MXPA00005083A - Oligonucleotidos para la amplificacion y deteccion de genes de hemocromatosis. - Google Patents

Abstract

La presente invencion suministra oligonucleotidos y metodos para amplificar, detectar e identificar variaciones en las secuencias, asociadas con la hemocromatosis. Se ha encontrado que la eficiencia reducida de la extension del apresto por las polimerasas del ADN, cuando el extremo 3' de un apresto no hibridiza perfectamente con el objetivo, se puede adaptar para su uso como un elemento para distinguir o identificar el nucleotido en el objetivo, el cual esta en el sitio donde existe una desigualdad en el diagnostico entre el apresto del detector y el objetivo. la eficiencia de la extension del apresto del detector se detecta como una indicacion de la presencia y/o identidad de la variacion de la secuencia en el objetivo. Los metodos de la invencion hacen uso de los aprestos de amplificacion especifica (HFE) del gene de hemocromatosis y las desigualdades de nucleotidos en o cerca del extremo 3' de un apresto del detector, para amplificar el gene de HFE y discriminar entre los alelos de tipo silvestre y los polimorfismos de nucleotidos sencillos, que pueden ocurrir en el exon 2 y el exon 4 del gene de HFE.

Description

OLIGONUCLEÓTIDOS PARA LA AMPLIFICACIÓN Y DETECCIÓN DE GENES DE HEMOCROMATOSIS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a oligonucleótidos para amplificar y detectar genes de hemocromatosis y, en particular, a oligonucleótidos para la detección de variaciones de secuencias en genes humanos de hemocromatosis .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La detección e identificación de variaciones en las secuencias del ADN entre individuos y especies, ha suministrado discernimientos en las relaciones de evolución, desórdenes de herencia, desórdenes adquiridos y otros aspectos de la genética molecular. El análisis de las variaciones de secuencias se ha realizado rutinariamente por el análisis del polimorfismo de longitud del fragmento de restricción (RFLP) , que depende de un cambio en la longitud del fragmento de restricción, como resultado de un cambio en la secuencia. El análisis del RFLP requiere la separación de tamaño de los fragmentos de restricción en un gel y la mancha Southern con una sonda adecuada. La técnica es lenta y de mano de obre intensa y no puede ser usada si el cambio de secuencia no resulta en un sitio de restricción nuevo o eliminado.

Más recientemente, se ha usado la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para facilitar el análisis de secuencia del ADN. Por ejemplo, los oligonucleótidos específicos de alelos se han usado para examinar manchas de puntos de los productos de la PCR para el diagnóstico de enfermedades. Si una mutación de punto crea o elimina un sitio de restricción, el desdoblamiento de los productos de la PCR puede ser usada para el diagnóstico genético (por ejemplo, la anemia de células falciformes) . Las técnicas generales de la PCR para el análisis de las variaciones de secuencias se han también reportado. S. K o , et al. (1990, Nucí . Acids Res . 18:999.1005) evaluaron el efecto den la PCR de varios desajustes del apresto-modelo para el propósito de diseñar aprestos para la amplificación del HIV, que sería tolerante de las variaciones de secuencias. Los autores también reconocieron que sus estudios podían facilitar el desarrollo de aprestos para la amplificación específica de alelos. Kwok, et al. informa que un desajuste de la terminal 3" en el apresto de la PCR produce resultados variables. En contraste con la excepción de un desajuste de 3' T, un desajuste terminal 3 ' acompañado por un segundo desajuste dentro de los últimos cuatro nucleótidos del apresto generalmente producirá una reducción drástica en el producto de amplificación. Los autores informan que un solo desajuste de un nucleótido de la terminal 3 ' (N-l) , dos nucleótidos de la terminal 3* (N-2) o tres nucleótidos de la terminal 3* (N-3) no tienen efecto en la eficiencia de la amplificación de la PCR. C.R. Newton, et al (1989, Nucí . Acids Res . 17:2503-2516) informan una mejora en la PCR para el análisis de cualquier mutación conocida en el ADN genómico. El sistema se refiere como un Sistema de Mutación Refractario de Amplificación, o ARMS, y emplea un apresto de la PCR específico de alelos. El nucleótido de la terminal 3* del apresto de la amplificación de la PCR es específico de alelos y, por lo tanto, no funcionará como un apresto de amplificación en la PCR si está desajustado al objetivo. Los autores también informaron que, en algunos casos, desajustes adicionales cerca de la terminal 3 * del apresto de amplificación mejoran la discriminación de alelos. La hemocromatosis (HC) es un desorden de herencia del metabolismo del hierro, que causa alta absorción del hierro y acumulación del hierro en exceso en los órganos mayores del cuerpo. (Para una revisión, véase E.C. Jazwinska, 1998, BioEssays 20:562-568). El gene responsable de la HC, designado HFE, se ha clonado y se han identificado dos mutaciones de sentido erróneo. Ambas mutaciones resultan en substituciones de aminoácidos en la proteína del HFE, una en el aminoácido 63 (H63D) y otra en el aminoácido 282 (C282Y) . Estas mutaciones están siendo investigadas como posibles pronósticos de riesgo para la HC. Las comparaciones de secuencias del gene HFE mostraron que es altamente homólogo a los genes de la familia de clase I del complejo de biocompatibilidad mayor. La secuencia genómica incluye siete exons y un marco de lectura abierto de 1,029 bases (J. N. Feder, et al . 1996. Nat . Genet . 13:399-408).

