CN117500530A - α-突触核蛋白抑制用组合物及聚集抑制方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种α‑突触核蛋白抑制用组合物及聚集抑制方法，更具体地，涉及一种将Nurr1和Foxa2基因导入脑细胞诱导其同时表达，借以抑制α‑突触核蛋白聚集(aggergation)和磷酸化(phosphorylation)的技术，依据本发明的组合物抑制α‑突触核蛋白的聚集和磷酸化的效果优异，可用于治疗和预防帕金森病。

Description

α-突触核蛋白抑制用组合物及聚集抑制方法

技术领域

本发明涉及一种α-突触核蛋白抑制用组合物及聚集抑制方法，更具体地，涉及一种导入Nurr1和Foxa2基因诱导其表达，借以抑制α-突触核蛋白聚集(aggergation)和磷酸化(phosphorylation)的技术。

背景技术

帕金森病是一种发病时出现肌肉颤抖、肌肉僵直等运动障碍的神经性退行性疾病。帕金森病的主要发病群体为老年人，已知随着受试者年龄的增长，帕金森病的发病危险也会增加。在韩国，估计每1000人中约有1至2人发病，且已知大多数发生在老年人身上的帕金森病几乎不受遗传因素的影响。已知帕金森病因中脑黑质部位的多巴胺细胞死亡而发病，但截至目前，黑质部位多巴胺细胞遭破坏的原因尚不明确。近来，随着人类平均寿命的增长，预计帕金森病的频率也将增加。

另外，在管理和治疗帕金森病方面会产生巨额费用，患者也要承受巨大的精神痛苦。因此，急需一种有效预防和治疗帕金森病的方法。

最近，许多帕金森病的相关研究都聚焦于α-突触核蛋白(α-synuclein)。α-突触核蛋白是人脑中的一种丰富的蛋白质，主要发现于被称为突触前末梢的特殊结构的神经细胞末端。前期研究结果表明，帕金森病与神经元内部α-突触核蛋白的生成与去除间的平衡遭破坏，以致形成α-突触核蛋白的聚集并形成路易小体(Lewy body)有关。已知路易小体改变神经元的膜通透性(permeability)，诱发因钙离子的引入和线粒体的损伤而导致的氧化应激，干扰正常微管(microtubule)的形成，导致神经元死亡，进而对帕金森病的发病造成影响。在这种背景下，一直有尝试抑制α-突触核蛋白，但截至目前，尚未开发出能够有效抑制α-突触核蛋白聚集的治疗剂或方法。

发明内容

技术问题

因此，本发明人通过实验发现，当Nurr1和Foxa2基因被导入脑细胞中表达时，可抑制α-突触核蛋白聚集，从而完成了本发明。特别是，还证实到，较比Nurr1基因的单独表达效果，在其与共激活剂(coactivator)Foxa2基因共同表达时，可通过协同作用发挥强烈的α-突触核蛋白聚集抑制效果。

因此，本发明提供一种α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集抑制用组合物，其包括：包含Nurr1和Foxa2基因的基因载体。

因此，本发明提供一种α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集抑制剂，其包括：包含Nurr1和Foxa2基因的基因载体。

本发明的另一个目的在于，提供一种α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集抑制用组合物，其包括：装载Nurr1和Foxa2基因的载体。

本发明的另一个目的在于，提供一种α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集抑制剂，其包括：装载Nurr1和Foxa2基因的载体。

本发明的另一个目的在于，提供一种α-突触核蛋白聚集抑制用组合物，其包括：导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞(brain cells)。

本发明的另一个目的在于，提供一种α-突触核蛋白聚集抑制剂，其包括：导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞(brain cells)。

本发明的另一个目的在于，提供一种α-突触核蛋白磷酸化抑制用组合物，其包括：包含Nurr1和Foxa2基因的基因载体。

本发明的另一个目的在于，提供一种α-突触核蛋白磷酸化抑制剂，其包括：包含Nurr1和Foxa2基因的基因载体。

本发明的另一个目的在于，提供一种α-突触核蛋白磷酸化抑制用组合物，其包括：装载Nurr1和Foxa2基因的载体。

本发明的另一个目的在于，提供一种α-突触核蛋白磷酸化抑制剂，其包括：装载Nurr1和Foxa2基因的载体。

本发明的另一个目的在于，提供一种α-突触核蛋白磷酸化抑制用组合物，其包括：导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞(brain cells)。

本发明的另一个目的在于，提供一种α-突触核蛋白磷酸化抑制剂，其包括：导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞(brain cells)。

本发明的另一个目的在于，提供一种用于预防或治疗因α-突触核蛋白聚集而发病的疾病的组合物，其包括：包含Nurr1和Foxa2基因的基因载体。

本发明的另一个目的在于，提供一种用于预防或治疗因α-突触核蛋白聚集而发病的疾病的组合物，其包括：装载Nurr1和Foxa2基因的载体。

本发明的另一个目的在于，提供一种用于预防或治疗因α-突触核蛋白聚集而发病的疾病的组合物，其包括：导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞(brain cells)。

技术问题

本发明人潜心研究了一种用于抑制α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集(被认为是引发帕金森病的主要原因)的方法。其结果发现，较比单独导入Nurr1基因表达的情况，导入Nurr1和Foxa2基因表达时，可以更好地抑制α-突触核蛋白(α-synuclein)的聚集和磷酸化。

本发明的一个方面，是一种α-突触核蛋白的聚集抑制用组合物，其包括：包含Nurr1和Foxa2基因的基因载体。

本发明的一个方面，是一种α-突触核蛋白的聚集抑制剂，其包括：包含Nurr1和Foxa2基因的基因载体。

本发明的另一个方面，是一种α-突触核蛋白的聚集抑制用组合物，其包括：装载Nurr1和Foxa2基因的载体。

本发明的另一个方面，是一种α-突触核蛋白的聚集抑制剂，其包括：装载Nurr1和Foxa2基因的载体。

本发明的又一个方面，是一种α-突触核蛋白的聚集抑制用组合物，其包括：导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞(brain cells)。

