X 10⁵의 세포를 6 웰플레이트(well plate)에 접종(seeding)을 하였다.

레트로 바이러스로 유전자를 도입하는 방법을 사용하기 위해, 바이러스 파티클(virus particles)을 PT67 패키징 세포주를 이용하여 준비하였다. 보다 구체적으로 pBabe puro 벡터에 인간 Bmi1 (NCBI accession No. L13689) 유전자를 삽입하여 제조한 pBabe puro Bmi1 (from Dr.G.P.Dimri, Evanston Northwestern Healthcare Research Institute, Feinberg School of Medicine,Northwestern University, Evanston, IL 60201, USA)를 PT67 팩키징 세포주(packagingcell line, Clontech)에 터보펙트(Turbofect, Fermentas)를 이용하여 트랜스펙션(transfection)을 한 후 푸로마이신(puromycine, 3μｇ/ml)(BD bioscience)으로 선별하였다. PT67 팩키징 세포주는 광범위한 포유류 숙주세포에 감염이 가능한 고역가 바이러스를 생성하는 세포이다.

각각의 유전자의 발현을 RT-PCR의 방법을 통해 확인한 후에, 이와 같이 만들어진 세포주가 80% 정도 되었을 때 상등액(supernatant)을 취하여 0.45μｍ (Millipore) 필터로 필터링(filtering)을 하여 세포 파편 (cell debris)을 제거한 후에 폴리브렌 (polybrene, 6μｇ/ml)(sigma)을 첨가하여 12시간 간격으로 분리한 마우스 섬유아세포에 3회 반복해서 감염(infection)시켰다.

실시예 2. Bmi1 유전자가 도입된 체세포를 배양 조건을 조절했을 때 생식세포 (germ cell)와 같은 세포로의 유도

도 1은 마우스 체세포에 레트로바이러스를 이용하여 Bmi1 유전자를 도입하고 배양 조건을 EGF를 제외하고 신경줄기세포의 배양 조건(DMEM/F12 + B27 + N2 + 1% penicillin/streptomycin + 20 ng/ml bFGF)에서 배양하였을 때, 스피어 (spheres)와 같은 모양의 세포가 형성이 되었고, 이를 더 배양하였을 때 생식세포 (germ cell)와 같은 세포가 형성되는 것을 확인할 수 있었다 (도 1a). 이때의 세포에서 유전자 발현을 RT-PCR의 방법을 통해 확인한 결과 생식세포 (germ cell)에서 발현되는 유전자들이 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 1b).

실시예 3. Bmi1 유전자가 도입된 세포의 배양 조건에 bFGF와 EGF가 미치는 영향 비교

Bmi1 유전자가 도입된 마우스 체세포를 생식 세포 (germ cell)로 유도했던 조건에 bFGF만이 포함되어 있었기 때문에, EGF와 bFGF가 어떻게 작용을 하고 있는지를 확인하기 위해 신경줄기세포의 배양 조건 (DMEM/F12+B27+N2+1%penicilin/streptomycin)에 bFGF와 EGF를 각각 따로 처리하여 그 영향을 확인해보았다.

배아줄기세포와 비교하였을 때 bFGF를 처리하는 조건에서 유전자 발현양상이 비슷하게 나타나고 있는 것을 RT-PCR과 웨스턴 블럿 (western blot) 분석 방법을 통해 확인할 수 있었다 (도 2a 및 2b). 또한, bFGF signalint pathway에 의한 작용기작을 확인하기 위해서 p-Akt/Aft, p-MEK/MEF, pERK/ERK의 발현을 확인하였고, 그 결과를 토대로 하여 해당하는 분자 (molecules)를 저해 (inhibition)하는 화학물질 (chemicals)을 처리하여 관련 분자 (molecules)가 bFGF, bFGF+EGF 처리 조건에서 조절되고 있는 것을 확인할 수 있었다. 이 때 Oct4와 Nanog의 발현도 함께 조절되고 있는 것을 확인할 수 있어, bFGF pathway를 통해 역분화된 줄기세포가 조절되고 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 2c 및 2d). 이와 같이 확인된 각각의 조건에서 형성되는 스피어 (spheres)의 수가 bFGF가 처리된 조건에서 가장 많이 증가 되고 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 2e).

실시예 4. Bmi1이 도입된 세포를 다양한 배양 조건에서 배양하였을 때 유전자 발현 양상 비교 분석

Bmi1이 도입된 체세포를 다양한 배양 조건에서 배양을 하고, 그 때의 세포의 모양 및 유전자 발현 양상을 RT-PCR의 방법을 통해 비교 분석하였다 (도 3).

