JP2008525003A5

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Publication number: JP2008525003A5
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Filing date: 2005-12-22
Publication date: 2012-05-31
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Description

インフルエンザウイルス（オルトミキソリウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ））はセグメント化ゲノムを伴う、エンベロープをもつマイナス鎖のＲＮＡウイルスである（特許文献１参照）。それらはそれらの核タンパク質及びマトリックスタンパク質間の著しい抗原の相異に基づいて、２種の分類：１つはインフルエンザＡ及びＢを包含し、他方はインフルエンザＣからなるものに分類される。３種の型のウイルスはまた、病原性及びゲノム組織が異なる。Ａ型は広範な温血動物に認められるがＢ型及びＣ型は主としてヒトの病原体である。インフルエンザＡウイルスは更に血液凝集素（ＨＡ）及び、ビリオン（ｖｉｒｉｏｎ）の表面から突き出すＮＡ表面の糖タンパク質の抗原特性により準分割される。現在１５種のＨＡ及び９種のＮＡサブタイプが存在する。インフルエンザＡウイルスはトリ、ブタ、ウマ、ヒト及び他の哺乳動物を包含する広範な動物に感染する。水鳥はインフルエンザＡのすべての知られたサブタイプの天然のレザボアとしての役目をもち、恐らくヒトの流行性インフルエンザ株の遺伝物質の発生源である。

インフルエンザウイルスは関連するパラミクソ・ウイルスと異なり、セグメント化ＲＮＡゲノムを有する。インフルエンザＡ及びＢウイルスは同様な構造をもち、他方インフルエンザＣはより異なる。Ａ型及びＢ型のウイルスはそれぞれ、それぞれ少なくとも１個のタンパク質をコードする８個の別々の遺伝子セグメントを含有するが、Ｃ型はＡ型及びＢ型のセグメント４及び６を併せて７個の別々のセグメントを含有する。インフルエンザＡ及びＢウイルスは３種のタンパク質：ＨＡ、ＮＡ及びマトリックス２（Ｍ２）の突起物（ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）で覆われている。インフルエンザＣウイルスは唯一の表面糖タンパク質を有する。各インフルエンザＲＮＡセグメントは核タンパク質（ＮＰ）によりキャプシドを包まれて（ｅｎｃａｐｓｉｄａａｔｅｄ）リボヌクレオチド核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。３種のポリメラーゼタンパク質はＲＮＰ複合体の一方の端と結合されている。ＲＮＰは不可欠な部分としてマトリックスタンパク質（マトリックス１）を含む膜で囲まれている。エンベロープのリン脂質部分は細胞の宿主の膜から誘導される。ウイルス粒子内には非構造的タンパク質２（ＮＳ２）も認められる。

インフルエンザウイルスはセグメント化ゲノムを有するので、同一宿主における２種の異なる株による同時感染は親遺伝子セグメントの異なる組み合わせを含有する新規の再仕分けされたインフルエンザ株の産生をもたらす可能性がある。野生のトリには１５種のＨＡサブタイプが存在することが知られており、ヒトに対して新規のＨＡ源を提供する。抗原シフトによる新規サブタイプをもつインフルエンザ株のヒトの流行における出現が１９５７年及び１９６８年の最近の２回のインフルエンザ流行の原因であり、おそらく１９１８年のインフルエンザ流行の原因であるらしい。流行するインフルエンザウイルスの出現について知られているすべてと一致するためには、流行株は１つの近年優勢なものと抗原の異なるＨＡをもたなければならない；このＨＡは６０〜７０年間ヒトに流行した可能性がなく；そして該ウイルスはヒトからヒトに感染可能でなければならない。１９５７年及び１９６８年双方において、流行はＨＡのシフトからもたらされ、双方の場合に流行株のＨＡはトリの株に密接に関連していた。流行の絶対条件の１つは、ＨＡが変化しなければならないことであり、残りのウイルスが変化することができる又は変化するにちがいない程度は不明である。１９５７及び１９６８年流行のウイルスのみが直接的研究に利用可能であり、１９１８年流行のインフルエンザウイルスは分子考古学を使用して特徴を研究されている。１９５７年に、３種の遺伝子がトリ−様遺伝子：ＨＡ、ＮＡ及びポリメラーゼ複合体（ＰＢ１）の１サブユニットにより置き換えられた。１９６８年には、ＨＡ及びＰＢ１のみが置き換えられた。

