KR20050084302A - 자율 복제 능력을 갖는 (-)쇄 ｒｎａ 바이러스 벡터 - Google Patents

자율 복제 능력을 갖는 (-)쇄 ｒｎａ 바이러스 벡터 Download PDF

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Abstract

초기 복제 유전자가 모두 발현되는 숙주에 센다이 바이러스를 도입하여 센다이 바이러스 입자를 재구성하는 방법을 개발하였다. 이에 따라 실용 가치가 높은 (-)쇄 RNA 바이러스 벡터의 제조가 가능해졌다.

Description

자율 복제 능력을 갖는 (-)쇄 ＲＮＡ 바이러스 벡터{(-)-strand RNA virus vector having autonomously replicating activity}
본 발명은 유전자 치료 등에 사용되는 바이러스 벡터에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 (-)쇄 RNA 바이러스 벡터에 관한 것이다.
사람 또는 동물에 대한 유전자 치료에서 치료 효과와 안전성은 매우 중요한 과제이다. 특히, 바이러스의 유전자를 재조합함으로써 얻어지는 “바이러스 벡터”를 사용하여 행해지는 치료는 설령 치료 효과가 인정되는 경우라도, 유전자가 염색체 DNA의 불특정한 위치에 삽입되거나, 재조합체 바이러스 또는 병원성 바이러스가 자연계로 방출되거나, 세포 내에 도입된 유전자 발현의 제어를 할 수 없는 등의 가능성을 부정할 수 없는 경우에는 치료 행위를 매우 신중하게 헹할 필요가 있다.
현재, 재조합체 바이러스를 사용한 유전자 치료가 이미 다수 이루어지고 있다. 유전자 치료 임상 프로토콜도 다수 제출되어 있다. 이러한 재조합형의 바이러스 벡터의 성질은 그 벡터가 유래하는 바이러스의 성질에 대부분 의존하고 있다.
바이러스 벡터의 기본 원리는 바이러스의 감염 능력을 이용하여 목적 유전자를 표적 세포 내에 도입하는 방법이다. 또한, “감염 능력”이란, 본 명세서에서는 “세포에 대한 접착 능력 및 막 융합 능력 등을 보유함으로써, 세포 내에 바이러스 내부의 핵산 등을 도입할 수 있는 능력”을 말한다. 바이러스 유전자에 목적 유전자를 삽입하는 등의 유전자 조작을 실시한 재조합형 바이러스 벡터의 표면에는 바이러스 유래의 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 또는 외피(envelope) 단백질 등이 존재하고 있고, 그것이 유래하는 바이러스의 감염 능력을 보유하고 있으므로 그 내부의 재조합 유전자를 세포 내에 도입하는 것이 가능해진다. 이와 같은 재조합형 바이러스 벡터는 유전자 치료의 목적뿐만아니라 목적 유전자 발현 세포의 제작, 트랜스제닉(transgenic) 동물 제작 등의 목적에 사용하는 것이 가능하다.
바이러스 벡터는 레트로 바이러스 벡터, DNA 바이러스 벡터, RNA 바이러스 벡터의 3가지로 분류된다.
유전자 치료에서 현재 가장 빈도 높게 사용되고 있는 벡터는 레트로 바이러스에 유래하는 레트로 바이러스 벡터이다. 레트로 바이러스는 이하의 과정을 거쳐 복제한다. 우선, 감염 성립 후, 자기의 RNA를 주형으로 하여 자기 유래의 역전사 효소를 촉매의 적어도 일부로 사용하여 상보쇄 DNA(cDNA)를 생성하고, 몇가지의 과정을 거친 후 숙주 염색체 DNA에 삽입되어 프로 바이러스가 된다. 프로 바이러스는 숙주 유래의 DNA 의존성 RNA 전사 효소에 의해 전사되어 바이러스 RNA가 생성된다. 바이러스 RNA는 자기가 코딩하는 유전자 발현물 군에 의해 패키지되어 바이러스 입자가 된다.
일반적으로 유전자 치료 등에 이용되고 있는 레트로 바이러스 벡터는 프로 바이러스 생성 과정까지의 능력을 유지하는데, 패키지에 필요한 유전자가 제거된 결손형 바이러스이기 때문에 프로 바이러스에서 바이러스 입자가 형성되는 일이 없도록 구축되어 있다. 레트로 바이러스로서는 예를 들면 마우스 백혈병 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 비비C형 온코 바이러스, 사람 면역 부전 바이러스, 성인 T세포 백혈병 바이러스 등을 예시할 수가 있다. 또한, 재조합형 레트로 바이러스 벡터로서 보고되어 있는 것으로는 마우스 백혈병 바이러스를 기본으로 한 것[Virology, 65, 1202 (1991), Biotechniques, 9, 980 (1989), Nucleic Acids Research, 18, 3587 (1990), Molecular and Cellular Biology, 7, 887 (1987), Proceedings of National Academy of Sciences of United States of America, 90, 3539 (1993), Proceedings of National Academy of Sciences of United States of America, 86, 3519 (1989) 등], 사람 면역 부전 바이러스를 기본으로 한 것[Journal of Clinical Investigation, 88, 1043 (1991)] 등을 들 수 있다.
레트로 바이러스 벡터는 이와 같이 특정 DNA를 고효율로 염색체 DNA에 도입하는 것을 목적으로 만들어진 벡터인데, 목적 유전자의 삽입 위치를 예상할 수 없기 때문에 삽입 실활에 의해 정상 유전자가 손상을 받거나 암 유전자를 활성화하거나 목적 유전자가 과잉 발현되거나 발현이 억제될 가능성을 부정할 수 없다. 이 문제점을 극복하기 위하여 염색체외 유전자로서 이용할 수 있는 DNA 바이러스 벡터를 이용한 일시적인(transient) 발현계의 개발이 진행되었다.
DNA 바이러스 벡터는 DNA 바이러스에서 유래하는 벡터이다. DNA 바이러스는 바이러스 입자 내에 유전 정보로서 DNA를 유지하는 것이며, 그 DNA의 복제는 자기의 DNA를 주형으로 하고, 숙주 유래의 DNA 의존성 복제 효소를 촉매의 적어도 일부로 사용하여 상보쇄를 생성하는 과정의 반복에 의해 이루어진다. 염색체외 유전자로서 이용할 수 있는 DNA 바이러스 벡터로서 예를 들면 아데노 바이러스 벡터(Adenovirus vector)의 실제의 유전자 치료제예는 문헌 [Nature Genetics, 3, 1-2 (1993)]에 기재된 것을 예시할 수 있다. 그러나, DNA 바이러스 벡터의 경우도 핵내에서 염색체 DNA와의 바람직하지 않은 재조합이 발생할 가능성이 높아 유전자 치료용 벡터로서 사용하는 경우에는 충분히 주의를 할 필요가 있다.
근래 상술한 바이러스 벡터에 비해 안전성이 높다고 생각되는 RNA 바이러스를 기본으로 한 RNA 바이러스 벡터가 개발되고 있다. RNA 바이러스의 복제는 자기의 RNA를 주형으로 하고, 자기 유래의 RNA 의존성 복제 효소를 촉매로 사용하여 상보쇄를 생성하는 과정의 반복에 의해 이루어진다.
(+)쇄 RNA 바이러스가 갖는 게놈 RNA는 동시에 메신저 RNA(이하 단순히 “mRNA”라 한다)로서도 기능하며 복제 또는 입자 형성에 필요한 단백질을 숙주 세포의 번역 기능에 의존하여 생산할 수 있다. 바꾸어 말하면, (+)쇄 RNA 바이러스가 갖는 게놈 RNA 자체가 전파력을 갖는다. 또한, 본 명세서에서 “전파력”이란 “감염 또는 인공적인 수법으로 핵산이 세포 내에 도입된 후 세포 내에 존재하는 도입 핵산이 복제 후 감염성 입자 또는 그에 준하는 복합체를 형성하여 다른 세포로 전파할 수 있는 능력”을 의미한다. (+)쇄 RNA 바이러스로 분류되는 신드비스(Sindbis) 바이러스 또는 (-)쇄 RNA 바이러스로 분류되는 센다이(Sendai) 바이러스는 감염 능력과 전파력을 갖는다. 파르보 바이러스과(Parvoviridae)로 분류되는 아데노 수반(adeno-associated) 바이러스는 감염 능력을 갖지만 전파력을 갖지 않는다(바이러스 입자가 형성되기 위해서는 아데노 바이러스의 동시 감염이 필요하다). 또, 시험관 내에서 인공적으로 전사된 신드비스 바이러스 유래의 (+)쇄 RNA는 전파력을 갖지만(세포 내로 도입되면 바이러스 입자를 형성한다), 시험관 내에서 인공적으로 전사된 센다이 바이러스 RNA는 (+)쇄, (-)쇄 모두 전파력을 갖지 않는다(세포 내로 도입되어도 바이러스 입자는 형성되지 않는다).
게놈 RNA가 동시에 mRNA라고 하는 장점에 의해 (+)쇄 RNA 바이러스를 통한 RNA 바이러스 벡터의 개발이 선행되었다 [Bio/Technology, 11, 916-920 (1993), Nucleic Acids Research, 23, 1495-1501 (1995), Human Gene Therapy, 6, 1161-1167 (1995), Methods in Cell Biology, 43, 43-53 (1994), Methods in Cell Biology, 43, 55-78, 1994)]. 예를 들면 셈리키 삼림 바이러스(Semliki forest virus; SFV) 또는 신드비스 바이러스(Sindbis virus)에 유래하는 RNA 바이러스 벡터는 게놈 RNA 중 바이러스 구조체에 관한 구조 유전자 영역을 결실시켜 바이러스의 전사 복제 단백질 유전자군을 남긴 것과, 전사 프로모터 하류에 목적하는 외래 유전자를 연결한 RNA를 기본적인 구조로 하고 있다. 이와 같은 RNA 또는 그 RNA를 전사시킬 수 있는 cDNA[Nucleic Acids Research,23,1495-1501(1995), Human Gene Therapy,6,1161-1167(1995)]를 직접 주사 등으로 세포 내에 도입하면 외래 유전자를 포함하는 RNA 벡터의 자율 복제와 전사 프로모터 하류의 외래 유전자의 전사가 일어나 목적하는 외래 유전자 산물이 세포 내에 발현된다. 또한, 구조 유전자를 발현하는 cDNA 유니트(헬퍼)와 상기한 RNA 벡터를 발현하는 cDNA 유니트를 패키징 세포 내에서 공존시킴으로써, 감염 능력을 갖지만 전파력을 갖지 않는 복합체를 제작하는데 성공하였다. 그러나, 패키징 도중에 헬퍼 유래의 RNA와 벡터 RNA 사이에서 재조합이 일어나 감염 입자가 출현하는 현상이 나타났다. 그리고 (+)쇄 RNA 바이러스에 특징적인 정이십면체 구조의 캡시드 내에 존재하는 스파이크 단백질이 이 재조합을 촉매한다는 것이 판명되었다. 그래서 스파이크 단백질을 변이시킴으로써 이 문제를 해결하는 것이 시도되고 있다[Bio/Technology, 11, 916-920 (1993)].
