KR20030013451A

KR20030013451A - 인플루엔자 에이/유돈/72(에이치3엔2) 게놈의뉴클레오타이드 서열

Info

Publication number: KR20030013451A
Application number: KR1020027017495A
Authority: KR
Inventors: 갈라르자호세엠.; 레이썸테레사이.
Original assignee: 아메리칸사이아나미드컴파니
Priority date: 2000-06-23
Filing date: 2001-06-21
Publication date: 2003-02-14
Also published as: MXPA02012255A; WO2002000884A2; AU2001270033A1; WO2002000884A3; BR0111819A; CN1437612A; JP2004514415A; EP1292614A2; IL153005A0; CA2410284A1

Abstract

게놈의 완전한 서열을 안티게놈 메시지 센스로 제공하는 네거티브 스트랜드 인플루엔자 A 바이러스 스트레인 A/Udorn/72(H3N2)의 8개 세그먼트 각각의 완전한 뉴클레오타이드 서열이 개시된다. 서열은 진단에 유용하고 새로운 인플루엔자 A 바이러스 스트레인을 생성시키기 위해 돌연변이에 의해 변형시킬 수 있다.

Description

인플루엔자 에이/유돈/72(에이치3엔2) 게놈의 뉴클레오타이드 서열{NUCLEOTIDE SEQUENCE OF INFLUENZA A/UDORN/72(H3N2) GENOME}

인플루엔자 바이러스는 A, B 및 C로 명명된 서브타입으로 구성된다. 인플루엔자 A 바이러스는 바이러스의 생활환에 요구되는 10 폴리펩타이드(단백질)을 암호화하는, 8 세그먼트의 단일 네거티브 스트랜드 RNA 게놈을 보유한다. 단백질의 순서는 다음과 같다:

세그먼트: 1 2 3 4 5 6 7 8

단백질: PB2 PB1 PA HA NP NA M1 NS1

스플라이싱

산물 M2 NS2

인플루엔자 서브타입 A 완전 게놈의 8 RNA 세그먼트 각각은 뉴클레오캡시드 단백질(NP)의 다중 서브유닛으로 캡시드화되어 있고 삼량체 폴리머라제(PB1, PB2 및 PA 서브유닛)과 회합되어 있어서, 리보핵단백질 복합체(RNP)를 형성한다(Lamb,R.A., pages 1-87 of The Influenza Viruses, R.M. Krug, ed. (Plenum Press, 1989)). NP 단백질은 구조 및 전사/복제 조절 단백질이다. 이들 구조는 비리온의 주요 구조 성분이고 코어와 바이러스 엔벨로프 간의 연결체로서 작용하는 것으로 보이는 매트릭스 단백질(M1)의 층으로 둘러싸여 있다. 이러한 숙주세포-유래 엔벨로프에는 항원 결정기인 두 주요 바이러스 암호화 표면 당단백질 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다제(NA), 및 훨씬 더 소량의 비-글리코실화 소형 단백질 M2가 점재해 있다(Lamb 1989; Lamb, R.A., et al., Cell, 40, 627-633 (1985)). M2 단백질은 이온 채널 활성을 지닌 세그먼트 #7(M1 단백질도 암호화한다)로부터의 스플라이싱 유전자 산물이며; 스플라이싱 유전자는 감염된 세포에만 존재한다. 이와 마찬가지로, 비-구조적 NS2 단백질은 세그먼트 #8(비-구조적 NS1 단백질도 암호화한다)로부터의 스플라이싱 유전자 산물이며; 스플라이싱 유전자는 감염된 세포에만 존재한다. HA 당단백질은 프로테아제에 의해 절단되어 HA1 및 HA2를 형성한다.

인플루엔자 바이러스 감염은 시알산-함유 세포 수용체에 표면 헤마글루티닌의 부착에 의해 개시된다. 이러한 첫 번째 바이러스-세포 상호작용은 수용체-매개 엔도사이토시스에 의한 세포 중으로 바이러스 입자의 흡수를 유도한다. 엔도솜의 낮은 pH 조건하에서, HA는 HA2의 소수성 NH₂말단 도메인과 엔도솜 막의 상호작용을 촉진하는 형태 변화를 겪게 되어, 막 융합이 일어나고 뒤 이어서 코어 RNP와 매트릭스 단백질(M1)이 세포질 중으로 방출된다. 완전한 게놈의 전사 및 복제가 일어나는 핵으로 RNP가 전좌되기 전에 세포질에서 RNP와 매트릭스 단백질의 해리가 일어난다(Martin, K., and Helenius, A., Cell, 67, 117-130 (1991); Shapiro, G.I., et al., J. Virology, 61, 764-773 (1987)).

1차 전사 후, 새로 합성된 단백질은 바이러스 게놈의 복제를 개시하고 이는 다시 전사와 단백질 합성을 증가시킨다. 바이러스 생활환의 이 시점에서, 표면 당단백질 HA 및 NA는 새로 조립된 바이러스가 방출될 원형질막의 불연속 지역에서 축적되기 시작한다. 바이러스 조립은 4종의 바이러스 암호화된 구조 단백질: 막에 고정된 단백질(HA, NA 및 M2), 및 RNP와 긴밀한 회합을 유지하는 언더라잉 매트릭스 단백질(M1)의 세포질 및/또는 막횡단 도메인 간의 일종의 상호작용을 통해 개시되는 것으로 추정된다(Garoff, H., et al., Microbiology and Molecular Biology Review, 62, 1171-1190 (1998); Nayak, D.P., ASM News, 62, 411-414 (1996)). 매트릭스 단백질 M1과 RNP 복합체간의 접촉, 및 8 RNP의 완전한 세트가 성숙 비리온 입자 중으로 혼입되어 들어가는 메커니즘은 잘 정의되어 있지 않다. 구조 성분 간의 특이적 분자 접촉은 형태발생 과정이 어떻게 개시되어 숙주 세포의 표면으로부터 성숙 입자 조립 및 출아 포인트로 진행하는지를 지시하는 것으로 추정된다.

바이러스 게놈의 복제 중에 RNA 폴리머라제에 의해 도입된 돌연변이에 의해 지속적으로 진화하는 다수의 인플루엔자 A 바이러스 서브타입 및 항원 변이체가 존재한다. 돌연변이는 또한 이들이 동일한 세포 숙주에 우연히 감염될 때 두 상이한 서브타입의 세그먼트간의 유전자 재분류에 의해서도 일어난다. 인플루엔자 A 바이러스의 이러한 생물학적 특징은 새로운 바이러스 스트레인을 생성시키며, 이는 인플루엔자에 대한 면역원 조성물의 주기적인 업데이트를 필요케 한다. 따라서, 인플루엔자 A 바이러스의 하나의 특정 스트레인의 완전한 뉴클레오타이드 서열과 완전한 길이 클론의 입수 가능성이 인플루엔자에 대한 새롭고 혁신적인 면역원 조성물의 개발에 필수이다. 따라서, 인플루엔자 A 바이러스의 완전한 뉴클레오타이드 서열의 결정 및 그러한 서열을 함유하는 완전한 길이 클론의 작제가 필요하다.

특히, 인플루엔자 A/Udorn/72 (H3N2)로 명명된 인플루엔자 A 스트레인이 1972년에 최초로 분리되었다. 폴리머라제 유전자 PB2, PB1 및 PA의 뉴클레오타이드 서열은 서열분석되지 않았다. HA, NP, M1, M2, NS1 및 NS2를 암호화하는 세그먼트의 뉴클레오타이드 서열이 서열분석되었다. 그러나, 이들 서열은 정확한 서열을 제공하지 못할 수도 있는 장비를 사용하여 수년 전에 수득되었다. 따라서, 업데이트된 정확한 서열을 제공하기 위해 그들 세그먼트의 서열분석을 반복할 필요가 있다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 인플루엔자 A/Udorn/72 (H3N2) 바이러스 스트레인과 세그먼트 #7 및 #8 mRNA의 스플라이싱 산물의 완전한 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 것이다. 본 발명의 추가 목적은 8 유전자와 스플라이싱 메시지 각각의 클론을 생성시키는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 이들 유전자와 스플라이싱 메시지의 산물 10개 모두의 연역된 아미노산 서열을 결정하는 것이다.

