JP2001046085A - 血色素症遺伝子を増幅して検出するためのオリゴヌクレオチド - Google Patents

血色素症遺伝子を増幅して検出するためのオリゴヌクレオチド

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、血色素症に関連する配列変化を増
幅して検出し、同定するためのオリゴヌクレオチドと方
法とを提供する。 【解決手段】 プライマーの3'末端が標的と完全にハイ
ブリダイゼーションしない場合、DNAポリメラーゼによ
るプライマー伸長効率の低さを、検出プライマーと標的
との間に診断用ミスマッチが起こる部位に位置する標的
のヌクレオチドを識別または同定するための手段として
使用するために適合させることができる。検出プライマ
ーの伸長効率は、標的の配列変異の存在および/または
正体の指標として検出される。本発明の方法は、血色素
症遺伝子（HFE）に特異的な増幅プライマーと検出プラ
イマーの3‘末端または3’末端近傍のヌクレオチドミス
マッチとを使用して、HFE遺伝子を増幅し、野生型対立
遺伝子と（HFE）遺伝子のエクソン2および4に生じる可
能性のある単一ヌクレオチド多型とを識別する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、血色素症遺伝子を増幅及び検出
するためのオリゴヌクレオチドに関し、さらに詳細に
は、ヒト血色素症遺伝子の配列変異を検出するためのオ
リゴヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】個体間および種間のDNA配列の変異を検
出し、同定することは、進化的な関係、先天性疾患、後
天性疾患および分子遺伝学の他の面に新たな知見を提供
してきた。配列変異の分析は、通常、配列変異の結果と
して制限断片長の変化を利用する制限酵素断片長多型
（RFLP）を分析することによって実施されている。RFLP
分析は、適当なプローブを用いて、ゲルおよびサザンブ
ロット法で制限断片のサイズ分離を必要とする。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】この技法は時間がかか
り、労働集約的で、配列の変化により制限部位が新たに
形成されない場合、または制限部位が除去されない場合
には使用することができない。
【０００４】さらに最近では、DNAの配列分析を容易に
するためにPCRが使用されている。例えば、対立遺伝子
特異的オリゴヌクレオチドが、疾患診断のためのPCR産
物のドットブロットをプローブするために使用されてい
る。点突然変異が制限部位を形成または除去する場合に
は、PCR産物の切断を遺伝子診断（例えば、鎌状赤血球
貧血）に使用することができる。配列変異を分析するた
めの一般的なPCR技術も報告されている。S.Kwokら（199
0、Nucl. Acids Res. 18:999-1005）は、配列変異を受
けないと思われるHIVを増幅するためのプライマーを設
計する目的のために、種々のプライマーと鋳型とのミス
マッチのPCRに対する影響を評価した。この著者らは、
自分達の研究は対立遺伝子特異的な増幅のためのプライ
マーの開発を容易にすると思われるとも考えた。S.Kwok
らは、PCRプライマーの3’末端ミスマッチは、種々の結
果を生じたことを報告している。一方、3'のTの末端ミ
スマッチを除いて、3’末端がプライマーの最後の4つの
ヌクレオチド内に第2のミスマッチを伴うと、一般に、
増幅産物が劇的に減少した。この著者らは、1個の3’末
端から1ヌクレオチドのミスマッチ（N-1）、3’末端か
ら2ヌクレオチドのミスマッチ（N-2）または3’末端か
ら3ヌクレオチドのミスマッチ（N-3）が、PCRによる増
幅効率に全く影響を与えなかったことを報告している。
C.R.Newtonら（1989、Nucl. Acids Res. 17:2503-251
6）は、ゲノムDNAにおける任意の既知の変異を分析する
ためのPCRの改善を報告している。この系はAmplificati
on Refractory Mutation SystemまたはARMSと呼ばれ、
対立遺伝子特異的PCRプライマーを使用する。PCR増幅プ
ライマーの3’末端ヌクレオチドは、対立遺伝子特異的
であるので、それが標的とミスマッチである場合には、
増幅プライマーとして機能しない。この著者らは、増幅
プライマーの3’末端近傍の追加のミスマッチが、対立
遺伝子識別を改善する場合もあることも報告している。
【０００５】血色素症（HC）は、鉄吸収が亢進し、主要
な体内器官に過剰の鉄の蓄積を生ずる遺伝的鉄代謝疾患
である（総論として、E. C. Jazwinska、1998、BioEssa
ys 20: 562-568参照）。HFEと命名されているHCの原因
遺伝子はクローニングされ、2つのミスセンス変異型が
同定されている。両変異によりHFEタンパク質は、一方
はアミノ酸63位（H63D）が、もう一方はアミノ酸282位
（C282Y）のアミノ酸が置換される。これらの変異はHC
のリスクの予測因子になる可能性があるとして検討され
ている。HFE遺伝子の配列の比較は、HFE遺伝子は主要組
織適合遺伝子複合体クラスIファミリーの遺伝子との相
同性が高いことを示している。ゲノム配列は1,029塩基
からなる7カ所のエクソンと1カ所のオープンリーディン
グフレームを含む（J. N. Federら、Nat. Genet. 13: 3
99-408）。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、検出プライマ
ーを使用して、関心のある核酸配列の配列変異を検出し
て、同定するための方法を提供する。検出プライマーは
関心のある配列にハイブリダイゼーションし、3’末端
が効率的に標的とハイブリダイゼーションする場合に
は、ポリメラーゼによって伸長される。本発明の方法
は、評価対象の標的配列（例えば、遺伝子の変異型対立
遺伝子）と第2の核酸配列（例えば、同じ遺伝子の野生
型対立遺伝子）との間の1個のヌクレオチドの違いを検
出し、同定するのに特に好適である。その理由は、本発
明の方法では、検出プライマーの3’末端または3’末端
近傍のヌクレオチドミスマッチを使用して、第1のヌク
レオチドと、標的のその部位に生じうる第2のヌクレオ
チドとを識別するからである。プライマーの3’末端ま
たは3’末端近傍の1つ以上のヌクレオチドが標的と効率
的にハイブリダイゼーションしない場合のDNAポリメラ
ーゼによるプライマー伸長効率の低下を、検出プライマ
ーの1つ以上のヌクレオチドがハイブリダイゼーション
する部位の標的のヌクレオチドを識別または同定するた
めの手段として使用するために適合することができる。
選択した標的にハイブリダイゼーションする選択した検
出プライマーの伸長反応効率は、伸長反応において生成
される伸長された検出プライマーの相対量を求めること
によってモニターされる。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明の方法は、標的核酸に含ま
れる核酸配列の変異を検出するのに有用である。特に、
本発明の方法は関心のある核酸配列（例えば、対立遺伝
子）における単一ヌクレオチド多型（single nucleotid
e polymorphism; SNP）を検出することと、任意選択的
に、このようなSNPまたは対立遺伝子を同定することと
に関する。このようなヌクレオチド配列変異は、標的配