이와 같이 RNA 자율 복제 능력을 갖는 벡터로서 (+)쇄 RNA 바이러스 벡터가 기대되는데, 유전자 치료용 벡터로서 이용하기 위해서는 다음과 같은 문제점이 존재한다.
1. 정이십면체 구조의 캡시드를 갖기 때문에 외래 유전자로서 삽입할 수 있는 크기가 최대 약 3700 뉴클레오티드로 한정되어 있다.
2. 패키지된 복합체에서 핵산이 세포로 방출되어 복제될 때까지 세포 접착, 세포 내 흡입(endocytosis), 막 융합, 탈각, 복제 효소의 번역이라는 5단계나 되는 과정이 필요하다.
3. 패키징시에 전파력이 있는 바이러스 입자가 극히 미량 형성될 가능성을 부정할 수 없다. 특히 감염력이 약해진 바이러스 입자이더라도 내부의 RNA 자체는 전파력을 가지므로 지발적으로 증폭될 가능성이 있어 체크하기가 곤란하다.
4. 모기 등의 곤충에 의해 매개되는 바이러스에서 유래하기 때문에 벡터 유전자가 도입된 동물 또는 인간이 야생형 바이러스에 의해 혼합 감염되었을 경우 전파력을 갖는 재조합체가 될 가능성이 있으며, 또한 그 재조합체가 곤충에 의해 자연계로 비산될 위험성이 있다.
이상의 문제점은 만약 (-)쇄 RNA 바이러스에 유래하는 RNA 바이러스 벡터가 구축되면 기본적으로 해결된다고 생각된다. 즉, (-)쇄 RNA 바이러스는 정이십면체 구조의 캡시드를 유지하지 않으며, 또한, 입자의 외피 크기는 그 내부에 포함되는 RNA의 함량에 따라 변화된다는 것이 알려져 있어 RNA 바이러스 벡터로서 사용하는 경우에 외래 유전자의 크기에 의한 제한이 적다는 것이 추정된다. 또, 입자 내에 전사 복제 단백질군이 패키지되어 있기 때문에 패키지된 복합체로부터 핵산이 세포로 방출되어 복제될 때까지 세포 접착, 막 융합의 2단계 밖에 필요로 하지 않는다. 나아가, 바이러스 RNA 단독으로는 전파력을 갖지 않으며, 전파력을 갖는 입자는 용이하게 막 융합을 일으켜 세포 내에서 증폭된다는 것을 확인할 수 있기 때문에 전파력을 갖는 입자가 존재하는지 여부의 검사가 용이하다. 또, (-)쇄 RNA 바이러스는 곤층에 의해 매개되는 일이 없다.
이와 같이, (-)쇄 RNA 바이러스는 산업적으로 유용한 바이러스 벡터의 재료로서 이용할 수 있는 장점을 다수 갖고 있음에도 불구하고 현재까지 유용한 유전자 치료용 (-)쇄 RNA 바이러스 벡터는 존재하고 있지 않다. 그것은 바이러스 cDNA를 경유한 바이러스 입자의 재구성을 행하는 것이 매우 곤란했다는 것에 기인한다고 생각된다. 즉, 외래 유전자를 벡터에 도입하기 위해서는 DNA 수준에서의 유전자 조작이 필요하기 때문에 외래 유전자를 도입한 바이러스 cDNA로부터 바이러스 입자가 재구성되지 않는다면 (-)쇄 RNA 바이러스 벡터로서 이용하는 것은 곤란한 것이다. 또한, “바이러스 입자의 재구성”이란, 바이러스 게놈의 핵산을 인공적으로 제작하여 시험관 내 또는 세포 내에서 원래의 바이러스 또는 재조합체 바이러스를 제작하는 것이다.
상술한 바와 같이, (-)쇄 RNA 바이러스의 RNA(vRNA; viral RNA) 또는 그 상보쇄 RNA(cRNA; complementary RNA)를 단독으로 세포 내에 도입하여도 (-)쇄 RNA 바이러스는 생성되지 않는다는 것이 밝혀졌다. 이것은 (+)쇄 RNA 바이러스의 경우와 결정적으로 다른 점이다. 또한, 일본 특개평 제4-211377호 공보에는 “(-)쇄 RNA 바이러스의 게놈에 대응하는 cDNA 및 감염성 (-)쇄 RNA 바이러스의 제조 방법” 에 대한 기재가 있는데, 상기 공보의 실험 내용이 그대로 기재되어 있는 문헌 [EMBO. J., 9, 379-384 (1990)]은 실험의 재현성이 없다는 것이 밝혀져 필자 스스로 논문 내용을 전면적으로 철회한 문헌 [EMBO. J. 10, 3558 (1991) 참조]으로 미루어 보아 특개평 제4-211377호 공보에 기재한 기술이 본 발명의 선행 기술에 해당되지 않는다는 것은 명확하다.
(-)쇄 RNA 바이러스의 재구성계에 대하여 인플루엔자 바이러스(Influenza virus)에 관한 보고가 있다(Annu. Rev. Microbiol., 47, 765-790 (1993), Curr. Opin. Genet. DEV., 2, 77-81 (1992)). 인플루엔자 바이러스는 8분절 게놈으로 구성되는 (-)쇄 RNA 바이러스이다. 상기 보고에 의하면 미리 그 중의 하나인 cDNA에 외래 유전자를 삽입하고, 또 외래 유전자를 포함하는 8개 모두의 cDNA로부터 전사된 RNA를 미리 바이러스 유래의 NP 단백질과 회합시켜 RNP로 만들었다. 이러한 RNP 및 RNA 의존성 RNA 폴리머라제를 세포 내에 공급함으로써 재구성이 성립되었다. 또, (-)쇄 1축쇄 RNA 바이러스에 대해서는 라브도 바이러스과(Rhabdoviridae)에 속하는 광견병 바이러스의 cDNA로부터의 바이러스 재구성에 대한 보고가 있다(J. Virol. 68, 713-719 (1994)).
그러나, 이러한 재구성 기술을 유전자 치료용 벡터 구성 기술로서 그대로 이용하는 것은 다음과 같은 문제로 인해 곤란하였다.
1. 재구성된 바이러스는 마커 유전자의 발현 또는 RT-PCR 등으로 확인을 행할 뿐으로, 생산량의 면에서 벡터 바이러스로서 충분히 이용할 수 있는 재구성계가 확립되어 있지 않다.
2. 유전자 치료용 벡터로서 감염 능력을 갖지만 전파력이 결여된 복합체를 제작하기 위해서는 (+)쇄 RNA 바이러스의 경우와 달리 복합체 내부에 초기 전사, 복제에 필요한 인자를 포함시킬 필요가 있으며 이와 같은 복합체를 대량으로 증폭시키는 기술은 알려져 있지 않다.
3. 재구성에 필요한 인자를 세포 내에 공급할 목적으로 천연형의 바이러스 또는 재조합형의 박시니아 바이러스 등의 바이러스를 cDNA가 도입되는 세포에 동시에 감염시켰으며, 그러한 천연형 바이러스의 분리가 용이하지 않다.
나아가, RNA 바이러스 벡터 전반에 관한 사항으로서 대량으로 복제, 전사한 RNA가 치료를 실시한 사람 또는 동물에 대하여 바람직하지 않는 효과를 초래했을 경우에, 숙주의 복제 또는 전사에는 영향을 주지 않는 RNA 바이러스 벡터의 복제 저해제를 미리 준비해 둘 필요가 있다고 생각되는데, 이 저해제의 개발은 이루어지고 있지 않다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 실제 사용가능한 (-)쇄 RNA 바이러스 벡터를 개발하는 것이다. 또, 상기 벡터를 고효율로 제조하는 방법을 개발하는 것이다. 또한, 상기 벡터의 증식 저해제를 개발하는 것이다.
본 발명자들은 우선 (-)쇄 RNA 바이러스의 대표격이며, 안전선 또는 편리성의 점에서 벡터로서 산업상 가장 유용하다고 생각되는 센다이 바이러스를 센다이 바이러스의 핵산으로 재구성하는 것을 시도하였다. 우선, 재구성 시험에 적용하기 위하여 센다이 바이러스 DI 입자(defective interfering particle/EMBO J.,10,3079-3085(1991) 참조) 유래의 cDNA 또는 센다이 바이러스 미니게놈의 cDNA를 실험 재료로 사용함으로써 각종 검토를 행하였다. 그 결과, 세포 내에 도입된 cDNA, 전사 복제에 관한 cDNA군 및 T7 RNA 폴리머라제 발현 유니트인 재조합체 박시니아 바이러스의 양비(量比)에 대하여 효율이 좋은 조건을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 센다이 바이러스의 전체 길이의 cDNA를 (+)쇄와 (-)쇄의 2가지 모두를 수득하고, 세포 내에서 (+)쇄 또는 (-)쇄의 센다이 바이러스 RNA가 생합성되는 플라스미드를 구축하여 전사 복제에 관한 cDNA군을 발현하고 있는 세포 내에 도입하였다. 그 결과, 센다이 바이러스 cDNA로부터 센다이 바이러스 입자의 재구성을 비로소 성공하였다.
