JP2005287499A - 塩基多型の同定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む核酸配列に対し、3’末端から5番目までの塩基のうち、少なくとも一つの塩基がDNA型塩基またはRNA型塩基と相互作用のない置換基に置換されていることを特徴とする野生型検出用オリゴヌクレオチド及び1種又は2種の変異型検出用オリゴヌクレオチドを同時に又は別々に反応させることにより塩基多型を同定する方法。DNA型塩基またはRNA型塩基と相互作用のない置換基は好ましくはイノシンである。
Description
ヘアピン構造の欠点は、安定性が非常に高く、非消光ハイブリッド形成型への変換がしばしば遅く、僅かにそちらに偏るだけで、一般的に性能は低い。
この方法においても二重標識検出プローブを塩基多型特異的プローブとすることで塩基多型の同定が可能である。
たとえば電気泳動法によれば野生型及び多型を別々に検出する必要がありまた泳動像から核酸量を正確に数値化することは困難である。またサザンブロット法やサンドイッチハイブリダイゼーション法ではプローブとのハイブリダイゼーション反応が必要であり、その条件を厳密に整える必要がある。更には過剰なプローブを除去する工程が必要であり、操作は非常に煩雑である。
(1) 試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む核酸配列に対し、3’末端から5番目までの塩基のうち、少なくとも一つの塩基がDNA型塩基またはRNA型塩基と相互作用のない置換基に置換されていることを特徴とする野生型検出用オリゴヌクレオチド及び1種又は2種の変異型検出用オリゴヌクレオチドを同時に又は別々に反応させることにより塩基多型を同定する方法。
なお、イノシンは糖の部分も含んだものであり、本発明でいう置換基部分は正式には6−ヒドロキシプリン−9−イルであるが、ここでは、分かりやすいよう、この置換基をイノシンと表現する。上記の他の標記も糖やリン酸部を含むものも含有する場合もあるが、同様である。
本発明において、オリゴヌクレオチドの伸長方法は、基本的には、従来の方法を用いて行うことができる。通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、4種類のデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)及びDNAポリメラーゼと共に、野生型用オリゴヌクレオチドと、1種又は2種の変異型用オリゴヌクレオチドを同時又はそれぞれ別個に用いて作用させることで、標的核酸を鋳型としてオリゴヌクレオチドが伸長する。
本発明において核酸特異標識物質は標識オリゴヌクレオチドの増幅反応によって得られた核酸に特異的に結合し、該オリゴヌクレオチドの標識と相互作用すれば何でもよく、好ましくは2本鎖核酸に特異的な標識が好ましい。2本鎖特異標識としては2本鎖にインターカーレートするサイバーグリーンI、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ローダミン等があるがこの限りではない。
ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。
放射性物質としては、32P、35Sなどが挙げられる。 発光団としては、ルテニウムなどが挙げられる。
野生型用オリゴヌクレオチドと変異型用オリゴヌクレオチドに異なる標識を用いた場合には、1回で検出が可能である。
本発明において、キットとしては、野生型検出用オリゴヌクレオチド及び1種又は2種の変異型検出用オリゴヌクレオチド、DNAポリメラーゼ、4種類のデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)を含む塩基多型検出用試薬キットを含むものである。
増幅によって検出する場合には、更に、リバースオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。
また、該各オリゴヌクレオチドは、予め上述したような酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などによって標識されていてもよい。
(1)β3 adrenergic receptor遺伝子の190番目の多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号1〜3に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド(以下、オリゴ1〜3と示す)を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社OPCカラムにて実施した。もしくはDNA合成受託会社((株)日本バイオサービス、(株)サワディー、GENSET KK、アマシャムファルマシア バイオテク(株)等)に依頼した。
オリゴ2 gtcatcgtgg ccatcgcicg
オリゴ3 acgaacacgt tggtcatggt
<1> PCR法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりヒトβ3 adrenergic receptor遺伝子の塩基多型 (Trp64Arg)を解析した。
以下の試薬を含む25μl溶液を調製した。
Taq DNAポリメラーゼ反応液
オリゴ1および/または2 5 pmol