列の増幅中に分析対象の試料中で直接検出され得る。本
発明の方法は、相補的な配列にハイブリダイゼーション
するプライマーの3’末端または3’末端近傍にミスマッ
チが存在する場合に、DNAポリメラーゼによるプライマ
ーの伸長効率が相対的に悪いことに基づいている。検出
プライマーが標的核酸の第1の対立遺伝子にハイブリダ
イゼーションされる場合には、1つ以上のミスマッチが
起き、検出プライマーが標的核酸の第2の対立遺伝子に
ハイブリダイゼーションされる場合には、正しい塩基対
形成が生じるように、検出プライマーの3’末端または
3’末端近傍のヌクレオチドを選択することによって、
検出プライマーを2つの異なる対立遺伝子にハイブリダ
イゼーションする場合におけるポリメラーゼによる伸長
効率の差を使用して、標的核酸がどちらの対立遺伝子を
含有するかを示すことができることを出願人らは見いだ
した。多数の対立遺伝子の任意の1つが存在しうる場合
には、各々3’末端または3’末端近傍に異なるミスマッ
チを有する可能性のある多数の検出プライマーを、分析
に使用することができる。最も効率的に伸長される検出
プライマーは、対立遺伝子の正体となる（すなわち、分
析対象の標的配列に存在するヌクレオチドの正体）。例
えば、同定される対立遺伝子の部位にA、G、CおよびTを
含む1組の検出プライマーを関心のある標的にハイブリ
ダイゼーションし、伸長する場合、対立遺伝子の正体
は、ポリメラーゼによって最も効率的に伸長されたシグ
ナルプライマーのヌクレオチドの相補鎖である。1つの
反応で対11立遺伝子を同定するためには、多数の検出プ
ライマーが反応中に存在し、検出プライマーの各々には
別個に検出され得る標識（例えば、検出プライマーの混
合物中で識別され得る異なる蛍光団）が結合されてい
る。
【０００８】さらに詳細には、本発明の検出プライマー
は、関心のある標的配列にハイブリダイゼーションし、
等温増幅反応中にDNAポリメラーゼによって伸長される
オリゴヌクレオチドである。検出プライマーのヌクレオ
チド配列は、関心のある標的核酸に特異的にハイブリダ
イゼーションし、検出プライマーの大多数が典型的なワ
トソン-クリック型に正しく標的と塩基対形成するよう
に選択される。しかし、3’末端または3’末端近傍の検
出プライマーのヌクレオチド配列は、標的配列の異なる
SNPまたは対立遺伝子（診断用ヌクレオチド位置）を識
別するように、選択される。診断用ヌクレオチドは、選
択した標的の特定の対立遺伝子の分析（例えば、存在ま
たは同定）を可能にする検出プライマー中のヌクレオチ
ドと規定される。すなわち、標的配列の第1の単一ヌク
レオチド変異（例えば、遺伝子の野生型または変異型対
立遺伝子）とハイブリダイゼーションすることにより、
SNPの部位に正しいワトソン-クリック型塩基対が形成さ
れ、検出プライマーが標的配列の同じ部位に第2のヌク
レオチド変異（例えば、遺伝子の第2の変異型対立遺伝
子）を含有する標的とハイブリダイゼーションすること
により、検出プライマーと標的との間にミスマッチが形
成されるように、検出プライマーの3’末端の配列は選
択される。プライマーのミスマッチが増幅反応において
どのように対立遺伝子の識別を可能にするかの一例とし
て、診断用ヌクレオチド位置にC残基を有する検出プラ
イマーが、検出プライマーの効率的な伸長を示す大きい
シグナルを形成する場合、これは標的対立遺伝子がGで
あることを示す。一方、伸長された検出プライマーのシ
グナルが低い場合には、標的対立遺伝子がGでないこと
を示す。1個だけのSNPが標的中に生じていることが予想
される場合には、1個の検出プライマーを使用して、分
析を実施すると、1個の対立遺伝子の同定が可能にな
る。同じヌクレオチド位置に多数の異なる対立遺伝子が
存在する場合には、単一の検出プライマーがその検出プ
ライマーが診断用となる対立遺伝子の有無に関する情報
を提供する。多数のSNPが考えられる場合に対立遺伝子
を同定するためには、SNP部位にA、TおよびGを含有する
多数の検出プライマーを使用して標的中の対立遺伝子を
同定することができる。すなわち、検出プライマーの伸
長産物に関連する高いシグナルを形成する検出プライマ
ーは、標的のSNPの相補鎖であるヌクレオチドを含有す
る。本発明では、検出プライマーのミスマッチと思われ
るヌクレオチドが3’末端または3’末端から約1〜4ヌク
レオチド残基（すなわち、N位、N-1位、N-2位、N-3位ま
たはN-4位）に置かれている。
【０００９】予期しないことであったが、検出プライマ
ーの配列に、関心のある対立遺伝子の検出または同定を
目的としない第2のミスマッチを置くことが好ましい場
合が多いことも見いだされた。第2の診断用でないミス
マッチは、同定対象のSNPの識別レベルを改善すること
が多く、好ましくは、診断用でないミスマッチが分析対
象の標的対立遺伝子と関係なく起きるように、変化する
ことが予想されない標的配列領域に基づいて選択され
る。第2のミスマッチは、対立遺伝子の識別に正の影響
を生ずるが、診断用ヌクレオチドの近傍にある場合に最
も大きな改善を提供する検出プライマーの任意の部位に
起きてもよい。これは、一般に、診断用ヌクレオチドか
ら1〜15ヌクレオチドまでの範囲であるが、好ましく
は、検出プライマーの診断用ヌクレオチドの約1〜5ヌク
レオチドの範囲である。診断用でないミスマッチが診断
用ミスマッチから離れると、対立遺伝子の識別に対して
与える影響が減少するという観察に基づいて、第2の診
断用でないミスマッチは検出プライマーのTmに対して一
般的な影響ではなく、位置的な影響を与えると出願人ら
は考えている。当業者は、検出プライマーを使用して対
立遺伝子の識別に対する影響を評価することにより、検
出プライマー中の診断用でないミスマッチの適切な位置
を通常の実験によって決定することができる。
【００１０】ミスマッチは、オリゴヌクレオチドの鎖長
が短い方が、長いものよりもハイブリダイゼーションに
対して大きい影響を与えることは周知であるが、本発明
の検出プライマーを使用した対立遺伝子の識別をTmに関
連するハイブリダイゼーションの影響に全く帰すことが
できない。例えば、診断用ヌクレオチドの位置を検出プ
ライマーの3’末端から分子の中心部に移動すると、識
別が実質的に低下する。対立遺伝子を識別する唯一の機
序がTmに関連したハイブリダイゼーション効率である場
合には、この移動は対立遺伝子の識別を低下しないで増
加するはずである。発明者らは、正反対の事象、すなわ
ち、診断用ヌクレオチドが検出プライマーの3’末端近
傍にある場合に、対立遺伝子が最適に識別されることを
観察した。また、発明者らは、3’末端に存在しない診
断用ミスマッチと以下に記載する追加の診断用でないミ
スマッチとを含有する検出プライマーが、マッチした検
出プライマーとミスマッチした検出プライマーとの間の
ハイブリダイゼーション効率の単純な差が最小であるこ
とが予想される場合には、比較的長い検出プライマーに
おける対立遺伝子の識別が良好になることを発見した。
診断用でないヌクレオチドは、診断用ヌクレオチドの近
傍に位置する場合には、識別を改善し、15ヌクレオチド
より大きく離れて配置される場合には、ほとんど影響が
ないということは、さらに、ハイブリダイゼーション効
率の改良以外の要因が本発明による対立遺伝子識別に関
係することを示唆している。
【００１１】本発明の検出プライマーは、一般に、鎖長
約12〜50ヌクレオチドである。1個の診断用ヌクレオチ
ドだけが存在する場合には、検出プライマーは、好まし