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención suministra métodos para detectar e identificar variaciones de secuencias en una secuencia de un ácido nucleico de interés, usando un apresto del detector. Este apresto del detector hibridiza a la secuencia de interés y se extiende por la polimerasa si el extremo 3' hibridiza eficientemente con el objetivo. Los métodos son particularmente muy adecuados para detectar e identificar diferencias de nucleótidos sencillas entre la secuencia objetivo evaluada (por ejemplo un alelo mutante de un gene) y una segunda secuencia del ácido nucleico (por ejemplo un alelo de tipo silvestre para el mismo gene) , conforme ellos hacen uso de los desajustes de nucleótidos en o cerca del extremo 31 del apresto detector, para discriminar entre un primer nucleótido y un segundo nucleótido, que pueden ocurrir en ese sitio en el objetivo. Se ha encontrado que la eficiencia reducida de la extensión del apresto por las polimerasas del ADN, cuando uno o más nucledtidos, en o cerca de la terminal 31 de un apresto, no hibridizan eficientemente con el objetivo, pueden ser adaptados para su uso como un medio para distinguir o identificar un nucleótido en el objetivo, el cual está en el sitio donde uno o más nucleótidos del apresto del detectar hibridizan. La eficiencia de la reacción de extensión para un apresto del detector seleccionado, hibridizado a un objetivo seleccionado, se vigila determinando la cantidad relativa del apresto del detector extendido, que se produce en la reacción de extensión.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras ÍA, IB, ÍC, ID y ÍE muestran los resultados del Ejemplo 1 para la detección e identificación de los polimorfismos sencillos de nucleótidos (SNP) usando un sistema objetivo modelo y aprestos del detector con un nucleótido de la terminal 3* de diagnóstico y un desajuste no de diagnóstico en N-3. Las Figuras 2A, 2B, 2C, 2D y 2E muestran los resultados del Ejemplo 2 para la detección e identificación de los SNP usando un sistema objetivo modelo y aprestos del detector, con un nucleótido de diagnóstico en N-l y sin desajuste no de diagnóstico. Las Figuras 3A, 3B y 3C muestran los resultados del Ejemplo 3 para la detección simultánea de tiempo real y la identificación de dos alelos del exon 4 del gene HFE. Las Figuras 43A, 4B y 4C muestran los resultados del Ejemplo 4 para una detección de identificación simultáneas de tiempo real, de dos alelos del exon 2 del gene HFE. La Figura 5 ilustra un posible mecanismo para la generación de señales falsas positivas, cuando los aprestos múltiples del detector en una reacción de amplificación tienen la misma secuencia de cola 5 • . La Figura 6 muestra los resultados del Ejemplo 5, que comparan el desempeño de los múltiples aprestos del detector en las reacciones, cuando estos múltiples aprestos del detector tienen las mismas o diferentes secuencias de cola 5 ' .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los métodos de la invención son útiles en detectar las variantes de una secuencia del ácido nucleico contenida en un ácido nucleico objetivo. En particular, los métodos de la invención se dirigen a detectar los polimorfismos sencillos de nucleótidos (SNP) en una secuencia de interés del ácido nucleico (por ejemplo los alelos) y, opcionalmente, para identificar estos SNP o alelos. Tales variantes de la secuencia de nucleótidos pueden ser detectadas directamente en una muestra que se va a analizar durante la amplificación de la secuencia objetivo. Los métodos de la invención se basan en la ineficiencia relativa de la primera extensión por las polimerasas del ADN, cuando ellas están desajustadas en o cerca del extremo 31 del apresto hibridizado a una secuencia complementaria de otra manera. Los solicitantes han encontrado que seleccionando los nucleótidos en o cerca del extremo 3 * del apresto detector, tal que uno o más desajustes ocurran, cuando el apresto del detector está hibridizado a un primer alelo de un ácido nucleico objetivo y ocurre el emparejamiento correcto de bases cuando el apresto del detector se hibridiza a un segundo alelo del ácido nucleico objetivo, la diferencia en la eficiencia de la extensión de la polimerasa cuando el apresto del detector se hibridiza a los dos alelos diferentes, puede ser usada para indicar cual alelo contiene el ácido nucleico objetivo. Cuando cualquiera de los múltiples alelos puede estar presente, se emplean múltiples aprestos de detector en el análisis, cada uno con un diferente potencial de desajuste en o cerca del extremo 3'.-El apresto del detector, el cual está extendido más eficientemente, proporciona la identidad del alelo (es decir, la identidad del nucleótido presente en la secuencia objetivo que se analiza) . Por ejemplo, si un conjunto de aprestos de detector, que comprenden A, G, . C y T en el sitio del alelo que se va a identificar, se hibridiza al objetivo de interés y se extiende, la identidad del alelo será el complemento del nucleótido en el apresto de señal que fue extendido más eficientemente por la polimerasa. Para la identificación del alelo en una sola reacción, están presentes múltiples aprestos de detector en la reacción y cada uno de estos aprestos tiene una etiqueta que se puede detectar separadamente con ellos (por ejemplo, loa fluoróforos diferentes pueden ser distinguidos dentro de la mezcla de los aprestos del detector) . Más específicamente, los aprestos del detector de la invención son oligonucleótidos que hibridizan a la secuencia de interés objetivo y se extienden por la polimerasa del ADN durante la reacción de amplificación isotérmica. La secuencia de nucleótidos del apresto del detector se selecciona de modo que hibridice específicamente el ácido nucleico objetivo de interés y la mayoría de las parejas básicas del apresto del detector correctamente en la forma de Watson-Crick con el objetivo. Sin embargo, la secuencia de nucleótidos del apresto del detector, en o cerca del extremo 3 * , se seleccionan para discriminar entre diferentes SNP o alelos de la secuencia objetivo (la posición del nucleótido de diagnóstico) . El nucleótido de diagnóstico se define como el nucleótido en el apresto del detector que permite el análisis (por ejemplo, la presencia o identificación) de un alelo particular en un objetivo seleccionado. Es decir, la secuencia del extremo 3' del apresto del detector se selecciona de modo que la hibridización con la primera variación del nucleótido sencilla de la secuencia objetivo (por ejemplo, un tipo silvestre o alelo mutante de un gene) resulta en la pareja básica correcta de Watson-Crick en el sitio del SNP y la hibridización del apresto del detector con un objetivo que contiene una segunda variación sencilla de nucleótidos de la secuencia objetivo en el mismo sitio (por ejemplo, un segundo alelo mutante del gene) resulta en un desajuste entre el apresto del detector y el objetivo. Como un ejemplo de cómo el desajuste en el apresto permite la discriminación de alelo en reacciones de amplificación, si un apresto de detector que tiene un residuo C en la posición del nucleótido de diagnóstico produce una alta señal indicativa de la extensión eficiente del apresto del detector, esto indica que el alelo objetivo es G. En contraste, una señal baja para el apresto del detector extendido indica que el alelo objetivo no es G. El uso del apresto del detector para obtener el