본 발명의 이러한 목적과 타 목적은 그 스트레인의 완전한 뉴클레오타이드 서열, 및 그들의 스플라이싱 메시지를 함께 포함하는 인플루엔자 A/Udorn/72 (H3N2) 스트레인의 세그먼트 전부의 뉴클레오타이드 서열을 구성하는 분리된 핵산분자의 규명에 의해 달성된다. 이들 뉴클레오타이드 서열의 전부는 포지티브 스트랜드, 안티게놈 메시지 센스로 제시된다.

특히, 완전한 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13 및 서열번호 17과 이들의 생물학적 등가물로 이루어진다.

이와 달리, 완전한 뉴클레오타이드 서열은 HA (P1)(서열번호 21)로 명명된 HA 서열의 변이체를 포함하고, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 17 및 서열번호 21과 이들의 생물학적 등가물로 이루어진다.

본 발명의 또다른 양태에서, 이들 분리된 핵산 분자는 개별 단백질을 암호화하는 개개의 분리된 인플루엔자 A 바이러스 핵산 분자에 대한 것이며 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 11 및 서열번호 21(서열번호 7의 변이체)과 이들의 생물학적 등가물로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

본 발명의 또다른 양태에서, 이들 개개의 분리된 핵산 분자는 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6과 이들의 생물학적 등가물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화한다.

본 발명의 추가 양태에서, 개개의 분리된 인플루엔자 A 바이러스 아미노산 서열이 제공되며, 이러한 서열은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 및 이들의 생물학적 등가물로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

본 발명의 추가 양태에서, 개개의 인플루엔자 A 바이러스 아미노산 서열이제공되며, 이러한 서열은 서열번호 8 또는 서열번호 12의 서열을 갖는다.

본 발명의 또다른 양태에서, 인플루엔자 A/Udorn/72 (H3N2) 스트레인의 세그먼트의 뉴클레오타이드 서열을 지닌 분리된 핵산 분자가: (1) 샘플내 상응하는 바이러스 세그먼트의 존재를 검출하기 위하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 분석에 사용하기 위한 PCR 프라이머의 디자인에; 또는 (2)샘플내 그 세그먼트에 의해 생산된 상응하는 단백질의 존재를 검출하기 위해 ELISA에 사용하기 위한 펩타이드의 디자인과 선택에 사용된다.

본 발명은 인플루엔자 바이러스 스트레인 A/Udorn/72 (H3N2)의 세그먼트 각각의 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다.

인플루엔자 A/Udorn/72 (H3N2) 스트레인의 수개의 세그먼트의 뉴클레오타이드 서열과 연역된 아미노산 서열이 공개되었다. Yuferov 등은 세그먼트 4의 HA 유전자의 서열을 보고하였다(Yuferoy, V.P., et al., Proceedings of the Academy of Sciences of the USSR, 278, 738-742 (1984)). Buckler-White 등은 세그먼트 5의 NP 유전자의 서열을 보고하였다(Buckler-White, A.J., and Murphy, B.R., Virology, 155, 345-355 (1986)). Markoff 등은 세그먼트 6의 NA 유전자의 서열을 보고하였다(Markoff, L., and Lai, C.J., Virology, 119, 288-297 (1982)). Lamb 등은 1981년에 세그먼트 7의 M1 유전자 및 M2 유전자 스플라이스 산물의 서열을 보고하였다(M1 in Lamb, R.A., and Lai, C.J., Virology, 112, 746-751 (1981)("Lamb Virology 1981"), and M2 in Lamb, R.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 4170-4174 (1981)("Lamb PNAS 1981")). Lamb 등은 1980년에 세그먼트 8의 NS1 유전자 및 NS2 유전자 스플라이스 산물의 서열을 보고하였다(Lamb, R.A., and Lai,C.J., Cell, 21, 475-485 (1980).

이들 세그먼트를 재서열분석하고, 아울러 이전에 규명되지 않았던 그들 세그먼트를 서열분석하기 위해, 인플루엔자 A/Udorn/72 (H3N2) 스트레인을 Madin-Darby 개 신장(MDCK) 세포에서 생장시켜 정제하였다. 바이러스 RNA를 정제된 비리온으로부터 추출하여 말단-특이성 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 증폭시킨다. 겔 정제된 유전자를 pGemT 벡터(Promega) 중으로 클로닝시키고 다중 프라이머 세트를 사용하여 서열분석한다. 말단의 서열은 3′및 5′연결 및 접합점을 가로지르는 RT-PCR 단편의 서열분석에 의해 결정된다(Galarza, J.M., et al., J. Virol, 70, 2360-2368 (1996)). M2 및 NS2 유전자는 각각 세그먼트 7 및 8의 mRNA의 스플라이싱 산물이다. 이들 유전자는 올리고-dT 및 유전자-특이성 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 MDCK-인플루엔자 A/Udorn-감염 세포로부터 정제한 mRNA로부터 회수한다. RT-PCR 산물을 겔 정제하고 pGemT 벡터 중으로 클로닝한다. 모든 유전자 서열은 형광 염료 터미네이터를 AmpliTaq DNA 폴리머라제(Perkin-Elmer)와 및 Applied Biosystems ABI 377 DNA 서열분석기를 사용하여 결정된다. 이러한 절차는 각 세그먼트에 대한 다중 클론으로 반복되고; 수득된 서열은 일정하다.

인플루엔자 A/Udorn/72 (H3N2) 스트레인의 완전한 게놈은 총 13628 뉴클레오타이드이다. 이는 인플루엔자 A/Udorn/72 (H3N2) 스트레인의 완전한 뉴클레오타이드 서열의 첫 번째 기술이다.

8개의 세그먼트가 프로모터, 인핸서 및 폴리아데닐화 시그널 같은 조절 서열을 포함하여, 이들의 암호화 영역, 및 이들의 5′및 3′비-암호화 영역에서 서열분석되었다. 세그먼트, 이들의 뉴클레오타이드의 수, 이들의 분리된 핵산 분자 서열(포지티브 스트랜드, 안티게놈, 메시지 센스로, 즉 5′에서 3′방향으로 나타냄), 이들의 암호화 영역 및 아미노산 해독은 다음과 같다:

세그먼트 #1: 2341 뉴클레오타이드, 서열번호 1, 암호화 영역 뉴클레오타이드 28-2304는 PB2, 759 아미노산(서열번호 2)를 암호화한다.

세그먼트 #2: 2341 뉴클레오타이드, 서열번호 3, 암호화 영역 뉴클레오타이드 25-2295는 PB1, 757 아미노산(서열번호 4)을 암호화한다.

세그먼트 #3: 2233 뉴클레오타이드, 서열번호 5, 암호화 영역 뉴클레오타이드 25-2172는 PA, 716 아미노산(서열번호 6)을 암호화한다.

세그먼트 #4: 1765 뉴클레오타이드, 서열번호 7, 암호화 영역 뉴클레오타이드 30-1727은 HA, 566 아미노산(서열번호 8)을 암호화한다.

서열번호 7 및 서열번호 8은 HA에 대해 몇가지 점에서 공개된 Yuferov 등 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열과 상이하다.

Yuferov 서열번호 7 또는 8

코돈 # 아미노산 # 코돈 # 아미노산 #

GAC Asp AAC Asn

81-83 18 81-83 18

GGT Gly GGG Gly

1101-1103 358 1101-1103 358

TAC Tyr TTC Phe

1485-1487 486 1485-1487 486

GAC Asp AAC Asn

1614-1616 529 1614-1616 529

세그먼트 #5: 1565 뉴클레오타이드, 서열번호 9, 암호화 영역 뉴클레오타이드 46-1539는 NP, 498 아미노산(서열번호 10)을 암호호한다.