オリゴ3 (未標識) 5 pmol
×10緩衝液 2.5 μl
2mM dNTP 2.5 μl
25 mM MgCl2 1.5 μl
Taq DNAポリメラーゼ 1.3 U
抽出DNA溶液 100 ng
95℃・5分
95℃・30秒、62.5℃・30秒、72℃、30秒(35サイクル)
72℃・2分。
上記<1>の増幅反応液5μlを SYBR GreenI(Molecular probes社)の溶液100μlに加えて、室温にて10分間反応させた。これによって、増幅されたヒトβ3 adrenergic receptor 遺伝子断片中にSyber Green Iが取り込まれる。
次に、暗室中で蛍光プレートリーダー(大日本製薬社)で蛍光強度量を測定した。
所要時間は数分であった。
得られた蛍光強度から、以下の計算式を用いて試料の蛍光強度量を算出した。
結果を表1に示す、また、判定結果を図1に示す。
[式1]
FL1(野生型検出用オリゴヌクレオチドを用いて得られた試料の蛍光強度)
=FLs1-FLb1
FLb1:Negative Control (試料が未添加)の励起波長:355/蛍光波長538
における蛍光強度
FLs1:各試料の励起波長:355/蛍光波長538における蛍光強度
[式2]
FL2(変異型検出用オリゴヌクレオチドを用いて得られた試料の蛍光強度)
=FLs2-FLb2
FLb2:Negative Control (試料が未添加)の励起波長:355/蛍光波長538
における蛍光強度
FLs2:各試料の励起波長:355/蛍光波長538における蛍光強度
N-アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子の塩基多型(G857A)の検出
(1)N-アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子の857番目の多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、
配列番号4〜6に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド(以下オリゴ4〜6)を
合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社のOPCカラムにて実施した。これらのオリゴヌクレオチドはDNA合成受託会社((株)日本バイオサービス、(株)サワディー、プロリゴ、シグマジェノシス)へ委託合成することも可能である。
<1>PCR法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロホルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりN-アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子の塩基多型(G857A)を解析した。
以下の試薬を含む25μl溶液を調製した。
オリゴ4および/または5 5pmol
オリゴ6 5pmol
×10緩衝液 2.5μl
2mM dNTPs 2.5μl
25mM MgCl2 2.5μl
Taq DNAポリメラーゼ(東洋紡績社製)1.3u
抽出DNA 100ng
95℃・5min
95℃・30sec.、65℃・30sec.、72℃・30sec.(35サイクル)
72℃・2min.
<2>の増幅反応液5μlをSYBR GreenI(Molecular probes社)の溶液100μlに加えて、室温にて10分間反応させた。これによって増幅されたN−アセチルトランスフェラーゼ2遺伝子断片中にSYBR GreenIが取り込まれる。
次に、暗室中で蛍光プレートリーダー(大日本製薬社製)で蛍光強度を測定した。所要時間は数分であった。
得られた蛍光強度から、前述の計算式を用いて試料の蛍光強度量を算出した。結果を表2に示す。
Helicobacter pyloriの23srRNA遺伝子塩基多型(A2142G)の検出
(1)Helicobacter pyloriの23srRNA遺伝子の2142番目の多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、
配列番号7〜9に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド(以下オリゴ7〜9)を
合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社のOPCカラムにて実施した。これらのオリゴヌクレオチドはDNA合成受託会社((株)日本バイオサービス、(株)サワディー、プロリゴ、シグマジェノシス)へ委託合成することも可能である。
<1>PCR法による増幅反応
胃生検材料からフェノール・クロロホルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりHelicobacter pyloriの23srRNA遺伝子の2142番目の多型を解析した。
以下の試薬を含む25μl溶液を調製した。
オリゴ7および/または8 5pmol
オリゴ9 5pmol
×10緩衝液 2.5μl
2mM dNTPs 2.5μl
25mM MgCl2 2.5μl
Taq DNAポリメラーゼ(東洋紡績社製)1.3u
抽出DNA 100ng
95℃・5min
95℃・30sec.、65℃・30sec.、72℃・30sec.(35サイクル)
72℃・2min.