우선, 실시예 3 (도 2)에서 확립된 조건을 기준으로 하고, 배아줄기세포의 배양 조건 및 상배엽 줄기세포 (epiblast stem cell)의 배양 조건 등 다양한 조건을 주고, 이때의 세포의 모양 및 유전자 발현 양상을 비교하였다. 여러 가지 조건에서 세포를 배양하여 비교한 결과 실시예 3 (도 2)에서 확립된 조건에서만 배아줄기세포와 유사한 양상으로 유전자 발현이 되고 있는 것을 확인할 수 있었다.

또한, ECM 분자 (extracellular matrix molecules)를 다양하게 사용하여 비교하였으나, 실시예 3 (도 2)에서 확립된 조건에서의 세포만큼 유전자 발현 양상이 배아줄기세포와 비슷하게 나타나지는 않았다. 이와 같이 확립된 조건에서 유도된 역분화 줄기세포의 경우 배아줄기세포에서 발현되는 주요 유전자들이 발현되는 시기를 분석하기 위해 RT-PCR의 방법을 사용하였고, 그 결과 7일째가 되었을 때는 대부분의 유전자들의 발현 양상이 배아줄기세포와 유사하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다 (도 4a).

또한, 스피어 (spheres)의 형성을 유도하는 세포들의 수에 따라 형성되는 역분화된 줄기세포의 수에도 차이가 나고 있는 것을 확인할 수 있었다. 이는 Bmi1 유전자가 도입된 세포를 포함된 벡터 (vector)의 선택적 마커 (selectable marker)를 이용하여 선발 (selection)을 한 경우와 그렇지 않은 경우가 비슷한 양상을 보이고 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 4b).

실시예 5. 역분화된 줄기세포의 특성 분석

역분화된 줄기세포와 배아줄기세포를 여러 가지 방법을 통해 특성을 비교 분석하였다. 배아줄기세포에서 발현되는 유전자들이 배아줄기세포와 비슷하게 발현이 되고 있는 것을 RT-PCR의 방법을 통해 확인할 수 있었고 (도 5a), 배아줄기세포에서 특이적으로 발현되는 표지인자인 SSEA1과 대표적인 유전자인 Oct4, Sox2가 발현이 되는 것을 면역화학염색법과 유세포분석 방법을 통해 확인할 수 있었다 (도 5b 및 5c).

전체 유전자 발현 (Global gene expression) 양상을 비교하였을 때 배아줄기세포와 유사한 정도로 나타나고 있었고, 역분화 주요인자들의 발현 정도도 비슷하게 나타나고 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 5d). 크로마틴 면역침강법 (Chromatin immunoprecipitation) 방법을 통해 주요 유전자들의 프로모터 부위의 히스톤 (histone)의 위치 (status)가 아세틸화 (acetylation)되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 반면에 체세포의 경우에는 K9위치에 탈메틸화 (dimethylation) 되어 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 5e).

또한, 배아줄기세포의 자가재생능력의 유지에 중요한 유전자들의 프로모터 부위를 분석하기 위해서 바이설파이트 시퀀싱 (bisulfite sequencing) 방법을 도입하여, Oct4와 Nanog의 프로모터 부위의 메틸화 (methylation) 유무를 분석하였다. 그 결과 마우스 체세포에서는 대부분 메틸화 (metylation) 되어 있었으나, 역분화된 줄기세포에서는 탈메틸화 (demethylation) 되고 있는 경향을 볼 수 있었다 (도 5f).

이와 같이 확립된 세포가 인 비트로 (in vitro)와 인 비보 (in vivo)에서 삼배엽성 세포로의 분화 유도가 가능한지 여부를 확인하기 위해서 인 비트로 (in vitro)에서는 각각에 해당하는 조건을 준 후 분화 유도를 하였더니 삼배엽에 해당하는 세포로의 분화 유도가 되었고 이 때 대표적인 마커들의 발현을 RT-PCR과 면역화학염색법 및 해당하는 염색법을 통해 확인할 수 있었다 (도 6a-6f).