서열번호 9 및 서열번호 10은 NP에 대해 공개된 Buckler-White 등 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열과 동일하다.

세그먼트 #6: 1466 뉴클레오타이드, 서열번호 11, 암호화 영역 뉴클레오타이드 20-1426은 NA, 469 아미노산(서열번호 12)을 암호화한다.

서열번호 11 및 서열번호 12는 NA에 대해 몇가지 점에서 공개된 Markoff 등 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열과 상이하다.

Markoff 서열번호 11 또는 12

코돈 # 아미노산 # 코돈 # 아미노산 #

CAG Gln CTG Leu

104-106 29 104-106 29

GGA Gly GCA Ala

546-548 177 546-548 177

CAA Gln CAG Gln

695-697 226 695-697 226

ACA Thr GCA Ala

992-994 325 992-994 325

또한, 아미노산 1에서의 메티오닌의 상류에서 리더 서열에 수개의 차이가 존재한다.

세그먼트 #7: 1027 뉴클레오타이드, 서열번호 13, 암호화 영역 뉴클레오타이드 26-781은 M1, 252 아미노산(서열번호 14)을 암호화한다.

서열번호 13 및 서열번호 14는 M1에 대해 공개된 Lamb Virology 1981 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열과 동일하다.

세그먼트 #7, 스플라이싱 산물: 322 뉴클레오타이드, 서열번호 15, 암호화 영역 뉴클레오타이드 26-316은 M2, 97 아미노산(서열번호 16)[잔기 10, 뉴클레오타이드 53-55에서 첫 번째 스플라이싱 아미노산]을 암호화한다.

서열번호 15 및 서열번호 16은 M2에 대해 공개된 Lamb PNAS 1981 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열과 동일하다.

세그먼트 #8: 890 뉴클레오타이드, 서열번호 17, 암호화 영역 뉴클레오타이드 27-737은 NS1, 237 아미노산(서열번호 18)을 암호화한다.

서열번호 17과 서열번호 18은 NS1에 대해 공개된 Lamb 등 1980 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열과 동일하다.

세그먼트 #8, 스플라이싱 산물: 402 뉴클레오타이드, 서열번호 19, 암호화 영역 뉴클레오타이드 27-389는 NS2, 121 아미노산(서열번호 20)[잔기 11, 뉴클레오타이드 57-59에서 첫 번째 스플라이싱 아미노산]을 암호화한다.

서열번호 19 및 서열번호 20은 NS2에 대해 공개된 Lamb 등 1980 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열과 동일하다.

전술한 바와 같이, 또한 HA (P1)으로 명명된 대체 HA 서열이다:

세그먼트 #4: 1764 뉴클레오타이드, 서열번호 21, 암호화 영역 뉴클레오타이드 30-1727은 HA, 566 아미노산(서열번호 22)을 암호화한다.

이론에 구애됨이 없이, HA (P1) 서열은 시간 경과에 따라 발생하는 인플루엔자 A/Udora/72 (H3N2) 스트레인으로부터의 마이너 돌연변이를 혼입할 수 있다. HA (P1) 서열(서열번호 21)은 1764 뉴클레오타이드를 가지며, 이는 세그먼트 #4의 비-암호화 영역내 하나의 뉴클레오타이드 결실(위치 1756)에 기인하여, HA 서열(서열번호 7)보다 하나가 더 적은 것이다.

본 발명의 두 HA 서열은 다음과 같이 그들의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열에 있어 상이하다:

뉴클레오타이드 위치 HA HA (P1) 아미노산 변화

35 G A 사일런트

81 A G Asn에서 Asp로

1103 G T 사일런트

1486 T A Phe에서 Tyr로

1614 A G Asn에서 Asp로

1756 T 결실 암호화 영역 외측

HA (P1) 서열은 또한 다음과 같이 Yuferov 등 HA 뉴클레오타이드 서열과 약간 상이하다:

뉴클레오타이드 위치 HA (P1) Yuferov 아미노산 변화

35 A G 사일런트

1756 결실 T 암호화 영역 외측

게놈 네거티브 센스(즉, 3′에서 5′방향)인 세그먼트의 mRNA의 핵산 서열은 전술한 포지티브 스트랜드, 안티게놈 메시지 센스 서열의 보체이다.

전술한 인플루엔자 A/Udorn/72 (H3N2) 바이러스 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 외에도, 본 발명은 유전 암호의 중복성에 의해, 바이러스 단백질을 암호화하는 그러한 서열과 생물학적으로 동등한 개개의 인플루엔자 A 바이러스 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 분리된 핵산 분자를 추가로 포함하며, 즉 이들 다른 뉴클레오타이드 서열은 여기에서 기재된 것들과는 상이하지만, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 11 및 서열번호 21의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 특징으로 한다.

특히, 본 발명은 Sambrook 등에 기술된 것들과 같이(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), 표준 고 엄격 서던 하이브리드화 조건하에서 후술되는 서열과의 하이브리드화를 허용하도록, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 11 및 서열번호 21의 서열의 충분한 복사체인 뉴클레오타이드 서열을 고려한다.

본 발명은 또한, 인플루엔자 A/Udorn/72 (H3N2) 바이러스 단백질의 것들과는 상이하지만, 이들 바이러스 단백질 중 하나에 대해 기술된 것들과는(서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6) 생물학적으로 동등한 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이러한 아미노산 서열은 서열의 3차원 구조가 바이러스 단백질의 것들로부터 본질적으로 불변하게 되도록, 이들의 서열이 바이러스 단백질 서열로부터의 마이너 결실, 이러한 서열 중으로의 삽입 또는 이에 대한 치환에 의해서만 상이할 경우 임의 바이러스 단백질과 생물학적으로 동등하다고 할 수 있다.

예를 들면, 소수성 아미노산인 아미노산 알라닌에 대한 코돈은 글라이신 같은 또다른 덜 소수성인 잔기, 또는 발린, 루이신, 또는 이소루이신 같은 더 소수성인 잔기를 암호화하는 코돈으로 치환될 수 있다. 마찬가지로, 아스파트산을 글루탐산으로와 같이 하나의 음으로 하전된(산성) 잔기를 또다른 하나로, 또는 라이신을 아르기닌 또는 히스티딘으로와 같이 하나의 양으로 하전된(염기성) 잔기를 또다른 하나로 치환시키는 변화, 및 이들의 수치료법 인덱스에 있어 잔기의 유사성에 기초한 변화도 생물학적 등가 산물을 생성할 것으로 예상될 수 있다. 단백질 분자의 N-말단 또는 C-말단 부분의 변화를 가져오는 뉴클레오타이드 변화는 단백질의 활성을 변화시킬 것으로 예상되지 않는다.

암호화된 산물의 구조적 및 생물학적 활성의 보유 결정과 같이, 각각의 제안된 변형은 당업계의 일상적인 기술에 속한다.

본 발명은 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6으로 이루어진 그룹 중에서선택된 개개 인플루엔자 A 바이러스 아미노산 서열을 포함하는 분리된 아미노산 서열을 추가로 포함한다.

본 발명은 또한 서열번호 8 및 서열번호 12의 개개의 분리된 아미노산 서열을 추가로 포함한다.

인플루엔자 A/Udorn/72 (B3N2) 바이러스의 근본적인 생물학적 특성은 8 세그먼트로 이루어진 그의 게놈에 좌우된다. 인플루엔자 바이러스의 세그먼트는 네거티브 극성 RNA의 단일 스트랜드로 이루어지고, 각각의 바이러스 스트레인은 그 자신의 특이적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

따라서, 바이러스 스트레인간의 완전 차별적인 동정이 바이러스의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 데 필수이다. 13,628 염기로 이루어진 완전한 특이적 뉴클레오타이드 서열이 본원에 기재된 바와 같이 명확하게 결정되었으므로, 바이러스는 유전자 수준에서 동정될 수 있고, 동정기술은 따라서 절대 결정을 제공한다.

