JP2004187533A - 非分節(−)鎖rnaウイルス発現ベクター - Google Patents
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Abstract
【課題】各種の細胞株において転写活性を有し、効率よくウイルスを産生することが可能な狂犬病ウイルスのような非分節(−)鎖RNAウイルス発現ベクター、及びその利用を提供すること。
【解決手段】非分節(−)鎖RNAウイルスcDNAの両端にリボザイムの配列を配置することによって、各種の細胞株においてウイルスの複製を行うことができる発現ベクターを構築することができる。本発明のウイルス発現ベクターには、プロモーターとして、サイトメガロウイルスプロモーターが用いられる。本発明のウイルス発現ベクターは、この発現ベクターに外来遺伝子を組み込んで用いることにより、外来遺伝子の標的細胞での発現を行うベクターとして、及び薬理活性を有するペプチド医薬のデリバリー用の組成物として用いることができる。
【解決手段】非分節(−)鎖RNAウイルスcDNAの両端にリボザイムの配列を配置することによって、各種の細胞株においてウイルスの複製を行うことができる発現ベクターを構築することができる。本発明のウイルス発現ベクターには、プロモーターとして、サイトメガロウイルスプロモーターが用いられる。本発明のウイルス発現ベクターは、この発現ベクターに外来遺伝子を組み込んで用いることにより、外来遺伝子の標的細胞での発現を行うベクターとして、及び薬理活性を有するペプチド医薬のデリバリー用の組成物として用いることができる。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、非分節(−)鎖RNAウイルスcDNAの両端にリボザイムの配列を配置した細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター、特に、狂犬病ウイルスcDNAの両端にリボザイムの配列を配置した細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクターに関する。
【0002】
【従来の技術】
有用なタンパク質をコードする遺伝子を、発現ベクターに組み込み、それを宿主細胞に導入して、遺伝子を発現する技術は既に周知のところであり、発現ベクターとして、ウイルスを基にして構築されたベクターも多くのものが知られている。近年は、ウイルスベクターを、外来遺伝子を標的細胞へ挿入するためのキャリヤーとしての利用が開発されており(Bio/Technology 3, 222, 1995、Cancer Gene Therapy 1, 51, 1994)そのためのベクターの改良もなされている(特表平8−501453号公報、特開平10−4979号公報)。
【0003】
狂犬病ウイルスをベクターとして用いることも既に周知のところである。狂犬病ウイルスは、非分節(−)鎖RNAウイルスであり、ラブドウイルス(Rhabdoviridae)科リッサウイルス(Lyssavirus)属に属する。モノネガウイルスの完全長cDNAからウイルスを回収する方法は、狂犬病ウイルスを用いてSchnellらにより1994年に初めて開発された(EMBO J. 13, 4195−4203, 1994)。
この狂犬病ウイルスcDNA発現系は、欧州のワクチン株であるSAD B19株(Virology 175,485−499,1990)を用いて開発された。この方法は、狂犬病ウイルスの詳細な分子生物学的解析及びワクチン・ベクター開発などの研究を可能にした(特開平8−168381号公報)。
【0004】
Schnellらにより、狂犬病ウイルスを用いて完全長cDNAからRNAウイルスを回収する方法(リバースジェネティクス)が開発されて以来、別のラブドウイルスである水疱性口内炎ウイルス(vesicular stmatitis virus)のリバースジェネティクス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4477−4481, 1995、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8388−83, 1995)及びパラミクソウイルスに属する麻疹ウイルス(paramyxoviruses measles virus)のリバースジェネティクス(ENBO J. 14, 5773−5784, 1995)、呼吸器合胞体ウイルス(respiratory syncytial virus)のリバースジェネティクス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11563−11567, 1995)、及びセンダイウイルス(Sendai Virus)のリバースジェネティクス(ENBO J. 14, 6087−6094, 1995、Genes Cells 1, 569−579, 1996)が基本的に同様の技術を用いて報告されてきた。
【0005】
狂犬病ウイルスを宿主細胞に感染させた場合に、その感染サイクルの開始のためには、完全長ポジティブセンス(positive sense)RNAは、転写後すぐに導入細胞においてキャプシドに包まれる(encapidated)必要がある。従って、該機能を得るために、従来法においては、ウイルスRNAポリメラーゼ(L及びPタンパク質)及びヌクレオキャプシド(N)タンパク質(ヘルパープラスミドとして公知である)をコードするプラスミドを同時に導入することが行われ、結果としてリボヌクレオキャプシドを活性化するという方法が行われた。今まで、完全長アンチゲノムRNA及び上記3つのウイルスmRNAの一次転写はT7RNAポリメラーゼの制御下で行われた。3つのグアニジン残基は、T7RNAポリメラーゼに最適の開始配列を形成し、アンチゲノムRNA転写物の5´末端に付加された。
【0006】
更に、生産的感染サイクルを開始するためには、一次ウイルスアンチゲノムRNA転写物の3´末端側の正確な切断が必要とされる。該切断は下記のデルタ肝炎型リボザイム(HdvRz)転写物の自己切断(autolytic cleavage)によって達成される。従来の方法では、T7RNAポリメラーゼを供給するために、組換えワクシニアウイルス、vTF7−3(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122−8126, 1986)の感染か、又は恒常的にT7RNAポリメラーゼを発現する細胞株であるBSR−T7/5(J. Virol. 73, 251−259, 1999)を用いることが必要であった。
【0007】
このように、従来報告されている狂犬病ウイルスcDNAの発現系のような、非分節(−)鎖RNAウイルスのcDNA発現系は、トランスフェクトしたプラスミドをT7RNAポリメラーゼにより転写を行い、(+)鎖の完全長ゲノムRNA及びN,P,L mRNAを同時に発現させることでウイルスの複製を可能にし、組換えウイルスを得るというものであった。従って、該RNAウイルスのcDNA発現系は、その複製には、T7RNAポリメラーゼを発現する特定の細胞種を用いるか、或いは、T7RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスを同時に感染させるか、という制約があった。
【0008】
一方で、細胞内ポリメラーゼI及びIIを利用するリバースジェネティクス技術が、分節マイナス鎖RNAウイルス、例えばインフルエンザAウイルスのために開発された(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9345−9350, 1999、J. Virol. 73, 9679−9682, 1999、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6108−6113, 2000)。該システムは、T7RNAポリメラーゼを使用せず、インフルエンザリバースジェネティクスを顕著に改良し、構築された。ごく最近になって、ウイルスミニゲノムRNAの正確な末端を作製するために、斬新なcDNAプラスミドがMercierらによって開発された(J. Virol. 76, 2024−2027, 2002)。該プラスミドはハンマーヘッド型リボザイム(HamRz)とHdvRz cDNAの間に挟まれるマイナス鎖ミニゲノムcDNAからなる。
上記のように、ウイルスの両末端の余分なヌクレオチドを切断する技術が開発された。
【0009】
【特許文献1】
特表平8−501453号公報
【特許文献2】
特開平10−4979号公報
【非特許文献1】
Bio/Technology 3, 222, 1995
【非特許文献2】
Cancer Gene Therapy 1, 51, 1994
【非特許文献3】
EMBO J. 13, 4195−4203, 1994
【非特許文献4】
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122−8126, 1986
【非特許文献5】
J. Virol. 73, 251−259, 1999
【非特許文献6】
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6108−6113, 2000
【0010】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、各種の細胞株において転写活性を有し、効率よくウイルスを産生することが可能な狂犬病ウイルスのような非分節(−)鎖RNAウイルス発現ベクター、及びその利用を提供することにある。
【0011】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、狂犬病ウイルスcDNAのような非分節(−)鎖RNAウイルスcDNA発現ベクターの利用に際して、従来のように、その転写複製に、T7RNAポリメラーゼを発現する特定の細胞種を用いなければならないとか、或いは、T7RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスを同時に感染させなければならないとかという制約がない発現ベクター、即ち、各種の細胞株において転写活性を有し、複製が可能な発現ベクターの開発について、鋭意研究を行った結果、非分節(−)鎖RNAウイルスcDNAの両端にリボザイムの配列を配置することによって、従来のような特定の細胞種の使用の限定や、或いは、特定のウイルスの同時感染が必要という制約がなく、細胞内RNAポリメラーゼIIを有する細胞であれば転写が可能であり、したがって、各種の細胞株においてウイルスの複製を行うことができる発現ベクターの構築が可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【0012】
即ち、具体的には本発明においては、ウイルス完全長ゲノムRNA転写物の本来の5´及び3´末端を作製するために、非病原性狂犬病ウイルスである、HamRzとHdvRz配列を両端にもつHEP−Flury株より完全長cDNAを含むプラスミドを構築し、該構築物をサイトメガロウイルス(CMV)前初期プロモーターの下流に配置することによって、該プラスミドの転写が細胞RNAポリメラーゼIIのコントロール下で行われることを見い出し、本発明をなした。本発明の発現ベクターはT7RNAポリメラーゼの補充を必要とせず、かつ、基本的に、cDNAプラスミドから組換えウイルスを産生するために組換えワクシニアウイルスに感染せずともすべての細胞株に適用でき、各種の細胞株において狂犬病ウイルスの転写を可能とた。その結果、ウイルスの回収が改善され、効率よくウイルスを産生することを可能とした。
【0013】