本发明的又一个方面，是一种α-突触核蛋白的聚集抑制剂，其包括：导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞(brain cells)。

本发明的又一个方面，是一种α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集抑制用组合物，其包括：选自由包含Nurr1和Foxa2基因的基因载体；及导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞(brain cells)构成的组中的任一种。

本发明的又一个方面，是一种α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集抑制用组合物，其包括：选自由装载Nurr1和Foxa2基因的载体；及导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞(braincells)构成的组中的任一种。

本发明的又一个方面，是一种α-突触核蛋白聚集抑制剂，其包括：选自由包含Nurr1和Foxa2基因的基因载体；及导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞(brain cells)构成的组中的任一种。

本发明的又一个方面，是一种α-突触核蛋白聚集抑制剂，其包括：选自由装载Nurr1和Foxa2基因的病毒载体；及导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞构成的组中的任一种。

本发明的又一个方面，是一种α-突触核蛋白的磷酸化抑制用组合物，其包括：包含Nurr1和Foxa2基因的基因载体。

本发明的又一个方面，是一种α-突触核蛋白的磷酸化抑制剂，其包括：包含Nurr1和Foxa2基因的基因载体。

本发明的又一个方面，是一种α-突触核蛋白的磷酸化抑制用组合物，其包括：装载Nurr1和Foxa2基因的载体。

本发明的又一个方面，是一种α-突触核蛋白的磷酸化抑制剂，其包括：装载Nurr1和Foxa2基因的载体。

本发明的又一个方面，是一种α-突触核蛋白的磷酸化抑制用组合物，其包括：导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞(brain cells)。

本发明的又一个方面，是一种α-突触核蛋白的磷酸化抑制剂，其包括：导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞(brain cells)。

本发明的又一个方面，是一种α-突触核蛋白磷酸化抑制用组合物，其包括：选自由包含Nurr1和Foxa2基因的基因载体；及导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞构成的组中的任一种。

本发明的又一个方面，是一种α-突触核蛋白磷酸化抑制用组合物，其包括：选自由装载Nurr1和Foxa2基因的病毒载体；及导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞构成的组中的任一种。

本发明的又一个方面，是一种α-突触核蛋白磷酸化抑制剂，其包括：选自由包含Nurr1和Foxa2基因的基因载体；及导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞构成的组中的任一种。

本发明的又一个方面，是一种α-突触核蛋白磷酸化抑制剂，其包括：选自由装载Nurr1和Foxa2基因的病毒载体；及导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞构成的组中的任一种。

本说明书中的术语“α-突触核蛋白”是大脑中丰富的蛋白质之一，主要发现于被称为突触前末梢的神经细胞的末端。已知α-突触核蛋白与磷酸和蛋白质相互作用，有助于调节神经传递物质多巴胺的释放。人类的α-突触核蛋白由140多个氨基酸组成并由SNCA基因编码。

本说明书中的术语“α-突触核蛋白聚集”是指2个以上的α-突触核蛋白发生聚集。在本发明的一个实现例中，较比非聚集的α-突触核蛋白，α-突触核蛋白聚集体可以具有更大的分子量及/或大小。

本说明书中的术语“抑制α-突触核蛋白聚集”可以理解为，抑制单个α-突触核蛋白与周围α-突触核蛋白聚集形成聚集体的现象，或分解并抑制已生成的聚集体。或者，抑制α-突触核蛋白聚集不单指抑制聚集，也可以包括：加快α-突触核蛋白或其聚集体的分解速度，或是调控α-突触核蛋白或其聚集体的生成和分解速度之间的平衡，使其保持在正常状态。

本说明书中的术语“基因载体”是指，将核酸序列或包含核酸序列的组合物递送给细胞或组织的一种方法。例如，基因载体可以包括：病毒载体或非病毒载体(如：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒及其他基于核酸的递送载体)，裸(naked)核酸的注射或显微注射，及基于聚合物的递送系统(如：脂质体和金属性颗粒系统)，生物(biolistic)注射脂质纳米颗粒(Lipid Nano particle；LNP)等，但不限于此。

在本发明的一个实现例中，基因载体可以是病毒载体。

本说明书中的术语“脑细胞(brain cells)”是指位于大脑中的细胞，脑细胞由神经细胞(neurons,neuron cells)和胶质细胞(glia,glial cells)等组成。

本说明书中的术语“神经细胞”是神经系统的细胞。本说明书中的术语“神经细胞”，可与“神经元”或“神经元细胞”互换使用。

本说明书中的术语“胶质细胞”，是大脑细胞中占比最大的细胞，其包括星形胶质细胞(astrocyte)或小胶质细胞(microglia)。已知星形胶质细胞参与神经细胞的保护、营养供给和炎症，小胶质细胞则是负责大脑炎症的细胞，已知其为在阿尔茨海默病等脑部疾病中发挥重要作用的细胞群。

本说明书中的术语“转导(transduction)”是指，遗传性状从一个细胞转移至另一个细胞，并以噬菌体作为介质导入该基因性状的一种现象，有时，噬菌体感染某种类型的细菌后，噬菌体DNA便与宿主DNA相结合，当噬菌体因溶菌现象而出现时，会携带一部分宿主DNA，而不是失去自己的部分DNA。如果这种噬菌体感染其他细菌，便会新导入之前宿主的基因，并表现出新的性状。在生物学研究中，术语“转导”一般指的是，使用病毒载体导入并表达靶细胞中的特定外源基因。

本说明书中的术语“细胞治疗剂”是指，通过从人体中分离、培养和特殊操作而制备成的细胞和组织，是一种用于治疗、诊断和预防目的的医药品(美国FDA规定)，是通过一系列行为(如：凭借体外增殖、筛选存活的自体、同种或异种细胞的方法或其他方法，改变细胞的生物学特性，以达到恢复细胞或组织的功能的目的)而被用于治疗、诊断和预防目的的医药品。根据细胞的分化程度，细胞治疗剂大致可分为体细胞治疗剂和干细胞治疗剂。