くは、鎖長約12〜24ヌクレオチドであり、さらに好まし
くは鎖長約12〜19ヌクレオチドである。診断用ヌクレオ
チドと診断用でないヌクレオチドとを含有する検出プラ
イマーは、約15〜20ヌクレオチドの鎖長が好ましく、15
〜36ヌクレオチドがさらに好ましく、18〜24ヌクレオチ
ドが最も好ましい。
【００１２】検出プライマーは本発明の等温増幅方法に
おいて種々の方法で使用され得る。第1の実施態様で
は、検出プライマーは核酸増幅反応に使用するための増
幅プライマーであってもよい。すなわち、検出プライマ
ーは増幅反応において2つの機能、すなわち関心のある
標的配列の増幅と標的配列内のSNPの検出または同定
（「検出/増幅プライマー」）を実施することができ
る。SDA、3SR、NASBA、TMAおよび他の等温増幅反応のた
めの増幅プライマーの構造と機能は当技術上周知であ
り、本明細書に教示されているように3’末端ヌクレオ
チド配列を選択することによって、本発明の検出プライ
マーとして使用するためにこれらの増幅プライマーを適
合させることは、当技術範囲内である。PCRでは、増幅
反応を駆動させる増幅プライマーには特定の配列または
構造は必要ない。このため、PCRの増幅プライマーは、
一般に、標的結合配列だけからなる。しかし、他の増幅
反応では、増幅プライマーは、増幅反応が生じるのに必
要な特殊な配列と構造を含む。例えば、3SRおよびNASBA
のための増幅プライマーは、5’末端近傍にRNAポリメラ
ーゼプロモーターを含む。プロモーターは、標的配列に
結合され、標的の多数のRNAコピーを転写させることに
よって増幅反応を起こさせる働きをする。SDAの増幅プ
ライマーは、5’末端近傍に制限エンドヌクレアーゼの
認識部位を含む。制限部位は、標的配列に結合され、半
改変され、増幅反応中に2本鎖になる。一旦2本鎖になる
と、制限部位のニッキングにより、ポリメラーゼによる
標的の多数のコピーの合成および置換を可能にすること
によって、SDA反応が進行する。
【００１３】検出/増幅プライマーが標的の3’末端また
は3’末端近傍とミスマッチを形成する場合には、増幅
効率が低下し、伸長された検出/増幅プライマー（すな
わち、増幅産物またはアンプリコン）を検出する際に、
増幅効率の低下に伴ってシグナルが低下することが、検
出/増幅プライマーとの診断用ミスマッチが生じた標的
のヌクレオチド位置にSNPが存在することまたはその正
体を示す。検出/増幅プライマーが伸長された場合に、
シグナル変化を形成する標識で検出/増幅プライマーを
標識する場合には（以下に考察）、伸長産物は標的の増
幅が生じるにつれて、リアルタイムで検出することがで
きるので、伸長産物を増幅後に検出する追加のステップ
が必要ない。SDAなどの等温増幅反応では、検出/増幅プ
ライマーのN-1またはN-2の単一ミスマッチは、一般に、
3’末端の単一ミスマッチより対立遺伝子識別の効率が
よいことがある。従って、検出プライマーが等温増幅反
応の増幅プライマーである場合には、3’末端ミスマッ
チは好ましくない。これは、報告によるとPCR増幅プラ
イマーの3’末端ミスマッチにより対立遺伝子識別が十
分であった温度サイクル型の増幅反応に関する従来技術
の教示とは異なる（Kwokら、上記を参照）。しかし、PC
Rに関する従来技術の教示とも異なり、本発明の等温増
幅方法では、特に任意の第2の診断用でないミスマッチ
が含まれる場合には、N-1からN-4における検出/増幅プ
ライマーと相補的な3’末端ヌクレオチドのミスマッチ
により、対立遺伝子識別は優れた結果となる。
【００１４】別の好ましい実施態様では、米国特許第5,
547,861号に教示されているように、検出プライマーを
等温増幅反応においてシグナルプライマー（検出プロー
ブとも呼ばれる）として使用する。この文献は、その開
示内容を参照することにより本明細書に組み入れられる
ものとする。増幅反応では、増幅プライマーの伸長がシ
グナルプライマーおよびその伸長産物と置き換わるよう
に、シグナルプライマーは、増幅プライマーの下流の標
的配列とハイブリダイゼーションする。伸長後、シグナ
ルプライマーは、第2の増幅プライマーのハイブリダイ
ゼーション部位である下流配列を含む。第2の増幅プラ
イマーは、伸長したシグナルプライマーとハイブリダイ
ゼーションし、その相補鎖の合成をプライムする。これ
らの2本鎖二次的増幅産物の生成は、標的配列の存在を
示すものとして検出できるだけでなく、本発明の方法で
は、検出プライマー（検出/シグナルプライマー）に特
徴的な配列を有するシグナルプライマーは標的配列内の
SNPの検出および/または同定も容易にする。この実施態
様では、3’末端（N）またはN-1からN-4のいずれかの診
断用ミスマッチが優れた対立遺伝子識別を提供する。特
に、マッチしたプライマーとミスマッチしたプライマー
との間のハイブリダイゼーション効率の差が小さくなる
長い検出プライマーを使用する場合には、先に記載され
ているように第2の診断用でないミスマッチを使用して
対立遺伝子識別をさらに改善する。3’末端の診断用ミ
スマッチだけでは検出/増幅プライマーの対立遺伝子識
別が不良であったので、この所見は予想されなかった。
検出/シグナルプライマーが伸長される場合にシグナル
の検出可能な変化を生ずるレポーター基で検出/シグナ
ルプライマーを標識する場合には、等温増幅反応におい
て検出/シグナルプライマーを使用すると、リアルタイ
ム（増幅と同時）での伸長産物の検出およびSNPの分析
が可能になる。または、検出/シグナルは増幅後またはS
NPを検出するために標的を増幅することなく使用されて
もよい。この実施態様では、第2のプライマーの伸長が
検出/シグナルプライマーおよび生成され得る任意の検
出/シグナルプライマー伸長産物と置き換わるように、
検出シグナルプライマーは、ポリメラーゼによって伸長
され得る任意のプライマーの下流の標的にハイブリダイ
ゼーションされる。
【００１５】検出/増幅プライマーの3’末端の診断用ミ
スマッチと比較したとき、検出/シグナルプライマーの
3’末端の診断用ミスマッチで得られた異なる結果は少
なくとも部分的には動態学的な影響による場合があると
出願人らは仮定している。シグナルプライマーが、ハイ
ブリダイゼーションされる標的において効率的に伸長さ
れない場合には（例えば、標的がミスマッチを含有する
場合）、それは上流の増幅プライマーの伸長によって、
鋳型から速やかに置き換えられる。シグナルプライマー
が効率的に伸長される場合には、シグナルプライマーが
標的から置き換えられる前に伸長が起きる。すなわち、
（一般に、完全にマッチしていて、効率的に伸長され
る）上流の増幅プライマーは、検出/シグナルプライマ
ーに伸長の「時間制限」を与える。一方、等温増幅反応
における増幅プライマーは、一般に、等温増幅反応の別
の成分によって、または温度サイクルによって、伸長の
時間制限を与えない。従って、十分な時間が利用できれ
ば、伸長反応の効率が悪くても、検出/増幅プライマー
は最終的には伸長され得る。3’末端ミスマッチを有す
る検出/増幅プライマーを等温増幅反応に使用する場合
には、この現象は対立遺伝子の識別を低下されると思わ
れる。しかし、米国特許第5,270,184号に記載されてい
るように、第2のプライマーが増幅プライマーの上流に
結合する場合には（例えば、「外部」または「バンパ
ー」プライマー）、時間制限が増幅の前に与えられる場
合がある。この場合には、上流のプライマーの伸長が増
幅プライマーの伸長に時間制限を与える。増幅プライマ