또한, 본 발명자들은 T7 RNA 폴리머라제 발현 유니트인 재조합체 박시니아 바이러스를 사용하지 않는 경우이더라도 센다이 바이러스의 재구성을 행할 수 있다는 것을 발견하였다. 즉, 시험관 내에서 전사한 센다이 바이러스의 전체 길이의 RNA를 세포 내에 도입하고, 초기 전사 복제 효소의 cDNA를 T7 프로모터 지배 하에 전사시켰을 경우, 바이러스 입자가 재구성되었다. 이것은 초기 전사 복제 효소군을 모두 발현하는 세포를 구축하면 박시니아 바이러스와 같은 헬퍼 바이러스를 모두 사용하지 않고, 재조합체 센다이 바이러스, 나아가 상술한 복합체를 만들어 내는 것이 가능하다는 것을 나타내고 있다. 또한, 초기 전사 복제 효소군을 모두 발현하는 세포는 문헌 [J. Virology, 68, 8413-8417 (1994)]에 기재되어 있으며, 이 기재를 참조하여 당업자가 만들어내는 것이 가능하다. 또한, 상기 문헌에 기재된 세포는 센다이 바이러스 유전자 중 NP, P/C, L의 유전자를 염색체상에 갖고 있는 239 세포 유래의 세포이며, 이것은 NP, P/C, L의 단백질을 발현하고 있다.
많은 바이러스 벡터의 예에서, 핵산에서 바이러스 입자의 재구성이 효율좋게 이루어진다면, 목적하는 바이러스 유전자를 재조합하거나, 외래 유전자를 삽입하거나 또는 목적하는 바이러스 유전자를 불활성화시키거나 결실시키는 것은 당업자에게 있어 용이하다는 것은 명확하다. 예를 들면, 센다이 바이러스 구조체 유전자의 적어도 일부를 결여시키고 복제 효소군의 유전자는 정상인 RNA를 세포 내에 도입한 경우, 초기 전사 및 초기 복제에 필요한 효소군을 세포 내에 공급하면 그 후의 자율 복제가 가능하다는 것은 DI 입자를 사용한 보고 문헌 [J. Virol. 68, 8413-8417 (1994)]에 의해 명확하다. 따라서, 예를 들면 “구조체 유전자의 적어도 일부를 결실시키고 복제 효소군의 유전자는 정상인 특정한 바이러스 cDNA”로부터 전사된 외래 유전자를 포함하는 RNA를 초기 전사 복제 효소를 포함하는 바이러스 구조체에 함입시키면, 세포 감염 능력과 RNA 자율 복제 능력을 갖지만 전파력이 결여된 외래 유전자의 벡터로서 기능하는 복합체를 만들어낼 수가 있다. 이와 같은 복합체는 유전자 치료용 벡터로서 매우 유효한 것이다. 즉, 본 발명에 의해 (-)쇄 RNA 바이러스에서 세포 감염 능력과 RNA 자율 복제 능력를 갖지만 전파력이 결여된 복합체의 제조, 예를 들면 초기 전사 복제 효소를 포함하는 복합체의 제조가 가능해졌다.
본 발명자들은 또한 복합체 중의 RNA의 결실 또는 불활성화된 유전자에 상당하는 구조 단백질을 발현하는 세포에 그 복합체를 감염시켜 동일한 복합체를 증폭하는 복합체의 증폭 방법을 개발하였다. 또한, 상기한 복합체를 증폭시키기 위하여 센다이 바이러스의 증식에 가장 적합한 종류의 하나인 조류의 알에 착안하여 센다이 바이러스의 M, F, HN 유전자 중 적어도 1종류 이상의 유전자를 염색체 상에 보유하는 트랜스제닉 조류, 그 알 및 세포가 복합체의 증폭에 적합하다는 것을 발견하였다. 트랜스제닉 조류의 제조법은 문헌 [Poltry Sci., 65, 1445-1458 (1986), Bio/Technology, 12, 60-63 (1994)]에 공지된 것으로, M, F, HN 유전자 중 적어도 1종류 이상의 유전자를 염색체 상에 보유하는 트랜스제닉 조류를 만들어내는 것은 당업자에게 용이한 것이다. M, F, HN 유전자 중 복합체에 포함되는 RNA의 전파력 결여에 관한 유전자가 코딩하는 단백질이 트랜스제닉 조류 내에서 생산되는 것이 적합하다.
본 발명자는 또한 상기 복합체를 제조하는 방법을 개발하였다. 이하, 센다이 바이러스에 관한 경우를 예시한다. 센다이 바이러스 Z주(Viology,108,318-324(1981))의 게놈은 15384 뉴클레오티드로 이루어지는 일축쇄 RNA이다. 그의 전체 염기 서열은 역전사 효소를 사용한 cDNA의 클로닝으로 결정되었다(Nucleic Acids Research, 11, 7317-7330 (1983), Nucleic Acids Research, 12, 7965-7972 (1984), Nucleic Acids Research, 14, 1545-1563 (1986)). 게놈 RNA는 (-)쇄 RNA이므로 바이러스 입자 내에 존재하는 전사 복제 효소군은 게놈 RNA를 주형으로 하여 전사와 복제를 행한다. 게놈 RNA가 코딩하는 단백질로서는 적어도 NP, P/C, M, F, HN, L의 6종류가 알려져 있는데, 이중 NP, P/C 및 L이 복제에 필요 충분한 인자라는 것이 알려졌고(Journal of Virology, 68, 8413-8417 (1994)), M, F, HN은 바이러스 구조체를 구성하기 위하여 필요한 성분이라는 것이 판명되었다. 이상으로부터 RNA가 유래하는 특정한 RNA 바이러스가 센다이 바이러스인 경우에는, 자율 복제에 관한 유전자군인 NP, P/C, L 모두와 M, F, HN 유전자 중 RNA의 전파력 결여에 관한 유전자군을 함께 발현하고 있는 세포 중에, ① DNA에 전사되는 cDNA, ② 그 cDNA를 세포 내에서 전사할 때에 필요한 RNA 폴리머라제를 코딩하는 유전자 또는 시험관 내에서 cDNA에서 전사한 RNA 그 자체를 함께 도입하여 감염성이 있는 복합체를 재구성할 수가 있다. 이 경우, 자율 복제에 관한 유전자군인 NP, P/C, L 모두와 M, F, HN 유전자 중 RNA의 전파력 결여에 관한 유전자군은 예를 들면 이러한 유전자를 코딩하는 플라스미드의 세포 내 도입 등의 일과성의 발현이어도 상관없지만, 적어도 RNA의 전파력 결여에 관한 유전자군은 염색체에 도입되어 안정하게 발현하는 것이 적합하다.
본 발명자들은 또한 이렇게 하여 재구성한 복합체를 대량으로 생산하는 방법을 개발하였다. 구체적으로는, 자율 복제에 관한 유전자군은 갖지 않고 M, F, HN 유전자 중 RNA의 전파력 결여에 관한 유전자군을 발현하고 있는 세포에 상기 복합체를 감염시켜 복합체를 생산하는 방법이다. 이 경우, 자율 복제에 관한 유전자군은 갖지 않고 M, F, HN 유전자 중 RNA의 전파력 결여에 관한 유전자군을 발현하고 있는 세포의 대량 생산을 위해서는 그 유전자군을 발현하고 있는 트랜스제닉 조류의 알이 적합하다.
본 발명자들은 또한 상기한 RNA와 단백질을 포함하는 복합체를 증식시키기 위한 세포를 만들어냈다. 구체적으로는, 이 세포는 상기 복합체가 보유하는 RNA의 전파력 결여에 관한 유전자군에 상당하는 유전자를 보유하는 세포이며, 그 유전자가 코딩하는 단백질군을 세포 내에 생산할 수 있는 세포이다. RNA가 유래하는 특정한 RNA 바이러스가 센다이 바이러스인 경우에는, 센다이 바이러스의 M, F, HN 유전자 중 적어도 1종 이상의 유전자를 염색체 상에 보유하는 세포 및 그 세포를 갖는 동물이 사용된다. 또한, M, F, HN 유전자는 야생형의 것일 필요는 없으며 야생형과 동등한 기능을 갖는 것이면 좋다. 즉, 유전자가 세포에 기능적으로 도입되었을 때, 결손 바이러스에 대하여 야생형과 동등한 상보 능력을 갖는 것이면 좋다. 세포는 센다이 바이러스가 숙주로 하는 세포가 적합하다. M, F, HN 유전자 중 벡터 바이러스의 RNA에서 전파력 결여에 관한 유전자군에 상당하는 유전자가 코딩하는 단백질군이 세포 내에서 생산되는 것이 바람직하다.
또, 본 발명자들은 기존의 RNA 바이러스에서 발현 효율을 높이는 것만이 중시되어 과잉 발현에 의해 본의 아닌 결과를 초래했을 때에 RNA의 복제를 억제하는 화합물의 개발이 이루어져 있지 않다는 점에 비추어, 세포 유래의 RNA의 전사 또는 번역에는 영향을 주지 않으며 RNA 의존성 RNA 복제 또는 RNA 의존성 RNA 전사를 특이적으로 저해함으로써 결과적으로 RNA 의존성 RNA 복제만을 억제하는 약제를 (-)쇄 RNA 바이러스 벡터의 저해제로서 개발하였다.
즉, 본 발명은 이하의 것을 포함한다.