インフルエンザ株は個々の遺伝子セグメントの配列の比較により遺伝子学的に特徴を調べることができ、再度ＷＨＯが指針を与え、そしてＷＨＯ協力センターがインフルエンザゲノムを含んでなるＲＮＡセグメントの個々の物体；核タンパク質（ＮＰ）、塩基性（ｂａｓｉｃ）ポリメラーゼ１（ＰＢ１）、塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）、酸ポリメラーゼ（ＰＡ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１及びＭ２）並びに非構造的タンパク質（ＮＳ１及びＮＳ２）をコードするインフルエンザＡ及びＢウイルスの核酸セグメント並びに核タンパク質（ＮＰ）、塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）、塩基性ポリメラーゼ２（ＰＢ２）、血球凝集素−ノイラミニダーゼ様糖タンパク質（ＨＮ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１及びＭ２）及び非構造タンパク質（ＮＳ１及びＮＳ２）をコードするインフルエンザＣウイルス核酸セグメント、の識別に対する指針を提供する。

組換えインフルエンザウイルスは、それからゲノムのウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）の各セグメントがＲＮＡポリメラーゼ１により転写される、１組の８種のプラスミド並びに核タンパク質（ＮＰ）及びポリメラーゼタンパク質ＰＢ１、ＰＢ２及びＰＡを発現する１組の４種の更なるプラスミドによる真核細胞のトランスフェクション時に産生された。これらの１２−プラスミド系を使用するウイルス産生の報告された有効性は比較的低かった。血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリックスタンパク質１及び２（Ｍ１及びＭ２）並びに非構造タンパク質２（ＮＳ２）をコードする５種の更なるプラスミドの同時発現時に、上澄み液中のウイルス滴定濃度は増加することができた。これらの１２及び１７−プラスミド系の的確な修飾が、トランスフェクションされたプラスミドの数を８に減少するように双方向性ベクトルの実行である。この系により、マイナス鎖ｖＲＮＡ及びプラス鎖ｍＲＮＡを同一プラスミドから合成することができる。

本発明はインフルエンザ遺伝子セグメント及びバクアテリオファージポリメラーゼプロモーターを含んでなる核酸又は該核酸の相補鎖を提供する。非セグメント化ウイルスに比較して、Ｔ７ポリメラーゼが作用しないと考えられた明白な例外はインフルエンザウイルスであり、その作製はポリメラーゼ及びクローンしたｃＤＮＡからの核タンパク質に加えて８種のウイルスのＲＮＡの合成の付加的複雑さを伴うことを示すＮｅｕｍａｎｎ及びＫａｗａｏｋａ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２８７，２４３−２４０，２００１）の所見と反対に、本発明はこのバクアテリオファージ−ポリメラーゼ−に基づく逆遺伝学的方法のためのプラスミドベクトル及びそれらが含有する要素に関して著しい自由度を提供する。例えば、ｖＲＮＡ又はｃＲＮＡ−様ＲＮＡ分子を産生するために我々はバクアテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼを使用したが、バクアテリオファージＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのような種々の他のＲＮＡポリメラーゼを使用することができる。好ましい態様において、本発明はインフルエンザ遺伝子セグメント及びＴ７プロモーターを含んでなる核酸又は該核酸の相補鎖を提供して、Ｔ７プロモーターの制御下のインフルエンザウイルスの遺伝子セグメントの発現時に本発明の系を基礎にさせる。１つの態様において、ポリメラーゼターミネーターが欠如している。該核酸はプロモーターの隣に１又は２個の更なるグアニン残基を提供されていることが好ましい。ワクチンの目的のためには、ワクチンの目的のためにＷＨＯにより推奨されるインフルエンザウイルスから誘導される遺伝子セグメントを含んでなる本発明に従う核酸が提供される。好ましい態様において、本発明はインフルエンザＡ遺伝子セグメント及びＴ７プロモーターを含んでなる核酸又は該核酸の相補鎖を提供する。双方向性の系においては特に、本発明に従う核酸はＴ７ターミネーターを含まないことが好ましい。ポリメラーゼは好ましくは、ウイルスを発現するプラスミドと一緒にトランスフェクションされる核外遺伝子から発現されるので、本明細書に提供される系は特定の種に限定はされない。Ｔ７ポリメラーゼに基づく逆遺伝学的系は時々、非セグメント化マイナス鎖ウイルスの救済のために使用されるが、バクアテリオファージポリメラーゼ法に基づくセグメント化インフルエンザウイルスに対する逆遺伝学的系はこれまで成功に使用されたことはなかった。ｃＤＮＡを転写するためにＴ７ポリメラーゼを使用する逆遺伝学的系における１つの制約因子は時々、Ｔ７−ポリメラーゼ駆動転写を高めるために転写開始部位にＧ残基を導入することにより克服すること追求されている。このアプローチは例えば、ＲＶ、ＶＳＶ及びＳＶの救済に使用されたが、しかしＺｏｂｅｌ当等（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９４Ｊｕｌ；２０２（１）：４７７−９；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９３Ａｕｇ１１；２１（１６）：３６０７−１４）は、ウイルスポリメラーゼが適当に機能するためには、インフルエンザＡ遺伝学セグメントの５’及び３’の両方が正確に規定される必要があり、従って、転写部位における更なるヌクレオチド付加のための空間を明らかに残さず、転写開始部位にＧ残基の導入を妨げることを教示していることを明記している。