본원에 기재된 서열은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)법을 이용하여 인플루엔자 바이러스 안티게놈 DNA의 뉴클레오타이드 서열의 일부를 검출하는 단계를 포함하는 동정법을 제공하고, ELISA를 이용하여 그 DNA에 의해 생산된 항원을 검출하기 위한 펩타이드를 생성시키는 데 유용하다.

하나의 특정 인플루엔자 스트레인의 완전히 서열분석되고 클로닝된 게놈의 구축은 이러한 유전자 청사진에 기초한 새롭고 혁신적인 면역원 조성물의 연구 개발에 유리하다.

규정된 돌연변이를 서열이 본원에서 기재되어 있는 하나 이상의 세그먼트에필요에 따라 도입시킨다. 하나 이상의 돌연변이가 부위-지향 돌연변이유발을 이용하여 도입된다. 그러나, 돌연변이체 인플루엔자 바이러스는 바이러스 RNA로부터 직접 생성될 수 없는데, 이유는 게놈 바이러스 RNA 또는 안티게놈 cDNA 어느 것도 합성을 위한 직접 주형으로 작용할 수 없기 때문이다. 그 대신에, 바이러스 RNA는 NP에 의한 캡시드화 후에, 바이러스 RNA 폴리머라제 복합체에 의해 포지티브-센스 mRNA로 전사되어야 한다.

Palese 등(U.S. 특허 5,166,057, 본원에서 참조로 인용)은 인플루엔자 A 바이러스 세그먼트의 "구제(rescue)"를 위한 역 유전학 헬퍼 바이러스-의존 시스템을 기재하였다. 간단히 말해서, 리보핵단백질(RNP) 복합체는 3종의 폴리머라제 단백질과 NP의 존재하에 시험관내 합성에 의해 생성된다. 이어서, RNP 복합체를 사용하여 진핵생물 세포를 형질감염시킨다. 인플루엔자 A 헬퍼 바이러스에 의한 후속 감염은 클로닝된 cDNA 세그먼트로부터 유래한 유전자를 보유하는 바이러스의 생성을 초래한다. 이어서, 선택법을 이용하여 다수의 헬퍼 바이러스로부터 목적하는 형질감염체를 분리한다.

완전한 돌연변이체 인플루엔자 A 스트레인을 구제하려는 경우에는 상이한 시스템이 사용된다. Neumann 등(Neumann, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 9345-9350 (1999), 본원에서 참조로 인용)에 의해 기재된 시스템을 사용하여, 변형된 인플루엔자 바이러스 스트레인 A/Udorn/72 (H3N2)을 클로닝된 cDNA로부터 완전하게 생성시킨다. 이러한 플라스미드-기본 시스템은 헬퍼 바이러스 감염의 이용을 요하지 않는다. 요약하면, 인간 배아 신장 세포주 293T와 같은 세포주를 각각이 스트레인의 바이러스 RNA 세그먼트를 암호화하고 적당한 RNA 폴리머라제 프로모터와 터미네이터에 의해 플랭킹되는 8 플라스미드로, 바이러스 NP, PB2, PB1 및 PA 단백질(생체내에서 RNP를 세포내적으로 합성하는 역할을 한다)을 암호화하는 또다른 4 플라스미드와 함께 형질감염시킨다. 수율은 바이러스 구조 단백질 HA, NA, M1, M2 및 NS2를 발현하는 5 추가 플라스미드의 첨가에 의해 상당히 증가된다.

이러한 시스템의 변화에 있어서, 8 플라스미드만이 요구된다(Hoffmann, E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6108-6113 (2000), 본원에서 참조로 인용). 각 플라스미드는 두 프로모터, 인간 RNA 폴리머라제 I(pol I) 프로모터 및 인간 RNA 폴리머라제 II(pol II) 프로모터를 함유한다. 진핵생물 세포를 8 발현 플라스미드로 형질감염시킨 후, 인간 pol I 및 II 프로모터는 각각 플라스미드 주형을 전사한다. 이렇게 하여 바이러스 mRNA와 vRNA 모두의 합성이 일어나게 되고, 궁극적으로는 감염성 인플루엔자 A 바이러스의 생성을 초래한다.

헬퍼 바이러스는 8, 12 또는 17 플라스미드 형질감염 시스템 어느 것에서도 요구되지 않기 때문에, 형질감염체 바이러스는 플라크 정제 없이 회수된다. 이 시스템은 새로운 HA 또는 NA 서브타입을 수반하는 전염병 퇴치에 사용하기 위한 살아있는 약독화된 인플루엔자 A 바이러스의 생산을 촉진시키며, 여기에서 인플루엔자 A/Udorn/72 (H3N2) 스트레인의 상응하는 세그먼트는 새로운 서브타입의 서열을 매칭하도록 돌연변이된다.

새로운 순환 서브타입의 서열에 상응하는 인플루엔자 A/Udorn/72 (H3N2) 스트레인내 HA 또는 NA를 암호화하는 세그먼트에 대한 예정된 돌연변이는 부위-지향돌연변이유발에 의해 이루어진다. 이러한 돌연변이는 표준 재조합 DNA법에 의해 바이러스 게놈의 DNA 카피 중으로 도입된다.

필요하다면, 재분류체 바이러스는 인플루엔자 A/Udorn/72 (H3N2)스트레인 (또는 이의 돌연변이체)을 암호화하는 세그먼트를 상이한 인플루엔자 바이러스 스트레인으로부터의 대응하는 세그먼트로 치환시켜 생성된다.

본 발명의 또다른 양태에서, 인플루엔자 A/Udorn/72 (H3N2) 스트레인의 세그먼트의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 분리된 핵산 분자를 사용하여 올리고뉴클레오타이드 탐침을 생성시키고(포지티브 스트랜드 안티게놈 메시지 센스 또는 네거티브 스트랜드 상보 게놈 센스로부터), 펩타이드를 발현시키는데(포지티브 스트랜드 안티게놈 메시지 센스로부터만) 사용되며, 이들 펩타이드는 체액과 조직의 샘플내 그 인플루엔자 A 스트레인 (또는 이의 돌연변이체)의 세그먼트의 존재 검출에 사용된다. 뉴클레오타이드 서열은 샘플내 바이러스 세그먼트의 존재 검출을 위해 고도로 특이성이고 민감한 진단 시험을 설계하는 데 사용된다.

PCR 프라이머는 본원에서 기재된 바이러스 서열을 기본으로 한 서열로 합성된다. 시험 샘플은 RNA의 역전사에 투입되고, 이어서 그 바이러스 스트레인의 규정된 세그먼트에 독특한 뉴클레오타이드를 갖는 본원에서 기재된 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 선택된 dDNA 영역의 PCR 증폭이 뒤따른다. 증폭된 PCR 산물은 겔상에서 확인되고 이들의 특이성은 특이적 뉴클레오타이드 탐침과의 하이브리드화에 의해 확인된다.

ELISA 시험은 바이러스 세그먼트에 의해 생산된 단백질의 존재 검출에 사용된다. 펩타이드는 본원에 기재된 바이러스 서열에 기초한 하나 이상의 독특한 잔기를 함유하도록 디자인되고 선택된다. 이들 펩타이드는 이어서 합텐(예를 들면, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)에 커플링되고 일특이성 폴리클로날 항체의 생산을 위해 동물(예를 들면, 토끼)을 면역시키는 데 사용된다. 이들 폴리클로날 항체의 선별, 또는 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 조합은 이어서 그 바이러스 세그먼트에 의해 생산된 단백질의 검출을 위하여 "포획 ELISA"에 사용될 수 있다.

본원에서 인용되는 모든 참조문헌은 본원에서 참조로 인용된다.