(1) 전파력을 갖는 특정한 (-)쇄 RNA 바이러스에서 유래하는 RNA와, 핵산을 포함하지 않는 바이러스 구조체를 포함하는 복합체로서, 세포 감염 능력과 RNA 자율 복제 능력을 갖지만 전파력이 결여된 복합체,
(2) 특정한 RNA 바이러스가 비분절형 (-)쇄 RNA 바이러스인 것을 특징으로 하는 (2)에 기재한 복합체,
(3) 특정한 RNA 바이러스가 센다이 바이러스인 것을 특징으로 하는 (3)에 기재한 복합체,
(4) 센다이 바이러스 RNA 또는 센다이 바이러스 cRNA를 포함하는 RNA로서, M, F, HN 단백질에 상당하는 유전자 중 적어도 하나 이상의 유전자가 결실 또는 불활성화되어 있는 RNA,
(5) (4)에 기재한 RNA와, 센다이 바이러스 유래의 핵산을 포함하지 않는 바이러스 구조체를 포함하는 복합체로서, 세포 감염 능력과 RNA 자율 복제 능력을 갖지만 전파력이 결여되는 복합체,
(6) (4)에 기재한 RNA를 시험관 내 또는 세포 내에서 전사할 수 있는 주형 DNA를 포함하는 DNA,
(7) 복합체 내에 포함되는 RNA가 외래 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (3) 또는 (5) 중 어느 하나에 기재한 복합체,
(8) 복합체 내에 포함되는 RNA가 외래 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 (3) 또는 (5)에 기재한 복합체,
(9) 외래 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 (4)에 기재한 RNA,
(10) 외래 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 (6)에 기재한 DNA,
(11) RNA 의존성 RNA 복제를 저해하는 약제를 포함하는, (1) 내지 (3), (5), (7) 또는 (8) 중 어느 하나에 기재한 복합체에 포함되는 RNA 복제 저해제,
(12) (1) 내지 (3), (5), (7) 또는 (8) 중 어느 하나에 기재한 복합체가 전파할 수 있는 숙주,
(13) (1) 내지 (3), (5), (7) 또는 (8) 중 어느 하나에 기재한 복합체의 감염 능력에 관한 유전자군을 염색체 상에 가지며, 상기 복합체를 감염시켰을 때, 그 복합체와 동일한 것을 복제할 수 있는 것을 특징으로 하는 (12)에 기재한 숙주,
(14) 숙주가 동물, 동물에서 유래한 세포, 동물의 조직 또는 동물의 알인 것을 특징으로 하는 (12) 또는 (13)에 기재한 숙주,
(15) 동물이 포유류인 것을 특징으로 하는 (14)에 기재한 숙주,
(16) 동물이 조류인 것을 특징으로 하는 (14)에 기재한 숙주,
(17) (3), (5) 또는 (8) 중 어느 하나에 기재한 복합체의 감염 능력에 관한 유전자군을 염색체 상에 가지며, 그 복합체를 감염시켰을 때, 그 복합체와 동일한 것을 복제할 수 있는 것을 특징으로 하는 숙주,
(18) 센다이 바이러스의 M 유전자, F 유전자, HN 유전자 또는 그것들과 동등한 기능을 갖는 유전자 중 적어도 하나 이상의 유전자를 염색체 상에 갖는 숙주,
(19) 센다이 바이러스의 M 유전자 또는 동등한 기능을 갖는 유전자를 염색체 상에 갖는 숙주,
(20) 센다이 바이러스의 M 유전자, NP 유전자, P/C 유전자 및 L 유전자(각 유전자는 동등한 기능을 갖는 유전자로 치환되어 있어도 좋다)를 염색체상에 갖는 숙주,
(21) 센다이 바이러스의 M 유전자, F 유전자 및 HN 유전자(각 유전자는 동등한 기능을 갖는 유전자로 치환되어 있어도 좋다)를 염색체상에 갖는 숙주,
(22) 센다이 바이러스의 M 유전자, F 유전자, HN 유전자, NP 유전자, P/C 유전자 및 L 유전자(각 유전자는 동등한 기능을 갖는 유전자로 치환되어 있어도 좋다)를 염색체상에 갖는 숙주,
(23) 숙주가 동물, 동물에서 유래하는 세포, 동물의 조직 또는 동물의 알인 것을 특징으로 하는 (17) 내지 (22) 중 어느 하나에 기재한 숙주,
(24) 동물이 포유류인 것을 특징으로 하는 (23)에 기재한 숙주,
(25) 동물이 조류인 것을 특징으로 하는 (23)에 기재한 숙주,
(26) a) (1) 내지 (3), (5), (7) 또는 (8) 중 어느 하나에 기재한 복합체에 포함되는 RNA 또는 상기 RNA의 cRNA, 또는 상기 RNA 또는 상기 cRNA를 생합성할 수 있는 유니트,
b) 상기 RNA의 cRNA의 복제에 필요한 효소군 또는 상기 효소군을 생합성할 수 있는 유니트,
c) 상기 복합체의 감염 능력에 관한 단백질군 또는 상기 단백질군을 생합성할 수 있는 유니트
의 3가지를 포함하는 키트,
(27) a) (1) 내지 (3), (5), (7) 또는 (8) 중 어느 하나에 기재한 복합체에 포함되는 RNA 또는 상기 RNA의 cRNA, 또는 상기 RNA 또는 상기 cRNA를 생합성할 수 있는 유니트,
b) 상기 RNA 또는 상기 cRNA의 복제에 필요한 효소군 또는 상기 효소군을 생합성할 수 있는 유니트,
c) (12) 내지 (25) 중 어느 하나에 기재한 숙주
의 3가지를 포함하는 키트,
(28) a) (1) 내지 (3), (5), (7) 또는 (8) 중 어느 하나에 기재한 복합체
b) (12) 내지 (25) 중 어느 하나에 기재한 숙주
의 2가지를 포함하는 키트,
(29) a) (3), (5) 또는 (8) 중 어느 하나에 기재한 복합체에 포함되는 RNA 또는 상기 RNA의 cRNA, 또는 상기 RNA 또는 상기 cRNA를 생합성할 수 있는 유니트,
b) 센다이 바이러스의 NP, P/C, L 단백질의 모두, 또는 상기 단백질을 생합성할 수 있는 유니트,
c) 상기 복합체의 감염 능력에 관한 단백질군, 또는 상기 단백질군을 생합성할 수 있는 유니트
의 3가지를 포함하는 키트,
(30) a) (3), (5) 또는 (8) 중 어느 하나에 기재한 복합체에 포함되는 RNA 또는 상기 RNA의 cRNA, 또는 상기 RNA 또는 상기 cRNA를 생합성할 수 있는 유니트,
b) 센다이 바이러스의 NP, P/C, L 단백질의 모두, 또는 상기 단백질을 생합성할 수 있는 유니트,
c) (17) 내지 (25) 중 어느 하나에 기재한 숙주
의 3가지를 포함하는 키트,
(31) a) (3), (5) 또는 (8) 중 어느 하나에 기재한 복합체
b) (17) 내지 (25) 중 어느 한항에 기재한 숙주
의 2가지를 포함하는 키트,
(32) 숙주내에 (26) a), b) 및 c)에 기재한 3가지를 도입함으로써 (1) 내지 (3), (5), (7) 또는 (8) 중 어느 하나에 기재한 복합체를 제조하는 방법,
(33) (27) c)에 기재한 숙주내에 (27) a) 및 b)에 기재한 2가지를 도입함으로써 (1) 내지 (3), (5), (7) 또는 (8) 중 어느 하나에 기재한 복합체를 제조하는 방법,
(34) (28) a)에 기재한 복합체를 (28) b)에 기재한 숙주에 감염시킴으로써 상기 복합체를 증폭하여 제조하는 방법,
(35) 숙주내에 (29) a), b) 및 c)에 기재한 3가지를 도입함으로써 (3), (5) 또는 (8) 중 어느 하나에 기재한 복합체를 제조하는 방법,
(36) (30) c)에 기재한 숙주에 (30) a) 및 b)에 기재한 2가지를 도입함으로써 (3), (5) 또는 (8) 중 어느 하나에 기재한 복합체를 제조하는 방법,
(37) (31) a)에 기재한 복합체를 (31) b)에 기재한 숙주에 감염시킴으로써 상기 복합체를 증폭하여 제조하는 방법,
(38) M에 상당하는 유전자가 결실 또는 불활성화되어 있는 것을 특징으로 하는 (9)에 기재한 RNA,
(39) M, F, HN에 상당하는 유전자가 모두 결실 또는 불활성화되어 있는 것을 특징으로 하는 (9)에 기재한 RNA,
(40) a) (38)에 기재한 RNA,
b) (20)에 기재한 숙주,
c) (19)에 기재한 숙주
의 3가지를 포함하는 키트,
(41) (40) a)에 기재한 RNA를 (40) b)에 기재한 숙주에 도입함으로써 얻어지는 복합체를 (40) c)에 기재한 숙주에 감염시키고 상기 복합체를 증폭시켜 제조하는 방법,
(42) (41)의 방법에 의해 제조된 복합체,
(43) a) (39)에 기재한 RNA
b) (22)에 기재한 숙주,
c) (21)에 기재한 숙주
의 3가지를 포함하는 키트,
(44) (43) a)에 기재한 RNA를 (43) b)에 기재한 숙주에 도입함으로써 얻어지는 복합체를 (43) c)에 기재한 숙주에 감염시키고 상기 복합체를 증폭하여 제조하는 방법,
(45) (44)의 방법에 의해 제조된 복합체,
(46) RNA 의존성 RNA 복제를 저해하는 약제를 포함하는, (42), (45) 중 어느 하나에 기재한 복합체에 포함되는 RNA 복제 저해제,
(47) (7)에 기재한 복합체를 숙주에 도입하고 발현된 외래 단백질을 회수하는 공정을 포함하는 외래 단백질의 제조 방법,
(48) 숙주가 전파력에 관한 유전자 중, (7)에 기재한 복합체에 포함되는 RNA에서 결여되어 있는 유전자군을 발현하고 있는 세포인 (47)에 기재한 외래 단백질의 제조 방법,
(49) (7)에 기재한 복합체를 숙주에 도입하고 배양액 또는 장뇨액(漿尿液)을 회수함으로써 수득할 수 있는, 발현된 외래 단백질을 포함하는 배양액 또는 장뇨액.
재료가 되는 (-)쇄 RNA 바이러스로서는 전파력을 유지하는 것이라면 어떠한 것이어도 사용할 수 있다. DI 입자 등의 불완전 바이러스 또는 합성한 올리고뉴클레오티드 등도 재료의 일부로서 당연히 사용할 수는 있지만 전체적으로 전파력을 갖는 바이러스와 동등한 배열을 보유하고 있어야 한다. 본 발명의 (-)쇄 RNA 바이러스에 포함되는 바이러스로서는 예를 들면 파라믹소 바이러스과의 (Paramyxoviridae)의 센다이 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus), 유행성 이하선염 바이러스(Mumps virus), 홍역 바이러스(Measles virus), RS 바이러스(Respiratory syncytial virus), 우역 바이러스(rinderpest virus), 디스템퍼 바이러스(distemper virus), 오르토믹소 바이러스과(Orthomyxoviridae)의 인플루엔자 바이러스, 라브도바이러스과의 수포성 구내염 바이러스(Vesicular S), 광견병 바이러스(Rabies virus) 등을 들 수 있다.
재료가 되는 (-)쇄 RNA 바이러스로서는 상기한 바이러스에서 유래하는 전파력을 유지하는 재조합체 (-)쇄 RNA 바이러스를 사용하여도 좋다. 재조합체 (-)쇄 RNA 바이러스는 예를 들면 면역원성에 관여하는 유전자를 불활성화하시키거나 RNA의 전사 효율 또는 복제 효율을 높이기 위하여 일부 유전자를 변이시킨 것이어도 좋다.
