CN108603191A - 分子克隆提取和验证方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提取和表征分子克隆的方法。所述方法包括：提供其上形成有分子克隆的基板；以非接触的方式对所述分子克隆中所需要的那些施加能量并从所述基板上提取所需要的分子克隆；将DNA条形码与所提取的分子克隆的碱基序列化学连接；并通过平行测序分析技术分析DNA条形码所连接的碱基序列。

Description

分子克隆提取和验证方法
技术领域
本公开涉及提取和表征分子克隆的方法。
背景技术
抗体是由抗原(例如，病毒和细菌)刺激体内免疫应答而产生的糖蛋白，其特异性结合抗原以诱导细胞外刺激。抗体以高选择性与特定蛋白结合。由于这个原因，抗体在生物学、生物技术和医学领域具有很高的实用性，包括从与目标蛋白标记/观察相关的基础研究到与患者体内异常蛋白活性调节有关的医学应用。特别是，抗体作为抗体药物缀合物(ADC)和嵌合抗原受体-T细胞(CART)治疗剂等下一代新药物平台的应用在近来的新药物开发中不断增加。
一般而言，抗体的有用性取决于它们与靶蛋白结合的能力和特异性。在此，特异性是指抗体结合靶蛋白但不结合其他蛋白的性质。这种结合性质来自抗体的三级结构特征。抗体的三级结构根据抗体的氨基酸序列的变化而改变。通过改变与抗体的特定氨基酸残基对应的脱氧核糖核酸(DNA)序列来修饰抗体的三级结构，和对结构修饰的抗体的表征是抗体工程领域中广泛使用的方法学。这些方法需要对抗体进行测序的技术和选择具有特定序列的DNA分子的技术，这些分子在抗体开发的整个过程中占据非常重要的位置。
通常，通过克隆和Sanger测序来完成抗体的测序和对所需抗体的DNA的选择。但是，它们非常耗费成本和时间，使得难以开发抗体。为了解决这些问题，已经提出了基于下一代测序(NGS)的方法。但是，这些方法只能分析短序列，这限制了它们的实际应用。本发明人进行了研究以克服上述技术限制并以低成本对抗体进行测序。因此，本发明人提出了快速提取分子克隆并在使用分子克隆之前基于DNA条形码和下一代测序(NGS)对分子克隆进行测序的方法。
发明内容
解决问题的方法
本公开提供了用于表征单独分离的分子克隆的方法和系统。传统上，Sanger测序被用作分子克隆测序的工具。近年来，下一代测序已被用于生物学、生物技术和相关领域以及各行各业的各种应用。然而，从经济角度来看，分子克隆的下一代测序的有效性并不令人满意。
根据本发明的一个方面，提供了一种提取和表征分子克隆的方法，所述方法包括：提供其上形成有分子克隆的基板；对所述分子克隆中所需要的那些分子克隆以非接触的方式施加能量从而从所述基板上提取所需要的分子克隆；将DNA条形码与所提取的分子克隆的序列化学连接；并通过平行测序确定DNA条形码连接的序列。
对所需要的分子克隆的非接触提取使得能够快速提取分子克隆，并且不要求使用耗材，因此可以使提取成本最小化。另外，具有已知序列的DNA条形码与分子克隆的接附提供了关于相应分子克隆位置的信息，使得能够通过下一代测序对分子克隆进行测序。根据本公开的方法，可以使用下一代测序替代Sanger测序，从而能够以大幅降低的成本大规模快速分析分子克隆。因此，本公开的方法使得能够以低成本合成DNA核苷酸，并因此预期有助基因合成领域的技术发展。
附图说明
图1是示出根据本公开的一个实施方式的提取和表征分子克隆的方法的流程图。
图2是示出根据本公开的一个实施方式的分子克隆提取和分析方法的示意过程流程图。
图3显示根据本公开的一个实施方式的emPCR产物的图。
图4显示根据本公开的一个实施方式的分子克隆的形状和布置。
图5和6是根据本公开的一个实施方式的分子克隆提取系统的示意图。
图7示出根据本公开的示例性实施方式的提取分子克隆的各种过程的示意图。
图8是示出根据本公开的一个实施方式的接附DNA条形码的过程的示意图。
图9显示实验中采用的DNA条形码的序列。
图10显示根据本公开的示例性实施方式与DNA条形码接附的分子克隆的扩增产物。
图11显示根据本公开的示例性实施方式的的一些平行测序结果。
图12显示根据本公开的示例性实施方式的取出的分子克隆的序列。
具体实施方式