본 발명이 더 잘 이해될 수 있도록 하기 위해, 하기 실시예가 기술된다. 실시예는 단지 설명의 목적에 지나지 않으며 본 발명의 범위를 제안하지 않는다.

실시예 1

인플루엔자 A/Udorn/72 (H3N2) 스트레인의 서열분석

8 세그먼트 각각의 서열분석을 다음과 같이 수행한다:

RT-PCR 프로토콜

인플루엔자 A/Udorn/72 (B3N2)를 Madin-Darby 개 신장(MDCK) 세포에서 생장시키고 청징화된 배양 상층액으로부터 농축시킨다. RNAeasy 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 바이러스 스톡 100 ㎕로부터 게놈 바이러스 RNA(vRNA)를 제조한다. 세그먼트 7번과 8번(각각 M2 및 NS2)의 mRNA의 스플라이싱 산물을 Oligotex mRNA 키트(Qiagen)를 사용하여 인플루엔자/Udorn-감염 MDCK 세포의 전체 mRNA로부터 분리된다. vRNA 또는 mRNA 대략 1 ㎍을 2 pmol의 유전자-특이성 프라이머와 디에틸피로카보네이트-처리수(RNAse 억제를 위해)를 함유하는 에펜도르프 튜브에 최종 부피 12 ㎕가 되게 가한다. 올리고-dT 프라이머를 사용하여 M2 및 NS2 스플라이싱 메시지를 역전사한다. RNA-프라이머 혼합물을 70℃에서 10분간 가한 다음 얼음 위에서 신속히 냉각시킨다. 이 튜브에 하기 시약: 5X 제 1 스트랜드 완충액(250 mM 트리스-HCl pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl₂) 4㎕, 0.1% DTT 2 ㎕, 및 dNTP 믹스(각각 dATP, dTTP, dGTP, dCTP 10 mM) 1 ㎕를 가한 다음, 42℃에서 2분간 배양시킨다. 계속해서, 1 ㎕의 SuperScript II(Gibco) 역전사효소를 가하고 42℃에서 추가로 50분간 재배양시킨다. RT 반응을 70℃에서 15분간 배양함으로써 중단시킨다. 하기 시약: 50 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 1.5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 1 μM의 각 프라이머, 0.2 mM의 각 dNTP 및 2 단위의 Taq 폴리머라제의 혼합물에 2 ㎕의 선행 RT를 가하여 PCR 반응을 셋업시킨다. DNA를 다음과 같이 Perkin-Elmer 9600 PCR 머신에서 증폭시킨다: 94℃에서 2분간 변성 1 사이클, 이어서 94℃에서 30초간 변성 30 사이클, 42℃에서 30초간 어닐링, 및 72℃에서 1분간 연장. 이렇게한 뒤에 72℃에서 7분간 연장 1 사이클을 수행한다. PCR-증폭 DNA를 1% 아가로스 겔상에서 분석하고 Qiagen 정제 키트를 사용하여 정제한다.

서열분석 프로토콜

RT-PCR에 의해 생성된 상응하는 DNA 세그먼트를 함유하는 플라스미드 pGEM-T 대략 500 ng을 3.2 pmol의 서열분석 프라이머 및 8 ㎕의 터미네이터 즉시 반응 믹스(Perkin-Elmer)를 함유하는 0.2 ml 튜브에 가하고 Perkin-Elmer 9600 PCR 머신에넣는다. 반응을 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 및 60℃에서 4분간 25 사이클로 증촉시킨다. 산물을 이어서, G50 Sephadex 스핀 칼럼 위에서 정제시키고, 동결건조시킨 다음, 50 mg/ml 블루 덱스트란 로딩 염료와 25 mM EDTA(pH 8.0) 3 ㎕에 재현탁시킨다. 샘플을 ABI 377 자동 서열분석기상에서 러닝시킨 다음 서열분석기(Gene Codes Corporation으로부터의 서열 분석 프로그램)를 이용하여 서열을 분석한다.

3′및 5′말단의 뉴클레오타이드 서열의 결정

정제된 게놈 vRNA(2.5 ㎍)(상기 참조)를 토바코 산 피로포스파타제(Epicenter Technologies, Madison, Wis.) 10 U로 37℃에서 30분간 처리하여 5′말단으로부터 포스페이트 그룹을 제거한다. 처리된 RNA를 페놀-클로로포름 추출하고 에탄올로 침전시킨다. 계속해서, RNA 5′및 3′말단을 T4 RNA-리가제(Pharmacia Biotech) 50 U로 37℃에서 1시간 동안 연결시키고 페놀-클로로포름으로 추출한 다음 에탄올로 침전시킨다. 연결된 RNA를 역전사시키고 프라이머의 순방향 및 역방향 쌍을 사용하여 GeneAmp Gold RNA PCR Reagent Kit(PE Biosystems)로 단일 반응으로 PCR을 수행한다(하기 참조). 서열분석 반응을 전술한 바와 같이, 각각의 RNA 세그먼트에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 수행한다(Galarza, J. M., et al., 1996, J of Virol. 70:2360-2368).

인플루엔자 A/Udorn/72 (H3N2)의 서열분석용 프라이머

순방향의 프라이머를 "F"로 표시하며 안티게놈, 플러스 센스이다. 역방향의 프라이머는 "R"로 표시하고 게놈 네거티브 센스이다.

PB2 (세그먼트 1) 프라이머

프라이머 F/R 프라이머 서열 bp 스패닝

- RT 프라이머

1107 F 5′-TATGGAAAGAATAAAAGAACTACGGAA-3′ 27-53

(서열번호 23)

- PCR 프라이머

1108 R 5′-TCGTTTTTAAACTATTCAACAT-3′ 2307-2328

(서열번호 24)

1107 F 5′-TATGGAAAGAATAAAAGAACTACGGAA-3′ 27-53

(서열번호 23)

- 서열분석 프라이머

1101 F 5′-AGCAGGTCAATTATATTCAATATG-3′ 1-24

(서열번호 25)

프라이머 서열은 다음과 같이 PB2 유전자 서열과 상이하다:

위치 PB2 유전자 1101 F

5 A G

6 A G

7 A T

8 G C

9 C A

11 G T

12 G T

13 T A

14 C T

16 A T

18 T C

20 T A

21 A T

22 T A

24 C G

1102 R 5′-AACAAGGTCGTTTTTAAACTATTC-3′ 2312-2335

(서열번호 26)

1103 F 5′-AGAACTCTATTCCAACAAATG-3′ 1816-1836

(서열번호 27)

1104 R 5′-AATCGGATATTTCATTGCCAT-3′ 178-198

(서열번호 28; 프라이머 서열은 뉴클레오타이드 195에 C를 가지는 반면에, PB2 유전자 서열은 T를 갖는다)

1105 F 5′-AGAACTCTATTCCAACAAATGAGGGATGTAGTT-3′ 1816-1848

(서열번호 29; 프라이머 서열은 뉴클레오타이드 1846에 G를 갖는 반면에, PB2 유전자 서열은 C를 갖는다)

1106 R 5′-AATCGGATATTTCATTGCCATCATCCATTTCAT-3′ 166-198

(서열번호 30; 프라이머 서열은 뉴클레오타이드 195에 C를 갖는 반면에, PB2 유전자 서열은 T를 갖는다)

1107 F 5′-TATGGAAAGAATAAAAGAACTACGGAA-3′ 27-53

(서열번호 23)

1108 R 5′-TCGTTTTTAAACTATTCAACAT-3′ 2307-2328

(서열번호 24)

1109 F 5′-AGACGTGGTGTTGGTAATGAA-3′ 2214-2234

(서열번호 31)

1110 F 5′-CGAAGAGTTGACATAAACCCT-3′ 454-474

(서열번호 32)

1111 R 5′-TCATCCCTCATCCCCTCACAT-3′ 1943-1963

(서열번호 33; 프라이머 서열은 뉴클레오타이드 1955에 C를 갖는 반면에, PB2 유전자 서열은 G를 갖는다)