上記のように、本発明の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクターには、プロモーターとして、サイトメガロウイルスプロモーターが用いられる。リボザイムとしては、改変ハンマーヘッド型リボザイム及び/又は肝炎デルタウイルス型リボザイムを用いることができる。本発明の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクターは、この発現ベクターに外来遺伝子を組み込んで用いることにより、外来遺伝子の標的細胞での発現を行うベクターとして用いることができる。また、該外来遺伝子として薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組込むことにより、医薬のデリバリー用の組成物として利用することができる。
【0014】
具体的には本発明は、非分節(−)鎖RNAウイルスcDNAにリボザイムの配列を配置したことを特徴とする細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター(請求項1)や、非分節(−)鎖RNAウイルスcDNAが、狂犬病ウイルスcDNAであることを特徴とする請求項1記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター(請求項2)や、狂犬病ウイルスcDNAが、狂犬病ウイルス HEP−Flury株であることを特徴とする請求項2記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター(請求項3)や、非分節(−)鎖RNAウイルスcDNAの完全長ゲノムcDNAの両端にリボザイム配列を配置したことを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター(請求項4)や、リボザイムが、改変ハンマーヘッド型リボザイム及び/又は肝炎デルタウイルス型リボザイムであることを特徴とする請求項4記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター(請求項5)や、細胞内RNAポリメラーゼ転写活性が、細胞内RNAポリメラーゼII転写活性であることを特徴とする請求項1〜5のいずれか記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター(請求項6)や、サイトメガロウイルスプロモーターの下流に、非分節(−)鎖RNAウイルスcDNAにリボザイムの配列を配置した配列を結合したことを特徴とする細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター(請求項7)や、非分節(−)鎖RNAウイルスcDNAにリボザイムの配列を配置した配列が、請求項2〜6のいずれか記載の狂犬病ウイルスcDNAにリボザイムの配列を配置した配列であることを特徴とする請求項7記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター(請求項8)や、請求項1〜8記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクターに外来遺伝子を組み込んだことを特徴とする細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有する外来遺伝子組換えウイルス発現ベクター(請求項9)からなる。
【0015】
また本発明は、請求項1〜9記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクターを、真核宿主細胞中に導入し、該真核宿主細胞中で発現させ、該真核宿主細胞中から回収することを特徴とする組換え非分節(−)鎖RNAウイルスの回収方法(請求項10)や、組換え非分節(−)鎖RNAウイルスが、狂犬病ウイルスHEP−Flury株であることを特徴とする請求項10記載の組換え非分節(−)鎖RNAウイルスの回収方法(請求項11)や、真核宿主細胞が、哺乳類細胞であることを特徴とする請求項10又は11記載の非分節(−)鎖RNAウイルスの回収方法(請求項12)からなる。
【0016】
さらに本発明は、請求項9記載の外来遺伝子組換えウイルス発現ベクターを、標的細胞と接触させ、標的細胞中に導入することを特徴とするにより外来遺伝子の標的細胞での発現方法(請求項13)や、外来遺伝子が、ワクチン抗原、インターロイキン、酵素、又は生理活性を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項13記載の外来遺伝子の標的細胞での発現方法(請求項14)や、外来遺伝子として、薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組み込んだ請求項9記載の外来遺伝子組換えウイルス発現ベクターと医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバント及び/又は賦形剤からなる医薬デリバリー用組成物(請求項15)からなる。
【0017】
【発明の実施の形態】
本発明は、狂犬病ウイルスcDNAのような非分節(−)鎖RNAウイルスcDNAの両端にリボザイムの配列を配置することにより、細胞内RNAポリメラーゼの転写活性を有するウイルス発現ベクターを構築することよりなる。狂犬病ウイルスの場合を例にとって、本発明のウイルス発現ベクターの構築について説明する。
まず、本発明のウイルス発現ベクターの構築に用いる狂犬病ウイルス株としては、ワクチン株として開発されたSAD B19株やRC−HL株のような非病原性のウイルス株を用いることができる。しかし、日本においてヒト用ワクチン株として用いられているHEP−Flury株が特に好ましい。発現ベクターの構築には、狂犬病ウイルス HEP−Flury株より、完全長ゲノムcDNAを作製し、この完全長ゲノムcDNAの両端に、リボザイムの配列を配置する。該リボザイムとしては、改変ハンマーヘッド型リボザイム及び/又は肝炎デルタウイルス型リボザイムを挙げることができる。
【0018】
該完全長ゲノムcDNAとリボザイムの配列からなる構築物を、サイトメガロウイルスプロモーターの下流に、挿入した。このようにして構築した狂犬病ウイルス発現ベクターは、細胞内RNAポリメラーゼ(RNAポリメラーゼII)により転写される。したがって、この狂犬病ウイルス発現ベクターを、BHK細胞やNA細胞等の各種哺乳類細胞等に、例えば、リン酸カルシウム法や、ポリアミン法のような方法によりトランスフェクトすることにより、組換えウイルスを複製し、回収することができる。
本発明の発現ベクターに外来遺伝子を組み込んで、ウイルス発現ベクターとして用いることができる。該外来遺伝子としては、ワクチン抗原、インターロイキン、酵素、又は生理活性を有するペプチドをコードする遺伝子等、有用なタンパク質をコードする適宜の遺伝子を挙げることができる。
【0019】
また、本発明のウイルス発現ベクターは、外来遺伝子の標的細胞での発現に用いることができる。本発明のウイルス発現ベクターに外来遺伝子を組み込んで、標的細胞と接触させ、標的細胞中に導入することにより、外来遺伝子を標的細胞で発現することができる。したがって、本発明のウイルス発現ベクターは、外来遺伝子として薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組み込んで、薬理活性を有するペプチド(医薬)のデリバリーシステムとして用いることができる。そのようなデリバリーシステム用の組成物としては、外来遺伝子として、薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組み込んだ、外来遺伝子組換えウイルス発現ベクターと医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバント及び/又は賦形剤等を適宜配合して、医薬デリバリー用組成物として用いることができる。
【0020】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
[材料と方法]
(ウイルス及び細胞)
狂犬病ウイルスの非病原性HEP−Flury株を用いて完全長cDNA及び各ウイルス遺伝子、N、P、G、及びL cDNAsをcDNAクローニングした(全塩基配列を配列表の配列番号1に示す。配列表の全塩基配列11615中、N遺伝子は71〜1423の塩基配列で、P遺伝子は1514〜2407の塩基配列で、M遺伝子は2496〜3104の塩基配列で、G遺伝子は3318〜4892の塩基配列で、L遺伝子は5101〜11484の塩基配列で表示される。また、F1領域は1〜2365の塩基配列で、F2領域は2359〜4944の塩基配列で、F3領域は4995〜10146の塩基配列で、F4領域は10141〜11615の塩基配列で示される。)
A/Jマウス由来の神経芽腫NA細胞及びサルVero細胞を、熱変性した10%ウシ胎児血清(FBS)を含む最小必須培地(MEM)中で37℃で培養した。BHK−21細胞、BSR−T7/5細胞(BHK−21由来の細胞株であり、恒常的にT7RNAポリメラーゼを発現する(J. Virol. 73, 251−259, 1999)。)、及びヒト胎児腎細胞293T(複製可能なサルウイルス40ラージT抗原を産生する(Mol. Cell Biol. 7, 379−387, 1987)。)を、10%FBSを含むダルベッコ変法イーグル培地(D−MEM)中で37℃で培養した。
【0021】
(プラスミドの作製)
(1)cDNAの作製
cDNAを得るために、プロトコールに従いISOGEN(Nippon gene社製、Japan)を使用して、狂犬病ウイルスHEP−Flury株に感染したNA細胞から全RNAを抽出した。逆転写酵素(RTase)反応を、下記のとおり、トリ骨髄芽球症ウイルス(myeloblastosis)RTase(Takara社製、Japan)、及びオリゴdT又は狂犬病ウイルス特異的プライマーを用いて、42℃で1時間行なった。下記の表1に示した、N、P、L、及びG用のプライマーセットと、Pyrobest DNA polymerase(Takara社製、Japan)を用いてPCRにより逆転写産物を増幅した。
【0022】
【表1】
【0023】
(2)完全長cDNAの作製
長いcDNA(longer cDNA)(L遺伝子及び完全長cDNA)を得るために、SuperScript II RTase及びeLONGase Enzyme Mix(Life Technologies社製)を用いて、RT−PCRを行った。PCR増幅は、目的増幅産物1キロベースあたり、94℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、及び68℃で60秒間の合成というサイクルで30サイクル行なった。ウイルスN、P、L、及びGタンパク質を産生するヘルパープラスミドを作製するために、pcDNA3.1/Zeo(+)ベクター(Invirogen社製)のマルチクローニングサイトにPCR産物を挿入し、それぞれpH−N、pH−P、pH−L、及びpH−Gを作製した。これらの遺伝子をその後CMVプロモーター及びT7プロモーターの制御下で発現させた。
【0024】
また、既に、HEP−Flury株の5つのウイルス遺伝子全て(N、P、M、G、及びL)のヌクレオチド配列が報告されている(Microbiol. Immunol. 41, 229−240, 1997、Microbiol. Immunol. 42, 761−771, 1998、Microbiol. Immunol. 43, 259−270, 1999、Virology 173, 465−477, 1989、Microbiol. Immunol. 42, 485−496, 1998)。完全長cDNAを合成するために、制限酵素認識部位を利用して、最初に以下の4つのcDNA断片(F1、F2、F3及びF4)を作製した(図1)。なお、F1:HST7−5プライマーで増幅されるLeader−BlpI断片、F2:H−Blp5プライマーで増幅されるBlp I−Xma I断片、F3:H−Bsr5プライマーで増幅されるBsr I−Nar I断片、及びF4:H−Kasafx5プライマーで増幅されるNar I−Trailer断片を表し、作製に用いたプライマーを表2に示した。