또한, 인 비보 (in vivo)에서 삼배엽성 세포로의 분화 유도가 가능한지 여부를 확인하기 위해 6주령의 Balb/c 누드마우스 (nude mouse)에 신장 캡슐 (kidney capsule)로 주사 (injection)한 후 8-10주 후에 조직을 prep하고 H&E 염색 및 면역화학염색을 하여 확인하였다 (도 6g). 그 결과 삼배엽에 해당하는 조직으로 분화가 유도된 것을 확인할 수 있었다. 따라서 Bmi1 유전자가 도입된 세포를 배양 조건을 조절하였을 때 세포의 형태 (morphology) 측면에서는 차이를 보이고는 있으나 대부분의 특성이 배아줄기세포와 유사하게 나타나고 있는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6. Bmi1 유전자의 발현을 조절하여 역분화에서의 Bmi1 유전자의 역할 확인 및 이와 같이 형성된 세포를 배아 줄기세포와 비교 분석

Bmi1 유전자가 역분화에 가장 중요한 역할을 하고 있는 것을 다시 확인하기 위해서 독시싸이클린 유도 시스템 (doxycycline inducible system)을 이용하였다. 독시싸이클린 (doxycyclin)으로 유도 (induction)를 하였을 때 배아줄기세포와 유사한 양상으로 유전자들이 발현되고 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 7a).

또한, 이때의 세포들에서도 상배엽 (epiblast) 및 삼배엽에 해당하는 대표적인 유전자들도 함께 발현이 되고 있는 것을 확인할 수 있었다. 배아줄기세포의 대표적인 마커인 SSEA1과 Oct4는 Bmi1 유전자가 턴온 (turn on)이 된 조건에서 발현이 되는 것을 면역화학염색법 및 유세포 분석 방법을 통해 확인할 수 있었다 (도 7b 및 7c).

주요 유전자들의 프로모터의 메틸화 (methylation) 상태를 분석한 결과 Bmi1 유전자가 유도된 조건에서 탈메틸화 (demethylation) 되고 있는 경향을 보이고 있었다 (도 7d). 따라서 이 결과를 통해 역분화 유도에 Bmi1 유전자가 중요한 역할을 하고 있는 것을 증명할 수 있었다.

실시예 7. 역분화 줄기세포의 homogenous population에서 배아줄기세포의 특성 비교 분석

확립된 역분화 줄기세포를 homogenous population으로 10개 정도의 단세포 클론 (single cell clone)을 만든 후에 이들 세포를 배아줄기세포와 비교하여 특성을 비교 분석하였다.

배아줄기세포에서 발현이 되는 대표적인 유전자들 뿐 아니라 상배엽 (epiblast), 삼배엽, 생식세포 (germ cell)에서 특이적으로 발현이 되고 있는 유전자들이 발현이 되고 있는 것을 RT-PCR과 웨스턴 블럿 (western blot) 분석 방법을 통해 확인할 수 있었다 (도 8a-8e).

또한, 인 비보 (in vivo)에서 테라토마 (teratoma)가 형성이 되는 것을 H&E stain의 방법을 통해 확인을 하였고 (도 8f), 키메라 (chimera) 형성 유무를 확인하기 위해 C57/BL6의 BL에 이식을 하였으나, 형성되지 않는 것을 확인할 수 있었다 (도 8g). 이에 대한 이유를 알아보기 위해서 8 cell stage에 세포를 이식을 하였더니, 이식한 세포가 BL stage에서 integration이 되지 않는 것을 확인할 수 있었고, 그 결과 배아줄기세포로 형성이 되지 않는 것을 확인할 수 있어, 그 때문에 키메라가 형성이 되지 않은 것으로 판단할 수 있었다.

실시예 8. Oct4-ⓟ-GFP를 이용하여 Oct4 포지티브 (Oct4 positive)한 세포를 선별하여 배아줄기세포와 특성 비교 분석

상기 실시예 7 (도 8)의 결과에서 확립된 역분화 줄기세포가 키메라 형성하지 않는 것을 보고, 이에 대한 보완을 하기 위해 Oct4-ⓟ-GFP (참고문헌 Nature 448, 318-324)를 도입하고 GFP를 통해 Oct4 포지티브 (Oct4 positive)한 세포들을 선별하였다.

이와 같은 방법으로 확립된 세포들이 그 전의 세포들과 비교하였을 때 배아줄기세포와 유사성이 더 높게 나타나고 있는 지를 여러 가지 특성 분석을 통해 확인하였다 (도 9a).

배아줄기세포에서 특이적으로 발현이 되고 있는 마커들의 발현을 면역화학염색법을 통해 확인하였고, 유세포 분석 방법을 통해서도 확인한 결과 배아줄기세포와 유사하게 나타나고 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 9b 및 9c). 또한, RT-PCR과 Real-time PCR의 방법을 통해 비교 분석한 결과 선별된 세포에서 발현이 더 증가하고 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 9d 및 9e).