しかし驚くべきことには、本発明の好ましい態様において、Ｔ７プロモーターの隣に少なくとも１個の更なるグアニン残基を提供された本発明に従う核酸が提供され、Ｔ７プロモーターの隣に２個の更なるグアニン残基が提供されることは更に好ましい。更に、本発明はＴ７ポリメラーゼを提供されたＭａｄｉｎＤａｒｂｙ犬の腎臓（ＭＤＣＫ）又は発育鶏卵繊維芽細胞（ＣＥＦ）を提供する。とりわけ、本発明は本発明に従う少なくとも１種の核酸を提供された細胞を提供する。本発明は１７−プラスミド又は１２−プラスミド又は８−プラスミド系のような多−プラスミド系の使用を容易にし、そして本発明が、更に、好ましくは、本発明に従うインフルエンザ遺伝子セグメントを発現することができる１個又は複数のプラスミドと一緒にトランスフェクションされるプラスミドから発現されるＴ７ポリメラーゼを提供された、本発明に従う核酸をもつ細胞を提供するために、該系は特定の種に限定されない。本明細書には更にＴ７ポリメラーゼが核局在化シグナルを含んでなる、本発明に従う細胞を使用することが提供される。好ましい態様において、本明細書に提供されるような細胞は霊長類以外の細胞であるので、それにより、本発明に従う核酸又は細胞から誘導される細胞物質又はワクチン中への霊長類ＤＮＡの導入を回避する。好ましくは、ＭＤＣＫ細胞又はＣＥＦ細胞が使用される。逆遺伝学的系のためにヘルパーウイルスが不要であり、トランスフェクションにより提供されるすべてのウイルス粒子が所望の核酸を含んでなり、そしてその後のワクチン産生系において面倒なクローン形成法を伴わずに使用することができることが本発明の利点である。本発明はまた、初めて、本発明に従う核酸を含んでなる複製型ウイルス粒子を提供する。米国特許第５，１６６，０５７号明細書においては、複製可能なこのようなウイルス粒子は提供されておらず、セグメント化インフルエンザウイルスにＴ７系を使用する他の試みは本発明まで成功しなかった。本明細書に提供されるような〜１０⁴のウイルス粒子のウイルス滴定濃度を含む細胞培養物の組成物は、ウイルスが複製を許される時は、＞１０⁷まで強化することができるトランスフェクション細胞培養物中でウイルス複製せずに容易に得ることができる。本発明に従う粒子の複製はヘルパーウイルスなしに実施されることが特に有用である。本発明に従う細胞から誘導される細胞又は物質あるいは本発明に従うウイルス粒子から誘導されるウイルス又は物質を含んでなる、このような細胞培養物組成物は有利には、インフルエンザウイルスによる被験体の感染に対する免疫学的防御をもたらすことを目的とした製薬学的組成物の生産のために使用することができる。確かに、本明細書に提供されたような細胞は米国特許第５，１６６，０５７号明細書には提供されていなかった。従って本発明はまた、本発明に従う少なくとも１種の核酸を含む細胞を培養する工程を含んでなる、複製型インフルエンザウイルス粒子の産生法を提供する。該方法に使用される少なくとも１種の核酸は少なくとも１種の、しかし好ましくは、７種又は８種のインフルエンザ遺伝子セグメント及びバクアテリオファージポリメラーゼプロモーター又は１種又は複数の該核酸の相補鎖を含んでなることが好ましい。更に、該セグメントはバクアテリオファージポリメラーゼターミネーターを含まず、それにより有利にはこのようなセグメントがプロモーターの隣に少なくとも１個の更なるグアニン残基を提供されているか又はプロモーターの隣に２個の更なるグアニン残基を提供されていることが好ましい。該セグメントは好ましくは、ワクチンの目的のためにＷＨＯにより推奨されるインフルエンザウイルス、例えば、インフルエンザＡ遺伝子セグメントから誘導される。最後に本発明は前記に開示の方法により得ることができる複製型インフルエンザウイルス粒子を提供する。それにより本発明はまた、本明細書に提供されるような組成物をそれを要する被験体に提供する方法を含んでなる、インフルエンザウイルスによる被験体の感染に対する免疫学的遮蔽をもたらすための方法を提供する。このような組成物は好ましくは、ワクチンとして、すなわちウイルス粒子又はこのような粒子から誘導されるウイルスタンパク質（サブユニット−ワクチン）を塩溶液又は補助剤（例えば、アルミニウム塩又は他の一般に使用される補助剤（例えば、ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｎｉｐ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｐｉｎｋ／Ａｐｐｅｎｄｉｃｅｓ／Ａ／Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ．ｐｄｆ．参照））のような適当な製薬学的担体と混合することにより調合される。