<1>の増幅反応液5μlをSYBR GreenI(Molecular probes社)の溶液100μlに加えて、室温にて10分間反応させた。これによって増幅されたHelicobacter pyloriの23srRNA遺伝子断片中にSYBR GreenIが取り込まれる。
次に、暗室中で蛍光プレートリーダー(大日本製薬社製)で蛍光強度を測定した。所要時間は数分であった。
得られた蛍光強度から、前述の計算式を用いて試料の蛍光強度量を算出した。結果を表3に示す。
Helicobacter pyloriの23srRNA遺伝子塩基多型(A2143G)の検出
(1)Helicobacter pyloriの23srRNA遺伝子の2143番目の多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、
配列番号10〜12に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド(以下オリゴ10〜12)を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社のOPCカラムにて実施した。これらのオリゴヌクレオチドはDNA合成受託会社((株)日本バイオサービス、(株)サワディー、プロリゴ、シグマジェノシス)へ委託合成することも可能である。
<1>PCR法による増幅反応
胃生検材料からフェノール・クロロホルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりHelicobacter pyloriの23srRNA遺伝子の2143番目の多型を解析した。
以下の試薬を含む25μl溶液を調製した。
オリゴ10および/または11 5pmol
オリゴ12 5pmol
×10緩衝液 2.5μl
2mM dNTPs 2.5μl
25mM MgCl2 2.5μl
Taq DNAポリメラーゼ(東洋紡績社製)1.3u
抽出DNA 100ng
95℃・5min
95℃・30sec.、65℃・30sec.、72℃・30sec.(35サイクル)
72℃・2min.
<2>の増幅反応液5μlをSYBR GreenI(Molecular probes社)の溶液100μlに加えて、室温にて10分間反応させた。これによって増幅されたHelicobacter pyloriの23srRNA遺伝子断片中にSYBR GreenIが取り込まれる。
次に、暗室中で蛍光プレートリーダー(大日本製薬社製)で蛍光強度を測定した。所要時間は数分であった。
得られた蛍光強度から、前述の計算式を用いて試料の蛍光強度量を算出した。結果を表4に示す。
シトクロムP4502D6*2遺伝子の塩基多型(C2850T)の検出
(1)シトクロムP4502D6遺伝子の2850番目の多型を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製DNAシンセサイザー392型を用いて、ホスホアミダイト法にて、
配列番号13〜15に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド(以下オリゴ13〜15)を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社のOPCカラムにて実施した。これらのオリゴヌクレオチドはDNA合成受託会社((株)日本バイオサービス、(株)サワディー、プロリゴ、シグマジェノシス)へ委託合成することも可能である。
<1>PCR法による増幅反応
ヒト白血球からフェノール・クロロホルム法により抽出したDNA溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりシトクロムP4502D6遺伝子の塩基多型(C2850T)を解析した。
以下の試薬を含む25μl溶液を調製した。
オリゴ13および/または14 5pmol
オリゴ15 5pmol
×10緩衝液 2.5μl
2mM dNTPs 2.5μl
25mM MgCl2 1.5μl
Taq DNAポリメラーゼ(東洋紡績社製)1.3u
抽出DNA 100ng
95℃・5min
95℃・30sec.、65℃・30sec.、72℃・30sec.(35サイクル)
72℃・2min.