将参考各种实施方式来详细描述本发明。一般提取和表征分子克隆的方法包括1)从微生物例如大肠杆菌获得分子克隆，2)人工提取分子克隆，3)通过培养或DNA扩增(例如聚合酶链式反应(PCR))增加分子克隆中DNA的量，和4)通过Sanger测序分析扩增的DNA。相比之下，本公开的方法使得能够基于分子克隆的非接触提取、DNA条形码编码和下一代测序的融合技术，以与传统方法相比更低的成本，快速获取关于分子克隆序列的信息和取回分子克隆。这些优点归因于分子克隆的非接触式提取和下一代测序的特点。本公开利用所表征的分子克隆的方法使得基因合成比常规方法成本低至少10倍。
现在将参照附图详细描述本发明的实施方式。提供这些实施方式是为了使本公开透彻和完整，并将本发明的范围充分传达给本领域技术人员。因此，本发明可以以许多不同的形式来实施，并且不应该被解释为限于在此阐述的示例性实施方式。在附图中，为了清楚起见，元件的尺寸(例如宽度、长度和厚度)可能被夸大。从观察者的视角解释图纸。应该理解，当元件被称为“在”另一元件“上”时，其可以直接处在另一元件上，或者在两者间也可以存在一个或多个中间元件。
本发明的一个方面提供了一种提取和表征分子克隆的方法。图1是示出根据本公开的一个实施方式的提取和表征分子克隆的方法的流程图。
在步骤S1中，提供其上形成有分子克隆的基板。分子克隆在克隆基础上具有相同的核酸序列信息。分子克隆可以通过在与其他核酸分子物理分离的空间中扩增某些核酸分子而获得。核酸可以包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、异种核酸(XNA)、合成核酸、修饰的核酸及其组合。由于DNA容易在体外或细胞内扩增，核酸优选为DNA。
核酸分子可以通过使用聚合酶的任何合适方法扩增，例如聚合酶链式反应(PCR)、体外转录、逆转录、线性扩增、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)、乳液PCR、使用珠粒的乳液PCR、桥接PCR、细胞内输注、细胞内克隆或其组合。在本公开的方法中可以使用能够分裂的细胞而没有特别的限制。这种细胞的实例包括微生物细胞，如大肠杆菌或酵母细胞，以及哺乳动物细胞。除特殊情况外，使用快速分裂的微生物细胞对于扩增核酸分子是有利的。使用珠粒的乳液PCR或细胞内克隆是优选的，因为所述珠粒或细胞的使用有助于随后提取分子克隆。
所述特殊情况包括蛋白(如抗体)的体内表达、特定基因的表达、特定细胞中的克隆不足、噬菌体或病毒转染入宿主细胞、以及影响细胞中特定序列的酶(例如限制酶或转座因子)的存在。
基板是固态基板，如玻璃或硅。广义而言，基板包括凝胶状基板，如聚丙烯酰胺和琼脂糖。
其他物质如分子或细胞可经由在基板上形成的分子克隆通过键合或吸附而引入到基板上。由于分子克隆可以具有不同的DNA序列或其相应的RNA序列或其蛋白结构，因此可以基于由结构差异产生的化学特征区别于其他文库。基于这个原则，当个体分子克隆分开时，其他文库可以有效地分离。其他文库是指生物化学分子的文库(例如核酸、修饰的核酸、蛋白、肽和脂质体)、化学分子的文库(例如小分子)、病毒文库和细胞文库(例如大肠杆菌、酵母、白细胞、癌细胞和干细胞)。其他文库可包括体积为1aL到1μL的文库。可与基板上形成的分子克隆结合的优选文库是核酸、核酸结合蛋白、用核酸结合蛋白展示的细胞表面、以及与特定表面蛋白结合的蛋白。该组合的优点在于其他文库可以根据其已知的构建和生物化学特性轻松分类。核酸结合蛋白的实例包括锌指和转录激活剂样效应子(TALE)。更广泛地说，核酸结合蛋白可以是RecA、Cas9和通过DNA或RNA与DNA或RNA结合的类似的蛋白，以及转座体。
基板可以选自由从模板复制基板、其中包括牺牲层的基板、涂覆有牺牲层的基板表面以及在电磁场下经历相变的基板组成的组。在提取步骤中将能量施加到基板上时，可以提高这些基板的效率。优选在基板上放置牺牲层，因为牺牲层吸收能量以提高提取效率并减少施加于生物化学分子的能量以使对生物化学分子的损害最小化。牺牲层可以是降低透射率或增加吸收率以增加能量吸收的玻璃或硅层。牺牲层的位置不受限制。例如，牺牲层可以涂覆在诸如玻璃或硅等固体的表面上。作为选择，牺牲层可以存在于诸如玻璃或硅等固体内部。在电磁场下经历相变的基板是指临时或永久液化、汽化或等离子体化的固体基板。从模板复制的基板是指通过大面积转移或复制而制造的基板[Haohao Lin等，Replication of a DNA microarray,JACS 127,11210-11211(2005)；Haohao Lin等，Replication of a DNA microarray from zip code masters,JACS128,3268-3272(2006)]或通过冲压集落板制造的基板。