배아줄기세포의 자가재생능력의 유지에 중요한 유전자들의 프로모터 부위의 메틸화 (methylation) 상태를 비교 분석한 결과 탈메틸화 (demethylation) 되고 있는 경향을 보이고 있었고, Oct4 프로모터 (promoter)의 경우 배아줄기세포와 거의 비슷한 정도로 탈메틸화 (demethylation) 되어 있는 것을 바이설파이트 시퀀싱 (bisulfite sequencing) 방법을 통해 확인할 수 있었다 (도 9f).

이때의 세포가 인 비보 (in vivo)에서 테라토마 (teratoma)를 형성하는지 여부를 확인하기 위해 위와 동일한 방법으로 세포를 주사 (injection)하였고, 8-10주 후에 확인을 한 결과 삼배엽에 해당하는 대표적인 조직들이 형성이 되고 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 면역화학염색법을 통해 대표적인 마커들이 발현되고 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 9g).

C57/BL6의 BL에 세포를 이식을 한 후 키메라가 형성이 된 것을 털의 색 (coat colar) 및 게놈 DNA PCR (genomic DNA PCR)의 방법을 통해 확인할 수 있었다 (도 9h).

실시예 9. 신생자 및 성체 마우스 (Neonatal and adult mouse)의 체세포에 동일한 방법을 적용하여 역분화 줄기세포로의 유도 방법 확립

신생자 및 성체 마우스의 체세포에 상기에서 확립된 역분화 유도 조건을 적용하여 역분화를 유도하였다. 그 결과 유도된 세포들은 배아줄기세포, 상배엽 (epiblast), 삼배엽에 해당하는 대표적인 유전자들이 발현되고 있는 것을 RT-PCR의 방법을 통해 확인할 수 있었다 (도 10a).

또한, 면역화학염색법을 통해 배아줄기세포에서 특이적으로 발현되는 대표적인 마커들이 역분화 줄기세포에서도 발현되고 있는 것을 확인할 수 있었고, AP stain을 한 결과 포지티브 (positive)하게 나타나고 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 10b).

텔로머라제 활성 (Telomerase activity)이 배아줄기세포와 유사하게 나타나고 있는 것을 TRAP assay 방법을 통해 확인할 수 있었다 (도 10c).

역분화 줄기세포와 배아줄기세포, 마우스 섬유아세포에서 배아줄기세포의 자가재생 능력의 유지에 중요한 유전자들의 프로모터 부위를 분석하기 위해서, 바이설파이트 시퀀싱 (bisulfite sequencing) 방법을 도입하여, Oct4와 Nanog의 프로모터 부위의 메틸화 (methylation) 유무를 분석하였다. 역분화 줄기세포의 경우 프로모터 부위가 탈메틸화 (demethylation)되고 있는 경향을 확인할 수 있었다 (도 10d).

이와 같이 확립된 세포들도 인 비보 (in vivo)에서 테라토마 (teratoma)를 형성하고 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 10e). 따라서 Bmi1 유전자를 이용하여 마우스 체세포에서 배 (embryo), 신생자 (neonatal), 성체 (adult)에서 분리한 세포들을 역분화 줄기세포로의 유도가 가능하다는 것을 증명할 수 있었고, Bmi1 유전자가 역분화 유도에 중요한 인자라는 것을 확인할 수 있었다.

Claims

ⅰ) Bmi1(B cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1) 단백질 또는 Bmi1 단백질을 코딩하는 핵산분자를 체세포에 도입하는 단계; 및
ⅱ) bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)를 포함하는 신경줄기세포 배양조건에서 배양하는 단계를 포함하여 구성되는 체세포로부터 상배엽 줄기세포 유사세포를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 ⅲ) Oct4가 발현된 세포를 선별하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 상배엽 줄기세포 유사세포를 제조하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Bmi1 유전자를 삽입한 벡터를 트랜스펙션시킨 패키징 세포로 감염시켜 Bmi1을 체세포로 도입하는 것을 특징으로 체세포로부터 상배엽 줄기세포 유사세포를 제조하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계 ⅱ)에서 7일 이상 배양하는 것을 특징으로 하는 체세포로부터 상배엽 줄기세포 유사세포를 제조하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 상배엽 줄기세포 유사세포.