1112 R 5′-ATTTTCTGTTATCCTCTTGTCA-3′ 204-224

(서열번호 34; 이러한 프라이머는 실제의 PB2 유전자 서열과 비교하여 뉴클레오타이드 220 뒤에 여분의 뉴클레오타이드(T)를 갖는다)

1113 F 5′-GTGGAGTCCGCTGTTTTGAG-3′ 2083-2102

(서열번호 35)

1114 F 5′-AGGATGGTGGACATTCTTAGG-3′ 904-924

(서열번호 36)

1115 R 5′-CCGATCAATGCTAACCACTAC-3′ 1507-1527

(서열번호 37)

1116 F 5′-AGCAAAAGCAGGTCAATTATATTCA-3′ 1-25

(서열번호 38)

1117 R 5′AGTAGAAACAAGGTCGTTTTTAAAC-3′ 2317-2341

(서열번호 39)

- 말단 서열의 결정에 사용된 프라이머

1104 R 5′-AATCGGATATTTCATTGCCAT-3′ 178-198

(서열번호 28)

1109 F 5′-AGACGTGGTGTTGGTAATGAA-3′ 2214-2234

(서열번호 31)

1112 R 5′-ATTTTCTGTTATCCTCTTGTCA-3′ 204-224

(서열번호 34)

1113 F 5′-GTGGAGTCCGCTGTTTTGAG-3′ 2083-2102

(서열번호 35)

PB1 (세그먼트 2) 프라이머

프라이머 F/R 프라이머 서열 bp 스패닝

- RT 프라이머

1215 F 5′-AGCAAAAGCAGGCAAACCAT-3′ 1-20

(서열번호 40; 프라이머 서열은 뉴클레오타이드 4에 A를 갖는 반면에, PB1 유전자 서열은 G를 갖는다)

- PCR 프라이머

1216 R 5′-AGTAGAAACAAGGCATTTTTT-3′ 2321-2341

(서열번호 41)

1215 F 5′-AGCAAAAGCAGGCAAACCAT-3′ 1-20

(서열번호 40)

- 서열분석 프라이머

1201 F 5′-TCGAGCTGAAGAAGCTATGG-3′ 1745-1764

(서열번호 42; 프라이머 서열은 뉴클레오타이드 1752에 G를 갖는 반면에, PB1 유전자 서열은 A를 가지며, 프라이머 서열은 뉴클레오타이드 1761에 A를 갖는 반면에, PB1 유전자 서열은 G를 갖는다)

1202 R 5′-GTTCTGTTGACTGTGTCCAT-3′ 142-161

(서열번호 43)

1203 F 5′-TCGAGCTGAAGAAGCTATGGGAGCAGACCCGT-3′ 1745-1776

(서열번호 44)

프라이머 서열은 다음과 같이 PB1 유전자 서열과 상이하다:

위치 PB1 유전자 1203 F

1752 A G

1761 G A

1770 A G

1776 C T

1204 R 5′-GTTCTGTTGACTGTGTCCATGGTGTATCC-3′ 133-161

(서열번호 45)

1205 F 5′-AGCGAAAGCAGGCAAACCATTTGAATGGATGTCAA-3 ′ 1-35

(서열번호 46)

1206 R 5′-ATTAAAAACAAGGCATTTTTTCATGAAGGAC-3′ 2341-2311

(서열번호 47; 프라이머 서열은 뉴클레오타이드 2337에 A를 갖는 반면에, PB1 유전자 서열은 G를 가지며, 프라이머 서열은 뉴클레오타이드 2340에 T를 갖는 반면에, PB1 유전자 서열은 G를 갖는다)

1207 F 5′-AATTTCCAGCATGGTGGAGGCCATGGTG-3′ 2154-2181

(서열번호 48)

1208 F 5′-GGGATCTTTGAAAACTCGTG-3′ 325-344

(서열번호 49)

1209 R 5′-CAGCATTGTTTACAGACTC-3′ 1936-1954

(서열번호 50)

1210 F 5′-ACCAAAGATGCAGAAAGAGG-3′ 706-725

(서열번호 51)

1211 R 5′-CTCATATTGATTCCGACTAA-3′ 1438-1457

(서열번호 52)

1212 R 5′-TGTCCACTTCCCTTTTTCTGA-3′ 172-192

(서열번호 53)

1213 F 5′-ATTTTTCCCCAGTAGTTCATAC-3′ 2118-2139

(서열번호 54)

1214 F 5′-ACGCTGTTGCAACTACACACTCCTG-3′ 1997-2021

(서열번호 55)

1215 F 5′-AGCAAAAGCAGGCAAACCAT-3′ 1-20

(서열번호 40)

1216 R 5′-AGTAGAAACAAGGCATTTTTT-3′ 2321-2341

(서열번호 41)

- 말단 서열의 결정에 사용된 프라이머

1204 R 5′-GTTCTGTTGACTGTGTCCATGGTGTATCC-3′ 133-161

(서열번호 45)

1212 R 5′-TGTCCACTTCCCTTTTTCTGA-3′ 172-192

(서열번호 53)

1213 F 5′-ATTTTTCCCCAGTAGTTCATAC-3′ 2118-2139

(서열번호 54)

1214 F 5′-ACGCTGTTGCAACTACACACTCCTG-3′ 1997-2021

(서열번호 55)

PA (세그먼트 3) 프라이머

프라이머 F/R 프라이머 서열 bp 스패닝

- RT 프라이머

1315 F 5′-AGCAAAAGCAGGTACTGATTCGAGA-3′ 1-25

(서열번호 56)

- PCR 프라이머

1315 F 5′-AGCAAAAGCAGGTACTGATTCGAGA-3′ 1-25

(서열번호 56)

1316 R 5′-AGTAGAAACAAGGTACTTTTTTGGA-3′ 2209-2233

(서열번호 57)

- 서열분석 프라이머

1301 F 5′-GAACCTGGAACCTTTGATCTT-3′ 2053-2073

(서열번호 58)

1302 R 5′-ATTCACCACTGTCCAGGCCAT-3′ 280-300

(서열번호 59)

프라이머 서열은 다음과 같이 PA 유전자 서열과 상이하다:

위치 PA 유전자 1302 F

294 T C

297 T C

300 G A

1303 F 5′-GAACCTGGAACCTTTGATCTTGAGGGGCTA-3′ 2053-2082

(서열번호 60; 프라이머 서열은 뉴클레오타이드 2075에 A를 갖는 반면에, PA 유전자 서열은 G를 갖는다)

1304 R 5′-ATTCACCACTGTCCAGGCCATTGACGCGTC-3′271-300

(서열번호 61)

프라이머 서열은 다음과 같이 PA 유전자 서열과 상이하다:

위치 PA 유전자 1304 F

274 G C

275 C G

276 G C

277 T A

294 T C

297 T C

300 G A

1305 F 5′-AGCAAAAGCAGGTAGTGATAG-3′ 1-21

(서열번호 62)

프라이머 서열은 다음과 같이 PA 유전자 서열과 상이하다:

위치 PA 유전자 1302 F

15 C G

20 T A

21 C G

1306 R 5′-AGTAGAAACAAGGTA-3′ 2219-2233

(서열번호 63)

1307 F 5′-AGCGAAAGCAGGTAGTGATTCGAGATGGA-3′ 1-29

(서열번호 64; 프라이머 서열은 뉴클레오타이드 4에 G를 갖는 반면에, PA 유전자 서열은 A를 갖는다)

1308 R 5′-AGTAGAAACAAGGTACTTTTTTGGACAG-3′ 2206-2233

(서열번호 65)

1309 R 5′-TCGATTTGTTGGAGTGACTGA-3′ 1782-1802

(서열번호 66)

1310 F 5′-GCCGAACTTCTCCTGCCTTGA-3′ 684-704

(서열번호 67)