【0025】
【表2】
【0026】
次に、付加GGG配列を持つT7プロモーター、5’− gcgcgcTAATACGACTCACTATAGGG −3’(BssH II部位を小文字で示す。配列番号18)をF1 cDNA産物のリーダー領域の前に挿入した。HdvRz cDNAの配列、5’− GGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCGggtacc −3’(Kpn I部位を小文字で示す。Annu. Rev. Biochem. 61, 641−671,1992、配列番号19)をF4 cDNA産物のトレーラー領域の後ろに加えた。F2とF3断片間に、本来の偽遺伝子の代わりにウイルス転写性単位及び特異制限酵素部位を含む合成オリゴヌクレオチド配列を、XBPNA5;5’− CCGGGGaaaaaaaCTaacaCCTCTcgtacgATTctgcagTTTgctagcAGGACCG −3’(ポリ(A)シグナル、転写開始シグナル、BsiW I部位、Pst I部位、Nhe I部位の順に小文字で示した。配列番号20)、及び相補的XBPNA3;3’− CCtttttttGAttgtGGAGAgcatgcTAAgacgtcAAAcgatcgTCCTGGCCATG −5’(ポリ(A)シグナル、転写開始シグナル、BsiW I部位、Pst I部位、Nhe I部位の順に小文字で示した。配列番号21)の二本鎖オリゴヌクレオチドとして挿入した。最後に、BssH II−Kpn I完全長cDNA断片の11735塩基をpBluescript II SK(+)(Stratagene社製)のマルチクローニング部位に挿入し、pHEP−1.0を得た。
【0027】
完全長プラスミドpHEP−1.0においてウイルスリーダー配列に続くT7プロモーターと付加GGG配列の代わりに、CMVプロモーターDNA(pcDNA3.1/Zeo(+)プラスミドの670塩基Mlu I−Nhe I断片)及びHamRbz配列cDNA、5’− TGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCacgcttaaca−3’(ウイルスリーダー配列を小文字で示す。Eur. J. Biochem. 247, 741−753,1997、配列番号22)を完全長cDNAプラスミドに挿入した(pHEP−2.0を得た)。pHEP−2.0の基幹プラスミドをpcDNA3.1/Zeo(+)プラスミドに取り替え、pHEP−3.0を得た。得られた全てのcDNAに変異が起こっていないかを調べるために配列決定を行った。本研究において構築した組換え型HEP−Flury株の完全長cDNAの配列はGenBankデータベースに登録した(アクセッションナンバー:AB085828、配列番号1)。
【0028】
(狂犬病ウイルスの産生)
10%FBSを含むD−MEM又はMEM中の6ウェルプレートにおいてBSR−T7/5細胞、BHK−21細胞、NA細胞、293T細胞、及びVero細胞を一晩培養して80%の濃度(1ウェルあたり4〜6×105)とした。導入前に、古い培地を新鮮な培地に交換した。製造者の手順に従い、完全長プラスミド2.0μg、pH−N 0.5μg、pH−P 0.25μg、pH−L 0.1μg、及びpH−G 0.15μgを、TransIT LT−1(Panvera社製、Madison, WI)を用いて細胞に導入した。pH−Gプラスミド(ウイルス糖タンパク質を挿入した)の導入は回収されたウイルスの産生に不可欠ではないが、Gタンパク質を供給することにより時にウイルスの産生量を改善する(J. Neurovirol. 6, 373−381, 2000)。16時間から24時間後に、細胞を一度洗浄した後、10%FBSを含むD−MEM又はMEMでさらに2〜5日培養を続けた。培養培地をNA細胞に加え、34℃で3日間インキュベーションした。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識狂犬病ウイルスNタンパク質特異的抗体(Centcor Inc.社製、Malvern, PA)を使用して免疫蛍光検査アッセイにより、NA細胞に回収されたウイルスが存在するかを調べた。回収されたウイルスはその後さらなる実験用ウイルスストックとするため、NA細胞に感染させ、増幅させた。完全長プラスミドpHEP−1.0及びpHEP−3.0から産生された回収されたウイルスはそれぞれrHEP−1.0とrHEP−3.0と表した。
【0029】
(ウイルスの検定)
ウイルスの力価を決定するため、96ウェルプレート中で、NA細胞の単層を文献記載の方法(Dev. Biol. Stand. 57, 199−211, 1984)に従いウイルス懸濁液の10倍に段階希釈したウイルス懸濁液で感染させ34℃でインキュベートした。感染後48時間で、細胞を80%のアセトンで固定し、FITC標識した狂犬病ウイルスNタンパク質特異的抗体で染色した。感染巣(foci)を蛍光顕微鏡下で数え、1mLあたりの感染形成ユニット(ffu/ml)として計算した。検定は全て3回行ない、平均値をウイルス力価として用いた。
【0030】
[発現ベクターの構築及び各種細胞株での転写・複製]
(ウイルスベクターとしての完全長cDNAプラスミドの構築)
狂犬病ウイルスHEP−Flury(Kyoto)株のN、P、M、G、及びLの5つのウイルス遺伝子すべてのヌクレオチド配列はすでに文献に記載されている(Microbiol. Immunol. 41, 229−240, 1997、Microbiol. Immunol. 42, 761−771, 1998、Microbiol. Immunol. 43, 259−270, 1999、Virology 173, 465−477, 1989、Microbiol. Immunol. 42, 485−496, 1998)。本研究においては、HEP−Flury(Tokyo)株をcDNAクローニング用に使用した。これら2つの株は同じ起源に由来するが、30年以上別々に継代し維持されてきた。HEP−Flury(Kyoto)株と比較すると、HEP−Flury(Tokyo)株のcDNA配列においては、コード領域で、変異アミノ酸(alterd amino acids)となる数個の変異がサイレント変異と同様に示された(表3)。このcDNA配列の差異はゲノム配列自体又はcDNAのクローニング工程により引き起こされた。
【0031】
【表3】
【0032】
まず最初に、本発明者らは、最初に構築したプラスミドを使用して回収実験を行ったが、該プラスミドからは回収したウイルスを回収することはできなかった。ヘルパープラスミドcDNAsと完全長プラスミドcDNA間の異なるアミノ酸をHEP−Flury(Kyoto)株の該当アミノ酸に置換した。アミノ酸を置換することによりこれらcDNAプラスミドから狂犬病ウイルスを回収することが可能となった。以上の結果からPタンパク質の81及び82番目のアミノ酸、及びLタンパク質の171、668、及び1478番目ののアミノ酸は、正常なタンパク質の折りたたみと共にウイルスポリメラーゼの機能及び/又は複製に不可欠であることを示す。3つのアミノ酸(Pタンパク質の174番目、Gタンパク質の14番目、Lタンパク質の2127番目のアミノ酸)のみが2つの実験株の間で異なった。
【0033】
完全長cDNAの合成過程で、T7又はCMVプロモーター配列及びリボザイム配列を加えた(材料と方法の図1を参照のこと)。狂犬病ウイルスゲノムはGとL遺伝子の間に400塩基長の非翻訳偽遺伝子(untranlated pseudogene)を持つ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 3914−3918, 1986)。偽遺伝子配列は細胞培養においてウイルスの蔓延、病原性、または伝播には関与せず(EMBO J. 13, 4195−4203, 1994、J. Neurovirol. 4, 115−119, 1998)、従ってウイルスベクターとして感染性組換えウイルスゲノムを操作するのに適した領域である。偽遺伝子はSchnellら(J. Virol. 70, 2318−2323, 1996)の考えに基づき合成のオリゴヌクレオチド断片と置換された。該合成オリゴヌクレオチド断片においては、外来遺伝子の挿入をする目的で、転写開始シグナルとポリAシグナル、及び特異的制限酵素部位を設けた。従来の方法(EMBO J. 13, 4195−4203, 1994)と同様に、cDNAをトランスフェクトした細胞中のpHEP−1.0プラスミドにおけるアンチゲノムRNAの初期転写はT7RNAポリメラーゼによって引き起こされ、アンチゲノムRNAの5´末端に付加的なGGGヌクレオチド配列を含む。
【0034】
一方、pHEP−3.0プラスミドにおけるアンチゲノムRNAの初期転写は細胞RNAポリメラーゼIIによって引き起こされる。cDNAをトランスフェクトした細胞において、ウイルスリーダー領域に先行するハンマーヘッドリボザイムが最初に転写され、ウイルスRNAは正確な5´末端となる。ウイルストレーラー領域に続くデルタ肝炎ウイルスリボザイムは抗ゲノムウイルスRNAの正確な3´末端を合成する。該プラスミドから産生された組換えウイルスゲノム構造物は、アンチゲノム5´末端の3連G(グアニン)ヌクレオチドの付加を除いて、同一である。
【0035】
(各種細胞株における狂犬病ウイルスの複製・回収)
T7RNAポリメラーゼを供給するため、恒常的にT7RNAポリメラーゼを発現するBSR−T7/5細胞株を使用した。複製された狂犬病ウイルスはBSR−T7/5細胞株においてのみ、プラスミドから回収された。pHEP−3.0で感染されると、ウイルス完全長RNAは細胞RNAポリメラーゼIIの制御下で転写される。ヘルパープラスミドは、CMVプロモーターとT7プロモーターの制御下でN、P、L、及びGタンパク質を発現する。ウイルスRNAの正しい5´末端及び3´末端は、その近接するリボザイムによってもたらされる自己分解的開裂(autolytic cleavage)により産生される。このメカニズムは、理論的にはどの細胞株でも起こる。従って、BSR−T7/5細胞と同様にBHK−21細胞、NA細胞、及び293T細胞におけるpHEP−3.0からウイルスを回収した(表4)。興味深いことに、Vero細胞がpHEP−3.0に感染したとき、組み換えウイルスは検出されなかった。
【0036】
【表4】
【0037】
回収されたウイルスがcDNAプラスミドに由来することを確認するために、回収されたウイルスに感染した細胞からのRNAをRT−PCRにより解析した。本来の野生型HEP−Flury株、及び回収されたウイルスからのPT−PCR産物の偽遺伝子領域(GとL遺伝子間)をアガロースゲル電気泳動法により調べた(図2)。本来のHEP−Flury株から1696塩基長のRT−PCR産物を産生する偽遺伝子を取り除き、付加的な転写単位(additional trascriptional unit)及び制限酵素部位と置換したところ、回収されたウイルスから1387塩基長の産物が産生された(図2B)。組換えウイルスrHEP−1.0及びrHEP−3.0のRT−PCR産物はPst I消化後に2個の断片ができたが、野生型HEP−Flury株からのRT−PCR産物は影響を受けなかった(図2C)。増幅された断片の配列解析により、実際に回収したウイルスがcDNAプラスミドに由来することが確認された。
pHEP−1.0及びpHEP−3.0からのウイルス回収効率を比較するため、本発明者らは増幅過程を経ずにBSR−T7/5細胞、BHK−21細胞、及びNA細胞においてしたウイルス量を測定した(表5)。
【0038】
【表5】
【0039】