分子克隆通常在基板上随机排列。当在普通克隆过程中将微生物铺展在琼脂平板上时，通常会发现这种随机排列。在将预定量的珠粒溶液施加到基板上之后，也可以观察到这种排列。但是，当使用微孔作为基板时，可以获得规则排列的分子克隆。分子克隆的规则排列与随机排列相比是有利的，因为可以容易地进行分子克隆的提取和DNA条形码编码。分子克隆与邻近的分子克隆相距至少1μm。这种排列有助于分子克隆的提取。分子克隆具有可以用肉眼或显微镜观察的尺寸。一般而言，出于提取容易性而言，分子克隆具有100μm以下的直径(通常为1μm以上)。例如，分子克隆可以采用直径为100μm以下的微生物集落的形式。
基板可以包括作为规则排列的孔阵列的微孔结构，每个孔具有1μL以下的体积。
术语“规则排列”是指将当斑点的中心点连接时绘制出等腰三角形、直角三角形、等边三角形、菱形、平行四边形、矩形、正方形、正五边形、正六边形或正八边形至正30边形，优选直角三角形、矩形、正方形或正六边形，更优选矩形、正方形或正六边形。规则排列不受限制，并且可包括可以找到规律性的任何设计。斑点之间的间隔可以是1nm至5mm，优选100nm至1mm，更优选300nm至1mm，甚至更优选1μm至500μm，特别是5μm至100μm。
在步骤S2中，对所述分子克隆中所需要的那些以非接触的方式施加能量从而从所述基板上提取所需要的分子克隆。以非接触的方式施加能量可通过选自由以下组成的组的至少一种方式进行：超声波施加、气动压力和激光施加。非接触模式在成本方面是有利的，因为不会引起交叉污染并且消耗品的使用被最小化。
优选的是，以非接触的方式施加能量基于通过入射脉冲激光的脉冲激光烧蚀或辐射压力喷射。在此情况下，一些或所有分子克隆从基板上分离。激光波长的传播方向基本上与分子克隆的移动方向相同，使得更容易取回所分离的克隆。
脉冲激光可以具有10nm至10,000nm、优选20nm至5,000nm、更优选100nm至2,000nm的波长。包括可见光或红外范围的上述定义的波长范围内的电磁场对光学元件没有显著影响，并且能够将足够的能量传递给基板或分子克隆。大多数商用脉冲激光器在上述范围内工作，因此易于实现该系统。此外，当基板使用牺牲层时，可以在系统没有任何实质性改变的情况下进行本公开的方法。
脉冲激光器可以具有在1as至1ms范围内的脉冲持续时间，优选为1fs至100ns。当由具有上述定义范围的脉冲持续时间的脉冲激光进行脉冲激光烧蚀时，分离的基板和分子克隆的传播路径更加恒定，这使得容易取回分子克隆。脉冲激光器具有每脉冲10kJ/cm2至1kJ/cm2的输出，优选每脉冲100kJ/cm2至300J/cm2。当脉冲激光烧蚀通过具有上述范围内的脉冲持续时间和脉冲输出的脉冲激光进行时，分子克隆的核酸分子受损坏较小，在分离的核酸的后续处理过程中带来高效率。
将需要的分子克隆与基板分离包括将需要的分子克隆转移到储库。转移到储库对于存储分离的分子克隆并在与其他反应物反应时使用该分子克隆是必要的。该储库可以包括设计用于引起或观察物理或化学反应的容器。该储库可以包括设计用于储存生物化学分子的容器。容器的体积为1aL至1L，优选1fL至10mL，更优选1pL至500μL，这对应于分子克隆和通过生物化学反应分离的核酸的后处理可以最容易地执行的反应体积。储库可以是微孔阵列，每个微孔具有1pL至1μL的体积[David K.Wood等，Single cell trapping and DNAdamage analysis using microwell arrays,PNAS(2010)]。该阵列结构可以减少分离的分子克隆和核酸的化学反应的反应体积，以使试剂的浪费最小化。另外，可以预期在一些反应中提高反应速率和效率。
通过将一些或全部的分子克隆转移到储库中，从而使所需要的分子克隆与基板分离。部分分子克隆的分离使得能够一次或多次使用相应的分子克隆。因此，当后面需要相同的分子克隆时，所提取的分子克隆可以快速地从先前确定的储库的相应位置取回。所需要的分子克隆可以分开储存在一个储库中，并因此可以诱导分子克隆和核酸之间的化学反应。
用于提取分子克隆的工具可以与用于图像观察和存储的系统组合或连接。该工具可以与运算单元相结合，该运算单元可以驱动用于分析图像的对象识别算法，以确定分子克隆的形状和位置。这些要素对于分子克隆的自动提取是必不可少的。