ーの伸長が3’末端または3’末端近傍のミスマッチによ
って遅延される場合には、増幅プライマーは伸長される
前に上流プライマーの伸長によって置き換えられること
がある。置き換わる上流プライマーが存在する場合に
は、マッチした標的とミスマッチした標的とを識別する
増幅プライマーの能力をこの動態学的な影響が増幅の前
に増大することが予測される。しかし、ミスプライミン
グが生ずる場合には、標的のミスマッチを正しくする増
幅プライマーの能力により、元の標的の間違ったコピー
ではない増幅産物が得られる。増幅プライマーは、アン
プリコンを生成した増幅プライマーと完全にマッチした
アンプリコンを生成するので、対立遺伝子識別の基礎は
排除される。一方、このような「補正」はシグナルプラ
イマーでは生じない。
【００１６】検出プライマーのハイブリダイゼーション
により、分析対象である標的の診断用ヌクレオチド位置
に正しく塩基対形成されるか、又は、ミスマッチが形成
されるかどうかは、DNAポリメラーゼによる検出プライ
マーの相対的な伸長効率を評価することによって決定さ
れる。この決定は定量的であっても定性的であってもよ
い。検出プライマーの伸長は3’末端または3’末端近傍
にミスマッチが存在する場合には、効率が悪く、3’末
端全体が標的と正しく塩基対形成されている場合には、
効率が高い。すなわち、検出プライマー産物は3’末端
近傍の正しい塩基対形成では、比較的より長く伸長され
る。伸長された検出プライマーは、一般に、検出プライ
マーに結合した標識によって検出される。標識は直接検
出可能であっても、当技術上周知のその後の反応後にの
み、検出可能であってもよい。または、検出プライマー
自体は未標識で、標識されたプローブにハイブリダイゼ
ーションすることによって、伸長産物が検出されてもよ
く、またはゲル上で可視化するために臭化エチジウムで
処理するなどのその後の反応で検出されてもよい。伸長
されていないプライマーに関連するシグナルの量と比較
したときの、伸長された検出プライマーに結合された標
識からの相対的シグナル量が、生成された伸長産物量お
よび伸長反応効率の指標となる。
【００１７】増幅反応中に生成された伸長された検出プ
ライマー産物の存在または量を求めるための当技術上周
知の多数の技法が存在する。先ず、例えば、ゲル電気泳
動によってまたは伸長された検出プライマーを固相に選
択的に捕獲することにより、伸長されていない検出プラ
イマーから分離することによって、サイズの増加により
検出プライマーの伸長産物を検出および/または定量す
ることができる。しかし、好ましい実施態様では、検出
プライマーは検出プライマーが伸長された場合にのみ検
出され得るレポーター基または検出プライマーが伸長さ
れた場合のみ、シグナルの変化を生ずる標識で標識され
る。このような標識の一例は、標識が結合したオリゴヌ
クレオチドが標的配列にハイブリダイゼーションして伸
長された場合に、蛍光極性の変化を受ける蛍光染料であ
る。シグナルプライマーのハイブリダイゼーションおよ
び伸長を検出するために蛍光極性の変化を使用する方法
は、米国特許第5,800,989号、米国特許第5,593,867号お
よび米国特許第5,641,633号に記載されている。これら
の特許は、シグナルプライマーが2本鎖になって（標的
配列上での伸長の成功によって可能になる）標的増幅を
検出できる場合に生ずる蛍光極性の変化を使用すること
について記載している。本発明の方法では、蛍光標識し
た検出プライマーの蛍光極性の変化を使用して、伸長効
率を評価することができ、増幅対象の標的中のSNPを検
出または同定することができる。
【００１８】プライマーの伸長を示すシグナルの検出可
能な変化を受ける標識の第2の例は蛍光ドナー/消光剤の
染料対である。消光剤染料は蛍光であってもよいが、蛍
光である必要はない。ドナーと消光剤が非常に近接して
いる場合には、ドナーの蛍光は消光される。染料が離れ
た位置に移動されると、消光は起こりにくく、ドナーの
蛍光は増加する。標的が存在する場合に染料間の距離を
増加するための種々の機序により、このようなドナー/
消光剤染料対を使用して標的核酸を検出することは、米
国特許第5,846,726号、米国特許第5,691,145号および欧
州特許第0 881 302号に記載されている。シグナルプラ
イマー増幅系および伸長され得るプライマー/プローブ
の両方にドナー/消光剤染料対を使用して、増幅されて
いない標的または増幅後の標的を検出することが開示さ
れている。本発明では、当技術上周知であるように、本
発明の検出プライマーをドナー/消光剤染料対で標識し
て、標的中のSNPを検出および/または同定するために使
用してもよい。
【００１９】前述の参照文献に開示されているように、
本質的にいかなる核酸増幅反応に使用するための種々の
プライマー伸長検出系が周知である。それらは、プライ
マー伸長を迅速に、リアルタイムで検出する等温増幅反
応に特に有用である。本発明の方法では、検出プライマ
ーは、前述の参照文献に教示されているように、蛍光レ
ポーター基を含有する化合物および蛍光極性または蛍光
消光の変化によって検出される伸長産物で標識されても
よい。または、これらの参照文献に教示されているよう
に、検出プライマーは未標識で、伸長産物は標識された
プライマー/プローブにハイブリダイゼーションされ、
プライマー/プローブの蛍光極性または蛍光消光の変化
を検出することによって検出されてもよい。
【００２０】
【実施例】例1 標識された検出プライマーを使用した単一ヌクレオチド
多型の同定を実証するために、1個のヌクレオチドだけ
が異なるモデル標的オリゴヌクレオチドを、以下のよう
に生成した。1カ所を除いて同一の配列を含有する4つの
オリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドの
変異位置は、アデニン（A）、シトシン（C）、グアニン
（G）またはチミン（T）を含有した。4つの変異型オリ
ゴヌクレオチドの3’末端に相補的な5番目のオリゴヌク
レオチドも合成した。4つの変異型オリゴヌクレオチド
の各々を5番目のオリゴヌクレオチドと混合し、沸騰し
た湯浴中で2分間加熱し、乾式恒温槽中で37℃で平衡化
した。次いで、アニーリングした変異型オリゴヌクレオ
チドおよび5番目のオリゴヌクレオチドを、14 mMのデオ
キシシチジンα-（O-1-チオ）-トリホスフェート、2 mM
のデオキシアデノシン三リン酸、2 mMのデオキシグアノ
シン三リン酸、2 mMのチミジン三リン酸および40単位の
エキソヌクレアーゼ欠損クレノウDNAポリメラーゼを含
有するプライマー伸長反応液中で伸長した。プライマー
伸長反応を37℃において45分間進行させ、その後、乾式
恒温槽で70℃において10分間反応液をインキュベーショ
ンすることによって、クレノウDNAポリメラーゼを失活
した。こうすることによって、1箇所のヌクレオチド位
置だけが異なる4つの2本鎖DNAモデル標的配列が生成さ
れた。この標的をA標的、C標的、G標的およびT標的と命
名した。
【００２１】3’末端を有するモデル標的配列と多型ヌ
クレオチド位置においてハイブリダイゼーションする、
第2の組の4つのオリゴヌクレオチドも検出プライマーと
して使用するために合成した。4つの検出プライマーの
各々は、3’末端（N、診断用ヌクレオチド）に4つのヌ
クレオチド塩基（A、C、GまたはT）の1つおよびモデル
標的配列とミスマッチを形成する3’末端から3塩基目の
位置に「A」ヌクレオチドを有した。1μMの検出プライ