pHEP−1.0からのウイルスの回収は、BSR−T7/5細胞にトランスフェクトしたもののみウイルスが回収され、感染した細胞のすべてのウェルからは回収されず、低効率であった。NA細胞でのウイルスの増幅が、高濃度の回収ウイルスを得るのに必要であることが明らかになった。一方、pHEP−3.0を導入すると、BSR−T7/5細胞、BHK−21細胞、及びNA細胞株のすべてにおいてウイルスを産生した。 ほとんどすべてのウェルにおいて、高濃度の回収ウイルスが増幅過程を必要とせずに得られた(表5)。ウイルス回収のための導入条件を最適化するため、本発明者らはヘルパープラスミドと完全長プラスミドを異なった量と比率で各細胞株に導入した。
【0040】
本発明者らは最適の導入状態が2.0μgの完全長プラスミド、0.5μgのpH−N、0.25μgのpH−P、0.1μgのpH−L、及び0.15μgのpH−Gであるという結論に達した。しかしながら、ウイルスの力価は最適のトランスフエクション条件下でも1×102から2×107ffu/mlの間で異なり、回収効率は多くの因子によって影響されることを示した。例えば、導入するプラスミドの量を2倍量変化させても回収効率を低減させることない。2つの要因によって変えることができる。導入したNA細胞5×105から最大で4×107ffuが回収された。以上の結果は、従来のT7ポリメラーゼによるシステムと比べて、本新規CMVプロモーターシステムが狂犬病ウイルスを効率よく回収できることを示す。
【0041】
[実施例の結果]
本発明は、狂犬病ウイルスをcDNAプラスミドから作製する方法に関するものであり、SAD−B19株(EMBO J. 13, 4195−4203, 1994)及びRC−HL株(J. Virol. 75, 9121−9128, 2001)に続く。本発明者は、2つの異なる完全長構築プラスミド、すなわちpHEP−1.0及びpHEP−3を使用してcDNAプラスミドから狂犬病ウイルスHEP−Flury株を回収することについて述べてきた。pHEP−1.0は従来の方法と同様にT7RNAポリメラーゼを利用する。新規リバースジェネティクスシステム(pHEP−3.0)は、細胞RNAポリメラーゼIIを利用し、T7RNAポリメラーゼを必要とせず、原則としてどの細胞株においても、cDNAプラスミドからウイルスを産生することができる。この新規システムにより、ウイルスの回収効率が著しく高められると共に、組み換えウイルスの作製がはるかに容易となった。
【0042】
それでもやはり、ウイルス回収効率は使用した細胞株により異なった。回収効率は導入細胞における多くの因子に依存する。つまりcDNAプラスミド導入効率、CMVプロモーター活性、リボザイムの開裂活性、ウイルスmRNAとゲノムRNAの転写及び複製の比率と割合、ウイルスタンパク質の翻訳、ウイルスタンパク質の産生及びウイルス粒子の増殖等の因子である。本研究において他の細胞株がウイルス粒子を産生した条件下でもVero細胞においては組み換えウイルスの産生が検出されなかった。cDNAのVero細胞への導入は、明らかに低効率であった。実際には、Vero細胞培養液における、Nタンパク質発現量は他の細胞株における発現量の10分の1以下であった。従って、本研究で決定した最適の導入条件は、Vero細胞に適さないように思われる。ヘルパープラスミドに対する完全長プラスミド比率の最適化と同様に、N、P、及びLタンパク質を挿入したヘルパープラスミドの比率と量の最適化が個々の細胞株に必要であることが示唆された。回収するウイルスの産生量は同じ導入条件で同じ細胞株からでさえ異なっており(表5)、導入細胞の生理的条件がまた、ウイルス産出率において非常に重要な要素であることを示す。
【0043】
成体マウスに対する固定毒株狂犬病ウイルス株の病原性は、糖タンパク質の333位にあるアルギニン又はリジンにより決まることが報告されている(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 70−74, 1983、Virology 172, 206−212, 1989)。リバースジェネティクスの技法を用いて又はモノクロナール抗体を用いた変異体(escape mutant)の作製によって、Gln、Ser又はGluとワクチン株中のArgを置き換えることで、病原性を減少することがわかっている(Vaccine 19, 3543−3551, 2001、Trends Microbiol. 1, 317−320, 1993)。この部位のアミノ酸置換はウイルスの病原性に影響を与えるが、その減弱の程度は個々の固定毒株において異なる。
【0044】
HEP−Flury株は非常に弱毒化している株であり、成体マウスに脳内接種をしてもマウスは死なない。HEP−Flury株はもともとGタンパク質の333位アミノ酸がグルタミンである、自然に選択された唯一の非病原性株である。この333位のグルタミンをアルギニンに置換することにより、HEP−Fluryの病原性がどれほど回復するかという疑問は未だ解決されていない。ワクチン株であるRC−HLとその親株である西ヶ原株間での病原性の違いはGタンパク質の333位のアミノ酸によるものではないことがわかっている(J. Virol. 75, 9121−9128, 2001)。従って、他の部位がHEP−Flury株の病原性の減弱の原因である可能性を除去できない。本研究で開発した非病原性HEP−Flury株を使用するシステムにより、分子レベルでの狂犬病ウイルスの病原性の更なる解析が可能である。本新規システムより、実験の特定目的に応じて適当な細胞株の選択が可能である。又、本新規システムは他のモノネガウイルスにも適用できるシステムである。
【0045】
[図面の説明]
図1:本発明の実施例において、狂犬病HEP−Flury株、pHEP−1.0及びpHEP−3.0の完全長cDNAプラスミドの模式図を示す図である。なお、図中の記号は、完全長cDNA構築のために用いたRT−PCR産物(F1、F2、F3、及びF4)及び制限酵素部位(BssH II、Blp I、Xma I、BsrG I、Nar I、及びKpn I)を示す(比率は一定でない)。また、T7:T7プロモーター、CMV:CMVプロモーター、Rbz:ハンマーヘッド型リボザイム又はデルタ肝炎型リボザイム配列cDNA、BPN(制限酵素部位を含むウイルス転写単位付加部位):BsiW I、Pst I、及びNhe I部位をそれぞれ示す。完全長cDNAをpBluescript II又はpCDNA3.1/Zeoのマルチクローニングサイトに挿入した。
【0046】
図2:本発明の実施例において、産生されたウイルスrHEP−1.0及びrHEP−3.0がcDNAプラスミド由来であることを示す図である。なお、図中のAは、野生型HEP−flury(wHEP)株及び産生された組換えウイルス(rHEP−1.0及びrHEP−3.0)のGとL遺伝子間のRT−PCRの模式図。wHEPのΨ領域(G遺伝子の終止コドンの後からポリAシグナルまでの位置、464bp)は材料と方法で記載したようにウイルス転写単位付加部位及び制限酵素部位(155bp)に置換した。ウイルスに感染したNA細胞から全RNAを抽出し、プライマーC5−b2(G遺伝子の5’− GACCTTGATGGAGGCTGA −3’:配列番号23)及びHL603−3(L遺伝子の3’− AGATTGGAGTCACCTGT −5’:配列番号24)を用いて、ゲノム狂犬病RNAをRT−PCRで増幅した。また図中のBは、wHEP、rHEP−1.0及びrHEP−3.0のRT−PCR産物(それぞれ1696、1387、及び1387塩基長)を1%アガロースゲルで電気泳動した結果を示す図である。さらに図中のCは、Bで示したcDNA断片を制限酵素Pst Iで切断し、Bと同様に1%アガロースゲルで電気泳動した結果を示す図である。なお、M:分子サイズマーカー(molecular sizemarker)、W:wHEP、1:rHEP−1.0、2:rHEP−3.0をそれぞれ表す。
【0047】
【発明の効果】
本発明で構築したウイルス発現ベクターは、細胞内RNA転写活性を有し、その細胞内での発現・複製にあたって、従来の狂犬病ウイルスベクターのように、T7RNAフアージプロモーターを持った細胞種に限定されるとか、又は、T7RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスの感染を同時に行うことを必要とするとかの、制約を解消することができた。したがって、本発明のウイルス発現ベクターは、NA細胞やBHK細胞等の各種の哺乳類細胞から、ウイルスの複製、回収が可能となった。即ち、従来法と同じT7プロモーターを利用するプラスミドpHEP−1.0を用いた場合、BSR−T7/5細胞からのみウイルスの複製・回収がおこる。本発明のプラスミドpHEP−3.0を用いた場合、BSR−T7/5細胞だけでなく、BHK−21、NA、293T細胞でも複製・回収が可能となる。そして、その効率を調べてみると、従来法においてはウイルスの回収を確認するためにはもう一回ウイルスの増幅が必要であるが、本方法においてはその様な増幅はほとんど必要ではなく、プラスミドをトランスフェクトした細胞の上清に多量のウイルスが産生していることが確認された。
【0048】
本発明のリボザイムの配列及びCMVプロモーターによる転写系を利用した狂犬病ウイルスの新規cDNAウイルス発現系は、T7RNAポリメラーゼを利用する従来法より簡便かつ高効率な組換えウイルスの回収が可能となり、又ワクチニアウイルスを感染させることなくNA細胞、BHK細胞など各種哺乳類細胞からウイルス回収が可能となった。本発明のベクターを用いることで二次感染欠損ウイルス、複製欠損ウイルスの作製及び有用なワクチン・ベクターの開発、更には、狂犬病ウイルスの分子病理の解析がより容易に行えることとなった。
本発明のウイルス発現ベクターは、外来遺伝子を組込んで、該外来遺伝子を標的細胞へ送達(デリバリー)することが可能であり、また、外来遺伝子として薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組込んで、医薬デリバリー用の組成物として用いることができる。
【0049】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の実施例において、狂犬病HEP−Flury株、pHEP−1.0及びpHEP−3.0の完全長cDNAプラスミドの模式図を示す図である。
【図2】本発明の実施例において、産生されたウイルスrHEP−1.0及びrHEP−3.0の確認したことを示す図である。なお、図中のAは、野生型HEP−Flury(wHEP)株及び産生された組み換えウイルス(rHEP−1.0及びrHEP−3.0)のGとL遺伝子間のRT−PCR模式図。また図中のBは、wHEP、rHEP−1.0及びrHEP−3.0のRT−PCR産物(それぞれ1696、1387、及び1387塩基長)を1%アガロースゲルで電気泳動した結果を示す図である。さらに図中のCは、Bで示したcDNA断片を制限酵素Pst Iで切断し、Bと同様に1%アガロースゲルで電気泳動した結果を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、非分節(−)鎖RNAウイルスcDNAの両端にリボザイムの配列を配置した細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター、特に、狂犬病ウイルスcDNAの両端にリボザイムの配列を配置した細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクターに関する。
【0002】
【従来の技術】
有用なタンパク質をコードする遺伝子を、発現ベクターに組み込み、それを宿主細胞に導入して、遺伝子を発現する技術は既に周知のところであり、発現ベクターとして、ウイルスを基にして構築されたベクターも多くのものが知られている。近年は、ウイルスベクターを、外来遺伝子を標的細胞へ挿入するためのキャリヤーとしての利用が開発されており(Bio/Technology 3, 222, 1995、Cancer Gene Therapy 1, 51, 1994)そのためのベクターの改良もなされている(特表平8−501453号公報、特開平10−4979号公報)。