ＲＮＡポリメラーゼＩ（ＰｏｌＩ）はリボゾームのＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を転写する核の酵素であり、増殖細胞中で豊富に発現される。ｖＲＮＡのように、ｒＲＮＡはキャップをもたず、ポリ（Ａ）尾部ももたない（２３）。Ｈｏｂｏｍ等（１９、２１、２９）はＰｏｌＩを使用して正確な５’及び３’末端をもつ人工的インフルエンザウイルスｖＲＮＡ−様セグメントを生成するのに成功した。ＰｏｌＩプロモーター−ターミネーターカセットの環境でクローン化されたｃＤＮＡの転写は正確な５’及び３’末端をもつｖＲＮＡ−様分子の生成を可能にした（２９）。ヘルパーインフルエンザウイルスに関与したその後の研究により、これらのゲノムｖＲＮＡ分子を認めることができ、インフルエンザウイルスのポリメラーゼ複合体により複製され、そして子孫のインフルエンザウイルス中にパッケージされることができることが示された。このシステムがウイルス遺伝子セグメント又は更なる遺伝子セグメントの１つに突然変異体を含有するインフルエンザウイルスの生成を許し、従ってウイルス遺伝子及びそれらの製品の研究を可能にした。ヘルパーウイルスの使用の結果として、トランスフェクタントウイルスの選択を必要とし、これがむしろ面倒である。

その後、Ｈｏｆｆｍａｎｎ等は８種のみのプラスミドからのインフルエンザＡウイルスの生成のための双方向性ＰｏｌＩ−ＰｏｌＩＩ転写系を開発した（１２）。この双方向性の系において、ｖＲＮＡのｃＤＮＡをヒトＰｏｌＩプロモーターと最少のマウスＰｏｌＩターミネーター配列間に挿入した。この全カセットをＰｏｌＩＩプロモーターとポリアデニル化サイト間に挿入した。これが単一の構築物からのＰｏｌＩ及びＰｏｌＩＩプロモーターそれぞれからのｖＲＮＡ及びｍＲＮＡの転写を許した。ＭａｄｉｎＤａｒｂｙ犬腎（ＭＤＣＫ）細胞とともに同時培養された２９３Ｔ細胞中で、それぞれインフルエンザＡウイルス遺伝子セグメントの１つをコードする８種のＰｏｌＩ−ＰｏｌＩＩプラスミドの同時トランスフェクションが２×１０⁷ｐｆｕ／上澄み液１ｍｌまでの収率で感染性インフルエンザＡウイルスの回収をもたらした（１２）。ｍＲＮＡ及びｖＲＮＡ双方の合成のための１個の鋳型の使用はウイルス生成に要するプラスミド数を減少させた。この系中のウイルス生成の効率は単方向性（１２〜１６プラスミド）ＰｏｌＩ系のものと同様であることが報告された。

ＰｏｌＩ−に基づく逆遺伝学的系の種特異性は主要な欠点を形成する。前記の逆遺伝学的系はヒトＰｏｌＩプロモーターを使用して、組換えウイルスの産生を２９３Ｔ細胞又はＶｅｒｏ細胞のような霊長類発生源の細胞に限定した。ＰｏｌＩプロモーターはヒト、マウス、ラット及びブタを包含する幾つかの種に対して特徴を示されたが（８、１４、１７）、それらは多数の他の動物に対しては未知のままである。イヌ及びトリ細胞はインフルエンザＡウイルスの研究及びワクチン産生に定常的に使用されるが、イヌ及びトリのＰｏｌＩプロモーターはまだ記載されていない。インフルエンザウイルスの逆遺伝学法の自由度を改善するために、我々は普遍的な逆遺伝学的系を開発することを追求した。我々はバクアテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（ｐＴ７）の制御下のインフルエンザＡウイルスの遺伝子セグメントの発現に基づく系を考案することを選択した。バクアテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｐｏｌ）は転写により、又は安定に修飾された細胞株の使用により細胞に供給することができるために、この系は特定の種からの細胞に限定されない。