提取工具可以与用于移动工具的装置组合。该装置可以是电驱动的。该装置优选以1mm以下、更优选100μm以下、甚至更优选5μm以下的精度操作。由于大多数微阵列中斑点间的间隔为5μm至100μm，因此以5μm以下的精度操作的电驱动装置能够在大多数微阵列中准确分离所需要的分子克隆。
提取的分子克隆可以是微生物或细胞的形式。在这种情况下，本公开的方法可以进一步包括在储库中填充培养基并培养该分子克隆以扩增分子克隆中核酸的量。
在步骤S3中，DNA条形码与所提取的分子克隆的序列化学连接。例如，DNA条形码可以化学连接到每个分子克隆序列的两端。优选的是，化学连接用酶进行。适用于化学连接的酶的实例包括聚合酶、连接酶和转座子(例如Tn5)。
就加工和经济效率而言，酶优选为聚合酶。一般而言，提取的分子克隆中的核酸含量处于飞摩尔(fmole)水平以下，使得难以在不扩增的情况下使用分子克隆。由于核酸需要扩增以用于后续加工，因为聚合酶能够将条形码同时连接至核酸并扩增核酸而优选使用该酶。当分子克隆中存在的核酸，特别是DNA或RNA是环形而不是线形时，不可能使用连接酶作为酶。另外，由于聚合酶的纯化容易，所以，通常以与其他酶相比低的成本生产聚合酶。使用聚合酶的合适的条形码编码方法包括聚合酶链式反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、多重置换扩增(MDA)和组装PCR(也称为PCA或重叠延伸PCR)。
优选的是，DNA条形码具有由5个以上碱基、优选7个以上碱基组成的序列。使用微阵列的平行DNA合成能够合成DNA，例如约10,000种不同的DNA，并且还将抗体文库的复杂性增加至至少10,000。因此，需要确保足够数量的不同DNA条形码可接附在10,000个以上的分子克隆上。由于条形码能够接附在每个分子克隆的两端，因此当考虑终端条形码的组合数时，需要至少100个条形码。序列由至少4个碱基组成，但考虑到测序错误、条形码接附的容易性、以及由条形码二级结构引起的潜在问题，有利的是构建条形码以使序列由5个以上碱基或7个以上碱基组成。
优选的是，3个以上碱基的均聚物不包括在条形码中。条形码中GC的比例约为30％至70％。这个比例有助于进行条码编码的分子生物学实验。某种条形码被设计成不与其他条形码共享5个以上的碱基。这种设计可以克服由DNA合成错误导致的条形码分析中的困难。
建议使用两组以上条形码以增加可由DNA条形码表示的例数。例如，在由96种条形码组成的组A和由96种条形码组成的组B连接到由分子克隆产生的DNA的末端的情况下，从192种条形码可以得到共96×96＝9216种编码。当使用利用2组以上DNA条形码的组合条形码编码时，不需要将来自不同组的DNA条形码以一对一的关系连接到核酸分子的末端。来自不同条形码组的条形码可以串联连接到每个核酸分子的一端。
多重PCR和聚合酶可用于连接条形码。多重PCR(multiplex PCR)是指使用两对以上引物或扩增两种以上不同区域的PCR技术。在许多情况下，scFv的编码抗体或氨基酸的DNA的长度大于一般新一代测序技术一次可读的DNA的长度。因此，需要分别扩增抗体的组成DNA的部分以确定抗体的全长序列。多重PCR是用于此目的的最佳技术。
在步骤S4中，DNA条形码连接的序列通过平行测序确定。例如，通过合成测序、通过连接测序、以及来自Illumina的HiSeq和MiSeq、来自Life Technology的IonTorrent和来自Roche的454的纳米孔测序可用于平行测序。提取的分子克隆在步骤S2中被放置在不同的储库中，并且在步骤S3中被偶联到DNA标签上。相应地，在步骤S4中，可以基于获得的信息确定哪些序列位于储库中。
在步骤S5中，取回通过平行测序分析的分子克隆中的特定那些。选择具体的分子克隆有多种标准。通常，选择特定的分子克隆用于蛋白表达、RNA表达和插入载体中。特别感兴趣的分子克隆(或经济上有用的分子克隆)优先选择。取回的分子克隆可能是条形码编码的线性dsDNA的形式。在分子克隆为微生物或细胞形式的情况下，分子克隆可以通过提取分子克隆并获取培养液中残留的微生物或细胞来取回。通过平行排序获得的信息包含特定序列的信息和关于条形码的信息，所述条形码与存在具有相应序列的分子克隆的储库的位置相对应。因此，通过条形码信息确定储库的位置，可以取回具体的分子克隆。