본 발명의 RNA와 단백질과의 복합체에 포함되는 RNA는 상기한 바이러스 또는 재조합체 바이러스의 cDNA를 변이시킨 것을 시험관 내 또는 세포 내에서 전사시킴으로써 얻을 수가 있다. 이때 얻어지는 RNA는 유래하는 바이러스의 전파력에 관한 적어도 하나의 유전자가 결실 또는 불활성화되어 있는 것이 필요한데, 자율 복제에 관한 유전자가 결실 또는 불활성화되어 있어서는 안된다. 또, DI 분자 등, 바이러스 게놈의 양단 구조를 갖는 cDNA에 인공적으로 자율 복제에 관한 유전자군을 삽입한 DNA를 시험관 내 또는 세포 내에서 전사시킴으로써 얻어지는 인공적인 배열을 갖는 RNA 분자도 마찬가지로 사용할 수 있다.
상술한 바와 같이, 센다이 바이러스에서 “자율 복제에 관한 유전자”란 NP, P/C, L 중 어느 하나의 유전자이며, “전파력에 관한 유전자”란 M, F, HN 중 어느 하나의 유전자이다. 따라서, 예를 들면 M 유전자만을 결실시킨 센다이 바이러스 Z주의 RNA는 본 발명의 “복합체”에 포함되는 성분으로서 적당하다. 또, M, F, HN 모두의 유전자가 결실 또는 불활성화된 것도 본 발명의 “복합체”에 포함되는 성분으로서 적당하다. 한편, NP, P/C, L을 코딩하는 유전자군이 RNA에서 발현되는 것이 필요하다. 단, 이러한 유전자군은 바이러스 유래의 배열 그 자체가 아니더라도 전사, 복제에서의 활성이 천연형의 그것과 동등하거나 그 이상이면 변이를 도입하거나 또는 다른 바이러스의 상당 유전자로 대용하여도 좋다.
본 발명의 “핵산을 포함하지 않는 바이러스 구조체”란 예를 들면 바이러스에서 RNA만을 제거한 것이 포함된다. 그 구조체로서는 감염 능력과 초기의 자율 복제 능력을 보유하는데, 전파력은 보유하지 않는 것이 사용된다. 센다이 바이러스를 예로 들면, M 유전자만을 결실시킨 센다이 바이러스의 RNA와 센다이 바이러스에서 RNA만을 제거한 것으로 이루어지는 복합체는 감염 능력과 자율 복제 능력을 갖지만 전파력을 갖지 않는 복합체이다. 복합체는 전파력을 부여하지 않는 것이면 이들 이외의 것을 함유하고 있어도 상관없다. 예를 들면, 외피 표면에 특정한 세포에 접착할 수 있는 접착 인자, 리간드, 수용체 등이 함유되어 있어도 상관없다.
복합체에 포함되는 RNA는 적당한 부위에 외래 유전자가 삽입된 것이어도 좋다. 목적하는 단백질을 발현시키기 위해서는 목적하는 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 삽입한다. 센다이 바이러스 RNA에서는 R1 서열(5'-AGGGTCAAAGT-3')과 R2 서열(5'-GTAAGAAAAA-3') 사이에 6의 배수의 염기수를 갖는 서열을 삽입하는 것이 바람직하다(Journal of Virology, Vol. 67, No.8 (1993) p.4822-4830). 삽입한 외래 유전자의 발현량은 유전자의 삽입 위치 및 유전자 전후의 RNA 염기 서열에 의해 조절할 수 있다. 예를 들면, 센다이 바이러스 RNA에서는 삽입 위치가 NP 유전자와 가까울수록 삽입된 유전자의 발현량이 많다는 것이 알려져 있다. 또한, 복합체를 도입하여 단백질을 발현시키기 위하여 사용하는 숙주로서는 전파력에 관한 유전자 중 복합체에 포함되는 RNA에 결여되어 있는 유전자군을 발현하고 있는 세포가 적합하게 사용된다. 이 경우, 대량 생산을 위해서는 그 유전자군을 발현하고 있는 트랜스제닉 조류의 알이 특히 적합하다. 발현된 단백질은 예를 들면 배양 세포를 숙주로 하는 경우에는 배양액에서, 계란을 숙주로 하는 경우에는 뇨장액(尿漿液)에서, 통상법에 따라 회수할 수 있다. 또한, 실시예 5 및 6에서는 본 출원의 복합체 대신에 전파력이 있는 복합체가 사용되고 있는데, 본 출원의 복합체에서도 상기한 “전파력에 관한 유전자 중 복합체에 포함되는 RNA에 결여되어 있는 유전자군을 발현하고 있는 세포”를 숙주로서 사용하면 실시예에서의 전파력이 있는 복합체와 마찬가지의 결과가 얻어진다는 것은 당업자에게 명확한 사실이다.
또한, 센다이 바이러스의 효율좋은 입자 재구성을 위해서는 세포 내에 도입하는 cDNA의 형태가 선상보다도 환상이 좋으며 (-)쇄 RNA가 세포 내에서 전사되기 보다는 (+)쇄 RNA가 세포 내에서 전사되는 것이 입자 형성 효율이 높다는 것이 본 발명자에 의해 확인되었다. 이러한 조건이 다른 모든 (-)쇄 RNA 바이러스 재구성에 적용할 수 있다고는 할 수 없으나, 다른 (-)쇄 RNA 바이러스 재구성시에도 본 명세서의 기재 내용 및 기술 상식을 바탕으로 하여 적절히 조건을 검색하는 것이 가능하며, 이에 의해 목적하는 (-)쇄 RNA 바이러스 벡터의 기본 재료를 만들어내는 기술을 확립하는 것, 즉 바이러스의 재구성계를 확립하는 것이 가능하다는 것은 명확하다.
본 발명에서의 “RNA 복제 저해제”로서는 RNA 의존성 RNA 복제를 저해하는 약제이면 어떠한 것이더라도 적용 가능한데, 예를 들면 리바비린(Ribavirin), TJ13025 등이 적합하게 사용되다. 이러한 복제 저해제는 예를 들면 세포 내에서의 재조합체 RNA의 증폭에 따른 건강 상태 악화가 관찰되었을 때, 또는 세포 내에서의 재조합체 RNA 유래의 외래 유전자 등의 발현을 제어하고자 하는 경우 등에 유효하다.
또한, 본 발명의 한 양태로서의 M 유전자가 결실된 센다이 바이러스 cDNA로부터 본 발명에 포함되는 복합체를 제조하고(A→B의 과정), 다시 그 복합체를 증폭하는 공정(B→C의 과정)을 도 1로서 예시한다.
<실시예>
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하겠는데, 본 발명은 이러한 실시예로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
센다이 바이러스 전사 유니트 pUC18/T7(-)HVJRz.DNA 및 pUC18/T7(+)HVJRz.DNA의 제작
T7 프로모터, (-)쇄 RNA가 전사되도록 설계된 센다이 바이러스 cDNA, 리보자임 유전자를 이 순서로 보유하는 DNA를 pUC18 플라스미드에 삽입한 플라스미드 pUC18/T7(-)HVJRz.DNA를 제작하였다. 또, T7 프로모터, (+)쇄 RNA가 전사되도록 설계된 센다이 바이러스 cDNA, 리보자임 유전자를 이 순서로 보유하는 DNA를 pUC18 플라스미드에 삽입한 프라스미드 pUC18/T7(+)HVJRz.DNA를 제작하였다. pUC18/T7(-)HVJRz.DNA 및 pUC18/T7(+)HVJRz.DNA의 구성을 도 2 및 도 3에 나타냈다.
<실시예 2>
cDNA로부터의 센다이 바이러스 재구성 실험
직경 6 ㎝의 플라스틱 샬레에 통상의 트립신 처리를 실시한 LLC-MK2 세포 2,000,000개와 MEM 배지(MEM+FBS 10 %) 2 ㎖를 첨가하여 CO2 5 %, 37 ℃의 조건하에서 24시간 배양하였다. 배양액을 제거하고 1 ㎖의 PBS를 사용하여 세정한 후, 다중 감염도(moi/multiplicity of infection)가 2가 되도록 조제하였다. T7 폴리메라이제를 발현하는 재조합 박시니아 바이러스 vTF7-3을 0.1 ㎖의 PBS에 현탁하여 첨가하였다. 15분마다 바이러스액이 전체에 분산되도록 샬레를 흔들어 1시간 동안 감염을 행하였다. 바이러스 용액을 제거하고 1 ㎖의 PBS를 사용하여 세정하였다. 이 샬레에 cDNA 용액을 포함하는 배지를 첨가하였다. cDNA 용액을 포함하는 배지의 제작은 이하와 같이 행하였다.
표에 나타낸 핵산(센다이 바이러스의 제작에 필요한 인자를 발현하는 플라스미드, pGEM-L, pGEM-P/C, pGEM-NP 포함)을 1.5 ㎖의 셈플링 튜브에 도입하고 HBS(Hepes buffered saline; 20mM Hepes pH7.4, 150mM NaCl)을 첨가하여 총량을 0.1 ㎖로 하였다. 표 중의 (-) 또는 (+)cDNA는 플라스미드 pUC18/T7(-)HVJRz.DNA 또는 pUC18/T7(+)HVJRz.DNA 그 자체를 나타내고 /C는 환상인 채, /L은 제한 효소 M1uI에 의해 직쇄화한 후에 세포에 도입되었다는 것을 나타낸다.
다른 한편, 폴리스티렌 튜브 중에서 HBS 0.07 ㎖, DOTAP(베링거 만하임사 제품) 0.03 ㎖을 조합하고 핵산 용액을 이 폴리스티렌 튜브로 옮겼다. 이 상태에서 10분간 정치시켰다. 여기에 세포 배양액(2 ㎖ MEM+FBS 10 %)을 첨가하였다. 다시 이 속에 박시니아 바이러스 저해제인 리팜피신(Rifampicin)과 시토신 아라비노시드(cytosin arabinoside C/Are C)를 최종 농도가 각각 0.1 ㎎/㎖, 0.04 ㎎/㎖이 되도록 첨가하였다. 이에 따라 cDNA 용액을 포함하는 배지가 제작되었다.