本说明书中的术语“导入(转导)Nurr1和Foxa2”是指，将编码两种基因的核酸同时导入脑细胞。两种基因可通过基因载体单独或同时导入。当载体被用作基因载体时，两种基因可分别通过各自的表达载体单独导入，或通过一个表达载体同时导入。

在本发明的一个实施例中，证实当同时导入Nurr1和Foxa2基因时，由于Nurr1和Foxa2相互间的协同效应，抑制α-突触核蛋白聚集的能力要明显优于单独导入Nurr1或Foxa2的情况。具体地，经证实，相较于单独导入Nurr1或Foxa2的情况，同时将Nurr1或Foxa2导入细胞时，α-突触核蛋白单体和聚集体均显著减少(参考图5至图6)

本说明书中的术语“导入(转导)Nurr1”是指，将编码Nurr1基因的核酸导入脑细胞。

为了导入编码Nurr1和/或Foxa2的基因，可以利用细胞内导入技术，其使用的是本领域公知的基因载体。例如，其可以使用病毒载体，如：使用腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、腺病毒。

装载Nurr1和Foxa2时，可以使用病毒性载体。病毒性载体可以使用腺相关病毒(AAV)、腺病毒、逆转录病毒和/或慢病毒等，但不限于此。因此，依据本发明的Nurr1和Foxa2导入，作为一个具体例，可以包括：将编码Nurr1和Foxa2的核酸插入到单独的单个表达载体或一个表达载体中，然后，将其导入脑细胞。

编码Nurr1和Foxa2的各个核酸，只要是本领域公知的编码Nurr1和Foxa2的碱基序列，即可不受限地使用。另外，核酸可以具有编码Nurr1和Foxa2的各功能等同物的碱基序列。功能等同物是指，与Nurr1和/或Foxa2氨基酸序列具有至少60％以上，70％以上，80％以上的序列同源性(即，同一性)的多肽。例如，功能等同物包括具有60％,61％,62％,63％,64％,65％,66％,67％,68％,69％,70％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,100％的序列同源性的多肽。功能等同物可能是由于部分氨基酸序列的添加、取代或缺失而产生的。氨基酸的缺失或取代可位于在与本发明的多肽生理活性无直接关联的区域。

另外，编码Nurr1和Foxa2的核酸，可借由本领域公知的基因重组方法制备。例如，编码Nurr1和Foxa2的核酸可以使用从基因组中扩增核酸的PCR扩增、化学合成法或cDNA序列制备技术来制备。

编码Nurr1和Foxa2的核酸，可以可操作地连接到表达调控序列上，从而插入到表达载体中。术语“可操作地连接(operably linked)”是指，一个核酸片段与另一个核酸片段相连接，使其功能或表达受另一核酸片段的影响。另外，表达调控序列(expressioncontrol sequence)是指一种DNA序列，其调控可操作地连接在特定宿主细胞上的核酸序列的表达。此类调控序列可以包括：启动转录的启动子、调控转录的任选的操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，以及调控转录和翻译终止的序列。这些也可以统称为“包含编码Nurr1和/或Foxa2的核酸的DNA构建体”。

本说明书中的术语“表达载体”是指，本领域公知的病毒载体或其他介质，其可插入编码结构基因的核酸，并可在宿主细胞内表达核酸。

在本发明中，载体可以是病毒载体。病毒载体可以是腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒载体、禽痘病毒载体等。例如，可以是腺相关病毒载体，但不限于此。

腺相关病毒(AAV)载体可通过将可制造病毒的材料导入细胞中来制备。慢病毒载体也可以通过几个步骤来制备，以在特定细胞系中生产病毒。

依据本发明的包含核酸的表达载体，可以借由将核酸引入细胞内的公知方法导入脑细胞内，其利用的是本领域公知的方法，例如但不限于病毒转导(transduction)、瞬时转染(transient transfection)、显微注射等方法。例如，利用基因重组技术，将Nurr1和/或Foxa2插入到腺相关病毒(AAV)或慢病毒载体中制备表达载体，再将该载体转导至包装(packaging)细胞，并培养转导的包装细胞，然后，进行分离纯化，即可获得AAV或慢病毒溶液。然后，利用该溶液感染脑细胞(神经细胞和/或胶质细胞)，可将Nurr1和/或Foxa2基因导入脑细胞。然后，利用AAV或慢病毒载体中包含的筛选标记，确认是否为单独表达或同时表达Nurr1和/或Foxa2后，即可获得需要的脑细胞。

依据本发明的导入并表达Nurr1和Foxa2的脑细胞，可借由包括以下步骤的制备方法制备。其步骤包括：

制备包含DNA构建体(construct)的重组基因载体的制备步骤，上述DNA构建体包含编码Nurr1和Foxa2的核酸；及

利用包含Nurr1和Foxa2的基因载体感染脑细胞的转染步骤。

依据本发明的导入并表达Nurr1和Foxa2的脑细胞，可借由包括以下步骤的制备方法制备。其步骤包括：

制备包含DNA构建体(construct)的重组病毒载体的制备步骤，上述DNA构建体包含编码Nurr1和Foxa2的核酸；

用重组病毒载体转染病毒生产细胞系，以制备Nurr1和Foxa2表达重组病毒的生产步骤；及

用表达Nurr1和Foxa2的重组病毒感染脑细胞的转染步骤。

将DNA构建体可操作地连接到表达调控序列(例如：启动子)上，并插入到本领域公知的病毒载体上，即可制备重组病毒载体。然后，将包含编码Nurr1和Foxa2的核酸的重组病毒载体导入病毒生产细胞系，以制备表达Nurr1和/或Foxa2的重组病毒。病毒生产细胞系可以使用生产相当于所用病毒载体的病毒的细胞系。然后，使用表达Nurr1和Foxa2的重组AAV或慢病毒来感染脑细胞。上述过程可借由本领域的公知方法完成。