análisis permite la identificación de un alelo si sólo el SNP se espera ocurra en el objetivo. Si puede haber múltiples diferentes alelos presentes en la misma posición de nucleótido, un solo apresto de detector suministrará la información en la presencia o ausencia del alelo para el cual el apresto del detector es diagnosticado. Para identificar el alelo cuando son posibles múltiples SNP, múltiples aprestos del detector que contienen A, T y G en el sitio del SNP pueden ser usados para identificar el alelo en el objetivo, es decir, el apresto del detector que produce una alta señal asociada con el producto de extensión del apresto del detector contiene el nucleótido el cual es el complemento del SNP en el objetivo. EN la presente invención, , el nucleótido potencialmente desajustado del apresto del detector se coloca en la terminal 3 ' o aproximadamente uno a cuatro residuos de nucleótidos desde la terminal 3' (es decir, en la posición N, N-l, N-2, N-3 o N-4) . Se ha encontrado, inesperadamente, que en muchos casos es preferible colocar un segundo desajuste en la secuencia del apresto del detector, el cual no se dirige a la detección o identificación del alelo de interés. El segundo desajuste no de diagnóstico mejora el nivel de discriminación entre los SNP que se detectan o identifican y se selecciona preferiblemente con base en una región de la secuencia objetivo, que no se espera varíe de modo que el desajuste no de diagnóstico ocurrirá independientemente del alelo objetivo que se analiza. El segundo desajuste puede ocurrir en cualquier sitio dentro del apresto del detector, que produce un efecto positivo en la determinación del alelo, pero típicamente produce la mejora más grande cuando está cerca del nucleótido de diagnóstico. Esto está típicamente dentro de uno a quince nucleótidos desde el nucleótido de diagnostico, pero preferiblemente dentro de aproximadamente 1-5 nucleótidos del nucleótido de diagnóstico del apresto del detector. Los solicitantes creen que el segundo desajuste no de diagnóstico tiene un efecto posicional más bien que un efecto general en la Tm del apresto del detector, con base en la observación de que conforme se mueve el desajuste no de diagnóstico en alejamiento del desajuste de diagnóstico su efecto positivo en la discriminación del alelo disminuye. Los expertos en la materia serán capaces de determinar, a través de la experimentación rutinaria, la colocación apropiada del desajuste no de diagnóstico en un apresto del detector por la evaluación de su efecto en la discriminación de alelo, usando este apresto del detector. Aunque se sabe que un desajuste en un oligonucleótido más corto tendrá un efecto más grande en la hibridización que un desajuste en un oligonucleótido más largo, la discriminación del alelo que usa los aprestos del detector de la invención no pueden ser atribuidos enteramente al efecto de hibridización asociada con la Tm. Por ejemplo, moviendo la posición del nucleótido de diagnóstico en alejamiento del extremo 3* del apresto del detector hacia el centro de la molécula, reduce substancialmente la discriminación. Si el solo mecanismo de discriminación entre alelos fue la eficiencia de hibridización asociada con la Tm, la recolocación debe aumentar más bien que disminuir la discriminación del alelo.

Hemos observado que lo opuesto, es decir, que la mejor discriminación de alelo ocurre cuando el nucleótido de diagnóstico está cerca del extremo 3 • del apresto del detector. Además, hemos observado que los aprestos del detector que contienen un desajuste de diagnóstico el cual no está en la terminal 3 * y un desajuste adicional no de diagnóstico, como se describe abajo, suministra una buena discriminación del alelo en los aprestos del detector relativamente más largos, donde simples diferencias en la eficiencia de hibridización entre los aprestos de detectores ajustados y desajustados se espera sea mínima. El hecho que el nucleótido no de diagnóstico mejora la discriminación cuando se ubica cerca del nucleótido de diagnóstico y tiene poco efecto cuando se coloca por más de quince nucleótidos en alejamiento ulterior sugiere que los factores además de la modificación de la eficiencia de hibridización se implican en la discriminación de alelos, de acuerdo con la invención. Los aprestos del detector de la invención tienen típicamente de 12 a 50 nucleótidos de longitud. Cuando sólo un nucleótido de diagnóstico está presente, el apresto del detector es preferiblemente de unos 12 a 24 nucleótidos de largo, más preferiblemente de 12 a 19 nucleótidos de largo. Para aprestos del detector que contienen un nucleótido tanto de diagnóstico como no de diagnóstico, longitudes de unos 12 a 50 nucleótidos son preferidas, más preferidas de 15 a 36 nucleótidos y especialmente preferidas de 18 a 24 nucleótidos. Los aprestos del detector pueden ser empleados en una variedad de maneras en los métodos de amplificación isotérmica de la invención. En una primera modalidad, el apresto del detector puede ser un apresto de amplificación para el uso en una reacción de amplificación del ácido nucleico. Es decir, el apresto del detector puede realizar dos funciones en una reacción de amplificación amplificación de la secuencia objetivo de interés y detección o identificación de los SNP dentro de la secuencia objetivo (un "apresto de detector/amplificación") . La estructura y función de los aprestos de amplificación para SDA, 3SR, NASBA, TMA y otras reacciones de amplificación isotérmicas, son bien conocidas en el arte y se encuentra dentro de la experiencia ordinaria en el arte adaptar estos aprestos de amplificación para el uso como aprestos del detector en la presente invención, seleccionando la secuencia de nucleótidos 3' como se enseña aquí. Para la PCR, no se requieren secuencias o estructuras especiales en el apresto de amplificación para impulsar la reacción de amplificación. Por esta razón, los aprestos de amplificación para la PCR consisten generalmente sólo de las secuencias de unión objetivo. EN otras reacciones de amplificación, sin embargo, los aprestos de amplificación comprenden secuencias especializadas y estructuras, necesarias para que ocurra la reacción de amplificación. Por ejemplo, los aprestos de amplificación para 3S y NASBA comprenden un promotor de la polimerasa del ARN cerca del extremo 5 ' . El promotor se anexa a la secuencia objetivo y sirve para impulsar la reacción de amplificación por dirigir la transcripción de múltiples copias del ARN del objetivo. Aprestos de amplificación para SDA comprenden un sitio de reconocimiento para una endonucleasa de restricción cerca del extremo 5 • . El sitio de restricción está anexo a la secuencia objetivo y llega a ser semimodificado y de cordón doble durante la reacción de amplificación. El corte del sitio de restricción una vez que llega a ser de cordón doble impulsa la reacción del SDA, permitiendo la síntesis y el desplazamiento de múltiples copias del objetivo por la polimerasa. Cuando el apresto de detector/amplificación forma un desajuste con el objetivo, en o cerca de su extremo 3', la eficiencia de amplificación se reduce y la reducción acompañante en la señal al detectar el apresto extendido de detector/amplificación (es decir, el producto de amplificación o amplicón) indica la presencia o la identidad de un SNP en la posición del nucleótido en el objetivo, cuando el desajuste de diagnóstico con