【0003】
狂犬病ウイルスをベクターとして用いることも既に周知のところである。狂犬病ウイルスは、非分節(−)鎖RNAウイルスであり、ラブドウイルス(Rhabdoviridae)科リッサウイルス(Lyssavirus)属に属する。モノネガウイルスの完全長cDNAからウイルスを回収する方法は、狂犬病ウイルスを用いてSchnellらにより1994年に初めて開発された(EMBO J. 13, 4195−4203, 1994)。
この狂犬病ウイルスcDNA発現系は、欧州のワクチン株であるSAD B19株(Virology 175,485−499,1990)を用いて開発された。この方法は、狂犬病ウイルスの詳細な分子生物学的解析及びワクチン・ベクター開発などの研究を可能にした(特開平8−168381号公報)。
【0004】
Schnellらにより、狂犬病ウイルスを用いて完全長cDNAからRNAウイルスを回収する方法(リバースジェネティクス)が開発されて以来、別のラブドウイルスである水疱性口内炎ウイルス(vesicular stmatitis virus)のリバースジェネティクス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4477−4481, 1995、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8388−83, 1995)及びパラミクソウイルスに属する麻疹ウイルス(paramyxoviruses measles virus)のリバースジェネティクス(ENBO J. 14, 5773−5784, 1995)、呼吸器合胞体ウイルス(respiratory syncytial virus)のリバースジェネティクス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11563−11567, 1995)、及びセンダイウイルス(Sendai Virus)のリバースジェネティクス(ENBO J. 14, 6087−6094, 1995、Genes Cells 1, 569−579, 1996)が基本的に同様の技術を用いて報告されてきた。
【0005】
狂犬病ウイルスを宿主細胞に感染させた場合に、その感染サイクルの開始のためには、完全長ポジティブセンス(positive sense)RNAは、転写後すぐに導入細胞においてキャプシドに包まれる(encapidated)必要がある。従って、該機能を得るために、従来法においては、ウイルスRNAポリメラーゼ(L及びPタンパク質)及びヌクレオキャプシド(N)タンパク質(ヘルパープラスミドとして公知である)をコードするプラスミドを同時に導入することが行われ、結果としてリボヌクレオキャプシドを活性化するという方法が行われた。今まで、完全長アンチゲノムRNA及び上記3つのウイルスmRNAの一次転写はT7RNAポリメラーゼの制御下で行われた。3つのグアニジン残基は、T7RNAポリメラーゼに最適の開始配列を形成し、アンチゲノムRNA転写物の5´末端に付加された。
【0006】
更に、生産的感染サイクルを開始するためには、一次ウイルスアンチゲノムRNA転写物の3´末端側の正確な切断が必要とされる。該切断は下記のデルタ肝炎型リボザイム(HdvRz)転写物の自己切断(autolytic cleavage)によって達成される。従来の方法では、T7RNAポリメラーゼを供給するために、組換えワクシニアウイルス、vTF7−3(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122−8126, 1986)の感染か、又は恒常的にT7RNAポリメラーゼを発現する細胞株であるBSR−T7/5(J. Virol. 73, 251−259, 1999)を用いることが必要であった。
【0007】
このように、従来報告されている狂犬病ウイルスcDNAの発現系のような、非分節(−)鎖RNAウイルスのcDNA発現系は、トランスフェクトしたプラスミドをT7RNAポリメラーゼにより転写を行い、(+)鎖の完全長ゲノムRNA及びN,P,L mRNAを同時に発現させることでウイルスの複製を可能にし、組換えウイルスを得るというものであった。従って、該RNAウイルスのcDNA発現系は、その複製には、T7RNAポリメラーゼを発現する特定の細胞種を用いるか、或いは、T7RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスを同時に感染させるか、という制約があった。
【0008】
一方で、細胞内ポリメラーゼI及びIIを利用するリバースジェネティクス技術が、分節マイナス鎖RNAウイルス、例えばインフルエンザAウイルスのために開発された(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9345−9350, 1999、J. Virol. 73, 9679−9682, 1999、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6108−6113, 2000)。該システムは、T7RNAポリメラーゼを使用せず、インフルエンザリバースジェネティクスを顕著に改良し、構築された。ごく最近になって、ウイルスミニゲノムRNAの正確な末端を作製するために、斬新なcDNAプラスミドがMercierらによって開発された(J. Virol. 76, 2024−2027, 2002)。該プラスミドはハンマーヘッド型リボザイム(HamRz)とHdvRz cDNAの間に挟まれるマイナス鎖ミニゲノムcDNAからなる。
上記のように、ウイルスの両末端の余分なヌクレオチドを切断する技術が開発された。
【0009】
【特許文献1】
特表平8−501453号公報
【特許文献2】
特開平10−4979号公報
【非特許文献1】
Bio/Technology 3, 222, 1995
【非特許文献2】
Cancer Gene Therapy 1, 51, 1994
【非特許文献3】
EMBO J. 13, 4195−4203, 1994
【非特許文献4】
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122−8126, 1986
【非特許文献5】
J. Virol. 73, 251−259, 1999
【非特許文献6】
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6108−6113, 2000
【0010】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、各種の細胞株において転写活性を有し、効率よくウイルスを産生することが可能な狂犬病ウイルスのような非分節(−)鎖RNAウイルス発現ベクター、及びその利用を提供することにある。
【0011】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、狂犬病ウイルスcDNAのような非分節(−)鎖RNAウイルスcDNA発現ベクターの利用に際して、従来のように、その転写複製に、T7RNAポリメラーゼを発現する特定の細胞種を用いなければならないとか、或いは、T7RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスを同時に感染させなければならないとかという制約がない発現ベクター、即ち、各種の細胞株において転写活性を有し、複製が可能な発現ベクターの開発について、鋭意研究を行った結果、非分節(−)鎖RNAウイルスcDNAの両端にリボザイムの配列を配置することによって、従来のような特定の細胞種の使用の限定や、或いは、特定のウイルスの同時感染が必要という制約がなく、細胞内RNAポリメラーゼIIを有する細胞であれば転写が可能であり、したがって、各種の細胞株においてウイルスの複製を行うことができる発現ベクターの構築が可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【0012】
即ち、具体的には本発明においては、ウイルス完全長ゲノムRNA転写物の本来の5´及び3´末端を作製するために、非病原性狂犬病ウイルスである、HamRzとHdvRz配列を両端にもつHEP−Flury株より完全長cDNAを含むプラスミドを構築し、該構築物をサイトメガロウイルス(CMV)前初期プロモーターの下流に配置することによって、該プラスミドの転写が細胞RNAポリメラーゼIIのコントロール下で行われることを見い出し、本発明をなした。本発明の発現ベクターはT7RNAポリメラーゼの補充を必要とせず、かつ、基本的に、cDNAプラスミドから組換えウイルスを産生するために組換えワクシニアウイルスに感染せずともすべての細胞株に適用でき、各種の細胞株において狂犬病ウイルスの転写を可能とた。その結果、ウイルスの回収が改善され、効率よくウイルスを産生することを可能とした。
【0013】
上記のように、本発明の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクターには、プロモーターとして、サイトメガロウイルスプロモーターが用いられる。リボザイムとしては、改変ハンマーヘッド型リボザイム及び/又は肝炎デルタウイルス型リボザイムを用いることができる。本発明の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクターは、この発現ベクターに外来遺伝子を組み込んで用いることにより、外来遺伝子の標的細胞での発現を行うベクターとして用いることができる。また、該外来遺伝子として薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組込むことにより、医薬のデリバリー用の組成物として利用することができる。
【0014】
具体的には本発明は、非分節(−)鎖RNAウイルスcDNAにリボザイムの配列を配置したことを特徴とする細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター(請求項1)や、非分節(−)鎖RNAウイルスcDNAが、狂犬病ウイルスcDNAであることを特徴とする請求項1記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター(請求項2)や、狂犬病ウイルスcDNAが、狂犬病ウイルス HEP−Flury株であることを特徴とする請求項2記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター(請求項3)や、非分節(−)鎖RNAウイルスcDNAの完全長ゲノムcDNAの両端にリボザイム配列を配置したことを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター(請求項4)や、リボザイムが、改変ハンマーヘッド型リボザイム及び/又は肝炎デルタウイルス型リボザイムであることを特徴とする請求項4記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター(請求項5)や、細胞内RNAポリメラーゼ転写活性が、細胞内RNAポリメラーゼII転写活性であることを特徴とする請求項1〜5のいずれか記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター(請求項6)や、サイトメガロウイルスプロモーターの下流に、非分節(−)鎖RNAウイルスcDNAにリボザイムの配列を配置した配列を結合したことを特徴とする細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター(請求項7)や、非分節(−)鎖RNAウイルスcDNAにリボザイムの配列を配置した配列が、請求項2〜6のいずれか記載の狂犬病ウイルスcDNAにリボザイムの配列を配置した配列であることを特徴とする請求項7記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター(請求項8)や、請求項1〜8記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクターに外来遺伝子を組み込んだことを特徴とする細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有する外来遺伝子組換えウイルス発現ベクター(請求項9)からなる。