<1>の増幅反応液5μlをSYBR GreenI(Molecular probes社)の溶液100μlに加えて、室温にて10分間反応させた。これによって増幅されたシトクロムP4502D6遺伝子断片中にSYBR GreenIが取り込まれる。
次に、暗室中で蛍光プレートリーダー(大日本製薬社製)で蛍光強度を測定した。所要時間は数分であった。
得られた蛍光強度から、前述の計算式を用いて試料の蛍光強度量を算出した。結果を表5に示す。
Claims (15)
- 試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む核酸配列に対し、3’末端から5番目までの塩基のうち、少なくとも一つの塩基がDNA型塩基またはRNA型塩基と相互作用のない置換基に置換されていることを特徴とする野生型検出用オリゴヌクレオチド及び1種又は2種の変異型検出用オリゴヌクレオチドを同時に又は別々に反応させることにより塩基多型を同定する方法。
- 試料中に含まれる特定の塩基多型部位を含む核酸配列に対し、3’末端から5番目までの塩基のうち、少なくとも一つの塩基がDNA型塩基またはRNA型塩基と相互作用のない置換基に置換されていることを特徴とする野生型検出用オリゴヌクレオチド及び1種又は2種の変異型検出用オリゴヌクレオチドを同時に又は別々に反応させ、多型特異的伸長反応を行うことを特徴とする請求項1記載の塩基多型を同定する方法
- DNA型塩基またはRNA型塩基と相互作用のない置換基に置換された部位が塩基多型部位に隣接していることを特徴とする請求項1または2記載の塩基多型を同定する方法。
- オリゴヌクレオチドの3’末端から5番目までの塩基が多型部位の塩基と相補的であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の塩基多型を同定する方法。
- オリゴヌクレオチドが予め標識されていることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の塩基多型を同定する方法。
- 標識が抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素よりなる群から選ばれたいずれかである請求項5記載の塩基多型を同定する方法。
- 塩基多型部位を含む核酸配列が予め増幅されていることを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の塩基多型を同定する方法。
- 増幅反応がPCR、NASBA、LCR、SDA、RCRおよびTMAよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする請求項7記載の方法。
- 野生型検出用オリゴヌクレオチド及び1種又は2種の変異型検出用オリゴヌクレオチドをプライマーとして同時に又は別々に作用させ、多型特異的に伸長反応を行った後、伸長生成物に核酸特異的標識を作用させ、多型特異的伸長産物を検出することを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の塩基多型を同定する方法。
- 核酸特異標識が2本鎖核酸特異的であることを特徴とする請求項9記載の塩基多型の同定方法。
- 核酸特異標識が蛍光色素であることを特徴とする請求項9及び10のいずれかに記載の塩基多型の同定方法。
- 少なくとも1つが標識された野生型検出用オリゴヌクレオチド及び1種又は2種の変異型検出用オリゴヌクレオチドをプライマーとして同時に又は別々に作用させ、多型特異的に伸長反応を行った後、伸長生成物に核酸特異的標識を作用させ、核酸特異的標識と標識オリゴヌクレオチドとの相互作用によって多型特異的伸長産物を検出することを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の塩基多型を同定する方法。
- 相互作用が蛍光共鳴エネルギー移動であることを特徴とする請求項12に記載の塩基多型を同定する方法。
- 少なくとも一つが標識されている野生型用オリゴヌクレオチド及び1種又は2種の変異型用オリゴヌクレオチドを用いて多型特異的増幅反応を行い、増幅反応中及びまたは反応後に測定することを特徴とする請求項12〜13のいずれかに記載の方法。
- 3’末端から5番目までの塩基のうち、少なくとも一つの塩基がDNA型塩基またはRNA型塩基と相互作用のない置換基に置換されていることを特徴とする野生型検出用オリゴヌクレオチド及び1種又は2種の変異型検出用オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ、核酸特異標識を含む、塩基多型を同定するキット。
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Citations (1)
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WO2001042498A1 (fr) * | 1999-12-10 | 2001-06-14 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Procede de detection de polymorphisme nucleotidique |
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2004
- 2004-10-06 JP JP2004293565A patent/JP4706223B2/ja active Active
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WO2011118603A1 (ja) | 2010-03-24 | 2011-09-29 | 凸版印刷株式会社 | 競合プライマーによる標的塩基配列の検出方法 |
JP5842811B2 (ja) * | 2010-03-24 | 2016-01-13 | 凸版印刷株式会社 | 競合プライマーによる標的塩基配列の検出方法 |
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