1311 F 5′-GTATTCAATAGCCTGTATG-3′ 1957-1975

(서열번호 68)

1312 R 5′-GACTTCTCTCCTTGTCACTC-3′ 386-405

(서열번호 69)

1313 F 5′-ACGAGTCAGCTAAAGTGGGCA-3′ 1111-1131

(서열번호 70)

1314 R 5′-GACACCTCTGCTGTGAAGTAA-3′ 1356-1376

(서열번호 71)

1315 F 5′-AGCGAAAGCAGGTAGTGATTCGAGA-3′ 1-25

(서열번호 56)

1316 R 5′-AGTAGAAACAAGGTACTTTTTTGGA-3 ′ 2209-2233

(서열번호 57)

1317 F 5′-GGAGCTGAGAAACCGAAGTTT-3′ 319-339

(서열번호 72)

1318 R 5′-GACTTGGCCAATAAAGTCCTA-3′ 1935-1955

(서열번호 73)

1319 R 5′-GCCTGCGCATAGTTCCTGTGA-3′ 644-664

(서열번호 74)

1320 R 5′-TCTACCACTATTGACTCGCC-3′ 196-215

(서열번호 75)

- 말단 서열의 결정에 사용된 프라이머

1301 F 5′-GAACCTGGAACCTTTGATCTT-3′ 2053-2073

(서열번호 58)

1303 F 5′-GAACCTGGAACCTTTGATCTTGAGGGGGCTA-3′ 2053-2082

(서열번호 60)

1311 F 5′-GTATTCAATAGCCTGTATG-3′ 1957-1975

(서열번호 68)

1312 R 5′-GACTTCTCTCCTTGTCACTC-3′ 386-405

(서열번호 69)

1320 R 5′-TCTACCACTATTGACTCGCC-3′ 196-215

(서열번호 75)

HA (세그먼트 4) 프라이머

프라이머 F/R 프라이머 서열 bp 스패닝

- RT 프라이머

1401 F 5′-AGCAAAAGCAGGGGATAATTCTA-3′ 1-23

(서열번호 76)

- PCR 프라이머

1401 F 5′-AGCAAAAGCAGGGGATAATTCTA-3′ 1-23

(서열번호 76)

1402 R 5′-AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAA-3′ 1743-1765

(서열번호 77)

- 서열분석 프라이머

1401 F 5′-AGCAAAAGCAGGGGATATTCTA-3′ 1-23

(서열분석 76)

1402 R 5′-AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAA-3′ 1743-1765

(서열번호 77)

1403 R 5′-ACAGTTTGTTCATTTCCGAG-3′ 1409-1419

(서열번호 78)

1404 R 5′-ACTTCAGGGTGTTTTGCTTA-3′ 1004-1023

(서열번호 79)

1405 R 5′-GAACCCCCCAAATGTATAGT-3′ 605-624

(서열번호 80)

1406 R 5′TGAGGAACTCTGAACCAGCT-3′ 199-218

(서열번호 81)

1407 F 5′-GTCACTAGTTGCCTCGTCAG-3′ 404-423

(서열번호 82)

1408 F 5′-CCGGGAGACATACTGGTAAT-3′ 792-811

(서열번호 83)

1409 F 5′-CAAATCAATGGGAAACTGAA-3′ 1203-1222

(서열번호 84)

1410 F 5′-TGAACTGAAGTCAGGATACA-3′ 1592-1611

(서열번호 85)

- 말단 서열의 결정에 사용된 프라이머

1405 R 5′-GAACCCCCCAAATGTATAGT-3′ 605-624

(서열분석 80)

1406 R 5′-TGAGGAACTCTGAACCAGCT-3′ 199-218

(서열분석 81)

1409 F 5′-CAAATCAATGGGAAACTGAA-3′ 1203-1222

(서열번호 84)

1410 F 5′-TGAACTGAAGTCAGGATACA-3′ 1592-1611

(서열번호 85)

NP (세그먼트 5) 프라이머

프라이머 F/R 프라이머 서열 bp 스패닝

- RT 프라이머

1509 F 5′-AGCAAAAGCAGGGTTAATAATCAC-3′ 1-24

(서열번호 86)

- PCR 프라이머

1509 F 5′-AGCAAAAGCAGGGTTAATAATCAC-3′ 1-24

(서열번호 86)

1510 R 5′-AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCCT-3′ 1542-1565

(서열번호 87)

- 서열분석 프라이머

1501 R 5′-TTGCACCTTCCATCATCCTT-3′ 1380-1399

(서열번호 88)

1502 R 5′-GTCTATTCCCACTAAAGAGT-3′ 932-951

(서열번호 89)

1503 R 5′-TGCATCAGAGAGCACATCCT-3′ 529-548

(서열번호 90)

1504 F 5′- GAACTCGTCCTTTATGACAA-3′ 364-383

(서열번호 91)

1505 F 5′-AGAGCAATGGATCAAGT-3′ 751-770

(서열번호 92; 뉴클레오타이드 761-763에서 3 염기 ATG의 결실이 존재)

1506 F 5′-TACTATGGAATCAAGTACTC-3′ 1161-1180

(서열번호 93)

1507 R 5′-ATCAATCATCTTCCCGAC-3′ 130-147

(서열번호 94)

1508 F 5′-AGTGTCCTTCCGTGGGCG-3′ 1410-1427

(서열번호 95)

1509 F 5′-AGCAAAAGCAGGGTTAATAATCAC-3′ 1-24

(서열번호 86)

1510 R 5′-AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCCT-3′ 1542-1565

(서열번호 87)

- 말단 서열의 결정에 사용된 프라이머

1503 R 5′-TGCATCAGAGAGCACATCCT-3′ 529-548

(서열번호 90)

1506 F 5′-TACTATGGAATCAAGTACTC-3′ 1161-1180

(서열번호 93)

NA (세그먼트 6) 프라이머

프라이머 F/R프라이머 서열bp 스패닝

- RT 프라이머

1601 F 5′-AGCAAAAGCAGGAGTGAAGATGA-3′ 1-23

(서열번호 96)

- PCR 프라이머

1601 F 5′-AGCAAAAGCAGGAGTGAAGATGA-3′ 1-23

(서열번호 96)

1602 R 5′-AGTAGAAACAAGGAGTTTTTTCTA-3′ 1443-1466

(서열번호 97)

- 서열분석 프라이머

1601 F 5′-AGCAAAAGCAGGAGTGAAGATGA-3′ 1-23

(서열번호 96)

1602 R 5′-AGTAGAAACAAGGAGTTTTTTCTA-3′ 1443-1466

(서열번호 97)

1603 R 5′-TCGTTGTTTCTGGGTGTGTC-3′ 989-1008

(서열번호 98; 프라이머 서열은 뉴클레오타이드 992에 T를 갖는 반면에, NA 유전자 서열은 C를 갖는다)

1604 R 5′-TTATCATACCCAGTGACACA-3′ 596-615

(서열번호 99)

1605 R 5′-ATTATTATTGGTTCACACGG-3′ 173-192

(서열번호 100)

1606 F 5′-TTATGTGTCATGCGATCCTG-3′ 379-398

(서열번호 101)

1607 F 5′-ATTGTTCATATTAGCCCATT-3′ 803-822

(서열번호 102)

1608 F 5′-ATAGGTCAGGTTATTCTGGT-3′ 1224-1243

(서열번호 103)

- 말단 서열의 결정에 사용된 프라이머

1608 F 5′-ATAGGTCAGGTTATTCTGGT-3′ 1224-1243

(서열번호 103)

1605 R 5′-ATTATTATTGGTTCACACGG-3′ 173-192

(서열번호 100)

M1 (세그먼트 7) 프라이머

프라이머 F/R 프라이머 서열 bp 스패닝

- RT 프라이머

*1706 F 5′-AGCAAAAGCAGGTAG-3′ 1-15

(서열번호 104)

- PCR 프라이머

1707 R 5′-AGTAGAAACAAGGTA-3′ 1013-1027

(서열번호 105)

1706 F 5′-AGCAAAAGCAGGTAG-3′ 1-15

(서열번호 104)

*1701 R 5′-TTTACTCCAGCTCTATGCTGACAA-3′ 985-1008

(서열번호 106)

*이들 프라이머는 M1 및 M2 유전자 모두를 증폭시킬 것이다.