【0015】
また本発明は、請求項1〜9記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクターを、真核宿主細胞中に導入し、該真核宿主細胞中で発現させ、該真核宿主細胞中から回収することを特徴とする組換え非分節(−)鎖RNAウイルスの回収方法(請求項10)や、組換え非分節(−)鎖RNAウイルスが、狂犬病ウイルスHEP−Flury株であることを特徴とする請求項10記載の組換え非分節(−)鎖RNAウイルスの回収方法(請求項11)や、真核宿主細胞が、哺乳類細胞であることを特徴とする請求項10又は11記載の非分節(−)鎖RNAウイルスの回収方法(請求項12)からなる。
【0016】
さらに本発明は、請求項9記載の外来遺伝子組換えウイルス発現ベクターを、標的細胞と接触させ、標的細胞中に導入することを特徴とするにより外来遺伝子の標的細胞での発現方法(請求項13)や、外来遺伝子が、ワクチン抗原、インターロイキン、酵素、又は生理活性を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項13記載の外来遺伝子の標的細胞での発現方法(請求項14)や、外来遺伝子として、薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組み込んだ請求項9記載の外来遺伝子組換えウイルス発現ベクターと医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバント及び/又は賦形剤からなる医薬デリバリー用組成物(請求項15)からなる。
【0017】
【発明の実施の形態】
本発明は、狂犬病ウイルスcDNAのような非分節(−)鎖RNAウイルスcDNAの両端にリボザイムの配列を配置することにより、細胞内RNAポリメラーゼの転写活性を有するウイルス発現ベクターを構築することよりなる。狂犬病ウイルスの場合を例にとって、本発明のウイルス発現ベクターの構築について説明する。
まず、本発明のウイルス発現ベクターの構築に用いる狂犬病ウイルス株としては、ワクチン株として開発されたSAD B19株やRC−HL株のような非病原性のウイルス株を用いることができる。しかし、日本においてヒト用ワクチン株として用いられているHEP−Flury株が特に好ましい。発現ベクターの構築には、狂犬病ウイルス HEP−Flury株より、完全長ゲノムcDNAを作製し、この完全長ゲノムcDNAの両端に、リボザイムの配列を配置する。該リボザイムとしては、改変ハンマーヘッド型リボザイム及び/又は肝炎デルタウイルス型リボザイムを挙げることができる。
【0018】
該完全長ゲノムcDNAとリボザイムの配列からなる構築物を、サイトメガロウイルスプロモーターの下流に、挿入した。このようにして構築した狂犬病ウイルス発現ベクターは、細胞内RNAポリメラーゼ(RNAポリメラーゼII)により転写される。したがって、この狂犬病ウイルス発現ベクターを、BHK細胞やNA細胞等の各種哺乳類細胞等に、例えば、リン酸カルシウム法や、ポリアミン法のような方法によりトランスフェクトすることにより、組換えウイルスを複製し、回収することができる。
本発明の発現ベクターに外来遺伝子を組み込んで、ウイルス発現ベクターとして用いることができる。該外来遺伝子としては、ワクチン抗原、インターロイキン、酵素、又は生理活性を有するペプチドをコードする遺伝子等、有用なタンパク質をコードする適宜の遺伝子を挙げることができる。
【0019】
また、本発明のウイルス発現ベクターは、外来遺伝子の標的細胞での発現に用いることができる。本発明のウイルス発現ベクターに外来遺伝子を組み込んで、標的細胞と接触させ、標的細胞中に導入することにより、外来遺伝子を標的細胞で発現することができる。したがって、本発明のウイルス発現ベクターは、外来遺伝子として薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組み込んで、薬理活性を有するペプチド(医薬)のデリバリーシステムとして用いることができる。そのようなデリバリーシステム用の組成物としては、外来遺伝子として、薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組み込んだ、外来遺伝子組換えウイルス発現ベクターと医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバント及び/又は賦形剤等を適宜配合して、医薬デリバリー用組成物として用いることができる。
【0020】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
[材料と方法]
(ウイルス及び細胞)
狂犬病ウイルスの非病原性HEP−Flury株を用いて完全長cDNA及び各ウイルス遺伝子、N、P、G、及びL cDNAsをcDNAクローニングした(全塩基配列を配列表の配列番号1に示す。配列表の全塩基配列11615中、N遺伝子は71〜1423の塩基配列で、P遺伝子は1514〜2407の塩基配列で、M遺伝子は2496〜3104の塩基配列で、G遺伝子は3318〜4892の塩基配列で、L遺伝子は5101〜11484の塩基配列で表示される。また、F1領域は1〜2365の塩基配列で、F2領域は2359〜4944の塩基配列で、F3領域は4995〜10146の塩基配列で、F4領域は10141〜11615の塩基配列で示される。)
A/Jマウス由来の神経芽腫NA細胞及びサルVero細胞を、熱変性した10%ウシ胎児血清(FBS)を含む最小必須培地(MEM)中で37℃で培養した。BHK−21細胞、BSR−T7/5細胞(BHK−21由来の細胞株であり、恒常的にT7RNAポリメラーゼを発現する(J. Virol. 73, 251−259, 1999)。)、及びヒト胎児腎細胞293T(複製可能なサルウイルス40ラージT抗原を産生する(Mol. Cell Biol. 7, 379−387, 1987)。)を、10%FBSを含むダルベッコ変法イーグル培地(D−MEM)中で37℃で培養した。
【0021】
(プラスミドの作製)
(1)cDNAの作製
cDNAを得るために、プロトコールに従いISOGEN(Nippon gene社製、Japan)を使用して、狂犬病ウイルスHEP−Flury株に感染したNA細胞から全RNAを抽出した。逆転写酵素(RTase)反応を、下記のとおり、トリ骨髄芽球症ウイルス(myeloblastosis)RTase(Takara社製、Japan)、及びオリゴdT又は狂犬病ウイルス特異的プライマーを用いて、42℃で1時間行なった。下記の表1に示した、N、P、L、及びG用のプライマーセットと、Pyrobest DNA polymerase(Takara社製、Japan)を用いてPCRにより逆転写産物を増幅した。
【0022】
【表1】
【0023】
(2)完全長cDNAの作製
長いcDNA(longer cDNA)(L遺伝子及び完全長cDNA)を得るために、SuperScript II RTase及びeLONGase Enzyme Mix(Life Technologies社製)を用いて、RT−PCRを行った。PCR増幅は、目的増幅産物1キロベースあたり、94℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、及び68℃で60秒間の合成というサイクルで30サイクル行なった。ウイルスN、P、L、及びGタンパク質を産生するヘルパープラスミドを作製するために、pcDNA3.1/Zeo(+)ベクター(Invirogen社製)のマルチクローニングサイトにPCR産物を挿入し、それぞれpH−N、pH−P、pH−L、及びpH−Gを作製した。これらの遺伝子をその後CMVプロモーター及びT7プロモーターの制御下で発現させた。
【0024】
また、既に、HEP−Flury株の5つのウイルス遺伝子全て(N、P、M、G、及びL)のヌクレオチド配列が報告されている(Microbiol. Immunol. 41, 229−240, 1997、Microbiol. Immunol. 42, 761−771, 1998、Microbiol. Immunol. 43, 259−270, 1999、Virology 173, 465−477, 1989、Microbiol. Immunol. 42, 485−496, 1998)。完全長cDNAを合成するために、制限酵素認識部位を利用して、最初に以下の4つのcDNA断片(F1、F2、F3及びF4)を作製した(図1)。なお、F1:HST7−5プライマーで増幅されるLeader−BlpI断片、F2:H−Blp5プライマーで増幅されるBlp I−Xma I断片、F3:H−Bsr5プライマーで増幅されるBsr I−Nar I断片、及びF4:H−Kasafx5プライマーで増幅されるNar I−Trailer断片を表し、作製に用いたプライマーを表2に示した。
【0025】
【表2】
【0026】
次に、付加GGG配列を持つT7プロモーター、5’− gcgcgcTAATACGACTCACTATAGGG −3’(BssH II部位を小文字で示す。配列番号18)をF1 cDNA産物のリーダー領域の前に挿入した。HdvRz cDNAの配列、5’− GGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCGggtacc −3’(Kpn I部位を小文字で示す。Annu. Rev. Biochem. 61, 641−671,1992、配列番号19)をF4 cDNA産物のトレーラー領域の後ろに加えた。F2とF3断片間に、本来の偽遺伝子の代わりにウイルス転写性単位及び特異制限酵素部位を含む合成オリゴヌクレオチド配列を、XBPNA5;5’− CCGGGGaaaaaaaCTaacaCCTCTcgtacgATTctgcagTTTgctagcAGGACCG −3’(ポリ(A)シグナル、転写開始シグナル、BsiW I部位、Pst I部位、Nhe I部位の順に小文字で示した。配列番号20)、及び相補的XBPNA3;3’− CCtttttttGAttgtGGAGAgcatgcTAAgacgtcAAAcgatcgTCCTGGCCATG −5’(ポリ(A)シグナル、転写開始シグナル、BsiW I部位、Pst I部位、Nhe I部位の順に小文字で示した。配列番号21)の二本鎖オリゴヌクレオチドとして挿入した。最後に、BssH II−Kpn I完全長cDNA断片の11735塩基をpBluescript II SK(+)(Stratagene社製)のマルチクローニング部位に挿入し、pHEP−1.0を得た。
【0027】
完全長プラスミドpHEP−1.0においてウイルスリーダー配列に続くT7プロモーターと付加GGG配列の代わりに、CMVプロモーターDNA(pcDNA3.1/Zeo(+)プラスミドの670塩基Mlu I−Nhe I断片)及びHamRbz配列cDNA、5’− TGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCacgcttaaca−3’(ウイルスリーダー配列を小文字で示す。Eur. J. Biochem. 247, 741−753,1997、配列番号22)を完全長cDNAプラスミドに挿入した(pHEP−2.0を得た)。pHEP−2.0の基幹プラスミドをpcDNA3.1/Zeo(+)プラスミドに取り替え、pHEP−3.0を得た。得られた全てのcDNAに変異が起こっていないかを調べるために配列決定を行った。本研究において構築した組換え型HEP−Flury株の完全長cDNAの配列はGenBankデータベースに登録した(アクセッションナンバー:AB085828、配列番号1)。