分子克隆可通过从条形码编码的分子克隆中去除DNA条形码而被取回。在这种情况下，通常使用通用引物再一次对DNA条形码接附的分子克隆进行PCR，以去除条形码编码的区域。当打算使用取回的分子克隆用于基因合成等特殊目的时，其中保留DNA条形码的相应分子克隆的组装产物可能会产生除期望序列以外的不需要的产物。因此，当分子克隆被取回时优选去除DNA条形码以便用于特定应用。
此外，本公开的方法可以还包括使用取回的分子克隆的DNA来表达和产生RNA或蛋白。
体外转录系统可用于RNA表达，并且体外转录/翻译系统可用于蛋白表达。
蛋白的表达和产生可以使用细胞或噬菌体完成。合适的细胞的实例包括但不限于大肠杆菌、酵母和CHO细胞。主要使用具有在其表面表达蛋白的功能的噬菌体。M13是噬菌体的代表物种。其他种类的噬菌体也可以使用。多种蛋白表达载体可用于蛋白表达。当使用噬菌体时，pComb3X可以用作载体。该载体有利于在噬菌体表面上表达蛋白并在大肠杆菌中繁殖噬菌体。
本公开的方法可以进一步包括使用蛋白进行各种分析。在步骤S5中，通常有选择地取回具有潜在工业价值的分子克隆。然而，有选择地取回的分子克隆需要实际验证其有用性。因此，有必要使用分子克隆表达蛋白并分析蛋白的各种特征。通常重要的是蛋白的结构特征以及由于蛋白的结构特征导致的蛋白与其他物质(例如病毒蛋白)的结合强度。X射线晶体学可用于研究蛋白的结构特征。蛋白的结构也可以通过模拟来分析。
表达的蛋白与其他物质的结合强度优选通过酶联免疫吸附测定(ELISA)技术来确认。也可以通过在不使用酶的情况下将荧光分子连接到抗原蛋白并直接观察荧光来确认结合强度。ELISA技术可以是使用微流体和微电机系统(MEMS)的微孔ELISA，但不限于此。微孔ELISA具有节约成本的优势。可以使用从直接模式、夹心模式和竞争模式中选择的适当模式来选择特定分子克隆。
根据一个实施方式，本公开的方法可以进一步包括：选择性地仅取回所表征的分子克隆中所需要的那些，并使用所需要的分子克隆用于靶标测序，用于构建外显子组或整个外显子组测序(WES)的捕获探针或基因合成。例如，通过对选择性取回的分子克隆进行扩增、转录和与gDNA杂交，可以选择性取回特定序列。通过分析取回的特定序列，可以有效地进行靶标测序或外显子组测序。特别地，由于各个捕获探针彼此分离，捕获效率可以通过改变捕获探针的浓度来有意地进行控制。
分离的核酸可以通过选自扩增、连接、组装PCR、等温组装[Daniel G Gibson等,Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases,NatureMethods 6,343-345(2010)]和配对式组装[William J.Blake等,Pairwise selectionassembly for sequence-independent construction of long-length DNA,NucleicAcids Research 38,2594-2602(2010)]中的至少一种方法组装成基因。
根据一个实施方案，取回的分子克隆可被克隆到pComb3X中，在大肠杆菌中转化，并在噬菌体中表达以确定它们对抗原的结合强度。
图2是说明根据本公开的一个实施方式的分子克隆提取和测序方法的流程图。图2的(a)显示通过emPCR形成分子克隆的过程。该过程可以使用诸如微生物细胞等细胞通过克隆来进行。DNA通常用作核酸以形成分子克隆。DNA可以在微阵列中合成或可以是抗体文库DNA。图2(b)显示了分子克隆的提取过程。图2(a)所示的过程中形成的分子克隆被固定在基板上，使用脉冲激光系统以非接触方式与基板分离，并转移到位于下方的储库中。图2的(c)示出了将不同的DNA条形码结合到从基板提取并转移到储库中的分子克隆的过程。一般而言，分子克隆附有不同的能够特异性标记孔的条形码。图2的(d)示出了通过平行测序获取关于序列的信息以及关于与该序列对应的条形码的信息的过程。对于抗体，可以分开获取关于VH区的信息和关于VL区的信息，并且可以在随后的过程中通过生物信息学方法经由条形码重建VH和VL的序列。图2(e)表示取回分子克隆并通过ELISA表征抗体的过程。
图3显示了根据本公开的一个实施方式的emPCR产物的图像。对捕获在乳液中的1至3个珠粒进行PCR。每个珠粒平均具有0.1个DNA分子。因此，大部分珠粒构成单分子克隆。