マー、25単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ（PNK）、1
75μCiのα-[32P]-アデノシン三リン酸（32P-ATP）およ
び1×濃度のPNK緩衝液を含有する25μlの反応液中で4つ
の検出プライマーを放射性標識した。標識反応は、PNK
以外の成分を含有する溶液にPNKを添加することによっ
て開始された。反応液を37℃において20分間インキュベ
ーションし、次いで沸騰した湯浴中で加熱してPNKを失
活した。
【００２２】検出プライマーは、増幅反応中でシグナル
プライマーとして使用した。標識した検出プライマー調
製物の各々の5μl量を各標的の別個のSDA反応液に添加
した（40 mMのKH2PO4/K2HPO4 , pH 7.6；10%v/vのグリ
セロール；7.5 mMの酢酸マグネシウム；0.5μMの各増幅
プライマー；1.4 mMのデオキシシチジンα-（O-1-チ
オ）-三リン酸；0.5 mMのデオキシアデノシン三リン
酸；0.5 mM デオキシグアノシン三リン酸；0.5 mM チミ
ジン三リン酸；0.1 mg/mlウシ血清アルブミン；0.5μg
ヒト胎盤DNA、104のA、C、GまたはT標的DNA分子；100 n
Mの放射性標識検出プライマー；160単位のBsoBi制限エ
ンドヌクレアーゼおよび25単位のBst DNAポリメラーゼ
ラージフラグメントを含有する50μl）。BsoBIおよびBs
tを加えないでSDA反応液を調製し、沸騰中の湯浴中で3
分間これらの反応混合物を加熱することによって、標的
DNA2本鎖を変性した。乾式恒温槽中で55℃において3分
間反応混合物を平衡化し、各反応液に160単位のBsoBIお
よび25単位のBstポリメラーゼラージフラグメントを添
加することによってSDAを開始した（酵素の総容量は50%
V/Vグリセロールで調整して2μlとした）。SDAを55℃
において30分間進行させた。反応中5分間隔で各反応液
の少量（5μl）を取り、5μlの配列停止溶液に添加して
SDA反応を停止した。全ての試料を採取したら、沸騰中
の湯浴中で3分間インキュベーションし、各試料の5μl
を8%ポリアクリルアミド、7M尿素配列決定ゲルにのせ
た。65Wで50分間の電気泳動後、モレキュラーダイナミ
クス（Molecular Dynamics）社製のホスホールイメージ
ャー（Phosphorimager）TMプレートをゲルに15分間露出
し、イメージクオント（ImageQuant）TMソフトウェアー
を使用してホスホールイメージャー（Phosphorimager）
TMプレート上の放射性標識産物およびプローブバンドに
存在する計測値を読むことによって、ゲル上の放射性標
識した反応産物および未反応のプローブを定量した。
【００２３】図1、2、3および4は、4つの異なるモデル
標的配列の各々における4つの検出プライマーの各々の
伸長について得られた結果を示す。各場合において、正
しい検出プライマーの量が増幅後により大きいことによ
って示されるように、標的中に多型ヌクレオチドの正し
い3‘対形成を含有しない検出プライマーと比較したと
き、標的DNA配列中の多型ヌクレオチドについて正しい
対形成となる3’末端を有する検出プライマーが、DNAポ
リメラーゼによってSDA中に主に伸長された。例えば、
3'A検出プライマーは、T標的配列を含有するSDA反応液
中でのみ、主に伸長された（図1）。C、GまたはA標的配
列に結合した3'A検出プライマーは、実質的に伸長しな
かった。SDA中に生成された伸長産物は、SDAに特徴的な
全長の伸長された放射性標識DNAプローブおよびニッキ
ングされた伸長アンプリコンを含んだ。同様に、T標的
には3C、3Gおよび3T検出プライマーの伸長がほとんどま
たは全くなかった（図2、3および4）。同様の結果は、
標的増幅反応に他の検出プライマーの各々を使用したと
き見られた（3C、3Gおよび3T検出プライマーをそれぞれ
図2、3および4に示す）。すなわち、検出プライマー
は、標的の多型位置における正しい3’マッチを生じる
標的において主に伸長された。一方、3’末端にCを有す
るSDA増幅プライマーを増幅反応の検出/増幅プライマー
として使用したとき、対立遺伝子は同定されなかった
（図5）。本発明によるN/N-3検出/シグナルプライマー
を等温増幅反応に使用して、標的核酸配列において選択
した位置に存在するヌクレオチドを同定することができ
るが、等温増幅反応のN/N-3検出/増幅プライマーは、対
立遺伝子を効率的に識別しないことをこれらの結果は例
示している。
【００２４】例2 変異型の診断用ヌクレオチドが検出プライマーの3’末
端から1ヌクレオチドめに位置し（N-1）、検出プライマ
ーの全体の長さが5’末端で4ヌクレオチド短い検出/シ
グナルプライマーを合成したことを除き、例1を繰り返
した。検出プライマーは、また検出プライマーの3’末
端から3ヌクレオチドの位置で標的DNAと完全にマッチし
た。4つの検出プライマーの各々を添加して、標的配列
の各々の104分子を含有するSDA反応液を分離した。先に
記載するように、標的を増幅し、検出した。図6（-1A検
出プライマー）、図7（-1C検出プライマー）、図8（-1G
検出プライマー）および図9（-1T検出プライマー）は実
験の結果を示す。全ての場合において、増幅中、検出プ
ライマーは、変異位置に完全な対形成を含有する標的に
おいて主に伸長された。完全にマッチした検出プライマ
ーと標的で得られたシグナルは、ミスマッチした検出プ
ライマー/標的対のいずれで得られたシグナルより30〜1
00倍高かった。シグナルのこの差により標的中の多型ヌ
クレオチドを明白に同定することができ、N-1ミスマッ
チがPCRアンプリコンの生成に全く影響を与えなかったK
wokら（上記）によるPCRの報告結果と異なる。
【００２５】N-1診断用ヌクレオチド（G）と標的のN-2
に第2の診断用でないミスマッチ（A）とを有する検出/
シグナルプライマーを使用して、同様の結果が得られ
た。この検出プライマーは、実施例1で使用した検出プ
ライマーより5’末端が5ヌクレオチド長かった。検出プ
ライマーを実施例1で調製した4つの別個のSDA反応の各
々に添加し、診断用ヌクレオチド（C）との対形成が正
しい標的に結合して主に伸長されることが見いだされ
た。1個だけミスマッチした標的で得られたシグナル
は、2個ミスマッチした標的のいずれで得られたものよ
り5倍以上高かったこと、およびC対立遺伝子は標的の
T、GおよびA対立遺伝子から容易に識別され得たことが
図10に示されている。
【００２６】例3 以下の実験では、HFE遺伝子（血色素症遺伝子）および
野生型対立遺伝子のエクソン4における単一ヌクレオチ
ド多型を、本発明の検出プライマーを使用して増幅中に
リアルタイムで同時に検出および識別した。野生型対立
遺伝子はヌクレオチド845がGであるが、変異型はこの位
置がAである。これにより、タンパク質のアミノ酸位置2
82は、システインからチロシンになる。
【００２７】各反応混合物が本発明による2つの検出/シ
グナルプライマー（一方は変異型対立遺伝子に特異的
で、一方は野生型対立遺伝子に特異的）を含有し、BsoB
IをAvaIに代えた以外は、米国特許第5,846,726号に記載
されているようにSDAを一般に実施した。各100μlの反
応液中の成分の最終濃度は、50 mMの KiPO4（pH 7.
5）、6.0 mMのMgOAc、0.2 mMの各dTTP、dGTP、dATP、1.