el apresto de detector/amplificación ocurre. Si el apresto de detector/amplificación se suministra con una etiqueta que produzca un cambio de señal cuando el apresto de detector/amplificación se ha extendido (como se discute abajo) , los productos de extensión pueden ser detectados en tiempo real conforme ocurre la amplificación del objetivo, eliminando así las etapas adicionales de la detección después de la amplificación de los productos de extensión. En las reacciones de amplificación isotérmicos, tal como SDA, un solo desajuste de N-l o N-2 en el apresto de detector/amplificación, en general, puede suministrar una discriminación de alelos más eficiente que un solo desajuste en la terminal 3 ' . Un desajuste en la terminal 3 • no se prefiere cuando el apresto del detector es un apresto de amplificación para una reacción de amplificación isotérmica. Esto es en contraste con las enseñanzas de la técnica anterior para las reacciones de amplificación de ciclos de temperatura, donde un desajuste de la terminal 31 en el apresto de amplificación de la PCR, como se informa, dan la discriminación adecuada de alelo (véase Kwok, et al., supra) . Sin embargo, también en contraste con las enseñanzas de la técnica anterior para la PCR, en los métodos de amplificación isotérmica de la presente invención, un desajuste del apresto del detector/amplificación en N-l a N-4 y un nucleótido complementario de la terminal 3 • resulta en una excelente discriminación de alelos, particularmente si se incluye el segundo desajuste no de diagnóstico opcional. Esta modalidad, por lo tato, es preferida para los aprestos de detector/amplificación de la invención. En una modalidad alternativa preferida, el apresto del detector se usa en una reacción de amplificación isotérmica como un solo apresto (también nombrado como una sonda del detector) como se enseña en la patente de E.U.A., No. 5,547,861, cuya descripción se incorpora aquí como referencia. En la reacción de amplificación, el apresto de señal hibridiza a la secuencia objetivo corriente abajo del apresto de amplificación de modo que la extensión del apresto de amplificación desplace el apresto de señal y su producto de extensión. Después de la extensión, el apresto de señal incluye la secuencia corriente abajo, la cual está en el sitio de hibridización por el segundo apresto de amplificación. Este segundo apresto de amplificación hibridiza al apresto de señal extendida y las síntesis del apresto de su cordón complementario. La producción de estos productos de amplificación secundarios de doble cordón puede ser detectada no sólo como una indicación de la presencia de la secuencia objetivo, sino en los métodos de la invención un apresto de señal el cual tiene las características de secuencia de un apresto de detector (apresto de detector/señal) también facilita la detección y/o identificación de los SNP dentro de la secuencia objetivo.

En esta modalidad, un desajuste de diagnóstico en cualquiera de la terminal 3* (N) o en N-l a N-4, suministra una excelente discriminación de alelos. Esta discriminación de alelos no se mejora ulteriormente con el uso de un segundo desajuste no de diagnóstico, como se describió previamente, en particular cuando se usan aprestos de detector más largos, donde la diferencia en la eficiencia de hibridización entre los aprestos ajustados y desajustados es pequeña. Este hallazgo fue inesperado, ya que el desajuste de diagnóstico de la terminal 3 ' solo produce una pobre discriminación de alelos en los aprestos de detector/amplificación. El uso de un apresto de detector/señal en una reacción de amplificación isotérmica también permite la detección de los productos de extensión y el análisis de los SNP en el tiempo real (es decir, concurrentemente con la amplificación) cuando el apresto de detector/señal se etiqueta con un grupo informador, que produce un cambio detectable en la señal cuando el apresto de detector/señal se extiende. Alternativamente, el apresto de detector/señal puede ser usado después de la amplificación o sin amplificar el objetivo para la detección de los SNP. En esta modalidad, el apresto de la señal del detector se hibridiza al objetivo corriente debajo de cualquier apresto, que se puede extender por la polimerasa, de modo que la extensión del segundo apresto desplace el apresto de detector/Señal y cualquier producto de extensión del apresto de detector/señal que pudiera ser producido. Los solicitantes hipotetizan que los diferentes resultados obtenidos con un desajuste de diagnóstico en la terminal 3 ' de un apresto de detector/señal en comparación al desajuste de diagnóstico en la terminal 3 ' de un apresto de detector/amplificación, pueden ser debidos, al menos parcialmente, a un efecto cinético. Si un apresto de señal no se extiende eficientemente en un objetivo, al cual se hibridiza (por ejemplo, cuando contiene desajustes) , será desplazado rápidamente desde el modelo por la extensión del apresto de amplificación corriente arriba. Si el apresto de señal se extiende eficientemente, la extensión ocurrirá antes que el apresto de señal sea deslazado desde el objetivo. Es decir, el apresto de amplificación corriente arriba (que está típicamente ajustado en forma perfecta y extendido eficientemente) impone un "límite de tiempo" para la extensión en el apresto de detector/señal. En contaste, el apresto de amplificación en una reacción de amplificación isotérmica no tiene un límite de tiempo para la extensión impuesta en él, por componentes adicionales de la reacción de amplificación isotérmica o por el ciclo térmico. Por lo tanto, con suficiente tiempo disponible, un apresto de detector/amplificación puede finalmente ser extendido aún cuando la reacción de extensiones ea ineficiente. Este fenómeno puede reducir la discriminación entre alelos, cuando un apresto de detector/amplificación con un desajuste de la terminal 3 ' se emplea en las reacciones de amplificación isotérmicas. Sin embargo, el límite de tiempo puede ser impuesto antes de la amplificación si un segundo apresto se une corriente arriba desde el apresto de amplificación, como se describe en la patente de E.U.A. , No. 5,270,184 (por ejemplo el apresto "externo" o "amortiguador") . EN este caso, la extensión del apresto corriente arriba coloca un límite de tiempo en la extensión del apresto de amplificación. Si la extensión del apresto de amplificación se retarda por un desajuste en o cerca del extremo 3 ' , el apresto de amplificación puede ser desplazado por el alargamiento del apresto corriente arriba antes de "extenderse. Este efecto cinético es esperado aumente la habilidad de los aprestos de amplificación a discriminar entre los objetivos ajustados y desajustados, antes de la amplificación, cuando hay un apresto corriente arriba ara desplazarlos. Sin embargo si ocurre un apresto equivocado, la habilidad de los aprestos de amplificación a corregir un desajuste con el objetivo puede resultar en un producto de amplificación, el cual no es una copia fiel del objetivo original. Los aprestos de amplificación producen amplicones que son ajustados perfectamente con los aprestos de amplificación que los producen, eliminando así la base de la discriminación de alelo. En contraste, tal "corrección" no ocurre con los aprestos de señales. Si la hibridización del apresto del detector resulta en una pareja base correcta o un desajuste en la posición del