图4显示了根据本公开的一个实施方式的分子克隆的形状和排列。图4(a)表示在将预定量的珠粒溶液施加到基板上后发现的分子克隆的随机排列。分子克隆通过使用珠粒的乳液PCR(emPCR)形成。图4(b)显示了大肠杆菌细胞逐个接种在规则排列的微孔中后，通过培养形成的分子克隆。在图4的(a)和(b)中，分子克隆由于其尺寸大(约100μm)而容易以非接触模式分离。培养大肠杆菌细胞的空间可能没有规律地排列。在这种情况下，小菌落形成简单，但大肠杆菌的位置需要通过图像处理来确认。
图5和图6是根据本公开的一个实施方式的提取分子克隆系统的示意图。该系统包括：其上安装有与分子克隆结合的基板的平台；用于以非接触的方式对分子克隆中所需要的那些施加能量以从基板上分离所需要的分子克隆的提取单元；以及用于定位基板使得基板的特定区域对应于提取单元以分离所需要的分子克隆的控制单元。
根据一个实施方式，提取单元可以包括脉冲激光源和聚光器(condenser)。该聚光器优选是光学透镜。光学透镜可用于聚焦脉冲激光能量并观察分子克隆和基板。可以将脉冲激光器在所需的时间点准确地照射到要在基板上分离的分子克隆的位置上，这通常使用计算机等控制单元通过控制脉冲激光器进行。光学透镜可以具有范围从2倍到100倍、优选从10倍到40倍的放大率。在此范围内，适合分离分子克隆的能量可以传输到基板，并且可以防止透镜与微阵列基板接触或减小焦距。
根据一个实施方式，提取系统的平台、提取单元和控制单元中的至少一个可以以1mm、优选100μm、更优选1μm以下的精度进行操纵。由于大部分分子克隆之间的间隔为1μm或以上，因此可以在1μm以下的精度上操作的平台、提取单元和控制单元能够在大多数基板上精确分离所需的分子克隆。
根据一个实施方式，该系统可以还包括用于观察基板以便分离所需要的分子克隆的成像单元。成像单元可以由选自光学透镜、光源和图像传感器中的一个或多个元件组成。光学透镜可以包括在提取单元中。如果需要，可以进一步使用单独的光学透镜。
光源具有10nm至10,000nm、优选50nm至2,000nm、更优选100nm至1,500nm范围内的波长。在此范围内，可以使用荧光或可见光最容易地观察或监视基板。光源可以是例如卤素灯。
图像传感器通常是电荷耦合器件(CCD)，但不限于此。可以在步骤S2中使用图像传感器，获取基板上的分子克隆中所需要的那些分子克隆所位于的各个斑点的位置，并确认斑点是否存在于所述位置中。在步骤S2中可以使用成像单元来确认是否准确定位了用于施加能量以根据位置信息分离所需要的分子克隆的提取工具。在步骤S2中可以使用成像单元来确认从基板分离的所需要分子克隆是否存在于储库中。
根据一个实施方式，该系统可以进一步包括安装用于取回分离的所需要分子克隆的储库的另一平台。该平台可以以1mm以下、优选100μm以下，更优选1μm以下的精度进行操纵。安装储库的额外平台可以促进对分离的生物化学分子的利用。具有1μm以下的精确度的平台能够将生物化学分子分离到具有微孔阵列的储库中，每个微孔具有1pL到1μL的体积。
图5所示的提取系统大致分为上部系统和下部系统。上部系统由计算机控制，由其下连接基板的上部平台(电动XY台)、能源施加装置和上部成像装置组成。
根据一个实施方式，脉冲激光束通过聚光器聚焦并进入基板，基板上的分子克隆通过脉冲激光烧蚀或辐射压力导致的膨胀压力而被提取并推送至处于下方作为储库的PCR板中。聚光器可以是光学透镜。例如，光学透镜可以具有2倍到100倍的放大率。下部系统包括可在Z轴方向移动的下部平台(电动XYZ平台)，下部平台上安装的作为储库的PCR管架或PCR板，以及下部成像装置。在下部成像装置中，当从基板分离的分子克隆被收集时或者为了确定孔的物理参考位置，图像可以通过其传送的储库可以用于光学观察。例如，储库包括各种收纳工具。该储库可以是由透明塑料材料制成的平底储库或平底PCR板。储库的平坦底部基本上不影响来自下部成像装置的光源的光的路径，使得能够容易地成像。
图6是显示根据本公开的一个实施方式的分子克隆提取原理的示意图。脉冲激光的使用使得能够通过各种作用机制提取分子克隆。所述机制的代表性实例包括脉冲激光烧蚀和辐射压力喷射。