4 mMのdCTPαS、5 μg/mLのアセチル化BSA、15%（v/v）
のグリセロール、400ngのサケ精子DNA、20単位のエキソ
クレノウBstポリメラーゼ、160単位のBsoBIおよび0また
は105コピーの標的DNAであった。この例では、標的DNA
は、野生型または変異型HFEエクソン4のDNAからクロー
ニングしたDNAから生成したPCR産物であった。野生型HF
Eエクソン4のDNAは、HFE野生型遺伝子のヌクレオチド位
置845にGを含有し、変異型HFEエクソン4のDNAはその位
置にSNPを含有し、ヌクレオチドはAであった。各試料
は、また2つの検出/シグナルプライマー（以下の配列番
号1および配列番号2）、2つの未標識バンパープライマ
ー（以下の配列番号3および配列番号4）並びに2つの未
標識SDA増幅プライマー（以下の配列番号5および配列番
号6）を含有した。下線を付けた配列は、標的配列との
相補鎖を示す。下線が付いていない位置N-3の塩基Aは、
標的配列の対応するヌクレオチドと相補的でない。この
内側のミスマッチは、この検出プライマーのヌクレオチ
ド位置845の選択性を改善する。C*は、野生型標的の位
置845のGと対形成する3’末端ヌクレオチド（検出プラ
イマーの位置N）を示す。T*は、変異型標的（G845A変
異）のヌクレオチド位置845のAと対形成する3’末端ヌ
クレオチドを示す。斜字体で示す配列は、制限酵素認識
部位（RERS）を示す。増幅プライマーでは、RERSは、SD
Aを進行させるニッキング部位となる。検出プライマー
では、RERSには、ドナー/消光剤染料対を形成する2つの
染料が隣接する。検出/シグナルプライマーが伸長さ
れ、置換され、2本鎖になると、RERSも2本鎖になり、制
限酵素によって切断され得るようになる。2本鎖の伸長
産物の量を検出するために、反応産物を適当な制限酵素
で処理して、検出プライマーのRERSを切断する。2本鎖
の産物が切断されて、染料対が分離されると、蛍光染料
は消光しない。蛍光の増加が、生成される伸長後の2本
鎖検出プライマーの量の指標となる。検出プライマーが
効率的に伸長されない場合には、RERSは1本鎖のままで
あり、制限酵素によって切断されず、蛍光染料は消光し
たままである。従って、蛍光の増加を検出できないとい
うことは、検出プライマーが標的において効率的に伸長
されなかったことを示す。
【００２８】 配列番号1 位置845のヌクレオチドGに特異的な検出プライマー（野生型） FAM-TC CTC GAG T(dabcyl)AT GGG TGC TCC ACC AGG C* (300 nM) 配列番号2 位置845のヌクレオチドAに特異的な検出プライマー（変異型） Rox-TT CTC GAG T(dabcyl)TA CAT GGG TGC TCC ACC AGG T* (300 nM) 配列番号3 エクソン4の第1のバンパープライマー： CGA ACC TAA AGA CGT ATT CGG C (50 nM) 配列番号4−エクソン4の第2のバンパープライマー： CCC CAA TAG ATT TTC TCA GCT CC (50 nM) 配列番号5−エクソン4の第1のSDA増幅プライマー： ACC GCA TCG ATT GCA TGT CTC GGG CTG GAT ACC CTT GGC T 配列番号6−エクソン4の第2のSDA増幅プライマー： CGA TTC CGC TCC AGA CTT CTC GGG AGA TCA CAA TGA GGG GCT GA
【００２９】各SDA反応物は、上記に示すように各々異
なる蛍光団で標識した2つの検出プライマーを含んだ。
反応物は、BstおよびBsoBI以外の全ての試薬を含有する
ようにマイクロウェル中で調製し、加熱変性し、55℃に
平衡させ、酵素を添加することによって増幅を開始し
た。マイクロウェルを密封し、温度制御を可能にするよ
うに改良したサイトフロアー（Cytofluor）IITM内に置
いた。バンドパスフィルターを使用して、フルオレセイ
ンに特徴的な1つの波長範囲（475〜495 nm）およびROX
に特異的なもう1つの範囲（635〜655 nm）までの励起に
制限した。各ウェルについて、45秒ごとに1回のフルオ
レセイン読みおよび1回のROX読みを実施した。反応は、
一般に、90分間モニターした。対照の反応は、標的DNA
を含有しなかった。
【００３０】結果を図11、12および13に示す。野生型エ
クソン4のDNAから誘導した標的だけを含有する試料では
（図11）、蛍光はフルオレセインに特徴的な発光範囲
（FAM、520〜540 nm）において経時的に強く増加した。
これは、配列番号1の検出プライマーはこの標的におい
て効率的に伸長されたことを示しており、野生型対立遺
伝子の存在を同定している。一方、野生型エクソン4試
料では、ROXに特徴的な発光蛍光（635〜655 nm）は低い
ままであり、配列番号2の検出プライマーは増幅中に標
的に結合して効率的に伸長されなかったことを示してお
り、変異型対立遺伝子が存在しないことを確認してい
る。一方、変異型エクソン4のDNAから誘導されたDNAを
含有し、野生型DNAを含有しない試料では、蛍光プロフ
ィールは逆であった（図12）。これらの試料では、蛍光
はROXの発光波長が強力に増加したが、FAM波長は増加せ
ず、変異型対立遺伝子が存在し、野生型対立遺伝子が存
在しないことを示している。野生型および変異型DNAを
共に含有する試料では、蛍光はモニターした両方の範囲
で増加し、試料中に両方の対立遺伝子が存在することを
示している（図13）。
【００３１】同様の実験において、野生型対立遺伝子に
特異的な別の検出プライマーを試験し、その性能を配列
番号1の検出プライマーと比較した。別の検出プライマ
ーは、N-2に診断用ヌクレオチドと、N-3に第2の診断用
でないヌクレオチドを有した（N-2/N-3検出プライマ
ー；FAM-TC CTC GAG T(dabcyl)AT GGG TGC TCC ACC TGA
C*AC；配列番号14）。また、増幅プライマー配列番号5
を配列番号15（ACG CAG CAG CAC ACA TTC TCG GGG AAG
AGC AGA GAT ATA CGT）と交換した。配列番号14を使用
して、一方は野生型標的だけを含有し、他方は変異型標
的だけを含有する2つの試料を試験した。各試験反応物
は、野生型対立遺伝子を検出するための配列番号14と変
異型対立遺伝子を検出するための配列番号2を含有し
た。配列番号1/配列番号2検出プライマー系は、対照反
応として作用した。フルオレセインおよびローダミンの
両蛍光をモニターし、各試料の蛍光読み値をプロットし
た。野生型標的を含有する試料では、N-2/N-3検出プラ
イマーが変換され、フルオレセイン発光が3倍増加し
た。変異特異的検出プライマーは未変換のままで、ロー
ダミン発光は本質的に変化しなかった。変異型標的だけ
を含有する試料では、パターンは逆であった。フルオレ
セイン発光が変化しなかったことによって示されるよう
に、N-2/N-3検出プライマーは変換されなかったが、変
異型特異的検出プライマーからのローダミン発光は、約
3倍増加した。この結果を対照反応と比較すると、配列
番号14の標的特異性は配列番号1の標的特異性とほぼ等
しいことが実証される。
【００３２】配列FAM-TA GCA GTC CCG AGA CTG CT(dabc
yl)A TGG GTG CTC CAC CAG GC*）を有する野生型特異的
な検出プライマーは、配列番号1より野生型対立遺伝子
の検出感度が高いが、特異性がわずかに低い。
【００３３】例 4 HFE遺伝子のエクソン2に特異的な増幅プライマーとエク
ソン2の野生型および変異型対立遺伝子を検出および同
定するための検出/シグナルプライマーの対を使用した
以外は、例3の実験プロトコールを繰り返した。野生型
対立遺伝子は、ヌクレオチド187がCである。変異型対立
遺伝子は、この位置にGを有するので、タンパク質のア
ミノ酸63位はヒスチジンがリジンになる。これらの検出
プライマーは、エクソン2の非コード鎖に含有される対
立遺伝子にハイブリダイゼーションするように設計され
た。
【００３４】 配列番号7 ヌクレオチド位置187の野生型対立遺伝子の検出プライマー（C187、 すなわち、相補鎖のG）： FAM-TC CTC GAG T(dabcyl)TA CCA GCT GTT CGT GTT CTA TGA TC* (300 nM) 配列番号8 ヌクレオチド位置187の変異型対立遺伝子の検出プライマー（G187、 すなわち、相補鎖のC）： Rox-TA CCG CAC T(dabcyl)GA TTA CCA GCT GTT CGT GTT CTA TAA TG* (300 n M) 配列番号9−エクソン2の第1のバンパープライマー： TGA ACA TGT GAT CCC ACC CT (50 nM) 配列番号10−エクソン2の第2のバンパープライマー： CCC CAA TAG ATT TTC TCA GCT CC (50 nM) 配列番号11−SDAの第1の増幅プライマー： ACC GCA TCG AAT GCA TGT CTC GGG AGC TTT GGG CTA CGT GGA TG 配列番号12−SDAの第2の増幅プライマー： CGA TTC CGC TCC AGA CTT CTC GGG GCT CCA CAC GGC GAC TCT
【００３５】配列番号7は、標的との診断用でないミス
マッチを含有しなかった。伸長された2本鎖検出プライ
マー産物が形成される結果ROX/Dabcyl染料対は消光しな
いので、配列番号8はRERSを含有しなかった。制限酵素
による切断は、蛍光の増加を観察するのに必ずしも必要
ではない。
【００３６】野生型または変異型エクソンのどちらかか
ら誘導された107コピーの標的DNAを含有するSDA反応の
結果を図14、15および16に示す。野生型エクソン2 のDN