상기 샬레를 40시간 동안 CO2 5 %, 37 ℃의 조건하에서 배양하였다. 라바 폴리스만을 사용하여 샬레 내의 세포를 긁어 모아 에펜도르프 튜브로 옮겨 6000 rpm에서 5분간 원심분리를 행하여 세포 성분만을 침전시키고, 다시 1 ㎖의 PBS에 현탁하였다. 이 세포액의 일부를 그대로의 상태, 또는 희석하여 10일령의 발육 계란에 접종하였다. 이 세포액을 표 1에 나타낸 세포수가 되도록 PBS로 희석하고 0.5 ㎖ 접종한 알을 35 ℃에서 72시간 배양한 후 4 ℃로 옮겨 하루밤 정치시켰다. 주사기와 주사침을 사용하여 이 알의 장뇨액을 바이러스액으로서 회수하였다.
회수한 바이러스액의 HAU(hemmaglutinin unit)와 PFU(plaque forming unit)의 측정을 이하에 나타내는 방법으로 행하였다.
HAU의 측정은 이하와 같이 행하였다. 닭의 혈청을 400x g에서 10분간 원심분리하고 상청액을 버렸다. 남은 침전물을 침전물의 100배량의 PBS(-)로 현탁하고, 이것을 다시 400x g에서 10분간 원심분리하여 상청액을 버렸다. 이 조작을 다시 2회 반복하여 0.1 % 혈구 용액을 제작하였다. 바이러스 용액을 단계 희석법으로 2배씩 희석하고, 그 0.05 ㎖씩을 96 구멍의 타이터 플레이트에 주입하였다. 이 타이터 플레이트에 다시 0.05 ㎖씩의 혈구 용액을 주입하고 가볍게 진동시켜 잘 섞은 후 4 ℃에서 40분 정치시켰다. 그 후 적혈구의 응집을 육안으로 관찰하여 응집된 것 중 바이러스 용액의 희석율이 가장 높은 것의 희석율을 HAU로서 나타냈다.
PFU의 측정은 이하와 같이 행하였다. CV-1 세포를 6 구멍의 배양 플레이트 상에 단층이 되도록 생육시켰다. 배양 플레이트의 배지를 버리고 단계 희석법으로 10배씩으로 희석한 바이러스 용액 0.1 ㎖씩을 각각의 배양 플레이트 내의 웰에 주입하여 37 ℃에서 1시간 동안 감염시켰다. 감염중에 혈청이 포함되어 있지 않은 2X MEM과 2 % 한천을 55 ℃에서 혼합하고, 다시 최종 농도 0.0075 ㎎/㎖가 되도록 트립신을 첨가하였다. 1시간 동안의 감염 후에 바이러스 용액을 제거하고 한천과 혼합한 배지 3 ㎖씩을 각각의 배양 플레이트 내의 웰에 첨가하고, 5 % CO2 조건 하에서 37 ℃에서 3일동안 보온하였다. 0.2 ㎖의 0.1 % 페놀 레드를 첨가하여 37 ℃에서 3시간 동안 보온한 후 제거하였다. 색이 부착되지 않은 플라크의 수를 세어 바이러스의 역가를 PFU/㎖로서 평가하였다.
표 1에는 LLC-MK2 세포에 도입한 주형이 되는 센다이 바이러스 cDNA, RNA 복제에 필요한 인자의 cDNA인 pGEM-L, pGEM-P/C 및 pGEM-NP의 양, 인큐베이션 시간, 계란에 접종한 세포수, HAU, PFU를 각각 나타냈다.
주형 cDNA 합계(㎍) pGEM-L(㎍) pGEM-P/C(㎍) pGEM-NP(㎍) 배양시간(시간) 세포수 HAU PFU
(+)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00x105 512 2x109
(+)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00x105 256 9x108
(+)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00x106 256 9x108
(+)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00x105 <2 <10
(+)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00x105 <2 <10
(+)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00x106 <2 <10
(-)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00x104 <2 <10
(-)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00x105 <2 <10
(-)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00x106 <2 <10
(-)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00x104 <2 <10
(-)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00x105 <2 <10
(-)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00x106 4 8x103
HAU, PFU를 함께 나타낸 샘플을 초원심분리로 침전시킨 후, 재부유시켜 20 % 내지 60 %의 자당 밀도 구배 원심분리로 정제하고 12.5 % SDS-PAGE로 단백질을 분리한 결과, 여기에 함유되는 단백질은 센다이 바이러스의 단백질과 같은 크기의 것이었다.
이 결과로부터 cDNA를 세포에 도입하여 센다이 바이러스를 재구성할 수 있다는 것이 나타났다. 또, (+)쇄를 전사하는 cDNA를 세포 내에 도입했을 때에는 (-)쇄를 전사하는 cDNA를 도입했을 때에 비해 바이러스 입자가 고효율로 재구성되는 것으로 밝혀졌다. 또한, cDNA를 환상인 채로 도입했을 때에는 직쇄상으로 도입했을 때에 비해 바이러스 입자가 고효율로 재구성된다는 것이 밝혀졌다.
<실시예 3>
센다이 바이러스 재구성에 필요한 RNA 복제 인자의 검토
L, P/C, NP를 발현하는 플라스미드 3가지 모두가 필요한지 여부를 조사하는 실험을 행하였다. 방법은 실시예 2와 마찬가지이지만 , 실시예 2에서는 cDNA와 함께 pGEM-L, pGEM-P/C 및 pGEM-NP의 3가지를 세포 내에 도입한데 반하여 본 실험에서는 pGEM-L, pGEM-P/C, pGEM-NP 중 임의의 2가지 또는 1가지만을 cDNA와 함께 세포 내에 도입하였다.
표 2는 LLC-MK2 세포에 도입된 주형이 되는 센다이 바이러스 cDNA, RNA 복제에 필요한 인자의 cDNA인 pGEM-L, pGEM-P/C 및 pGEM-NP의 양, 인큐베이션 시간, 계란에 접종한 세포수, HAU, PFU를 각각 나타냈다.
주형 cDNA 합계(㎍) pGEM-L(㎍) pGEM-P/C(㎍) pGEM-NP(㎍) 배양시간(시간) 세포수 HAU PFU
(+)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00x105 256 6x108
(+)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00x106 512 4x109
(+)cDNA/C 10 0 2 4 40 1.00x106 <2 <10
(+)cDNA/C 10 0 2 4 40 1.00x106 <2 <10
(+)cDNA/C 10 4 0 4 40 1.00x106 <2 <10
(+)cDNA/C 10 4 0 4 40 1.00x106 <2 <10
(+)cDNA/C 10 4 2 0 40 1.00x106 <2 <10
(+)cDNA/C 10 4 2 0 40 1.00x106 <2 <10
(+)cDNA/C 10 0 0 4 40 1.00x106 <2 <10
(+)cDNA/C 10 0 0 4 40 1.00x106 <2 <10
(+)cDNA/C 10 0 2 0 40 1.00x106 <2 <10
(+)cDNA/C 10 0 2 0 40 1.00x106 <2 <10
(+)cDNA/C 10 4 0 0 40 1.00x106 <2 <10
(+)cDNA/C 10 4 0 0 40 1.00x106 <2 <10
표 2로부터 어떤 조합의 2가지를 도입한 경우에도 바이러스의 생산이 발견되지 않았다. 이 결과, 이 3종의 단백질 모두가 바이러스 재구성에 필수적이라는 것이 확인되었다.
<실시예 4>
시험관내 전사 RNA로부터의 센다이 바이러스 재구성 실험
실시예 2에서 cDNA로부터 센다이 바이러스가 재구성되는 것을 나타냈는데, 다시 cDNA를 시험관내에서 전사한 산물, 즉 vRNA 및 cRNA에서도 마찬가지로 되는지 여부를 검토하였다.
센다이 바이러스 전사 유니트 pUC18/T7(-)HVJRz.DNA 및 pUC18/T7(+)HVJRz.DNA를 제한 효소 MluI로 직쇄상으로 만든 후 이것을 주형으로서 이용하여 정제 T7 폴리머라제(EPICENTRE TECHNOLOGIES: Ampliscribe T7 Transcription Kit)에 의한 시험관내 RNA 합성을 행하였다. 시험관내 RNA 합성 방법은 키트의 프로토콜에 따랐다. 여기에서 얻어진 RNA 산물을 실시예 2의 cDNA 대신에 사용하여 마찬가지의 실험을 행하고 바이러스 생산의 평가는 HA 시험에 의해 행하였다.
결과를 표 3에 나타냈다.
주형 cDNA 합계(㎍) pGEM-L(㎍) pGEM-P/C(㎍) pGEM-NP(㎍) 배양시간(시간) 세포수 HAU PFU
시험관내 (-)RNA 10 4 2 4 40 1.00E+06 512 2x109
시험관내 (-)RNA 10 4 2 4 40 1.00E+06 512 ND
시험관내 (+)RNA 10 4 2 4 40 1.00E+06 2 5x103
시험관내 (+)RNA 10 4 2 4 40 1.00E+06 <2 ND
이 결과에 의해 어느쪽 센스의 RNA를 세포 내에 도입하여도 바이러스를 재구성할 수가 있었다.
<실시예 5>
센다이 바이러스 벡터내에 삽입한 외래 유전자의 숙주내 발현의 검토
(1) 외래 유전자(HIV-1 gp120 유전자)가 삽입된 센다이 바이러스 벡터 “pSeVgp120”의 제조
프라이머 a (서열 번호: 1) 및 프라이머 d (서열 번호: 2)를 사용하여 “pNI432” 상의 HIV-1 gp120 유전자를 표준 PCR법으로 증폭하였다.
프라이머 a (서열 번호 1)
프라이머 d (서열 번호 2)
TA 클로닝을 행하여 NotI로 소화시키고 이것을 NotI로 소화한 “pSeV18+”에 삽입하였다. 이어서, 이 플라스미드로 이. 콜라이(E. coli)를 형질전환시키고 이. 콜라이의 각 콜로니의 DNA를 “Miniprep”법으로 추출하여 DraIII 소화후 전기 영동을 행하고 영동된 DNA 중 삽입에 의해 기대되는 크기의 DNA 단편을 포함하고 있다는 것이 확인된 클론을 선발함으로써 양성 클론을 얻었다(이하, 이 양성 클론을 “클론 9”라 칭한다). 목적하는 염기 서열이라는 것을 확인한 후, 염화 세슘 밀도 구배 원심분리로 DNA를 정제하였다. 또한, 이것에 의해 얻어진 gp120이 삽입된 pSeV18+를 “pSeVgp120”이라 칭한다.