Ｔ７ｐｏｌに基づく逆遺伝学的系は非セグメント化のマイナス鎖ウイルスの救済のために使用される。Ｓｃｈｎｅｌｌ等は最初に、クローン化ｃＤＮＡ単独からの非セグメント化のマイナス鎖ウイルスを救済した。ｃＤＮＡクローンは狂犬病ウイルス（ＲＶ）の全長の抗ゲノムＲＮＡをコードすることにより作製された。このｃＤＮＡはＴ７ｐｏｌターミネーター配列（ｔＴ７）の隣にｐＴ７及びＨδＶｒｉｂ配列を有した。Ｔ７ｐｏｌによる転写後、ゲノムの正確な３’末端が３’末端におけるＨδＶｒｉｂ配列の自己消化開裂（ａｕｔｏｌｙｔｉｃｃｌｅａｖａｇｅ）により生成される。このプラスミドは、Ｔ７ｐｏｌを発現する細胞に、ｐＴ７の制御下でウイルスのＮタンパク質及びポリメラーゼタンパク質Ｌ及びＰをコードする発現プラスミドで同時トランスフェクションされた。この方法は組換えＲＶの救済をもたらしたが、２×１０⁷トランスフェクション細胞のうちの約１個からのみであった（２７）。それ以来、非セグメント化ＮＳＶのパラミキソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）及びフィロウイルス（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）科について同様な系が記載された（１０）。

ｃＤＮＡからの非セグメント化のマイナス鎖ウイルスの有効な回収のためには、マイナスセンスｖＲＮＡでなく、むしろプラスセンス抗ゲノムＲＮＡ（ｃＲＮＡ）が非常にしばしば産生される。裸のマイナスセンスｖＲＮＡ及びウイルスタンパク質をコードするプラスセンスのｍＲＮＡの同時の存在がハイブリッド形成をもたらして、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）へのゲノムの集合を妨げるであろうと考えられる（２７）。マイナス鎖のウイルスは通常、それらが常に、ハイブリッド形成を妨げるＲＮＰ型にそれらのゲノムを維持するためにこの問題に遭遇しない。Ｓｅｎｄａｉウイルス（１５）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（６）及びヒトメタニューモウイルス（１１）の回収がマイナスセンスのゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡにより報告されているが、効率はプラスセンスＲＮＡによる結果より有意に低かった。この原理はまた、組換えインフルエンザウイルスの救済についても適用された。Ｈｏｆｆｍａｎｎ等（１３）はまた、抗ゲノムのプラスセンスＲＮＡからの組換えインフルエンザウイルス産生の効率を決定した。細胞質中でのみ複製する非セグメント化及びセグメント化のマイナス鎖のウイルスに比較して、インフルエンザＡウイルスは同様な

効率で、ゲノム及び抗ゲノムベクトル双方から救済することができた。

ｐＰｏｌＩ−ＣＡＴ−ＲＴのＨδＶｒｉｂ（２５）はＰＣＲにより増力され（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）、ｐＳＯ７２のＸｂａｌ−ＢａｍＨＩサイトでクローン化された。ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶにより消化されたｔＴ７配列はｐＳＰ７２−ＨδＶｒｉｂのＢａｍＨＩ−Ｈｐａｌサイトにおいてクローン化されて、ｐＳＰ７２−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７（ＭＳ２４）をもたらした。ｐＴ７をコードするオリゴヌクレオチドを、導入されたＢｂｓｌサイトに適当な条件でｐＳＰ７２−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７のＮｄｅｌ−Ｘｂａｌサイトで連結反応させると、ベクトルｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７（ＭＳ２５、図１）をもたらした。インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４のセグメント５からの、ＮＣＲを隣にもつ緑の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のオープンリーディングフレームを、鋳型としてｐＳＰ−Ｈｕ−ＧＦＰ−Ｍｕ（４）を使用してｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７のＢｂｓｌサイトでクローン化した。このＧＦＰミニゲノムをセンス及びアンチセンス配置双方でクローン化し、ｐＴ７のすぐ下流に０／２／３個のいずれかの更なるＧ残基を含有した（図１）。

ｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７中でインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の遺伝子セグメントをクローンするためには、ｄｅＷｉｔ等に記載された（４）双方向性インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４構築物をＰＣＲの鋳型として使用した（第４の３’ヌクレオチドは国立インフルエンザ配列データベースで報告されたインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４配列と対応していた）。Ａａｒｌ制限サイトを含有するプライマーがクローンセグメント１、２、３、４、６、７、８に対して使用され、セグメント５に対しては率直な（ｂｌｕｎｔ）末端連結反応が使用され、遺伝子セグメントは、ｐＴ７後に２個の更なるＧ残基を含有するアンチセンス配置のＢｂｓｌサイトでクローンされた。

双方向性ベクトルｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７−ｐＣＭＶ（ＭＳ６５、図１）はｔＴ７の下流でＣＭＶプロモーター（ｐＣＭＶ）をクローン化して対応する遺伝子セグメントからｍＲＮＡの産生を可能にすることにより産生された。ｐＣＭＶはＡｓｅｌ制限サイトを含有するプライマーを使用してＰＣＲにより増力された。ｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７は一部Ａｓｅｌで消化され、ｐＣＭＶは遺伝子セグメントからのｍＲＮＡの産生のために適当な方向のｔＴ７からの下流で連結反応された。

再度インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４セグメントをクローン化して各双方向性Ｔ７ｐｏｌ駆動インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４構築物を得た。

Ｔ７ｐｏｌに基づく系による組換えウイルスの産生
２９３Ｔ細胞を、前記のように、ＰＲ／８／３４の遺伝子セグメントを含有する単方向性プラスミドそれぞれから５μｇ、それぞれ５μｇの発現プラスミドＨＭＧ−ＰＢ２、ＨＭＧ−ＰＢ１、ＨＭＧ−ＰＡ、ＨＭＧ−ＮＰ及び１５μｇのｐＡＲ３１３２によりトランスフェクションした。あるいはまた、我々はＰＲ／８／３４の遺伝子セグメントを含有する双方向性プラスミドそれぞれから５μｇ及び１５μｇのｐＡＲ３１３２をトランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後に上澄みを回収し、１ｍｌを使用してＭＤＣＫ細胞の密集単層を感染させた。

結果
単方向性のＴ７ｐｏｌに基づく逆遺伝学的系によるＧＦＰミニゲノムアッセイ
ｐＴ７、ＨδＶｒｉｂ及びｔＴ７を含有する単方向性ベクトルを構成した。インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４のセグメント５の非コード領域（ＮＣＲ）を隣にもつＧＦＰオープンリーディングフレームを０、２又は３個の更なるＧ残基をもつセンス（Ｓ）及びアンチセンス（ＡＳ）配置のｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７中でクローンさせた（図１及び別図２及び３）。これらの構築物はそれぞれＳ−０Ｇ、Ｓ−２Ｇ、Ｓ−３Ｇ、ＡＳ−０Ｇ、ＡＳ−２Ｇ及びＡＳ−３Ｇと名付けた。我々はこれらの選択肢のどれが最良の効果をもたらしたかを試験した。

単方向性のＴ７ｐｏｌに基づく逆遺伝学的系による組換えウイルスの産生
次にインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の遺伝子セグメントを組換えインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の産生のために、ベクトルｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７中でクローン化させた。

インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の遺伝子セグメントをコードする８種の構築物、ｐＴ７ＰＯＬ（ｐＡＲ３１３２）、ｐＨＭＧ−ＰＢ１、ｐＨＭＧ−ＰＢ２、ｐＨＭＧ−ＰＡ及びｐＨＭＧ−ＮＰで２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。トランスフェクション後、産生ウイルスの複製を許すために、培地にトリプシンを添加した。トランスフェクションの７２時間後、上澄みを回収し、ＭＤＣＫ細胞播種に使用した。播種の３日後、ウイルス複製の指標として、これらのＭＤＣＫ細胞の上澄み上でＨＡ−試験を実施した。ＨＡ−試験は陽性であった。次に２９３Ｔ及びＭＤＣＫ上澄みのウイルス滴定濃度を決定した。２９３Ｔ上澄み中のウイルス滴定濃度は１．６×１０¹ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌであることが示され、ＭＤＣＫ上澄み中のウイルス滴定は２．０×１０⁷ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌであることが示された。トランスフェクション後に２９３Ｔ細胞にトリプシンを添加しなかった時は、２９３Ｔ細胞及びＭＤＣＫ細胞中に僅かに低いウイルス滴定を得た（データは示されていない）。従って、これは、ＰｏｌＩプロモーターを使用しなかった最初のプラスミドのみの組換えインフルエンザＡウイルスの救済を表わす。