nucleótido de diagnóstico del objetivo que se analiza se determina evaluando la eficiencia relativa de la extensión del apresto del detector por la polimerasa del ADN. Este discriminación puede ser cuantitativa o cualitativa. La extensión del apresto del detector es menos eficiente en la presencia de un desajuste en o cerca del extremo 3 * y más eficiente cuando todo el extremo 3 ' está emparejado correctamente en la base con el objetivo. Es decir, el producto del apresto del detector relativamente más extendido se produce con la pareja base correcta cerca del extremo 3 * . El apresto del detector extendido se detecta típicamente por medio de una etiqueta asociada con el apresto del detecto. La etiqueta puede ser detectada directamente o se puede detectar sólo después de una reacción subsecuente, como se conoce en el arte. Alternativamente, el propio apresto del detector puede estar sin etiqueta y el producto de extensión detectado pro la hibridización a una sonda etiquetada o en una reacción subsecuente, tal como el tratamiento con el bromuro de etidio para la visualización sobre un gel. La cantidad relativa de la señal de la etiqueta que se asocia con el apresto del detector extendido en comparación con la cantidad de la señal asociada con el apresto sin extender, sirve como una indicación de la cantidad del producto de extensión producido y la eficiencia de la reacción de extensión. Existen muchas técnicas conocidas en el arte para determinar la presencia o cantidad del producto del apresto del detector extendido producido en la reacción de amplificación. Primera, para los productos de extensión del apresto del detector pueden ser detectados y/o cuantificados por su tamaño aumentado, por ejemplo, por la separación del apresto del detector sin extender por la electroforesis de gel o por capturar selectivamente el apresto del detector extendido en una ase sólida. Sin embargo, en una modalidad preferida, los aprestos del detector se etiquetan con un grupo informado que se puede detectar solamente cuando el apresto del detector se ha extendido o una etiqueta que produce un cambio en la señal solamente cuando el apresto del detector se ha extendido. Un ejemplo de tal etiqueta son los tintes fluorescentes que sufren cambios en la polarización de la fluorescencia cuando los oligonucleótidos a los cuales se enlazan se han hibridizado y extendido sobre una secuencia objetivo. Los métodos de emplear cambios en la polarización de fluorescencia para detectar la hibridizasión y extensión de un apresto de señal se describen en las patentes de E.U.A., No. 5,800,989; No. 5,593,867 y No. 5,641,633. Estas patentes describen el uso de ambos en la polarización de la fluorescencia que ocurre cuando el apresto de señal llega a ser de doble cordón (hecho posible por su extensión exitosa en la secuencia objetivo) para detectar la amplificación objetivo. En los métodos de la invención, los cambios en la polarización de fluorescencia del apresto del detector rotulado fluorescentemente pueden ser usados para evaluar la eficiencia de extensión y detectar o identificar un SNP en el objetivo que se amplifica. Un segundo ejemplo de etiquetas que sufren un cambio detectable en la señal, indicativo de la extensión del apresto, son las parejas de tintes de donador fluorescente/extinguidor. El tinte extinguidor puede también ser fluorescente, pero no necesariamente. Cuando el donador y extinguidor están en proximidad estrecha, la fluorescencia del donador es extinguida. Conforme los tintes se mueven en alejamiento, la extinción se reduce y la fluorescencia del donador aumenta. El uso de parejas de tintes de donador/extinguidor en una variedad de mecanismos para aumentar la distancia entre los tintes en la presencia del objetivo para la detección de los ácidos nucleicos objetivo, se describen en las patentes de E.U.A., No. 5,846,726, No. 5,691,145 y en la patente europea EP 0 881 302. Se describen tanto el uso en las parejas de tintes de donador/extinguidor en los sistemas de amplificación del apresto de señal como en los aprestos/sondas extensibles para la detección de objetivos no amplificados o después de la amplificación. En la presente invención, los aprestos del detector de la invención pueden ser rotulados con parejas de tintes de donador/extinguidor y empleadas para la detección y/o identificación de los SNP en el objetivo, como es conocido en el arte. Como se describió en las referencias anteriores, una variedad de sistemas de detección de la extensión del apresto son conocidos para el uso en esencialmente cualquier reacción de amplificación del ácido nucleico. Ellos son particularmente bien adecuados para las reacciones de amplificación isotérmica, cuando ellos suministran una detección de tiempo real, rápida, de la extensión del apresto. En los métodos de la presente invención, los aprestos del detector pueden ser rotulados con estructuras que contienen grupos informadores fluorescentes como enseñan las referencias anteriores y el producto de extensión detectado por los cambios en la polarización de fluorescencia o la extinción de fluorescencia. Alternativamente, el apresto del detector puede estar sin rotular y su producto de extensión detectado por hibridización a un apresto/sonda con detección de los cambios en la polarización de la fluorescencia o la extinción de la fluorescencia del apresto/sonda, como enseñan estas referencias.

EJEMPLO 1 Para demostrar la identificación de un solo polimorfismo de nucleótidos que usan aprestos del detector rotulado, que difieren por sólo un nucledtido, se prepararon oligonucleótidos objetivo modelo como sigue: Cuatro oligonucleótidos que contienen secuencias idénticas, excepto en una posición, se sintetizaron. La posición variable del oligonucleótido contenía o adenosina (A) , citosina (C) , guanina (G) o timina (T) . Un quinto oligonucleótido complementario a las terminales 3 ' de los cuatro oligonucleótidos variantes también se sintetizó. Cada uno de los cuatro oligonucleótidos variantes se mezcló con el quinto oligonucleótido, se calentó durante 2 minutos en un baño de agua hirviente y se equilibró a 37sc en un incubador seco. El oligonucleótido variante templado y el quinto oligonucleótido luego se extendieron en una primera reacción de extensión, que comprende 14 mM de a- (0-1-tio) -trifosfato de desoxicitidina, 2 mM de trifosfato de desoxiadenosina, 2 mM de trifosfato de desoxiguanosina, 2 mM de trifosfato de timidina y 40 unidades de polimerasa del ADN Klenow, deficiente de exonucleasa. Las reacciones de extensión de apresto se dejaron proceder durante 45 minutos a 372C, seguido por inactivar la polimerasa Klenow incubando las reacciones a 702C durante 10 minutos en un incubador seco. Esto produjo cuatro secuencias objetivo modelo del ADN de doble cordón, que difieren sólo en una porción de nucleótido. Los objetivos se designaron como objetivos A, C, g y T. Un segundo juego de cuatro oligonucleótidos, que hibridizan a las secuencias de objetivo modelo, con sus terminales 3' en la posición del nucleótido polimórfico, también se sintetizaron para el uso como aprestos del detector. Cada uno de los cuatro aprestos del detector tenían una de las cuatro bases de nucleótido (A, C, G o T) en su terminal 31 (N, el nucleótido de diagnóstico) y un nucleótido "A" en las tres bases de posición desde la terminal 3', que formó un desajuste con la secuencia objetivo modelo (N-3, el nucleótido no de diagnóstico). Los cuatro aprestos de detector se radio-rotularon en reacciones de 25 µl que contiene 1 µM del apresto del detector, 25 unidades de la cinasa del polinucleótido T4 (PNK) , 175 µCi de trifosfato a-[32P] -adenosina (32P-ATP) y el regulador PNK a una concentración de IX. Las reacciones de etiquetado se iniciaron por la adición del NK a una solución que contiene los otros componentes. Las reacciones se incubaron durante 20 minutos a , 37sc, luego se calentaron en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos para inactivar el PNK. Los aprestos del detector se usaron como los aprestos de señal en la reacción de amplificación. Una parte alícuota de 5 µl de cada preparación de apresto de detector etiquetada se agregó a una reacción de SDA separada para cada objetivo (50 µl que comprenden 40 mM de KH2PO4/K2HPO4, pH de 7.6; 10% vol/vol de glicerol; 7.5 mM de acetato de magnesio; 0.5 µM del apresto de amplificación; 1.4 mM de a- (O-l-tio) -trifosfato de desoxicitidina; 0.5 mM de trifosfato de desoxiadenosina; 0.5 M de trifosfato de desoxiguanosina; 0.5 mM de trifosfato de timidina; 0.1 mg/ml de albúmina de suero de bovino; 0.5 µg de ADN de placenta humana, 104 moléculas del ADN objetivo, A, C, G ó T; 100 nM del apresto del detector radio-rotulado; 160 unidades de la endonucleasa de restricción de BsoBi y 25 unidades del fragmento grande de polimerasa del ADN de Bst) . Las reacciones de SDA se ensamblaron sin el BsoBi y Bst, y los dúplex de ADN objetivo se desnaturalizaron calentando estas mezclas de reacción durante 3 minutos en un baño de aguja hirviente. Las mezclas de reacción se equilibraron a 55SC durante 3 minutos en un incubador seco y el SDA se inició agregando 160 unidades de BsoBI y 25 unidades del fragmento grande de polimerasa de Bst a cada reacción (volumen total de enzimas de 2 µl, ajustado con 50% vol/vol de glicerol) . El SDA se dejó proceder durante 30 minutos a 55ac. Partes alícuotas de cada reacción (5µl) se removieron en intervalos de 5 minutos, durante la reacción y se agregaron a 5 µl de la solución de detención de la secuencia para extinguir la reacción de SDA. Cuando todas las muestras se habían recogido, ellas se incubaron en un baño de agua hirviente durante 3 minutos y 5 µl de cada muestra se cargaron en 8% de poliacrilamida, 7N de gel de secuencia de urea. Seguido por la electroforesis a 65 durante 50 minutos, los productos de reacción radio-rotulados y la sonda sin reaccionar sobre el gel se cuantificó exponiendo una laca Molecular Dynamic Phosphorimager™ al gel durante 15 minutos y leyendo el número de cuentas presente en el producto radio-rotulado y las bandas de sonda en la placa Phosphorimager™, usando el software (programa) ImagenQuant™. Las Figuras ÍA, IB, ÍC y ID muestran los resultados obtenidos por la extensión de cada uno de los cuatro aprestos del detector en cada una de las cuatro diferentes secuencias objetivo modelo. En cada caso, el apresto del detector con el nucleótido 3 * que fue la coincidencia correcta para el nucleótido polimórfico en la secuencia del ADN objetivo, se extendió preferiblemente durante SDA por la polimerasa del ADN, cuando se compara a los aprestos del detector que no contienen la coincidencia 31 correcta para el nucleótido polimórfico en el objetivo, como es evidente por las cantidades mayores del apresto del detector correcta después de la amplificación. Por ejemplo, el apresto del detector 3 'A se extiende preferiblemente sólo en las reacciones de SDA que contienen la secuencia objetivo T (Figura ÍA) . Esencialmente no hubo extensión del apresto del detector 3 'A en las secuencias objetivo C, G o A. Los productos de extensión producidos durante SDA incluyen las sondas del ADN radio-rotuladas extendidas, de longitud completa, y los amplicones extendidos con muesca característicos de SDA. Similarmente, el objetivo T soportó poca o ninguna extensión de los aprestos del detector 3C, 3G y 3T (Figuras IB, ÍC y ID) . Resultados similares se ven usando cada uno de los . otros aprestos del detector en las reacciones de la amplificación objetivo (aprestos de detector 3C, G y 3T, mostrados en las Figuras IB, ÍC y ID, respectivamente) , es decir, el apresto del detector se extendió preferiblemente sobre el objetivo que produjo la coincidencia 3 ' correcta en la posición polimórficas en el objetivo. EN contraste, cuando el apresto de amplificación de SDA con un C en la terminal 3 ' se usó como un apresto de detector/amplificación en las reacciones de amplificación en que el alelo no pudo ser identificado (Figura ÍE) . Estos resultados ilustran que los aprestos de detector/señal de N/N-3, de acuerdo con la invención, pueden ser usados en reacciones de amplificación isotérmica para identificar el nucleótido presente en una posición seleccionada en una secuencia de ácido nucleico objetivo, en tanto los aprestos de detector/amplificación N/N-3 para las reacciones de amplificación isotérmicas no discriminan efectivamente entre alelos.

EJEMPLO 2 Se repitió el Ejemplo 1, excepto que los aprestos de detector/señal se sintetizaron de modo que el nucleótido de diagnóstico, variante, colocara un nucleótido desde la terminal 3' del apresto de detector (N-l) y la longitud general del apresto del detector se acortara por 4 nucleótidos en el extremo 5 ' . Los aprestos del detector también hicieron una coincidencia perfecta con el ADN objetivo en la posición de tres nucleótidos desde la terminal 31 del apresto del detector. Cada uno de los aprestos del detector se agregó a reacciones de SDA separadas que contienen 10 moléculas de cada una de las secuencias objetivo. Los objetivos se amplificaron y detectaron como se describió previamente. Las Figuras 2A (apresto de detector -ÍA) , 2B (apresto de detector -ÍC) , 2C (apresto de detector -1G) y 2D apresto de detector -ÍT) muestran los resultados de los experimentos. En cada caso, durante la amplificación, el apresto del detector se extendió preferiblemente sobre el objetivo, el cual contiene la coincidencia perfecta en la posición variante. Las señales obtenidas con el apresto del detector que coincide perfectamente y el objetivo fueron de 30 a 100 veces mayores que las señales obtenidas con cualquiera de las parejas de apreso/objetivo del detector desajustadas. Esta diferencia en la señal permitió la identificación no ambigua del nucledtido polimorfo en el objetivo y está en contraste con los resultados reportados para la PCR por Kwok et al., supra , donde el desajuste N-l no tiene efecto en el rendimiento de los amplicones de la PCR. Se obtienen resultados similares usando un apresto de detector/señal que tiene un nucleótido (G) de diagnóstico N-l y un segundo desajuste de no diagnóstico con los objetivos de N-2 (A) . Este apresto de detector fue de cinco nucleótidos más largo en el extremo 5 ' que los aprestos del detector usados en el Ejemplo 1. El apresto del detector se agregó a cada una de cuatro reacciones de separadas, preparadas como en el Ejemplo 1. y se encontró se extendía preferiblemente en el objetivo que contenía la coincidencia correcta para el nucleótido (C) de diagnóstico. La Figura 2E muestra que la señal obtenida con el objetivo simplemente desajustado fue sobre cinco veces mayor que aquél obtenido con cualquiera de los objetivos doblemente desajustados y que el alelo C puede ser fácilmente distinguido de los alelos T, G y A del objetivo.