依据本发明的表达Nurr1和/或Foxa2的脑细胞，可以按照本领域公知的方法进行增殖和培养。

依据本发明的脑细胞，可以在有助于靶细胞类型生存和增殖的培养液中培养。可以在培养液中补充为持续培养脑细胞而开发的添加剂。例如，有Gibco公司市售的N2培养基、B27添加剂和牛血清等。培养时，可通过观察培养基和细胞的状态更换培养基，培养脑细胞。这时，脑细胞持续增殖，相互聚集，形成神经球(neurospheres)，即可实施继代培养。根据情况，可每7-8天进行一次继代培养。

依据本发明的组合物，可以抑制α-突触核蛋白的聚集和磷酸化，保护包含神经细胞和胶质细胞的脑细胞免受损伤，使脑细胞得以补充(再生)或重建(复原)。

本说明书中的术语“再生(regeneration)”是指，当已形成的器官或个体出现部分缺失时，该部分得到补充的一种现象，“复原”也可称作“重建(reconstitution)”，指的是组织的重建，从已解离的细胞或组织中进行组织或器官重建。

本发明的组合物或细胞治疗剂，可根据给药方式，制备成包含可接受的载体的适当制剂。适用于给药方式的制剂是已知的，较为典型的可包括：通过跨膜轻松完成迁移的制剂。

另外，本发明的组合物，可使用一般的医药品制剂形态。非口服用制剂可制备成灭菌的水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂或冻干制剂，口服给药时，则可制备成片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆或威化剂等形态，如果是注射剂，则可制备成单位给药安瓿或多次给药形态。另外，本发明的治疗用组合物，可与医学上可接受的载体同时施用。例如，口服给药时，可使用粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、色素或香料等，注射剂则可混合使用缓冲剂、防腐剂、镇痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等，用于局部给药时，可使用基剂、赋形剂、润滑剂、保存剂等。

本发明的又一个方面，是一种用于预防或治疗因α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集而发病的疾病的组合物，其包括：选自由包含Nurr1和Foxa2基因的基因载体；及导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞(brain cells)构成的组中的任一种。

本发明的又一个方面，是一种用于预防或治疗因α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集而发病的疾病的组合物，其包括：选自由装载Nurr1和Foxa2基因的病毒载体；及导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞(brain cells)构成的组中的任一种。

本发明的又一个方面，是一种包括以下步骤的治疗或缓解因α-突触核蛋白聚集而发病的疾病的方法。其步骤包括：

向受试者施用组合物的步骤，该组合物包括：选自由包含Nurr1和Foxa2基因的基因载体；及导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞(brain cells)构成的组中的任一种。

本发明的又一个方面，是一种包括以下步骤的治疗或缓解因α-突触核蛋白聚集而发病的疾病的方法。其步骤包括：

向受试者施用组合物的步骤，该组合物包括：选自由装载Nurr1和Foxa2基因的病毒载体；及导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞(brain cells)构成的组中的任一种。

本说明书中的术语“受试者”是作为治疗、观察或实验对象的脊椎动物，例如，可以是牛、猪、马、山羊、狗、猫、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠和人类等。

本说明书中的术语“治疗”是指，获得有益的或理想的临床结果的一种方法。为达到本发明的目的，有益或理想的临床结果包括但不限于：症状的缓解，疾病范围的减少，病情的稳定(即，不恶化)，病情进展的延迟或速度减慢，病情的改善或症状的暂时缓解或减轻(部分或全部)、是否可检测或不可检测。另外，“治疗”还指，在与未接受治疗时的预期存活率相比，可增加存活率。“治疗”也指治疗学性治疗，及预防性或预防措施性方法。上述治疗包括可预防性障碍和已发生障碍所需的治疗。“缓解(Palliating)”疾病是指，与未治疗情况相比，病情范围和/或不理想的临床症状有所减少，及/或进展的时间进程(time course)有所延迟或延长。

在本发明的一个实现例中，因α-突触核蛋白而发病的疾病可以是，选自由帕金森病(Parkinson’s disease)和路易体痴呆(Dementia with Lewy Bodies)构成的组中的一种疾病，但不限于此。

另外，使用本发明的治疗用组合物，治疗因α-突触核蛋白而发病的疾病的方法，可以包括：通过导入指定物质的一般途径，向受试者或患者给药。

给药方法包括：脑内给药、中脑给药、脑室内给药、脊椎腔给药、腹腔内给药、静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、皮内给药、口服给药、局部给药、鼻内给药、肺内给药和直肠内给药，但不限于此。

另外，施用依据本发明的组合物时，可借由任何一种可确保活性物质移动至靶细胞的装置完成。给药方式和制剂包括：使用立体定向系统(Stereotactic System)的中脑注射剂、脑黑质注射剂、脑室注射剂、脑脊液注射剂、静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂或滴注注射剂。注射剂可使用生理盐水或林格氏液等水性溶剂、植物油、高级脂肪酸酯(例如：油酸乙酯等)、醇类(例如：乙醇、苯甲醇、丙二醇或甘油等)等的非水溶性溶剂来制备。注射剂可以包括：防变质的稳定剂(例如：抗坏血酸、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、BHA、生育酚、EDTA等)、乳化剂、pH调节用缓冲剂、阻止微生物生长的保存剂(例如：硝酸苯汞、硫柳汞、苯扎氯铵、苯酚、甲酚、苯甲醇等)等的药剂学载体。

可以以药学有效量施用依据本发明的组合物。本领域技术人员根据医学领域的已知因素，如：疾病类型、受试者(患者)的年龄、体重、健康、性别、受试者(患者)对药物的敏感度、给药途径、给药方法、给药次数、治疗周期、配合或同时使用的药物等，可以很容易地确定药学有效量。