【0028】
(狂犬病ウイルスの産生)
10%FBSを含むD−MEM又はMEM中の6ウェルプレートにおいてBSR−T7/5細胞、BHK−21細胞、NA細胞、293T細胞、及びVero細胞を一晩培養して80%の濃度(1ウェルあたり4〜6×105)とした。導入前に、古い培地を新鮮な培地に交換した。製造者の手順に従い、完全長プラスミド2.0μg、pH−N 0.5μg、pH−P 0.25μg、pH−L 0.1μg、及びpH−G 0.15μgを、TransIT LT−1(Panvera社製、Madison, WI)を用いて細胞に導入した。pH−Gプラスミド(ウイルス糖タンパク質を挿入した)の導入は回収されたウイルスの産生に不可欠ではないが、Gタンパク質を供給することにより時にウイルスの産生量を改善する(J. Neurovirol. 6, 373−381, 2000)。16時間から24時間後に、細胞を一度洗浄した後、10%FBSを含むD−MEM又はMEMでさらに2〜5日培養を続けた。培養培地をNA細胞に加え、34℃で3日間インキュベーションした。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識狂犬病ウイルスNタンパク質特異的抗体(Centcor Inc.社製、Malvern, PA)を使用して免疫蛍光検査アッセイにより、NA細胞に回収されたウイルスが存在するかを調べた。回収されたウイルスはその後さらなる実験用ウイルスストックとするため、NA細胞に感染させ、増幅させた。完全長プラスミドpHEP−1.0及びpHEP−3.0から産生された回収されたウイルスはそれぞれrHEP−1.0とrHEP−3.0と表した。
【0029】
(ウイルスの検定)
ウイルスの力価を決定するため、96ウェルプレート中で、NA細胞の単層を文献記載の方法(Dev. Biol. Stand. 57, 199−211, 1984)に従いウイルス懸濁液の10倍に段階希釈したウイルス懸濁液で感染させ34℃でインキュベートした。感染後48時間で、細胞を80%のアセトンで固定し、FITC標識した狂犬病ウイルスNタンパク質特異的抗体で染色した。感染巣(foci)を蛍光顕微鏡下で数え、1mLあたりの感染形成ユニット(ffu/ml)として計算した。検定は全て3回行ない、平均値をウイルス力価として用いた。
【0030】
[発現ベクターの構築及び各種細胞株での転写・複製]
(ウイルスベクターとしての完全長cDNAプラスミドの構築)
狂犬病ウイルスHEP−Flury(Kyoto)株のN、P、M、G、及びLの5つのウイルス遺伝子すべてのヌクレオチド配列はすでに文献に記載されている(Microbiol. Immunol. 41, 229−240, 1997、Microbiol. Immunol. 42, 761−771, 1998、Microbiol. Immunol. 43, 259−270, 1999、Virology 173, 465−477, 1989、Microbiol. Immunol. 42, 485−496, 1998)。本研究においては、HEP−Flury(Tokyo)株をcDNAクローニング用に使用した。これら2つの株は同じ起源に由来するが、30年以上別々に継代し維持されてきた。HEP−Flury(Kyoto)株と比較すると、HEP−Flury(Tokyo)株のcDNA配列においては、コード領域で、変異アミノ酸(alterd amino acids)となる数個の変異がサイレント変異と同様に示された(表3)。このcDNA配列の差異はゲノム配列自体又はcDNAのクローニング工程により引き起こされた。
【0031】
【表3】
【0032】
まず最初に、本発明者らは、最初に構築したプラスミドを使用して回収実験を行ったが、該プラスミドからは回収したウイルスを回収することはできなかった。ヘルパープラスミドcDNAsと完全長プラスミドcDNA間の異なるアミノ酸をHEP−Flury(Kyoto)株の該当アミノ酸に置換した。アミノ酸を置換することによりこれらcDNAプラスミドから狂犬病ウイルスを回収することが可能となった。以上の結果からPタンパク質の81及び82番目のアミノ酸、及びLタンパク質の171、668、及び1478番目ののアミノ酸は、正常なタンパク質の折りたたみと共にウイルスポリメラーゼの機能及び/又は複製に不可欠であることを示す。3つのアミノ酸(Pタンパク質の174番目、Gタンパク質の14番目、Lタンパク質の2127番目のアミノ酸)のみが2つの実験株の間で異なった。
【0033】
完全長cDNAの合成過程で、T7又はCMVプロモーター配列及びリボザイム配列を加えた(材料と方法の図1を参照のこと)。狂犬病ウイルスゲノムはGとL遺伝子の間に400塩基長の非翻訳偽遺伝子(untranlated pseudogene)を持つ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 3914−3918, 1986)。偽遺伝子配列は細胞培養においてウイルスの蔓延、病原性、または伝播には関与せず(EMBO J. 13, 4195−4203, 1994、J. Neurovirol. 4, 115−119, 1998)、従ってウイルスベクターとして感染性組換えウイルスゲノムを操作するのに適した領域である。偽遺伝子はSchnellら(J. Virol. 70, 2318−2323, 1996)の考えに基づき合成のオリゴヌクレオチド断片と置換された。該合成オリゴヌクレオチド断片においては、外来遺伝子の挿入をする目的で、転写開始シグナルとポリAシグナル、及び特異的制限酵素部位を設けた。従来の方法(EMBO J. 13, 4195−4203, 1994)と同様に、cDNAをトランスフェクトした細胞中のpHEP−1.0プラスミドにおけるアンチゲノムRNAの初期転写はT7RNAポリメラーゼによって引き起こされ、アンチゲノムRNAの5´末端に付加的なGGGヌクレオチド配列を含む。
【0034】
一方、pHEP−3.0プラスミドにおけるアンチゲノムRNAの初期転写は細胞RNAポリメラーゼIIによって引き起こされる。cDNAをトランスフェクトした細胞において、ウイルスリーダー領域に先行するハンマーヘッドリボザイムが最初に転写され、ウイルスRNAは正確な5´末端となる。ウイルストレーラー領域に続くデルタ肝炎ウイルスリボザイムは抗ゲノムウイルスRNAの正確な3´末端を合成する。該プラスミドから産生された組換えウイルスゲノム構造物は、アンチゲノム5´末端の3連G(グアニン)ヌクレオチドの付加を除いて、同一である。
【0035】
(各種細胞株における狂犬病ウイルスの複製・回収)
T7RNAポリメラーゼを供給するため、恒常的にT7RNAポリメラーゼを発現するBSR−T7/5細胞株を使用した。複製された狂犬病ウイルスはBSR−T7/5細胞株においてのみ、プラスミドから回収された。pHEP−3.0で感染されると、ウイルス完全長RNAは細胞RNAポリメラーゼIIの制御下で転写される。ヘルパープラスミドは、CMVプロモーターとT7プロモーターの制御下でN、P、L、及びGタンパク質を発現する。ウイルスRNAの正しい5´末端及び3´末端は、その近接するリボザイムによってもたらされる自己分解的開裂(autolytic cleavage)により産生される。このメカニズムは、理論的にはどの細胞株でも起こる。従って、BSR−T7/5細胞と同様にBHK−21細胞、NA細胞、及び293T細胞におけるpHEP−3.0からウイルスを回収した(表4)。興味深いことに、Vero細胞がpHEP−3.0に感染したとき、組み換えウイルスは検出されなかった。
【0036】
【表4】
【0037】
回収されたウイルスがcDNAプラスミドに由来することを確認するために、回収されたウイルスに感染した細胞からのRNAをRT−PCRにより解析した。本来の野生型HEP−Flury株、及び回収されたウイルスからのPT−PCR産物の偽遺伝子領域(GとL遺伝子間)をアガロースゲル電気泳動法により調べた(図2)。本来のHEP−Flury株から1696塩基長のRT−PCR産物を産生する偽遺伝子を取り除き、付加的な転写単位(additional trascriptional unit)及び制限酵素部位と置換したところ、回収されたウイルスから1387塩基長の産物が産生された(図2B)。組換えウイルスrHEP−1.0及びrHEP−3.0のRT−PCR産物はPst I消化後に2個の断片ができたが、野生型HEP−Flury株からのRT−PCR産物は影響を受けなかった(図2C)。増幅された断片の配列解析により、実際に回収したウイルスがcDNAプラスミドに由来することが確認された。
pHEP−1.0及びpHEP−3.0からのウイルス回収効率を比較するため、本発明者らは増幅過程を経ずにBSR−T7/5細胞、BHK−21細胞、及びNA細胞においてしたウイルス量を測定した(表5)。
【0038】
【表5】
【0039】
pHEP−1.0からのウイルスの回収は、BSR−T7/5細胞にトランスフェクトしたもののみウイルスが回収され、感染した細胞のすべてのウェルからは回収されず、低効率であった。NA細胞でのウイルスの増幅が、高濃度の回収ウイルスを得るのに必要であることが明らかになった。一方、pHEP−3.0を導入すると、BSR−T7/5細胞、BHK−21細胞、及びNA細胞株のすべてにおいてウイルスを産生した。 ほとんどすべてのウェルにおいて、高濃度の回収ウイルスが増幅過程を必要とせずに得られた(表5)。ウイルス回収のための導入条件を最適化するため、本発明者らはヘルパープラスミドと完全長プラスミドを異なった量と比率で各細胞株に導入した。
【0040】
本発明者らは最適の導入状態が2.0μgの完全長プラスミド、0.5μgのpH−N、0.25μgのpH−P、0.1μgのpH−L、及び0.15μgのpH−Gであるという結論に達した。しかしながら、ウイルスの力価は最適のトランスフエクション条件下でも1×102から2×107ffu/mlの間で異なり、回収効率は多くの因子によって影響されることを示した。例えば、導入するプラスミドの量を2倍量変化させても回収効率を低減させることない。2つの要因によって変えることができる。導入したNA細胞5×105から最大で4×107ffuが回収された。以上の結果は、従来のT7ポリメラーゼによるシステムと比べて、本新規CMVプロモーターシステムが狂犬病ウイルスを効率よく回収できることを示す。
【0041】
[実施例の結果]
本発明は、狂犬病ウイルスをcDNAプラスミドから作製する方法に関するものであり、SAD−B19株(EMBO J. 13, 4195−4203, 1994)及びRC−HL株(J. Virol. 75, 9121−9128, 2001)に続く。本発明者は、2つの異なる完全長構築プラスミド、すなわちpHEP−1.0及びpHEP−3を使用してcDNAプラスミドから狂犬病ウイルスHEP−Flury株を回収することについて述べてきた。pHEP−1.0は従来の方法と同様にT7RNAポリメラーゼを利用する。新規リバースジェネティクスシステム(pHEP−3.0)は、細胞RNAポリメラーゼIIを利用し、T7RNAポリメラーゼを必要とせず、原則としてどの細胞株においても、cDNAプラスミドからウイルスを産生することができる。この新規システムにより、ウイルスの回収効率が著しく高められると共に、組み換えウイルスの作製がはるかに容易となった。
【0042】