(2) pSeVgp120을 보유하는 센다이 바이러스(SeVgp120)의 재구성 및 gp120 발현의 해석
LLCMK2 세포에 pGEM NP, P, L 외에 다시 pSeVgp120을 도입한 것 이외는 실시예 2와 마찬가지 방법으로 발육 계란의 뇨액을 회수하고 HAU의 측정 및 gp120 발현의 검토(ELISA)를 행하였다. HAU의 측정은 실시예 2와 같은 방법으로 행하였다.
또, ELISA는 이하와 같이 행하였다. HIV-1에 대한 모노클로날 항체가 주입된 96 웰 플레이트에 100 μl의 시료를 첨가하여 37 ℃에서 60분 반응시켰다. PBS로 세정한 후, 100 μl의 HRP 결합 항 HIV-1 항체를 첨가하여 37 ℃에서 60분 반응시켰다. 이것을 PBS로 세정후, 테트라메틸벤티딘을 첨가하여 HRP 활성으로 전환되는 반응 생성물의 양을 산성 조건하에 450 nm의 흡광도로 검출함으로써 gp120의 발현량을 측정하였다. 이 결과를 표 4 좌측에 나타냈다.
또, 얻어진 바이러스액은 CV-1 세포에 감염시켜 동일한 검토를 행하였다. CV-1 세포를 1 플레이트당 5×105 세포가 되도록 주입한 후 생육시켜 배지를 버리고 PBS(-)로 세정하여 감염 다중도 10에서 바이러스액을 첨가하여 실온에서 1시간 감염시켰다. 바이러스액을 버리고 PBS(-)로 세정하여 plainMEM 배지(MEM 배지에 항생 물질 AraC, Rif 및 트립신을 첨가한 것)를 첨가하여 37 ℃에서 48시간 반응시켰다. 반응 후 배지를 회수하고 HAU의 측정(실시예 2와 같은 방법) 및 gp120 발현의 검토(ELISA)를 행하였다. 이 결과를 표 4 중앙에 나타냈다. 또한, CV-1 세포의 배양 상청액을 다시 발육 계란에 접종하고 이것에 의해 얻은 바이러스액의 HAU의 측정 결과 및 gp120 발현의 검토(ELISA) 결과를 표 4 우측에 나타냈다.
뇨장액 (F1)gp120(HAU) CV-1 배지 (F1)gp120(HAU) 뇨장액 (F2)gp120(HAU) 단위: ㎍/ml
0.10(4) 3.46(128) 1.56, 1.21(512, 512)
0.15(32) 1.18(128)
0.05(32) 2.20(128)
표 4에서 밝혀졌듯이, CV-1 세포에서 특히 고농도의 gp120이 생산되고(표 중앙), 또 다시 발육 계란에 접종한 뇨장액으로부터도 고농도의 gp120이 검출되었다(표 우측). 또한, 표 4 좌측과 표 4 중앙에는 3가지 클론의 결과를 나타냈다.
또한, gp120의 발현을 웨스턴 블로팅법으로 해석하였다. SeVgp120을 감염시킨 CV-1 세포의 배지를 20,000 rpm으로 1시간 원심분리하여 바이러스를 침전시키고, 상청액을 TCA(10 %(v/v), 빙상에서 15분) 또는 70 % 에탄올(-20 ℃)로 처리하고 15,000 rpm으로 15분 원심분리하고, 침강된 단백질을 “SDS-PAGE Sample buffer”(다이이찌 가가꾸)와 혼합하여 90 ℃에서 3분간 반응시키고, 10 % 아크릴아미드겔 상에서 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기 영동(SDS-PAGE)을 행하였다. 영동 후, 단백질을 PVDF막(다이이찌 가가꾸)에 전사하고, 모노클로날 항체 902를 실온에서 1시간 반응시켰다. 이어서, T-TBS로 세정하고 항mIgG(애머샴사)를 실온에서 1시간 반응시켜T-TBS로 세정하였다. 다시 HRP 결합 프로테인 A(애머샴사)를 실온에서 1시간 반응시켜 T-TBS로 세정하였다. 여기에 4-클로로-1-나프톨(4CNPlus)(다이이찌 가가꾸)을 첨가하여 gp120을 검출하였다. 그 결과, 예상되는 gp120의 분자량의 위치에 밴드가 검출되었다.
또한, CV-1 세포로의 SeVgp120의 감염 후의 시간과 HAU의 값 및 gp120의 발현량과의 관계를 해석하였다. 10 ㎝ 플레이트에 5×106 세포가 되도록 CV-1 세포를 주입하고 감염 다중도 10에서 SeVgp120을 감염시키고, 그 후 30, 43, 53, 70 시간째에 1 ㎖의 배지를 회수하여 등량의 신선 배지와 혼합하여 HAU의 측정, gp120 발현의 감토(ELISA) 및 웨스턴 프로팅을 행하였다. 이 결과를 도 4에 나타냈다. 도 4에서 밝혀졌듯이, 센다이 바이러스의 HA 타이터의 증가에 따라 gp120 생산량도 증가하는 경향을 나타냈다.
<실시예 6>
각종 형태의 세포에서의 SeVgp120의 증식 및 gp120 발현의 해석
각종 형태의 세포를 사용한 것 이외는 실시예 5와 마찬가지 방법으로 HAU의 측정 및 gp120 발현의 검토(ELISA)를 행하였다. 이 결과를 표 5에 나타냈다.
세포형 시간 (감염후) HAU rgp120 (㎍/ml)
CV-1 96 32 2.5
LLCMK2 48 16 0.5
CHO 55 4 0.46
NIH3T3 48 4 0.25
MT4 24 16 0.8
MOLT4' 24 16 1.2
또한, 표 좌측은 각종 형태의 세포로의 SeVgp120의 감염 후의 시간을 나타냈다. 이 결과 실험을 행한 모든 세포에서 SeVgp120의 증식 및 gp120의 발현이 검출되었다.
<실시예 7>
센다이 바이러스 벡터 내에 삽입한 루시퍼라제 유전자의 숙주내에서의 발현 검토
벡터 삽입용 루시퍼라제 유전자를 단리하기 위하여 하기 30 mer의 프라이머 (서열 번호: 3) 및 69 mer의 프라이머 (서열 번호: 4)를 사용하고 주형으로서 “pHvluciRT4”를 사용하여 표준 PCR법으로 양단에 NotI 부위가 부가된 루시퍼라제 유전자를 단리하였다.
30 mer 프라이머 (서열 번호: 3)
69 mer 프라이머 (서열 번호: 4)
이어서, 이것을 NotI로 소화한 pSeV18+에 삽입하여 루시퍼라제 유전자가 삽입된 센다이 바이러스 벡터를 얻었다. 이어서, LLCMK2 세포에 도입하여 발육 계란에 접종하였다. 발육란의 뇨막을 제거하고 냉 PBS(-)로 2회 세정하여 “lysis buffer”(Picagene WACO) 25 μl을 첨가하여 잘 교반한 후 15000 rpm으로 2분간 원심분리하였다. 상청액 5 μl을 채취하고 기질(IATRON) 50 μl를 첨가하여 96웰 플레이트에 넣어 루미노메타(Luminous CT-9000D, DIA-IARON)로 형광 강도를 측정하였다. 활성은 cps(counts per second)로 표시하였다. 그 결과, 감염 후 24시간째의 CV-1 세포에서 특히 높은 루시퍼라제 활성이 검출되었다(표 6). 또한, 루시퍼라제 유전자가 도입되지 않은 센다이 바이러스를 대조용으로 사용하였다(표 중의 “SeV”로 표시되어 있다). 또, 표에는 2가지 클론의 검출 결과를 나타냈다.
형광 강도 (총수/10초)
뇨장막 CV-1 (감염후 24시간째)
Luc/SeV 669187
2891560 8707815
SeV 69 48
23 49
<산업상 이용 가능성>
(-)쇄 RNA 바이러스 cDNA로부터 고효율로 바이러스 입자를 재구성하는 계를 확립하여 “전파력을 갖는 특정한 (-)쇄 RNA 바이러스에서 유래하는 RNA와, 핵산을 포함하지 않는 바이러스 구조체를 포함하는 복합체로서 세포 감염 능력과 RNA 자율 복제 능력을 갖지만 전파력이 결여된 것”을 제조하여 증폭하는 방법 등을 개발하였다. 이 복합체는 세포에 감염된 후 세포 내에서만 증폭되므로 유전자 치료 등 안전성이 요구되는 분야에서 특히 유용하다.
초기 복제 유전자가 모두 발현되는 숙주에 센다이 바이러스를 도입하여 센다이 바이러스 입자를 재구성하는 방법을 개발하였다. 이에 따라 실용 가치가 높은 (-)쇄 RNA 바이러스 벡터의 제조가 가능해졌다.
서열표
서열 번호: 1
서열의 길이: 38
서열의 형태: 핵산
쇄의 수: 일축쇄
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 합성 DNA
서열
서열 번호: 2
서열의 길이: 69
서열의 형태: 핵산
쇄의 수: 일축쇄
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 합성 DNA
서열
서열 번호: 3
서열의 길이: 30
서열의 형태: 핵산
쇄의 수: 일축쇄
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 합성 DNA
서열
서열 번호: 4
서열의 길이: 69
서열의 형태: 핵산
쇄의 수: 일축쇄
토폴로지: 직쇄상
서열의 종류: 다른 핵산 합성 DNA
서열
도 1은 M 유전자가 결실된 센다이 바이러스 cDNA로부터 본 발명에 포함되는 복합체를 제조하고(A→B의 과정), 다시 그 복합체를 증폭하는 공정(B→C의 과정)을 설명하는 도면이다.
도 2는 pUC18/T7(+)HVJRz.DNA의 구성을 나타내는 도면이다.
도 3은 pUC18/T7(-)HVJRz.DNA의 구성을 나타내는 도면이다.
도 4는 CV-1 세포로의 SeVgp120의 감염 후의 시간과 HAU의 값 및 gp120의 발현량과의 관계를 나타내는 도면이다.