本发明的导入Foxa2和/或Nurr1基因的脑细胞，可以根据治疗有效量，以组合物形态直接移植到病变部位。

本说明书中的术语“治疗有效量”是指，足以停止或减轻因α-突触核蛋白聚集或磷酸化而引起的受试者或患者的生理学效应的量。所用的细胞的治疗有效量将取决于受试者(患者)的需要、受试者(患者)的年龄、生理状况和健康状态、指定的治疗效果、靶向治疗的组织大小和面积、病变的程度和选择的传导途径。另外，细胞可使用低细胞给药剂量的多个微型移植方法，施用于靶组织内的一个或多个部位。本发明的细胞在移植前完全分离，如：可形成单个细胞的悬浮液，或在移植前几乎全部分离，如：可形成细胞的小型聚集体。细胞可通过将其移植或移动到指定的组织部位，以重建或再生功能缺陷区域的方式施用。

关于为实现治疗有效性而可施用细胞的适当范围，可在本领域技术人员的普通知识范围内，根据受试者或患者的情况适当使用。例如，本发明的组合物中可包含的细胞，可以是约10至1,000,000,000个细胞，但不限于此。

本发明的组合物的适当给药量，取决于给药方式、受试者(患者)的年龄、体重、性别、疾病症状的程度、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度和反应感应性等因素。通常，熟练的医生可以很容易地确定并开出针对靶向治疗的有效给药量。本发明的药剂组合物，可以包含1×10¹～1×10¹³virus genome(vg)/μl,1×10²～1×10¹³vg/μl,1×10³～1×10¹³vg/μl,1×10⁴～1×10¹³vg/μl,1×10⁵～1×10¹³vg/μl,1×10⁶～1×10¹³vg/μl,1×10⁷～1×10¹³vg/μl,1×10⁸～1×10¹³vg/μl,1×10⁹～1×10¹³vg/μl,1×10¹⁰～1×10¹³vg/μl,1×10¹¹～1×10¹³vg/μl,1×10¹²～1×10¹³vg/μl,1×10¹～1×10¹²vg/μl,1×10¹～1×10¹¹vg/μl,1×10¹～1×10¹⁰vg/μl,1×10¹～1×10⁹vg/μl,1×10¹～1×10⁸vg/μl,1×10¹～1×10⁷vg/μl,1×10¹～1×10⁶vg/μl,1×10¹～1×10⁵vg/μl,1×10¹～1×10⁴vg/μl,1×10¹～1×10³vg/μl,1×10¹～1×10²vg/μl,1×10²～1×10¹²vg/μl,1×10³～1×10¹¹vg/μl,1×10⁴～1×10¹⁰vg/μl,1×10⁵～1×10⁹vg/μl,1×10⁶～1×10⁸vg/μl,1×10²～1×10³vg/μl,1×10³～1×10⁴vg/μl,1×10⁴～1×10⁵vg/μl,1×10⁵～1×10⁶vg/μl,1×10⁶～1×10⁷vg/μl,1×10⁷～1×10⁸vg/μl,1×10⁸～1×10⁹vg/μl,1×10⁹～1×10¹⁰vg/μl,1×10¹⁰～1×10¹¹vg/μl,1×10¹¹～1×10¹²vg/μl的病毒载体或病毒基因。通常，可以向患者注射1×10⁶～2×10¹⁶vg/dose 1次至5次。为确保效果持久，可采用类似方法在数月或数年后再次注射。

发明的效果

本发明涉及一种α-突触核蛋白抑制用组合物及聚集抑制方法，更具体地，涉及一种导入Nurr1和Foxa2基因诱导其表达，借以抑制α-突触核蛋白聚集(aggergation)和磷酸化(phosphorylation)的技术，依据本发明的组合物抑制α-突触核蛋白的聚集和磷酸化的效果优异，可用于治疗和预防帕金森病。

附图说明

图1显示的是，根据一个实施例，对对照组(Cont)及导入Nurr1和Foxa2基因的多巴胺神经元和胶质细胞(NF)进行α-突触核蛋白预形成纤维(Preformed fibril，PFF)处理后，进行蛋白质印迹分析的结果照片。

图2显示的是，根据有一个实施例，进行蛋白质印迹分析后，比较对照组及Nurr1和Foxa2基因导入组(NF)的α-突触核蛋白聚集程度的图表。

图3显示的是，根据一个实施例，进行蛋白质印迹分析后，呈现对照组及Nurr1和Foxa2基因导入组(NF)的磷酸化α-突触核蛋白单体水平的图表。

图4显示的是，根据一个实施例，进行蛋白质印迹分析后，呈现对照组及Nurr1和Foxa2基因导入组(NF)的磷酸化α-突触核蛋白聚集体水平的图表。

图5显示的是，根据一个实施例，对对照组(Cont)、单独导入Nurr1基因(N)、单独导入Foxa2基因(F)、同时导入Nurr1和Foxa2基因的多巴胺神经元和胶质细胞进行α-突触核蛋白预形成纤维(Preformed fibril，PFF)处理后，进行蛋白质印迹分析的结果照片。

图6显示的是，根据一个实施例，进行蛋白质印迹分析后，比较对照组(Cont)、Foxa2单独导入组(F)、Nurr1单独导入组(N)及Nurr1和Foxa2基因导入组(NF)的α-突触核蛋白聚集体和单体的水平的图表。

图7显示的是，根据一个实施例，野生型(WT)、帕金森病模型对照组(Cont)及导入Nurr1和Foxa2的实验组(NF)的爬杆实验(Pole test)结果图表。

图8显示的是，根据一个实施例，野生型(WT)、帕金森病模型对照组(Cont)及导入Nurr1和Foxa2的实验组(NF)的爬杆实验的结果照片。

图9显示的是，根据一个实施例，野生型(WT)、帕金森病模型对照组(PD)及导入Nurr1和Foxa2的实验组(NF)在第8周的平衡木实验(Beam test)的结果图表。

图10显示的是，根据一个实施例，野生型(WT)、帕金森病模型对照组(PD)及导入Nurr1和Foxa2的实验组(NF)在第12周的平衡木实验的结果图表。

图11显示的是，根据一个实施例，野生型(WT)、帕金森病模型对照组(PD)及导入Nurr1和Foxa2的实验组(NF)的平衡木实验的结果图表。

图12显示的是，根据一个实施例，根据旷场实验(Open Field test；OFT)，野生型(WT)、帕金森病模型对照组(PD)及导入Nurr1和Foxa2的实验组(NF)移动的总距离(Totaldistance)图表。