それでもやはり、ウイルス回収効率は使用した細胞株により異なった。回収効率は導入細胞における多くの因子に依存する。つまりcDNAプラスミド導入効率、CMVプロモーター活性、リボザイムの開裂活性、ウイルスmRNAとゲノムRNAの転写及び複製の比率と割合、ウイルスタンパク質の翻訳、ウイルスタンパク質の産生及びウイルス粒子の増殖等の因子である。本研究において他の細胞株がウイルス粒子を産生した条件下でもVero細胞においては組み換えウイルスの産生が検出されなかった。cDNAのVero細胞への導入は、明らかに低効率であった。実際には、Vero細胞培養液における、Nタンパク質発現量は他の細胞株における発現量の10分の1以下であった。従って、本研究で決定した最適の導入条件は、Vero細胞に適さないように思われる。ヘルパープラスミドに対する完全長プラスミド比率の最適化と同様に、N、P、及びLタンパク質を挿入したヘルパープラスミドの比率と量の最適化が個々の細胞株に必要であることが示唆された。回収するウイルスの産生量は同じ導入条件で同じ細胞株からでさえ異なっており(表5)、導入細胞の生理的条件がまた、ウイルス産出率において非常に重要な要素であることを示す。
【0043】
成体マウスに対する固定毒株狂犬病ウイルス株の病原性は、糖タンパク質の333位にあるアルギニン又はリジンにより決まることが報告されている(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 70−74, 1983、Virology 172, 206−212, 1989)。リバースジェネティクスの技法を用いて又はモノクロナール抗体を用いた変異体(escape mutant)の作製によって、Gln、Ser又はGluとワクチン株中のArgを置き換えることで、病原性を減少することがわかっている(Vaccine 19, 3543−3551, 2001、Trends Microbiol. 1, 317−320, 1993)。この部位のアミノ酸置換はウイルスの病原性に影響を与えるが、その減弱の程度は個々の固定毒株において異なる。
【0044】
HEP−Flury株は非常に弱毒化している株であり、成体マウスに脳内接種をしてもマウスは死なない。HEP−Flury株はもともとGタンパク質の333位アミノ酸がグルタミンである、自然に選択された唯一の非病原性株である。この333位のグルタミンをアルギニンに置換することにより、HEP−Fluryの病原性がどれほど回復するかという疑問は未だ解決されていない。ワクチン株であるRC−HLとその親株である西ヶ原株間での病原性の違いはGタンパク質の333位のアミノ酸によるものではないことがわかっている(J. Virol. 75, 9121−9128, 2001)。従って、他の部位がHEP−Flury株の病原性の減弱の原因である可能性を除去できない。本研究で開発した非病原性HEP−Flury株を使用するシステムにより、分子レベルでの狂犬病ウイルスの病原性の更なる解析が可能である。本新規システムより、実験の特定目的に応じて適当な細胞株の選択が可能である。又、本新規システムは他のモノネガウイルスにも適用できるシステムである。
【0045】
[図面の説明]
図1:本発明の実施例において、狂犬病HEP−Flury株、pHEP−1.0及びpHEP−3.0の完全長cDNAプラスミドの模式図を示す図である。なお、図中の記号は、完全長cDNA構築のために用いたRT−PCR産物(F1、F2、F3、及びF4)及び制限酵素部位(BssH II、Blp I、Xma I、BsrG I、Nar I、及びKpn I)を示す(比率は一定でない)。また、T7:T7プロモーター、CMV:CMVプロモーター、Rbz:ハンマーヘッド型リボザイム又はデルタ肝炎型リボザイム配列cDNA、BPN(制限酵素部位を含むウイルス転写単位付加部位):BsiW I、Pst I、及びNhe I部位をそれぞれ示す。完全長cDNAをpBluescript II又はpCDNA3.1/Zeoのマルチクローニングサイトに挿入した。
【0046】
図2:本発明の実施例において、産生されたウイルスrHEP−1.0及びrHEP−3.0がcDNAプラスミド由来であることを示す図である。なお、図中のAは、野生型HEP−flury(wHEP)株及び産生された組換えウイルス(rHEP−1.0及びrHEP−3.0)のGとL遺伝子間のRT−PCRの模式図。wHEPのΨ領域(G遺伝子の終止コドンの後からポリAシグナルまでの位置、464bp)は材料と方法で記載したようにウイルス転写単位付加部位及び制限酵素部位(155bp)に置換した。ウイルスに感染したNA細胞から全RNAを抽出し、プライマーC5−b2(G遺伝子の5’− GACCTTGATGGAGGCTGA −3’:配列番号23)及びHL603−3(L遺伝子の3’− AGATTGGAGTCACCTGT −5’:配列番号24)を用いて、ゲノム狂犬病RNAをRT−PCRで増幅した。また図中のBは、wHEP、rHEP−1.0及びrHEP−3.0のRT−PCR産物(それぞれ1696、1387、及び1387塩基長)を1%アガロースゲルで電気泳動した結果を示す図である。さらに図中のCは、Bで示したcDNA断片を制限酵素Pst Iで切断し、Bと同様に1%アガロースゲルで電気泳動した結果を示す図である。なお、M:分子サイズマーカー(molecular sizemarker)、W:wHEP、1:rHEP−1.0、2:rHEP−3.0をそれぞれ表す。
【0047】
【発明の効果】
本発明で構築したウイルス発現ベクターは、細胞内RNA転写活性を有し、その細胞内での発現・複製にあたって、従来の狂犬病ウイルスベクターのように、T7RNAフアージプロモーターを持った細胞種に限定されるとか、又は、T7RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスの感染を同時に行うことを必要とするとかの、制約を解消することができた。したがって、本発明のウイルス発現ベクターは、NA細胞やBHK細胞等の各種の哺乳類細胞から、ウイルスの複製、回収が可能となった。即ち、従来法と同じT7プロモーターを利用するプラスミドpHEP−1.0を用いた場合、BSR−T7/5細胞からのみウイルスの複製・回収がおこる。本発明のプラスミドpHEP−3.0を用いた場合、BSR−T7/5細胞だけでなく、BHK−21、NA、293T細胞でも複製・回収が可能となる。そして、その効率を調べてみると、従来法においてはウイルスの回収を確認するためにはもう一回ウイルスの増幅が必要であるが、本方法においてはその様な増幅はほとんど必要ではなく、プラスミドをトランスフェクトした細胞の上清に多量のウイルスが産生していることが確認された。
【0048】
本発明のリボザイムの配列及びCMVプロモーターによる転写系を利用した狂犬病ウイルスの新規cDNAウイルス発現系は、T7RNAポリメラーゼを利用する従来法より簡便かつ高効率な組換えウイルスの回収が可能となり、又ワクチニアウイルスを感染させることなくNA細胞、BHK細胞など各種哺乳類細胞からウイルス回収が可能となった。本発明のベクターを用いることで二次感染欠損ウイルス、複製欠損ウイルスの作製及び有用なワクチン・ベクターの開発、更には、狂犬病ウイルスの分子病理の解析がより容易に行えることとなった。
本発明のウイルス発現ベクターは、外来遺伝子を組込んで、該外来遺伝子を標的細胞へ送達(デリバリー)することが可能であり、また、外来遺伝子として薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組込んで、医薬デリバリー用の組成物として用いることができる。
【0049】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の実施例において、狂犬病HEP−Flury株、pHEP−1.0及びpHEP−3.0の完全長cDNAプラスミドの模式図を示す図である。
【図2】本発明の実施例において、産生されたウイルスrHEP−1.0及びrHEP−3.0の確認したことを示す図である。なお、図中のAは、野生型HEP−Flury(wHEP)株及び産生された組み換えウイルス(rHEP−1.0及びrHEP−3.0)のGとL遺伝子間のRT−PCR模式図。また図中のBは、wHEP、rHEP−1.0及びrHEP−3.0のRT−PCR産物(それぞれ1696、1387、及び1387塩基長)を1%アガロースゲルで電気泳動した結果を示す図である。さらに図中のCは、Bで示したcDNA断片を制限酵素Pst Iで切断し、Bと同様に1%アガロースゲルで電気泳動した結果を示す図である。
Claims (15)
- 非分節(−)鎖RNAウイルスcDNAにリボザイムの配列を配置したことを特徴とする細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター。
- 非分節(−)鎖RNAウイルスcDNAが、狂犬病ウイルスcDNAであることを特徴とする請求項1記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター。
- 狂犬病ウイルスcDNAが、狂犬病ウイルス HEP−Flury株であることを特徴とする請求項2記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター。
- 非分節(−)鎖RNAウイルスcDNAの完全長ゲノムcDNAの両端にリボザイム配列を配置したことを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター。
- リボザイムが、改変ハンマーヘッド型リボザイム及び/又は肝炎デルタウイルス型リボザイムであることを特徴とする請求項4記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター。
- 細胞内RNAポリメラーゼ転写活性が、細胞内RNAポリメラーゼII転写活性であることを特徴とする請求項1〜5のいずれか記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター。
- サイトメガロウイルスプロモーターの下流に、非分節(−)鎖RNAウイルスcDNAの両端にリボザイムの配列を配置した配列を結合したことを特徴とする細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター。
- 非分節(−)鎖RNAウイルスcDNAの両端にリボザイムの配列を配置した配列が、請求項2〜6のいずれか記載の狂犬病ウイルスcDNAの両端にリボザイムの配列を配置した配列であることを特徴とする請求項7記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクター。
- 請求項1〜8記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクターに外来遺伝子を組み込んだことを特徴とする細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有する外来遺伝子組換えウイルス発現ベクター。
- 請求項1〜9記載の細胞内RNAポリメラーゼ転写活性を有するウイルス発現ベクターを、真核宿主細胞中に導入し、該真核宿主細胞中で発現させ、該真核宿主細胞中から回収することを特徴とする組換え非分節(−)鎖RNAウイルスの回収方法。
- 組換え非分節(−)鎖RNAウイルスが、狂犬病ウイルスHEP−Flury株であることを特徴とする請求項10記載の組換え非分節(−)鎖RNAウイルスの回収方法。
- 真核宿主細胞が、哺乳類細胞であることを特徴とする請求項10又は11記載の非分節(−)鎖RNAウイルスの回収方法。
- 請求項9記載の外来遺伝子組換えウイルス発現ベクターを、標的細胞と接触させ、標的細胞中に導入することを特徴とするにより外来遺伝子の標的細胞での発現方法。
- 外来遺伝子が、ワクチン抗原、インターロイキン、酵素、又は生理活性を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項13記載の外来遺伝子の標的細胞での発現方法。
- 外来遺伝子として、薬理活性を有するペプチドをコードする遺伝子を組み込んだ請求項9記載の外来遺伝子組換えウイルス発現ベクターと医薬上許容される担体、希釈剤、アジュバント及び/又は賦形剤からなる医薬デリバリー用組成物。
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