图7示出了根据本公开的示例性实施方式的用于提取分子克隆的各种过程的示意图。图7的(a)表示直接将激光照射到分子克隆(聚集体)上以提取分子克隆的过程。图7的(b)示出了通过将分子克隆接附到涂覆有牺牲层的基板上并将激光照射到牺牲层上来提取分子克隆的过程。根据该过程，动能可以通过牺牲层转移，从而允许提取难以用激光直接提取的分子克隆。图7的(c)示出了在透镜、基板和分子克隆被反转的状态下提取分子克隆的过程。当需要控制提取的分子克隆在微流体通道中的运动时，该过程是有用的。图7的(d)示出了提取各种分子克隆并将所提取的分子克隆收集在一个储库中的过程。图7的(e)示出了提取具有不同尺寸的分子克隆(各种微阵列碎片)并收集在一个或多个储器中的过程。图7(f)表示用激光照射时，利用存在于不透明基板上的分子克隆反射的光提取分子克隆的过程。在该过程中，如图7(f)所示，由于光不透过不透明基板，所以需要改变激光照射的方向和基板上的分子克隆的位置。图7(g)显示了提取复制的分子克隆的过程。根据这个过程，在完成随后的平行测序之后，当预定取回特定分子克隆时，预先复制由分子克隆形成的基板。复制的基板的使用允许在非接触模式下快速取回特定分子克隆。
图8是说明根据本公开的一个实施方式的用于接附DNA条形码的过程的示意图。DNA条形码通过正向引物和反向引物的组合接附。少量引物(n为正向引物，m为反向引物，总共n+m)的组合可以给出大量的特定条形码(n×m)。通常，一侧的条形码表示孔板的数量，另一侧的条形码表示孔板上的孔的数量。
图9显示了实验中使用的示例性DNA条形码的序列。每个条形码由对应条形码编号的7个不同的碱基组成，其序列没有特定碱基的重复。条形码序列通常位于碱基序列的5'末端(图9中的碱基序列的左侧)。这有助于从平行测序结果中识别条形码。但是，条形码的位置可能会有所不同，具体取决于测序仪的特性。
图10显示根据本公开的示例性实施方式的与DNA条形码接附的分子克隆的扩增产物。
图11显示了根据本公开的示例性实施方式的一些平行测序结果。图11所示的每一条全长序列分为条形码的序列和分子克隆的核酸序列。提取的分子克隆的位置和序列可以通过测序和条形码编码确定。
图12显示了根据本公开的示例性实施方式的取回的分子克隆的序列。最上面的一行(样品名称：77(参考))显示了平行测序结果，其余的行显示了在克隆到大肠杆菌中后取回的分子克隆的序列。取回的分子克隆的序列由Sanger测序确定。从图12可以看出，平行测序结果与取回的分子克隆的实际序列相同，表明本公开可用于抗体测序或基因合成。
当本公开用于基因合成时，可以以低成本分析分子克隆的序列，导致基因合成总成本的显著降低。
本公开也可用于靶标测序或构建用于外显子组或全外显子组测序(WES)的捕获探针。例如，通过表征所需要的分子克隆，选择性地取回所需要的分子克隆，并使取回的分子克隆进行扩增、转录和与gDNA杂交，可以选择性地取回特定的序列。通过分析取回的特定序列，可以有效地进行靶标测序或外显子组测序。
本公开可用于抗体的合成和表征。例如，从抗体表达微生物、噬菌体或病毒中获得分子克隆，测量分子克隆与特定抗原的抗体结合特性，提取分子克隆中所需要的那些并测序，从而由所需要的分子克隆合成具有所需特征的新抗体，并对抗体进行表征。
作为另一实例，通过从抗体表达细胞或噬菌体中提取获得分子克隆，将DNA条形码接附于分子克隆并通过NGS分析，将感兴趣的分子克隆取回并插入到pComb3x中以产生抗体或scFv蛋白，表征抗体或蛋白，并且表征具有良好结合特性的蛋白和编码其的DNA序列。
与从测序基板中提取DNA的方法相比，本发明具有以下优点。
第一，从测序基板中提取DNA的方法在选择可用的下一代测序平台方面存在限制。例如，在Roche 454测序仪中使用激光可以容易地提取DNA，但是难以将提取技术应用于基于使用不透明基板(例如，Ion Torrent Proton)的半导体芯片的测序系统、使用流体通道的通用纳米孔系统或基于玻璃基板的Illumina系统。相比之下，本公开的方法利用仅用于测序的NGS平台，避免了考虑提取DNA的容易性的需要。因此，本公开的方法可以应用于所有测序系统。
第二，从测序基板提取的DNA应经扩增以用于下游应用。一般来说，由于DNA非常稀有，它们扩增的成功率应该提高到100％左右。这涉及相当多的经济和时间上的努力，结果是整个程序的成本增加。与此相反，本公开的方法可以将时间和试剂的消耗量减少到一半以下，同时保持80％以上的扩增成功率，从而降低总成本。