图13显示的是，根据一个实施例，根据旷场实验，野生型(WT)、帕金森病模型对照组(PD)及导入Nurr1和Foxa2的实验组(NF)的平均速度(Average speed)图表。

图14显示的是，根据一个实施例，野生型(WT)、帕金森病模型对照组(PD)及导入Nurr1和Foxa2的实验组(NF)的旷场实验结果图。

图15显示的是，根据一个实施例，野生型(WT)、帕金森病模型对照组(PD)及导入Nurr1和Foxa2的实验组(NF)在第8周的转棒实验(Rotarod test)的结果图表。

图16显示的是，根据一个实施例，野生型(WT)、帕金森病模型对照组(PD)及导入Nurr1和Foxa2的实验组(NF)在第12周的转棒实验的结果图表。

图17显示的是，根据一个实施例，野生型(WT)、帕金森病模型对照组(PD)及导入Nurr1和Foxa2的实验组(NF)的转棒实验的结果照片。

最新实施方式

一种α-突触核蛋白聚集抑制剂，其包括：选自由装载Nurr1和Foxa2基因的病毒载体；及导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞(brain cells)构成的组中的任一种。

具体实施方式

以下，结合下述实施例对本发明进行更详细的说明。但，这些实施例仅用于本发明的举例说明，本发明的范围不受这些实施例的限制。

实施例1：载体制备

为转导慢病毒而制备了载体。在CMV启动子(promoter)的控制下，将各个cDNA插入到pCDH(System Biosciences公司,Mountain View,CA)的多克隆位点，以生成表达Nurr1或Foxa2的慢病毒载体。pGIPZ-shNurr1和pGIPZ-shFoxa2慢病毒载体购自Open Biosystems公司(Rockford,IL)。空(empty)主干(backbone)载体pCDH或pGIPZ用作阴性对照。慢病毒的滴度使用QuickTiterTM HIV慢病毒定量试剂盒(Cell Biolabs公司，San Diego，CA)测量，每个转导反应使用包含106个转导单位(transducing unit,TU)/ml(60至70ng/ml)的20μl/well(24孔培养板)或2ml/6cm培养皿。

为了通过立体定位(steeotaxic)注射而诱导活体内表达，在CMV启动子的控制下，将各个cNDA亚克隆到pAAV-MCS载体(Addgene公司，Cambridge，MA)，以生成表达Nurr1或Foxa2的AAV。为了评估递送的基因表达效率，还生成了表达绿色荧光蛋白(GreenFluorescence Protein,GF)的AAV。AAV(血清型9或2)的生产、分离纯化在科学技术研究院(大韩民国首尔)完成。AAV的滴度使用QuickTiterTM HIV慢病毒定量试剂盒(Cell Biolabs公司)测量。通过利用单个病毒制剂的混合物(1:1,v:v)感染细胞来完成共同表达研究。

实施例2：细胞培养

2-1.培养腹侧中脑神经干细胞(vental midbrain Neural Progenitor Cell；VMNPC)

将具有多巴胺能潜能(dopaminergic potential)的腹侧中脑神经干细胞，以4x10⁵/孔接种到涂有聚-L-鸟氨酸-纤连蛋白(poly-L-ornitine-fibronectin；PLO-FN)的6孔板(well plate)中。24小时后，在突触蛋白(synapsin)启动子的控制下，分别以10⁶transducing unit(TU)/ml(60–70ng/ml),1:1(v:v)，转导表达Nurr1和Foxa2的慢病毒。对照组使用相同剂量对表达GFP的慢病毒进行了处理。然后，培养三天，分化为神经元。

2-2.腹侧中脑胶质细胞(Vental midbrain glia)的培养

为了培养复测中脑胶质细胞，将小鼠腹侧中脑角质细胞，以3x10⁶个3x10⁶接种到涂有聚-L-鸟氨酸-纤连蛋白100mm x 20mm培养皿(culture dish)中，24小时后，在CMV启动子的控制下，以10⁶transducing unit(TU)/ml(60–70ng/ml),1:1(v:v)混合，转导单独表达Nurr1和Foxa2的慢病毒。对照组使用相同剂量处理了对照病毒。然后，培养了五天。

2-3.共同培养(co-culture)

将实施例2-2中培养的胶质细胞(VM glia)以2:1的比例接种到实施例2-1中培养的多巴胺能中脑神经元(dopaminergic VM neuron)中(VM Neuron:VM glia＝2:1)。第二天，处理α-突触核蛋白预形成纤维(Preformed fibril，PFF)，使其最终浓度达到2μg/ml，7天后，通过蛋白质印迹分析确认α-突触核蛋白的蛋白量。

实施例3：蛋白质印迹分析

在1％ Triton X-100/PBS solution中，添加蛋白酶抑制剂(Proteaseinhibitor；Roche)和磷酸酶抑制剂混合物(phosphatase inhibitor cocktails,Sigma)，从铺板细胞中提取蛋白质。离心后，用1％ SDS样品缓冲液溶解沉淀，并将15μg的蛋白质上样到SDS-PAGE凝胶(4–16％梯度凝胶)上。转膜后，在5％ BSA/TBST中封闭，一抗在4℃条件下孵育过夜，二抗室温下孵育1小时。一抗使用的是α-syn(BD biosciences,610787)；pS129-α-syn(Bio Legend,825701)。另外，蛋白质印迹分析实验结果如图1所示。完成蛋白质印迹分析后，利用ImageJ程序，对蛋白质印迹分析结果进行了定量测量，具体如图2至图4及表1至表3所示。

【表1】

【表2】

【表3】

实施例4：确认Nurr1和Foxa2抑制α-突触核蛋白聚集和磷酸化

蛋白质印迹分析结果如图1所示，证实，与未经Nurr1和Foxa2处理的神经元和胶质细胞相比，对转导Nurr1和Foxa2基因的神经元和胶质细胞进行α-突触核蛋白PFF时，α-突触核蛋白的聚集较比对照组有所减少。另外，还证实，α-突触核蛋白的磷酸化单体和聚集体的水平也较比对照组大幅减少。