Claims (49)

  1. 전파력을 갖는 특정한 (-)쇄 RNA 바이러스에서 유래하는 RNA와, 핵산을 포함하지 않는 바이러스 구조체를 포함하는 복합체로서, 세포 감염 능력과 RNA 자율 복제 능력을 갖지만 전파력이 결여된 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 특정한 RNA 바이러스가 비분절형 (-)쇄 RNA 바이러스인 것을 특징으로 하는 복합체.
  3. 제1항에 있어서, 특정한 RNA 바이러스가 센다이 바이러스인 것을 특징으로 하는 복합체.
  4. 센다이 바이러스 RNA 또는 센다이 바이러스 cRNA를 포함하는 RNA로서, M, F, HN 단백질에 상당하는 유전자 중 적어도 하나 이상의 유전자가 결실 또는 불활성화되어 있는 RNA.
  5. 제4항에 기재한 RNA와, 센다이 바이러스 유래의 핵산을 포함하지 않는 바이러스 구조체를 포함하는 복합체로서, 세포 감염 능력과 RNA 자율 복제 능력을 갖지만 전파력이 결여되는 복합체.
  6. 제4항에 기재한 RNA를 시험관 내 또는 세포 내에서 전사할 수 있는 주형 DNA를 포함하는 DNA.
  7. 제1 내지 3항 및 5항 중 어느 한 항에 있어서, 복합체 내에 포함되는 RNA가 외래 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 복합체.
  8. 제3 또는 5항에 있어서, 복합체 내에 포함되는 RNA가 외래 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 복합체.
  9. 제4항에 있어서, 외래 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA.
  10. 제6항에 있어서, 외래 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA.
  11. RNA 의존성 RNA 복제를 저해하는 약제를 포함하는, 제1 내지 3항, 5항, 7항 및 8항 중 어느 한 항에 기재한 복합체에 포함되는 RNA 복제 저해제.
  12. 제1 내지 3항, 5항, 7항 및 8항 중 어느 한 항에 기재한 복합체를 전파할 수 있는 숙주.
  13. 제12항에 있어서, 제1 내지 3항, 5항, 7항 및 8항 중 어느 한 항에 기재한 복합체의 감염 능력에 관한 유전자군을 염색체 상에 가지며, 상기 복합체를 감염시켰을 때 상기 복합체와 동일한 것을 복제할 수 있는 것을 특징으로 하는 숙주.
  14. 제12 또는 13항에 있어서, 숙주가 동물, 동물에서 유래한 세포, 동물의 조직 또는 동물의 알인 것을 특징으로 하는 숙주.
  15. 제14항에 있어서, 동물이 포유류인 것을 특징으로 하는 숙주.
  16. 제14항에 있어서, 동물이 조류인 것을 특징으로 하는 숙주.
  17. 제3, 5항 및 8항 중 어느 한 항에 기재한 복합체의 감염 능력에 관한 유전자군을 발현하고 있고, 상기 복합체를 감염시켰을 때 상기 복합체와 동일한 것을 복제할 수 있는 것을 특징으로 하는 숙주.
  18. 센다이 바이러스의 M 유전자, F 유전자, HN 유전자 또는 이들 유전자와 동등한 기능을 갖는 유전자 중 적어도 하나 이상의 유전자를 염색체 상에 갖는 숙주.
  19. 센다이 바이러스의 M 유전자 또는 동등한 기능을 갖는 유전자를 염색체 상에 갖는 숙주.
  20. 센다이 바이러스의 M 유전자, NP 유전자, P/C 유전자 및 L 유전자(각 유전자는 동등한 기능을 갖는 유전자로 치환되어 있어도 좋다)를 염색체 상에 갖는 숙주.
  21. 센다이 바이러스의 M 유전자, F 유전자 및 HN 유전자(각 유전자는 동등한 기능을 갖는 유전자로 치환되어 있어도 좋다)를 염색체 상에 갖는 숙주.
  22. 센다이 바이러스의 M 유전자, F 유전자, HN 유전자, NP 유전자, P/C 유전자 및 L 유전자(각 유전자는 동등한 기능을 갖는 유전자로 치환되어 있어도 좋다)를 염색체 상에 갖는 숙주.
  23. 제17 내지 22항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주가 동물, 동물에서 유래하는 세포, 동물의 조직 또는 동물의 알인 것을 특징으로 하는 숙주.
  24. 제23항에 있어서, 동물이 포유류인 것을 특징으로 하는 숙주.
  25. 제23항에 있어서, 동물이 조류인 것을 특징으로 하는 숙주.
  26. a) 제1 내지 3항, 5항, 7항 및 8항 중 어느 한 항에 기재한 복합체에 포함되는 RNA 또는 상기 RNA의 cRNA, 또는 상기 RNA 또는 상기 cRNA를 생합성할 수 있는 유니트,
    b) 상기 RNA 또는 상기 cRNA의 복제에 필요한 효소군 또는 상기 효소군을 생합성할 수 있는 유니트,
    c) 상기 복합체의 감염 능력에 관한 단백질군 또는 상기 단백질군을 생합성할 수 있는 유니트
    의 3가지를 포함하는 키트.
  27. a) 제1 내지 3항, 5항, 7항 및 8항 중 어느 한 항에 기재한 복합체에 포함되는 RNA 또는 상기 RNA의 cRNA, 또는 상기 RNA 또는 상기 cRNA를 생합성할 수 있는 유니트,
    b) 상기 RNA 또는 상기 cRNA의 복제에 필요한 효소군 또는 상기 효소군을 생합성할 수 있는 유니트,
    c) 제12 내지 25항 중 어느 한 항에 기재한 숙주
    의 3가지를 포함하는 키트.
  28. a) 제1 내지 3항, 5항, 7항 및 8항 중 어느 한 항에 기재한 복합체,
    b) 제12 내지 25항 중 어느 한 항에 기재한 숙주,
    의 2가지를 포함하는 키트.
  29. a) 제3항, 5항 및 8항 중 어느 한 항에 기재한 복합체에 포함되는 RNA 또는 상기 RNA의 cRNA, 또는 상기 RNA 또는 상기 cRNA를 생합성할 수 있는 유니트,
    b) 센다이 바이러스의 NP, P/C, L 단백질의 모두, 또는 상기 단백질군을 생합성할 수 있는 유니트,
    c) 상기 복합체의 감염 능력에 관한 단백질군, 또는 상기 단백질군을 생합성할 수 있는 유니트
    의 3가지를 포함하는 키트.
  30. a) 제3, 5항 및 8항 중 어느 한 항에 기재한 복합체에 포함되는 RNA 또는 상기 RNA의 cRNA, 또는 상기 RNA 또는 상기 cRNA를 생합성할 수 있는 유니트,
    b) 센다이 바이러스의 NP, P/C, L 단백질의 모두, 또는 상기 단백질군을 생합성할 수 있는 유니트,
    c) 제17 내지 25항 중 어느 한 항에 기재한 숙주
    의 3가지를 포함하는 키트.
  31. a) 제3항, 5항 및 8항 중 어느 한 항에 기재한 복합체,
    b) 제17항 내지 25항 중 어느 한 항에 기재한 숙주,
    의 2가지를 포함하는 키트.
  32. 숙주 내에 제26항 a), b) 및 c)에 기재한 3가지를 도입함으로써 제1 내지 3항, 5항, 7항 및 8항 중 어느 한 항에 기재한 복합체를 제조하는 방법.
  33. 제27항 c)에 기재한 숙주내에 제27항 a) 및 b)에 기재한 2가지를 도입함으로써 제1 내지 3항, 5항, 7항 및 8항 중 어느 한 항에 기재한 복합체를 제조하는 방법.
  34. 제28항 a)에 기재한 복합체를 제28항 b)에 기재한 숙주에 감염시킴으로써 상기 복합체를 증폭하여 제조하는 방법.
  35. 숙주내에 제29항 a), b) 및 c)에 기재한 3가지를 도입함으로써 제3항, 5항 및 8항 중 어느 한 항에 기재한 복합체를 제조하는 방법.
  36. 제30항 c)에 기재한 숙주에 제30항 a) 및 b)에 기재한 2가지를 도입함으로써 제3항, 5항 및 8항 중 어느 한 항에 기재한 복합체를 제조하는 방법.
  37. 제31항 a)에 기재한 복합체를 제31항 b)에 기재한 숙주에 감염시킴으로써 상기 복합체를 증폭하여 제조하는 방법.
  38. 제9항에 있어서, M에 상당하는 유전자가 결실 또는 불활성화되어 있는 것을 특징으로 하는 RNA.
  39. 제9항에 있어서, M, F, HN에 상당하는 유전자가 모두 결실 또는 불활성화되어 있는 것을 특징으로 하는 RNA.
  40. a) 제38항에 기재한 RNA,
    b) 제20항에 기재한 숙주,
    c) 제19항에 기재한 숙주
    의 3가지를 포함하는 키트.
  41. 제40항 a)에 기재한 RNA를 제40항 b)에 기재한 숙주에 도입함으로써 얻어지는 복합체를 제40항 c)에 기재한 숙주에 감염시키고 상기 복합체를 증폭하여 제조하는 방법.
  42. 제41항의 방법에 의해 제조된 복합체.
  43. a) 제39항에 기재한 RNA,
    b) 제22항에 기재한 숙주,
    c) 제21항에 기재한 숙주
    의 3가지를 포함하는 키트.
  44. 제43항 a)에 기재한 RNA를 제43항 b)에 기재한 숙주에 도입함으로써 얻어지는 복합체를 제43항 c)에 기재한 숙주에 감염시키고 상기 복합체를 증폭하여 제조하는 방법.
  45. 제44항의 방법에 의해 제조된 복합체.
  46. RNA 의존성 RNA 복제를 저해하는 약제를 포함하는, 제42항 및 45항 중 어느 한 항에 기재한 복합체에 포함되는 RNA 복제 저해제.
  47. 제7항에 기재한 복합체를 숙주에 도입하고, 발현된 외래 단백질을 회수하는 공정을 포함하는 외래 단백질의 제조 방법.
  48. 제47항에 있어서, 숙주가 전파력에 관한 유전자 중 제7항에 기재한 복합체에 포함되는 RNA에 결여되어 있는 유전자군을 발현하고 있는 세포인 외래 단백질의 제조 방법.
  49. 제7항에 기재한 복합체를 숙주에 도입하고, 배양액 또는 장뇨액을 회수함으로써 수득할 수 있는, 발현된 외래 단백질을 포함하는 배양액 또는 장뇨액.
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