Aだけから誘導された標的を含有する試料では（図1
4）、フルオレセインの発光波長範囲の蛍光が経時的に
強く増加し、野生型対立遺伝子の存在を示している。ま
た、これらの試料ではローダミンの発光波長範囲の蛍光
は、低いままで、変異型対立遺伝子が存在しないことを
示している。一方、変異型エクソン2からだけ誘導され
たDNAを含有する試料では、蛍光プロフィールは逆であ
った（図15）。この場合には、ROX蛍光が強く増加し、F
AM蛍光は低いままであった。野生型および変異型DNAの
両方を含有する試料では（図16）、両蛍光団の蛍光は強
く増加し、1つの試料中に両方の対立遺伝子が存在する
ことを示している。
【００３７】また、反応においてCGA TAC GCT CCT GAC
TTC TCG GGA CAA ACG GCG ACT CTCAT（配列番号17）を
有する増幅プライマーと配列番号12を交換することによ
って、エクソン2標的の増幅効率がよりよくなる。さら
に、配列Rox-TA GCG CCC GAGCGC T(dabcyl)AT GTT CGT
GTT CTA TGA TC*A（配列番号18）を有するN-1検出プラ
イマーは、別の増幅プライマー配列番号17と併用して使
用される場合には、対立遺伝子識別を改善する。
【００３８】例5 この例は、核酸増幅反応において多数の対立遺伝子特異
的プローブの交差反応性を調整するために検出プライマ
ーに、5’末端配列を使用することを例示する。この例
はSDAを使用したが、2つの対立遺伝子を識別するための
標識プローブまたはプライマーの伸長に関係するPCR、N
ASBA、3SR等を含む、当技術上周知の他の増幅方法でも
同様の結果が予測される。
【００３９】例3および4は、一方は野生型対立遺伝子に
特異的で、他方は変異型対立遺伝子に特異的である2つ
の異なって標識された検出/シグナルプライマーを含有
するSDA反応を記載している。従って、各反応混合物
は、変異型対立遺伝子、野生型対立遺伝子または両対立
遺伝子を同時に検出することができる。どちらかの対立
遺伝子について１つの試料を分析できることは、試料を
分割し、1検出プライマーアッセイを2つ別個に実施する
別の方法より簡便で、信頼性があり、少量の試料しか必
要としない。しかし、2つ以上の異なる標識の検出プラ
イマーを含有する反応混合物中では、第2の検出プライ
マーの標識が存在する場合には、一方の検出プライマー
によって、多量の偽の交差反応シグナルが形成されるこ
とがある。この交差反応性は、両方の検出プライマーが
同時に存在することによって生じ、または悪化するが、
1検出プライマー反応混合物中では、交差反応性は低下
するか、または消失すると出願人らは考えている。2つ
の検出プライマーの5’末端配列が実質的に異なるよう
に、検出プライマーを設計することによって、このよう
な多数の検出プライマー反応混合物中で交差反応性を実
質的に低下することができることが発見された。5’末
端は元の標的配列に相補的でなく、対立遺伝子特異的ヌ
クレオチドは、検出プライマーの5’末端から離れた位
置または3’末端近傍に位置するので、この結果は予測
されなかった。
【００４０】図17は、例としてSDAを使用したとき、こ
の予測されなかった交差反応の原因と思われるものを例
示する。図示した「野生型」標的は診断されるヌクレオ
チド位置にCを含有する。従って、示すように、この対
立遺伝子の検出プライマーは、3’末端Gを含有する。こ
れを例示する目的のために、「変異型」対立遺伝子（示
していない）は診断位置にTを含有し、その検出プライ
マーは3’末端Aを含有する。両方の検出プライマーが増
幅反応中に存在する。増幅中、C-特異的検出プライマー
は標的にハイブリダイゼーションし、伸長され、2本鎖
に変換され、切断可能になって、ドナー/消光剤染料対
を分離する。得られた蛍光の増加は、Cを含有する標的
が存在することを示す。次いで、残りの2本鎖種は、ニ
ッキング可能な制限部位を含有するので、直線的増幅を
受ける。直線的増幅は、診断位置にCを含有する1本鎖種
を生成する。次いで、2つの別の反応経路が可能であ
る。1つの場合では、前のように、直線増幅産物が適当
なC特異的検出プライマーにハイブリダイゼーション
し、切断された産物に変換され、C特異的シグナルをさ
らに増強することができる。または、直線増幅反応産物
がT特異的検出プライマーに擬似的にハイブリダイゼー
ションすることがある。T特異的検出プライマーの3’末
端の1個のミスマッチは、このような誤ったハイブリダ
イゼーションを防ぐには十分ではないと思われる。しか
し、T特異的検出プライマーおよびC特異的検出プライマ
ーの5’末端配列が同一である場合には、ハイブリダイ
ゼーションが起き、擬似的にハイブリダイゼーションし
たT特異的検出プライマーは、A:Cミスマッチを伸長させ
ることなく、切断された蛍光産物に速やかに変換される
と思われる。これにより、診断位置にTヌクレオチドが
存在することを誤って示すシグナルが形成される。しか
し、T特異的検出プライマーおよびC特異的検出プライマ
ーが異なる5’末端配列を含有する場合には、5’末端は
直線増幅産物にハイブリダイゼーションすることによっ
て、2本鎖形態に変換されることができないので、擬似
的にハイブリダイゼーションしたT特異的検出プライマ
ーは切断を受けない。検出プライマーは、野生型標的に
誤ってハイブリダイゼーションしても、切断されないま
まなので、偽陽性シグナルは形成されないと思われる。
示した例では、5’末端配列の残りが異なった場合に
は、2つの検出プライマーが同じ制限部位を持つという
ことだけでは、末端をハイブリダイゼーションさせるの
に十分でないと思われる。
【００４１】図17はSDAにおいて偽陽性シグナルを擬似
的に形成する機序を例示しているが、同様の反応は他の
増幅方法において生じる。PCR、NASBA、3SR、TMAまたは
任意の他の増幅反応においてCを含有する1本鎖検出プラ
イマー伸長産物が形成されるときは、常に、それはC特
異的検出プライマー（正しい）またはT特異的検出プラ
イマー（正しくない）にハイブリダイゼーションする。
2つの検出プライマーが同じ5’末端配列を有する場合に
は、伸長産物はどちらか一方の5’末端と相補的であ
り、RERSは2本鎖で、切断可能である。2つの検出プライ
マーが異なる5’末端配列を有する場合には、検出プラ
イマーが正しくない標的にハイブリダイゼーションする
と、2本鎖RERSが形成されず、偽陽性シグナルは形成さ
れない。
【００４２】この現象を例示するために、4つのSDA反応
物を調製した。全ての反応物は変異型特異的検出プライ
マー配列番号2（300nM）を含有した。反応物1および2
は、配列番号2と同一の5’末端配列を有する野生型に特
異的な配列番号13(FAM-TT CTCGAG T(dabcyl)TA CAT GGG
TGC TCC ACC AGG C* (300 nM)を含有した。反応物3お
よび4は、5’末端配列が、RERS（CTCGAG）以外は配列番
号2と異なり、フルオレセイン標識した野生型特異的検
出プライマー配列番号1（300 nM）を含有した。反応混
合物はまた、HFE遺伝子のエクソン4から誘導した野生型
（反応物1および3）または変異型（反応物2および4）標
的DNA（反応物あたり105コピー）を含有した（例3参
照）。フルオレセインの蛍光発光だけを検出した以外
は、例3と同様に反応を実施した。
【００４３】結果を図18に示す。反応物1はフルオレセ
インの蛍光が強く増加し、標的中に野生型対立遺伝子の
存在を示す。変異型DNAだけを含有する反応物2は、野生
型が存在しないが、蛍光は小さいが、実質的に増加し
た。反応物に存在する2つの検出プライマーの5’末端配
列が同一であったので、おそらく図17に例示する機序に
よって、このシグナルは野生型「特異的」検出プライマ
ーの擬似的な変換を示した。野生型検出プライマーの
5’末端を変更したとき（配列番号1）、標的特異的シグ
ナルに実質的に影響を与えることなく（反応3）、交差
反応によるシグナルは抑えられた（反応4）。
【図面の簡単な説明】
【図１】診断用3’末端ヌクレオチドおよびN-3の診断用
でないミスマッチを用いたモデル標的システムおよび検
出プライマーを使用して、SNPを検出し、同定する例1の
結果を示す。
【図２】診断用3’末端ヌクレオチドおよびN-3の診断用
でないミスマッチを用いたモデル標的システムおよび検
出プライマーを使用して、SNPを検出し、同定する例1の
結果を示す。
【図３】診断用3’末端ヌクレオチドおよびN-3の診断用
でないミスマッチを用いたモデル標的システムおよび検
出プライマーを使用して、SNPを検出し、同定する例1の
結果を示す。
【図４】診断用3’末端ヌクレオチドおよびN-3の診断用
でないミスマッチを用いたモデル標的システムおよび検
出プライマーを使用して、SNPを検出し、同定する例1の
結果を示す。
【図５】診断用3’末端ヌクレオチドおよびN-3の診断用
でないミスマッチを用いたモデル標的システムおよび検
出プライマーを使用して、SNPを検出し、同定する例1の
結果を示す。
【図６】N-1の診断用ヌクレオチドおよび診断用でない
ミスマッチを用いたモデル標的システムおよび検出プラ
イマーを使用して、SNPを検出し、同定する例2の結果を
示す。
【図７】N-1の診断用ヌクレオチドおよび診断用でない
ミスマッチを用いたモデル標的システムおよび検出プラ
イマーを使用して、SNPを検出し、同定する例2の結果を
示す。
【図８】N-1の診断用ヌクレオチドおよび診断用でない
ミスマッチを用いたモデル標的システムおよび検出プラ
イマーを使用して、SNPを検出し、同定する例2の結果を
示す。
【図９】N-1の診断用ヌクレオチドおよび診断用でない
ミスマッチを用いたモデル標的システムおよび検出プラ
イマーを使用して、SNPを検出し、同定する例2の結果を
示す。
【図１０】N-1の診断用ヌクレオチドおよび診断用でな