具体地，如图2和表1所示，转导Nurr1和Foxa2基因时，聚集的α-突触核蛋白的蛋白量和聚集较比对照组有所减少。另外，如图3至图4及表2至表3所示，证实，转导Nurr1和Foxa2基因时，磷酸化的α-突触核蛋白聚集体的水平较比对照组约减少60％，单体(monomer)约减至30％。

实施例5：比较Nurr1单独给药、Nurr1和Foxa2联合给药对α-突触核蛋白聚集体的抑制效果

对Nurr1单独给药、Foxa2单独给药，或同时导入Nurr1和Foxa2的各个神经元和胶质细胞进行细胞铺板，在1％ Triton X-100/PBS缓冲液中，添加蛋白酶抑制剂(Proteaseinhibitor；Roche)和磷酸酶抑制剂混合物(phosphatase inhibitor cocktails,Sigma)，提取蛋白质。

离心后，用1％ SDS样品缓冲液溶解沉淀，并将15μg的蛋白质上样到SDS-PAGE gel(4–16％gradient gel)上。转膜后，在5％ BSA/TBST中封闭，一抗在4℃条件下孵育过夜，二抗室温下孵育1小时。一抗使用的是α-syn(BD biosciences,610787)；pS129-α-syn(BioLegend,825701)。另外，蛋白质印迹分析实验结果如图5所示。完成蛋白质印迹分析后，利用ImageJ程序，对蛋白质印迹分析结果进行了定量测量，具体如图6至表4所示。

【表4】

实验结果，如图6和表4所示，证实，相较于单独转导Nurr1或Foxa2基因的组(N或F)，同时转导Nurr1和Foxa2基因的组(N+F)的α-突触核蛋白聚集显著减少。具体地，较比对照组，同时转导Nurr1和Foxa2基因的组使α-突触核蛋白聚集减少48％以上，特别是，较比Nurr1单独给药组，使α-突触核蛋白聚集减少32％以上。结果证实，相较于单独导入Nurr1的情况，同时转导Nurr1和Foxa2基因时，可使α-突触核蛋白聚集显著减少，进而预计在治疗帕金森病方面，同时导入Nurr1和Foxa2将更有效。

实施例6：证实在帕金森病模型中导入Nurr1和Foxa2后行为有改善

6-1.帕金森病(PD model)小鼠的制备

混合ICR小鼠AAV2-CMV-αsyn-HA和5μgα-syn PFF后，注射到小鼠的黑质(substantia nigra；SN)中。具体地，使用立体定位仪(stereotaxic instrument)固定小鼠后，将其头部皮肤正中切开约1cm，确认了前囟(bregma)。使用电钻，在以前囟为准的–3.3mm前部(anterior),1.2mm横向位置(lateral position)钻开颅骨，并将AAV2-CMV-α-syn-HA(1.3x10¹³gc/μL)2μL和α-syn PFF(5mg/mL)2μL装入(loading)立体定位注射器(stereotaxic injector)中，进入颅骨4.6mm深度处，以0.5μl/min的速度，分别向黑质两侧缓慢给药2微升(两侧给药部位的各载体给药量为1.3x10¹³gc/site)。两侧黑质部位给药20分钟后，每10分钟撤回注射器1.5mm，以最小化给药混合物的泄漏(leaking)。使用医用皮肤缝合器缝合小鼠颅骨皮肤，并用聚维酮消毒，恢复后将其放入笼中。

给药4周后，通过表达Nurr1、Foxa2的病毒载体转导Nurr1和Foxa2。具体地，使用立体定位仪(stereotaxic instrument)固定小鼠后，将其头部皮肤正中切开约1cm，确认了前囟(bregma)。使用电钻，在以前囟为准的–3.3mm前部(anterior),1.2mm横向位置(lateralposition)钻开颅骨，并将每个载体AAV9-hNurr1和AAV9-hFoxa2以1x10¹⁰gc/μL的浓度装入立体定位注射器(stereotaxic injector)中。进入颅骨4.6mm深度处，以0.5μl/min的速度，分别向黑质部位两侧缓慢给药2微升(两侧给药部位的各载体给药量为1.0x10¹⁰gc/site)。两侧黑质部位给药20分钟后，每10分钟撤回注射器1.5mm，以最小化给药混合物的泄漏(leaking)。使用医用皮肤缝合器缝合小鼠颅骨皮肤，并用聚维酮消毒，恢复后将其放入笼中。

6-2.爬杆实验(Pole test)

转导Nurr1和Foxa2，4周、8周和12周后进行了爬杆实验。实验是在实验前2至3天对小鼠进行预先训练，使其适应后进行的。进行实验时，对野生型(WT)、帕金森病模型对照组(Cont)、Nurr1和Foxa2转导(NF)组的小鼠从杆的上端下降所需的时间进行了测量。实验过程中，当小鼠从杆上掉落或滑落的情况，设置为负值(Negative value)，并设置为与相应周最大值相同的值，完成数据的创建。这时，野生型小鼠测试了6只、对照组和Nurr 1和Foxa2转导组小鼠测试了8只。测得的时间的显著效果通过单因素方差分析(one-way ANOCA)得到确定。

【表5】

实验结果，如图7至图8所示，与野生型、Nurr1和Foxa2转导(NF)组的小鼠相比，对照组小鼠下杆所需的时间更长，从杆上掉落或滑落的频率更高。

6-3.平衡木实验(Beam test)

转导Nurr1和Foxa2，4周、8周和12周后进行了平衡木实验。实验是在实验前2至3天对小鼠进行预先训练，使其适应后进行的。实验使用的平衡木为方形，厚度为10mm。测试时，对野生型(WT)、帕金森病模型对照组(PD)、Nurr1和Foxa2转导(NF)组的小鼠从平衡木的一端移动至另一端所需的时间进行了两次测量。实验过程中，当小鼠从杆上掉落或滑落的情况，设置为负值(Negative value)，并设置为与相应周最大值相同的值，完成数据的创建。这时，野生型小鼠、对照组(PD组)和Nurr 1和Foxa2转导组小鼠均使用了6只。测得的时间的显著效果通过单因素方差分析(one-way ANOCA)得到确定。