EJEMPLO 3 En los siguientes experimentos, un polimorfismo de nucleótidos sencillo en exon 4 del gene HFE (el gene responsable de la hemocromatosis) y el alelo de tipo silvestre se detectaron e identificaron simultáneamente en el tiempo real durante la amplificación usando los aprestos de detector de la invención. El alelo de tipo silvestre es un G en el nucleótido 845, en tanto el alelo mutante es un A en esta posición. Esto resulta en un cambio de cisteína a tirosina en la posición 282 de aminoácidos en la proteína. El SDA se ejecuta generalmente como se describe en la patente de E.U.A., No. 5,846,726, excepto que cada mezcla de reacción contiene dos aprestos de detector/señal, de acuerdo con la invención (uno específico para el alelo mutante y otro específico para el alelo de tipo silvestre) y BsoBI substituye a Aval. Las concentraciones finales de los componentes en cada 100 µl de reacción fueron de 50 mM de KiP0 (pH de 7.5), 6.0 mM de MgOAc, 0.2 mM de cada dTTP, dGTP, dATP, 1.4 mM de dCTPaS, 5 µg/ml de BSA acetilado, 15% (vol/vol) de glicerol, 400 ng de ADN de esperma de salmón, 20 unidades de polimerasa Klenow Bst exo", 160 unidades de BsoBI y cualquiera de 0 o 105 copias del ADN objetivo. En este ejemplo, el ADN objetivo consiste de los productos de la PCR generada del ADN clonado de cualquier ADN de exon 4 de HFE normal o mutante. El ADN de exon 4 de HFE normal contiene un G en la posición de nucleótidos 845 del gene de tipo silvestre de HFE y el ADN de exon 4 del HFE mutante contiene un SNP en esa posición, en que el nucleótido fue A. Cada muestra también contiene dos aprestos de detector/señal (SEC ID N0:1 y SEC ID N0:2 siguientes), dos aprestos reguladores sin rotular (SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 4 siguientes) y dos aprestos de amplificación de SDA sin rotular (SEC ID N0:5 y SEC ID N0:6 siguientes). Las secuencias subrayadas indican la forma complementaria de la secuencia objetivo. La base A en la posición N-3, que no está subrayada no es complementaria al nusleótido correspondiente en la secuencia objetivo. Este desajuste interno mejora la selectividad de este apresto del detector para la posición de nucleótidos 845. C representa el nucleótido en la terminal 3 ' (posición N del apresto del detector) que hace pareja con G en la posición 845 del objetivo de tipo silvestre. T representa el nucleótido de la terminal 3' que hace pareja con A en la posición de nucleótidos 845 del objetivo mutante (la mutación G845A) . Las secuencias en letra itálica representan los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción (RERS) . En los aprestos de amplificación los RERS suministran el sitio de muesca que impulsa SDA. En los aprestos del detector, los RERS están flanqueados por dos tintes, los cuales forman una pareja de tintes de donador/extinguidor. Conforme el apresto de detector/señal se extiende, se desplaza y se hace de doble cordón y los RERS también llegan a ser de doble cordón y desdoblables por la enzima de restricción. Para detectar la cantidad del producto de extensión de doble cordón, los productos de reacción se tratan con la enzima de restricción apropiada para desdoblar los RERS del apresto del detector. La extinción del tinte fluorescente disminuye los productos de doble cordón que se desdoblan y la pareja de tintes se separa. El aumento en la fluorescencia es un indicador de la cantidad del apresto del detector de doble cordón extendido, producido. Si el apresto del detector no se extiende eficientemente, los RERS permanecen de un solo cordón, no se desdobla por la enzima de restricción y el tinte fluorescente permanece extinguido. La falla en detectar un aumento en la fluorescencia, por lo tanto, indica que el apresto del detector no se extendió eficientemente en el objetivo.