双方向性Ｔ７系
次に我々はｐＴ７の制御下で双方向性逆遺伝学的系を開発することを所望した。ｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７中でｐＣＭＶをクローン化させることによりプラスミドベクトルを産生して、ベクトルｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７−ｐＣＭＶをもたらした（図１）。インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４のセグメント５の非コード領域（ＮＤＲ）を隣にもつＧＦＰオープンリーディングフレームを２個の更なるＧ残基をもつアンチセンス配置におけるｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７−ｐＣＭＶ中でクローン化させた。我々はこのプラスミドがインフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体によるミニゲノム複製の必要なしにＧＦＰ発現を引き起こすであろうと期待したので（ｐＣＭＶはミニゲノムに対してセンス配置にある）、我々は更に、ｐＴ７に対してセンス配置にある（従ってｐＣＭＶに対してアンチセンス）ミニゲノム（０のＧ残基）を含有する同様な構築物を作製した。ミニゲノムプラスミドを核Ｔ７ｐｏｌ及びｐＨＭＧ−ＰＢ１、ｐＨＭＧ−ＰＢ２、ｐＨＭＧ−ＰＡ及びｐＨＭＧ−ＮＰを発現するプラスミドと一緒に２９３Ｔ細胞中でトランスフェクションした。３０時間後に細胞をＦＡＣＳにより分析した（図５）。

双方向性のＴ７ｐｏｌに基づく逆遺伝学的系による組換えウイルスの産生
次にインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の遺伝子セグメントを組換えインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の作製のためにベクトルｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７−ｐＣＭＶ中でクローン化させた。

インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の遺伝子セグメントをコードする８種の構築物及びｐＴ７ｐｏｌ（ｐＡＲ３１３２）で２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。トランスフェクション後、産生されたウイルスの複製を許すために培地にトリプシンを添加した。トランスフェクションの７２時間後、上澄みを回収し、ＭＤＣＫ細胞を播種するために使用した。播種の３日後、ウイルス複製の指標としてのＨＡ−試験をこれらのＭＤＣＫ細胞の上澄み上で実施した。ＨＡ−試験は陰性であり、組換えウイルスが回収されなかったことを示した。

ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ遺伝子を発現するために双方向性ベクトルを使用するミニゲノムリポーターアッセイから、これらのプラスミドからのタンパク質発現は非常に低いという証拠が得られた（データは示されていない）。ｔＴ７配列が転写形態ｐＣＭＶを妨げて、コード遺伝子の低い産生をもたらしたことが仮定された。従って、ｔＴ７配列を省いた新規の双方向性プラスミド（ｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｐＣＭＶ）が作製された。インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の遺伝子セグメントを組換えインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４の作製のためにベクトルｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｐＣＭＶ中でクローン化させた。最初の試みにおいては、再度組換えウイルスは産生されなかった。しかし、トランスフェクションに使用されるプラスミドの量の何かの最適化により、組換えウイルスの産生に成功した。この実験に使用されたプラスミドの量はＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＨＡをコードする構築物それぞれ１０μｇ及びＮＰ、ＮＡ、ＭＡ及びＮＳをコードする構築物、それぞれ５μｇであった。２９３Ｔ細胞中の組換えウイルス滴定濃度は検出不可能であったが、ＭＤＣＫ細胞の次の播種は１．３×１０⁵ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌの初期滴定濃度をもつウイルスをもたらした。

ここで、初めて、我々により２９３Ｔ細胞中にＴ７ｐｏｌに基づく系を使用する組換えインフルエンザＡウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（ＭＤＣＫ−適応ＮＩＢＳＣ株）の産生が示された。しかし、これらの方法の使用をインフルエンザＡウイルスＡ／ＰＲ／８／３４に限定する条件はなく、それらは他のセグメント化マイナス鎖ＲＮＡウイルスのみならずまた、Ａ型、Ｂ型及びＣ型すべてのインフルエンザウイルスに適用することができる。これらの方法の使用を２９３Ｔ細胞、ＢＳＲ−Ｔ７細胞及びＭＤＣＫ細胞に限定する条件もなく、Ｔ７ｐｏｌは例えば、組換えウイルスがそのときに産生され得る広範な細胞株のトランスフェクションにより供給することができる。