【表6】

实验结果，如图7至图8及表6所示，与野生型、Nurr1和Foxa2转导(NF)组的小鼠相比，对照组小鼠穿过平衡木所需的时间更长。

6-4.旷场实验(Open Field test；OFT)

转导Nurr1和Foxa2，8周后进行了旷场实验。实验是在实验前2至3天对小鼠进行预先训练，使其适应后进行的。将野生型(wild type；WT)、帕金森病模型对照组(PD)、Nurr1和Foxa2转导(NF)组的小鼠放入旷场后，对各组小鼠在5分钟内移动的路线、速度和距离等进行了测量。这时，野生型小鼠、对照组(PD)、Nurr1和Foxa2转导组小鼠均使用了6只。测得的时间的显著效果通过单因素方差分析(one-way ANOCA)得到确定。

【表7】

【表8】

实验结果，如图12至图14及表7所示，证实，Nurr1和Foxa2转导(NF)组小鼠的行为得到改善，其与野生型在移动的总距离和平均速度上几乎没有差异。此外，与对照组(PD)相比，Nurr1和Foxa2转导(NF)组小鼠移动的总距离和移动时的平均速度显著提高。

6-5.转棒实验(Rotarod Test)

转导Nurr1和Foxa2，8周和12周后进行了转棒实验。实验是在实验前2至3天对小鼠进行预先训练，使其适应后进行的。进行实验时，从4rpm缓慢增速至40rpm，对野生型(wildtype；WT)、帕金森病模型对照组(PD)、Nurr1和Foxa2转导(NF)组的小鼠从棒上掉落的时间测量了两次。这时，野生型小鼠、对照组(PD组)、Nurr1和Foxa2转导组小鼠均使用了6只。测得的时间的显著效果通过单因素方差分析(one-way ANOCA)得到确定。

【表9】

【表10】

实验结果，如图15至图17及表9至表10所示，相较于对照组，Nurr1和Foxa2转导(NF)组的小鼠在第8周和第12周从棒上掉落时所需的时间更长。

6-6.小结

因此，证实，相较于帕金森病模型对照组，Nurr1和Foxa2转导(NF)组的小鼠在爬杆实验、平衡木实验、旷场实验和转棒实验中均表现出运动能力和行为得到显著改善。通过上述结果证实，Nurr1和Foxa2基因导入可使帕金森病特有的僵直、运动迟缓、姿势不稳等运动能力的下降得到恢复，因此，期待Nurr1和Foxa2基因导入能够用于帕金森病的治疗。

【工业可用性】

本发明涉及一种α-突触核蛋白抑制用组合物及聚集抑制方法，更具体地，涉及一种导入Nurr1和Foxa2基因诱导其表达，借以抑制α-突触核蛋白聚集(aggergation)和磷酸化(phosphorylation)的技术。

Claims (14)

1.一种α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集抑制剂，其包括：选自由包含Nurr1和Foxa2基因的基因载体；及导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞(brain cells)构成的组中的任一种。

2.如权利要求1所述的α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集抑制剂，所述基因载体为病毒载体。

3.如权利要求2所述的α-突触核蛋白聚集抑制剂，所述病毒载体为选自由腺相关病毒载体、逆转录病毒载体和腺病毒载体构成的的组中的一种。

4.如权利要求1所述的α-突触核蛋白聚集抑制剂，所述脑细胞(brain cells)为神经元(neurons)，及包括星形胶质细胞(astrocyte)或小胶质细胞(microglia)的胶质细胞(glia)。

5.一种α-突触核蛋白(α-synuclein)磷酸化抑制剂，其包括：选自由包含Nurr1和Foxa2基因的基因载体；及导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞(brain cells)构成的组中的任一种。

6.如权利要求5所述的α-突触核蛋白(α-synuclein)磷酸化抑制剂，所述基因载体为病毒载体。

7.如权利要求6所述的α-突触核蛋白(α-synuclein)磷酸化抑制剂，所述病毒载体为选自由腺相关病毒载体、逆转录病毒载体和腺病毒载体构成的的组中的一种。

8.如权利要求5所述的α-突触核蛋白(α-synuclein)磷酸化抑制剂，所述脑细胞(braincells)为神经元(neurons)，及包括星形胶质细胞(astrocyte)或小胶质细胞(microglia)的胶质细胞(glia)。

9.一种用于预防或治疗因α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集而发病的疾病的组合物，其包括：选自由包含Nurr1和Foxa2基因的基因载体；及导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞(brain cells)构成的组中的任一种。

10.如权利要求9所述的用于预防或治疗因α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集而发病的疾病的组合物，所述基因载体为病毒载体。

11.如权利要求10所述的用于预防或治疗因α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集而发病的疾病的组合物，所述病毒载体为选自由腺相关病毒载体、逆转录病毒载体和腺病毒载体构成的的组中的一种。

12.如权利要求9所述的用于预防或治疗因α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集而发病的疾病的组合物，所述脑细胞(brain cells)为神经元(neurons)，及包括星形胶质细胞(astrocyte)或小胶质细胞(microglia)的胶质细胞(glia)。

13.如权利要求9所述的用于预防或治疗因α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集而发病的疾病的组合物，所述因α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集而发病的疾病为选自由帕金森病(Parkinson’s disease)和路易体痴呆(Dementia with Lewy Bodies)构成的组中的一种疾病。

14.一种治疗因α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集而发病的疾病疾病的方法,其包括：向受试者施用组合物,该组合物含有选自由以下组成的组中的任一种：选自由包含Nurr1和Foxa2基因的基因载体；及导入Nurr1和Foxa2基因的脑细胞(brain cells)构成的组中的任一种。