- 서열분석 프라이머

1701 R 5′-TTTACTCCAGCTCTATGCTGACAA-3′ 985-1008

(서열번호 106)

1702 R 5′-GATCCAGCCATTTGCTCCAT-3′ 590-609

(서열번호 107)

1703 R 5′-GAGGTGACAGGATTGGTCTT-3′ 169-188

(서열번호 108)

1704 F 5′-CATGGACAGAGCAGTTAAAC-3′ 301-320

(서열번호 109)

°1705 F 5′-GCGAGTATCATTGGGATCTT-3′ 801-820

(서열번호 110)

°M1 및 M2 서열에 공통

- 말단 서열의 분석에 사용된 프라이머

1705 F 5′-GCGAGTATCATTGGGATCTT-3′ 801-820

(서열번호 110)

1702 R 5′-GATCCAGCCATTTGCTCCAT-3′ 590-609

(서열번호 107)

1703 R 5′-GAGGTGACAGGATTGGTCTT-3′ 169-188

(서열번호 108)

프라이머 1701, 1705 및 1706은 M2의 서열분석에 충분하다.

NS1 (세그먼트 8) 프라이머

프라이머 F/R 프라이머 서열 bp 스패닝

- RT 프라이머

*1801 F 5′-AGCAAAAGCAGGGTGACAAAGACA-3′ 1-24

(서열번호 111)

- PCR 프라이머

1801 F 5′-AGCAAAAGCAGGGTGACAAAGACA-3′ 1-24

(서열번호 111)

1802 R 5′-AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTAT-3′ 867-890

(서열번호 112)

*1803 R 5′-TTTTTTATCATTAAATAAGCTGAA-3′ 851-874

(서열번호 113)

*이들 프라이머는 NS1 및 NS2 유전자 모두를 증폭시킬 것이다.

- 서열분석 프라이머

°1801 F 5′-AGCAAAAGCAGGGTGACAAAGACA-3′ 1-24

(서열번호 111)

1802 R 5′-AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTAT-3′ 867-890

(서열번호 112)

°1803 R 5′-TTTTTTATCATTAAATAAGCTGAA-3′ 851-874

(서열번호 113)

1804 R 5′-AATTGCATTTTTGACATCCT-3′ 541-560

(서열번호 114)

1805 R 5′-ATCTTCTCTACTATCTGCTT-3′ 210-229

(서열번호 115)

1806 F 5′-CAAGCAATCATGGATAAGAA-3′ 387-406

(서열번호 116)

°1807 F 5′-GGCGAGAACAGCTAGGTCAA-3′ 692-711

(서열번호 117)

°NS1 및 NS2 서열에 공통

- 말단 서열의 결정에 사용된 프라이머

1807 F 5′-GGCGAGAACAGCTAGGTCAA-3′ 692-711

(서열번호 117)

1804 R 5′-AATTGCATTTTTGACATCCT-3′ 541-560

(서열번호 114)

1806 F 5′-CAAGCAATCATGGATAAGAA-3′ 387-406

(서열번호 116)

1805 R 5′-ATCTTCTCTACTATCTGCTT-3′ 210-229

(서열번호 115)

프라이머 1801, 1803 및 1807은 NS2의 서열분석에 충분하다.

실시예 2

인플루엔자 A/Udorn/72 (H3N2) 스트레인의 세그먼트 검출을 위한 PCR 분석

PCR 분석을 이용하여 인플루엔자 A/Udorn/72 (H3N2) 스트레인의 세그먼트의 존재를 검출한다. 본원에 기재된 바이러스 서열과의 상동성에 기초하여 PCR 프라이머를 디자인하고 선택한다. 분석은 샘플을 RNA의 역전사에 투입한 다음, 본원에 기재된 특이적 분자 서열에 상응하는 선택된 cDNA 영역의 PCR 증폭에 의해 수행된다. 증폭된 PCR 산물을 겔상에서 확인하고 이들의 특이성을 특이적 뉴클레오타이드 탐침과의 하이브리드화에 의해 확인한다.

실시예 3

인플루엔자 A/Udorn/72 (H3N2) 스트레인의 세그먼트에 의해 생산된 항원의 검출을 위한 ELISA

ELISA 시험을 이용하여 인플루엔자 A/Udorn/72 (H3N2) 스트레인의 세그먼트에 의해 생산된 항원의 존재를 검출한다. 본원에 기재된 바이러스 서열과의 상동성에 기초하여 펩타이드를 디자인하고 선택한다. 이어서, 이들 펩타이드를 KLH에 커플링시키고 일특이성 폴리클로날 항체의 생산을 위해 토끼를 면역시키는 데 사용한다. 이어서, 이들 폴리클로날 항체의 선택, 또는 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 조합을 "포획 ELISA"에 이용하여 그 바이러스 세그먼트에 의해 생산된 단백질의 존재를 검출한다.

Claims

인플루엔자 A/Udorn/72 (H3N2) 스트레인의 완전한 뉴클레오타이드 서열을 포지티브 스트랜드, 안티게놈 메시지 센스로 포함하고, 완전한 서열이 (a)서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13 및 서열번호 17, 또는 (b)서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 17 및 서열번호 21로 이루어진 서열로 이루어지는 분리된 핵산 분자.
제 1 항에 있어서, 인플루엔자 A/Udorn/72 (H3N2) 스트레인의 완전한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 완전한 서열이 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13 및 서열번호 17로 이루어지는 분리된 핵산 분자.
제 1 항에 있어서, 인플루엔자 A/Udorn/72 (H3N2) 스트레인의 완전한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 완전한 서열이 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 17 및 서열번호 21로 이루어지는 분리된 핵산 분자.
개개의 인플루엔자 A 바이러스 뉴클레오타이드 서열을 포지티브 스트랜드,안티게놈 메시지 센스로 포함하고, 서열이 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 11 및 서열번호 21로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 분리된 핵산 분자.
제 4 항에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 1인 분리된 핵산 분자.
제 4 항에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 3인 분리된 핵산 분자.
제 4 항에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 5인 분리된 핵산 분자.
제 4 항에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 7인 분리된 핵산 분자.
제 4 항에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 11인 분리된 핵산 분자.
제 4 항에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스 뉴클레오타이드 서열이 서열번호21인 분리된 핵산 분자.
개개의 인플루엔자 A 바이러스 뉴클레오타이드 서열을 포지티브 스트랜드, 안티게놈 메시지 센스로 포함하고, 서열이 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
제 11 항에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스 뉴클레오타이드 서열이 서열이 서열번호 2인 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
제 11 항에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스 뉴클레오타이드 서열이 서열이 서열번호 4인 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
제 11 항에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스 뉴클레오타이드 서열이 서열이 서열번호 6인 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
개개의 인플루엔자 A 바이러스 아미노산 서열을 포함하고, 서열이 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 분리된 아미노산 서열.
제 15 항에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스 아미노산 서열이 서열번호 2인 분리된 아미노산 서열.
제 15 항에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스 아미노산 서열이 서열번호 4인 분리된 아미노산 서열.
제 15 항에 있어서, 인플루엔자 A 바이러스 아미노산 서열이 서열번호 6인 분리된 아미노산 서열.
개개의 인플루엔자 A 바이러스 서열을 포함하고, 서열이 서열번호 8인 분리된 아미노산 서열.
개개의 인플루엔자 A 바이러스 서열을 포함하고, 서열이 서열번호 12인 분리된 아미노산 서열.