我々は更に、ｔＴ７がそれから消去された１組の双方向性ベクトルを生成した。これを、知られた酵素による処理のＢａｍＨＩ−ＢｐｅＥＩによるｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｔＴ７−ｐＣＭＶの消化及び連結反応により実施して、ｐＳＰ７２−ｐＴ７−ＨδＶｒｉｂ−ｐＣＭＶ（ＭＳ９０、図１）を生成した。再度、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４セグメントをクローン化して各双方向性Ｔ７ｐｏｌ駆動インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４構築物を得た。

Claims

少なくとも１種の核酸でトランスフェクションされた細胞を培養する工程を含んでなる、ヘルパーウイルスを使用せずに複製型インフルエンザウイルス粒子を産生する方法であって、核酸がインフルエンザ遺伝子断片及びバクアテリオファージポリメラーゼプロモーターを含んでなるか又は核酸がインフルエンザ遺伝子断片の相補物及びバクアテリオファージポリメラーゼプロモーターを含んでなることを特徴とする、上記方法。
請求項１記載の方法であって、該方法に使用される核酸が、バクアテリオファージポリメラーゼターミネーターを含まない、上記方法。
請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法であって、該方法に使用される核酸が、バクアテリオファージポリメラーゼプロモーターの隣に少なくとも１個の更なるグアニン残基を提供された、上記方法。
請求項３記載の核酸であって、該方法に使用される核酸が、バクアテリオファージポリメラーゼプロモーターの隣に２個の更なるグアニン残基を提供された、上記方法。
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、該バクアテリオファージポリメラーゼプロモーターが、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターである、上記方法。
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、細胞のトランスフェクションが、該方法で使用される７又は８種の核酸による、上記方法。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、細胞のトランスフェクションが、インフルエンザ核タンパク質及びポリメラーゼタンパク質ＰＡ、ＰＢ１及びＰＢ２のみならずまた、８種のインフルエンザｖＲＮＡ核酸を発現する１２種の単方向性プラスミドによる、上記方法。
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、該方法に使用される少なくとも１種の核酸が、ワクチンの目的のために世界保健機構により推奨されるインフルエンザウイルスから誘導されたインフルエンザ遺伝子断片を含んでなる、上記方法。
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法であって、該方法に使用される少なくとも１種の核酸がインフルエンザＡ遺伝子断片を含んでなる、上記方法。
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、該方法に使用される細胞が更にバクアテリオファージポリメラーゼを提供された、上記方法。
請求項１０記載の方法であって、該バクアテリオファージポリメラーゼが、核局在化シグナルを含んでなる、上記方法。
請求項１０〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、該バクアテリオファージポリメラーゼが、Ｔ７ポリメラーゼである、上記方法。
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法であって、該方法に使用される細胞が、霊長類以外の細胞である、上記方法。
請求項１３記載の方法であって、該方法に使用される細胞が、ＭＤＣＫ細胞又はＣＥＦ細胞である、上記方法。
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法により得ることができる複製型インフルエンザウイルス粒子。
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法に従って、少なくとも１種の核酸でトランスフェクションされた細胞。
請求項１５記載のウイルス粒子から誘導されるウイルス粒子又は物質、あるいは請求項１６記載の細胞から誘導される細胞又は物質を含んでなる組成物。
インフルエンザウイルスによる被験体の感染に対して免疫学的防御をもたらすことを目的とした製薬学的組成物の製造のための請求項１７記載の組成物の使用。
請求項１７記載の組成物をそれを必要をする被験体に提供する方法を含んでなる、インフルエンザウイルスによる被験体の感染に対して免疫学的防御をもたらす方法。
インフルエンザ遺伝子セグメント及びＴ７バクテリオファージポリメラーゼプロモーターを含んでなり、かつ、該プロモターに接して少なくとも一つの追加のグアニン残基を備えた核酸。
請求項２０記載の核酸であって、２つの追加のグアニン残基を備えた、上記核酸。
ワクチンの目的上ＷＨＯにより推薦されているインフルエンザウイルス由来の遺伝子セグメントを含んでなる請求項２０又は２１記載の核酸。
インフルエンザＡの遺伝子セグメントを含んでなる請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の核酸。
請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の核酸を備えた細胞。
さらに、Ｔ７バクテリオファージポリメラーゼを備えた請求項２４記載の細胞。
請求項２５記載の細胞であって、該ポリメラーゼが核局在化シグナルを含んでなる、上記細胞。
請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の非霊長目の動物細胞。
ＭＤＣＫ細胞又はＣＥＦ細胞である請求項２７記載の細胞。
ヘルパーウイルスを備えていない請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の細胞。
医薬組成物の製造のための、請求項１６または２４に記載の細胞の使用。