第三，本公开的方法可以潜在地应用于任何类型的分子克隆，因为它不受测序平台的影响。特别是，本公开的方法可以使用传统上用于分子生物学领域的微生物。例如，根据本公开，微生物可以用于通过表面展示来研究蛋白(包括抗体)。本公开的方法在分子克隆复制期间的准确性比诸如PCR等体外扩增方法高至少10倍。
尽管已经参考本发明的实施方式详细描述了本发明，但是本领域技术人员将认识到，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以对实施方式进行各种修改。

Claims (17)

1.一种提取和表征分子克隆的方法，所述方法包括：提供其上形成有分子克隆的基板；对所述分子克隆中所需要的那些分子克隆以非接触的方式施加能量从而从所述基板上提取所需要的分子克隆；将DNA条形码与所提取的分子克隆的序列化学连接；并通过平行测序确定DNA条形码连接的序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述分子克隆由微生物形成。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述分子克隆通过emPCR形成。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述分子克隆采取直径为100μm以下的微生物集落的形式。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述基板选自由以下组成的组：从模板复制的基板、其中包括牺牲层的基板、涂覆有牺牲层的基板表面和在电磁场下经历相变的基板。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述基板包括作为规则排列的孔阵列的微孔结构，每个孔具有1μL以下的体积。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述以非接触的方式施加能量通过选自由以下组成的组的至少一种方式进行：超声波施加、气动压力和激光施加。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述以非接触的方式施加能量基于通过入射脉冲激光的脉冲激光烧蚀或辐射压力喷射。
9.如权利要求1所述的方法，其中，所述化学连接利用酶进行。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述酶是聚合酶。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述条形码通过多重PCR利用所述聚合酶连接。
12.如权利要求1所述的方法，其中，所述DNA条形码化学连接到每个所提取的分子克隆的序列的两端。
13.如权利要求1所述的方法，其中，所述化学连接利用两组以上DNA条形码通过组合条形码编码进行。
14.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括仅取出通过平行测序分析过的所述分子克隆中的特定分子克隆。
15.如权利要求14所述的方法，所述方法还包括利用所取出的分子克隆的DNA表达和产生RNA或蛋白。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述蛋白表达和产生使用细胞或噬菌体完成。
17.如权利要求15所述的方法，所述方法还包括分析所表达的蛋白的结构特征或者所表达的蛋白与其他物质的结合强度。
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JUNAID ZIAUDDIN ET AL.: "Microarrays of cells expressing defined cDNAs", 《NATURE》 *
POORNIMA PARAMESWARAN ET AL.: "A pyrosequencing-tailored nucleotide barcode design unveils opportunities for large-scale sample multiplexing", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *

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