いミスマッチを用いたモデル標的システムおよび検出プ
ライマーを使用して、SNPを検出し、同定する例2の結果
を示す。
【図１１】HFE遺伝子のエクソン4の2つの対立遺伝子を
リアルタイムで同時に検出し、同定する例3の結果を示
す。
【図１２】HFE遺伝子のエクソン4の2つの対立遺伝子を
リアルタイムで同時に検出し、同定する例3の結果を示
す。
【図１３】HFE遺伝子のエクソン4の2つの対立遺伝子を
リアルタイムで同時に検出し、同定する例3の結果を示
す。
【図１４】HFE遺伝子のエクソン2の2つの対立遺伝子を
リアルタイムで同時に検出し、同定する例4の結果を示
す。
【図１５】HFE遺伝子のエクソン2の2つの対立遺伝子を
リアルタイムで同時に検出し、同定する例4の結果を示
す。
【図１６】HFE遺伝子のエクソン2の2つの対立遺伝子を
リアルタイムで同時に検出し、同定する例4の結果を示
す。
【図１７】増幅反応の多数の検出プライマーが同一の
5’末端配列を有する場合に偽陽性を発生する可能性の
ある機序を例示する。
【図１８】多数の検出プライマーが同一または異なる
5’末端配列を有する場合に、反応における多数の検出
プライマーの性能を比較する例5の結果を示す。 SEQUENCE LISTING <110> Nadeau, James G. Garic-Stankovik, Ana Dean, Cheryl H. Scott, Patricia B. Spargo, Catherine A. <120> Oligonucleotides for Amplification and Detection of Hemochromatosis Gene <130> 12-257 <140> JP P2000-182852 <141> 2000-06-19 <150> US09/335217 <151> 1999-06-17 <160> 18 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tcctcgagta tgggtgctcc accaggc 27 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ttctcgagtt acatgggtgc tccaccaggt 30 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens １ <400> 3 cgaacctaaa gacgtattcg gc 22 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ccccaataga ttttctcagc tcc 23 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 accgcatcga ttgcatgtct cgggctggat acccttggct 40 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 cgattccgct ccagacttct cgggagatca caatgagggg ctga 44 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tcctcgagtt accagctgtt cgtgttctat gatc 34 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 taccgcactg attaccagct gttcgtgttc tataatg 37 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tgaacatgtg atcccaccct 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 ccccaataga ttttctcagc tcc 23 <210> 11 <211> 44 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 accgcatcga atgcatgtct cgggagcttt gggctacgtg gatg 44 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 cgattccgct ccagacttct cggggctcca cacggcgact ct 42 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ttctcgagtt acatgggtgc tccaccaggc 30 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 tcctcgagta tgggtgctcc acctgacac 29 <210> 15 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 acgcagcagc acacattctc ggggaagagc agagatatac gt 42 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 tagcagtccc gagactgcta tgggtgctcc accaggc 37 <210> 17 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 cgatacgctc ctgacttctc gggacaaacg gcgactctca t 41 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 tagcgcccga gcgctatgtt cgtgttctat gatca 35
フロントページの続き (71)出願人 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡ ＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥ ＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者 パトリシア・ビー・スコット アメリカ合衆国ノースカロライナ州27502, エイペックス，ホリー・ブルック・ドライ ブ 4833 (72)発明者 キャサリン・エイ・スパーゴ アメリカ合衆国ノースカロライナ州27502, エイペックス，イーストリッジ・ドライブ 7103 (72)発明者 シェリル・エイチ・ディーン アメリカ合衆国ノースカロライナ州27614, ローリー，トレイルズ・エンド・コート 205 (72)発明者 アナ・ガリッチ‐スタンコヴィッチ アメリカ合衆国ノースカロライナ州27606, ローリー，サンドリン・プレイス 1008, ＃イー

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号１、配列番号２、配列番号７、
    配列番号８、配列番号１６および配列番号１８の標的結
    合配列からなる群から選択される標的結合配列を含む検
    出プライマー。
  2. 【請求項２】 配列番号１、配列番号２、配列番号７、
    配列番号８、配列番号１３、配列番号１６および配列番
    号１８からなる群から選択される請求項１に記載の検出
    プライマー。
  3. 【請求項３】 配列番号５、配列番号６、配列番号１
    １、配列番号１２、配列番号１５および配列番号１７の
    標的結合配列からなる群から選択される標的結合配列
    と、任意選択により、核酸増幅反応に要求される配列と
    からなるオリゴヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 配列番号５、配列番号６、配列番号１
    １、配列番号１２、配列番号１５および配列番号１７か
    らなる群から選択される請求項３に記載のオリゴヌクレ
    オチド。
  5. 【請求項５】 ａ）配列番号５、配列番号６、配列番号
    １１、配列番号１２、配列番号１５および配列番号１７
    の標的結合配列からなる群から選択される標的結合配列
    と、任意選択により、核酸増幅反応に要求される配列と
    からなるオリゴヌクレオチドを使用してＨＦＥ遺伝子の
    標的配列を増幅するステップと、 ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号７、配列番号
    ８、配列番号１６および配列番号１８の標的結合配列か
    らなる群から選択される標的結合配列を含む検出プライ
    マーを使用して、増幅した標的配列中の単一ヌクレオチ
    ド多型を検出または同定するステップとを含むＨＦＥ遺
    伝子中の単一ヌクレオチド多型を検出または同定するた
    めの方法。
  6. 【請求項６】 検出プライマーが配列番号１、配列番号
    ２、配列番号７、配列番号８、配列番号１３、配列番号
    １６および配列番号１８からなる群から選択される請求
    項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 オリゴヌクレオチドが、配列番号５、配
    列番号６、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５
    および配列番号１７からなる群から選択される請求項５
    に記載の方法。
JP2000182852A 1999-06-17 2000-06-19 血色素症遺伝子を増幅して検出するためのオリゴヌクレオチド Pending JP2001046085A (ja)

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