SEC ID N0:1 - Apresto del detector específico para el nucleótido G en la posición 845 (tipo silvestre) : FAM-TC CTC GAGT (dabcyl) AT GGG TGC TCC ACC AGG C* (300 nM) SEC ID NO: 2 - Apresto del detector específico para el nucleótido A en la posición 845 (mutante) : Rox-TT CTC GAGT (dabcyl)TA CAT GGG TGC TCC ACC AGG T (300 nM) SEC: ID NO: 3 - primer apresto regulador para exon 4: CGA ACC TAA AGA CGT ATT CGG C (50 nM) SEC ID NO: 4 - segundo apresto regulador para exon 4: CCC CAA TAG ATT TTC TCA GCT CC (50 nM) SEC ID NO: 5 - primer apresto de amplificación de SDA para exon 4 : ACC GCA TCG ATT GCA TGT CTC GGG CTG GAT ACC CTT GGC T SEC. ID NO: 6 - segundo apresto de amplificación de SDA para exon 4 : CGA TTC CGC TCC AGA CTT CTC GGG AGA TCA CAA TGA GGG GCT GA Cada reacción de SDA incluye ambos aprestos de detector, cada uno rotulado con un diferente fluoróforo, como se mostró anteriormente. Las reacciones se ensamblaron en microcavidades para contener todos los reactivos, excepto Bst y BsoBI y la amplificación se inició después de la desnaturalización por calor y el equilibrio a 552C por la adición de las enzimas. Las microcavidades se sellaron y colocaron en un Cytofluor II™ que se ha modificado para permitir el control de la temperatura. Filtros de paso de banda se usaron para limitar la excitación a un intervalo de longitud de onda característico de la fluoresceína (475-495 nm) y un segundo intervalo específico para ROX (635-655 nm) . Para cada cavidad, una lectura de fluoresceína y una de ROX se hicieron cada 45 segundos. Las reacciones se vigilaron típicamente durante 90 minutos. Las reacciones de control no contenían el ADN objetivo. Los resultados se muestran en las Figuras 3A, 3B y 3C. En muestras que contienen sólo objetivos derivados del ADN normal de exon 4 (Figura 3A) , la fluorescencia aumentó fuertemente con el tiempo en el intervalo de longitud de onda de emisión característico de la fluoresceína (FAM, 520-540 nm) , que indica que el apresto del detector de la SEC ID N0:1 se extendió eficientemente en este objetivo e identifica la presencia del alelo de tipo silvestre. En contraste, en las muestras normales de exon 4, la fluorescencia característica de ROX (635-655 nm) permaneció baja, que indica que el apresto del detector de la SEC. ID N0:l no fue extendida eficientemente en el objetivo durante la amplificación y que confirma de la ausencia del alelo mutante. En contraste, el perfil de fluorescencia se invirtió para muestras que contienen el ADN derivado del ADN mutante del exon 4 y que carece del ADN normal (Figura 3B) . En estas muestras, la fluorescencia aumentó fuertemente en las longitudes de onda de emisión de ROX, pero no las longitudes de onda de FAM, que indica la presencia del alelo mutante y la ausencia del alelo de tipo silvestre. En la muestra que contiene tanto el ADN de tipo silvestre como el mutante, la fluorescencia aumentó en ambos intervalos de vigilancia, que indica la presencia de ambos alelos en la muestra (Figura 3C) . En un experimento similar, un apresto del detector alternativo específico del alelo del tipo silvestre, se probó y su desempeño se comparó con el apresto del detector de la SEC ID NO:l. El apresto del detector alternativo tiene un nucleótido de diagnóstico en N-2 y un segundo nucleótido no de diagnóstico en N-3 (un apresto de detector N-2/N-3; FAM-TC, CTC GAG T(dabacyl)AT GGG TGT ACC TGA C*AC ; SEC. ID NO: 14) . Además, el apresto de amplificación SEC OD NO: 5 se reemplazó con la SEC ID NO: 15 (ACG CAG CAG CAC ACÁ TTC TCG GGG AAG AGC AGA GAT ATA CGT) . Se probaron dos muestras usando la SEC ID NO: 14 - una que contiene sólo el objetivo de tipo silvestre y la otra que contiene sólo el objetivo mutante. Cada reacción de prueba contiene la SEC ID NO: 14 para la detección del alelo de tipo silvestre y la SEC ID NO: 2 para la detección di objetivo mutante. El sistema del apresto del detector de SEC ID N0:1/SEC ID NO: 2 sirvió como una reacción de control. Tanto la fluoresceína como la fluorescencia de rodamina se vigilaron y las lecturas de la fluorescencia para cada muestra se proyectaron. En la muestra que contiene el objetivo de tipo silvestre, el apresto del detector N-2/N-3 se convirtió, resultando en un aumento de tres veces en la emisión de la fluoresceína. El apresto del detector específico mutante permaneció sin convertir y la emisión de rodamina fue esencialmente sin cambiar. En la muestra que contiene sólo el objetivo mutante, el patrón se invirtió. El apresto del detector de N-2/N-3 no fue convertido, como se indica por no haber cambio en la emisión de la fluoresceína, pero la emisión de rodamina desde el apresto del detector específico mutante aumento a aproximadamente tres veces. La comparación de los resultados para la reacción de control demostró que la especificidad objetivo para la SEC ID NO: 14 es aproximadamente el equivalente a la especificidad objetivo para la SEC ID N0:1. También se encontró que un apresto detector específico de tipo silvestre, que tiene la secuencia FAM-TA GCA GTC CCG AGA CTG(dabcyl) A TGG GTG CTC CAC CAG GC* (SEC ID. NO: 16) suministró una detección más sensible del alelo de tipo silvestre que la SEC ID N0:1, aunque es levemente menos específica.

EJEMPLO 4 El protocolo experimental del Ejemplo 3 se repitió, excepto que una pareja de aprestos de amplificación específicos para el exon 2 del gene HFE y los aprestos del detector/señal para la detección e identificación de los alelos de tipo silvestre y mutantes en el exon 2, se usaron. El alelo de tipo silvestre es C en el nucleótido 187. El alelo mutante tiene una G en esta posición, que resulta en un cambio de la histidina a la lisina en el aminoácido 63 en la proteína. Estos aprestos del detector se diseñan para hibridizar al alelo contenido en el cordón sin codificar del exon 2.

SEC ID NO: 7 - Apresto detector para el alelo de tipo silvestre en la posición 187 de nucleótidos (C187, es decir, G en el cordón complementario) : FAM-TC CTC GAGT (dbcY1) TA CCA GCT GTT CGT GTT CTA TGA TC* (300 nM) SEC ID NO: 8 - Apresto detector para el alelo mutante en la posición de nucleótidos 187 (G187, es decir, C en el cordón complementario) : Rox-TA CCG CAC T(dabcyl)GA TTA CCA GCT GTT CGT GTT CTA TAA TG* (300 nM) SEC ID NO: 9 - Primer apresto regulado para exon 2: TGA ACÁ TGT GAT CCC ACC CT (50 nM) SEC ID NO: 10 - Segundo apresto regulador para exon 2: CCC CAA TAG ATT TTC TCA GCT CC (50 nM) SEC ID NO: 11 - Primer apresto de amplificación para SDA: ACC GCA TCG AAT GCA TGT CTC GGG AGC TTT GGG CTA CGT GGA TG SEC ID NO: 12 - Segundo apresto de amplificación para SDA: CGA TTC CGC TCC AGA CTT CTC GGG GCT CCA CAC GGC GAC TCT La SEC ID NO: 7 no contiene un desajuste de no diagnóstico con el objetivo. La SEC ID NO: 8 no contiene los RERS, conforma la pareja de tintes ROX/Dabcyl deja de extinguirse en la formación del producto de apresto del detector de doble cordón extendido. El desdoblamiento con una enzima de restricción no es necesario para observar el aumento en la fluorescencia. Los resultados se muestran en la Figura 4A, 4B y 4C para las reacciones de SDA que contienen 107 copias del ADN de exon 2 objetivo derivado de cualquiera del tipo silvestre o mutante. En las muestras que contienen el objetivo derivado del ADN del exon 2 normal solamente (Figura 4A) , la fluorescencia aumentó fuertemente con el tiempo en el intervalo de longitud de onda de emisión para la fluoresceína, que indica la presencia del alelo de tipo silvestre. Además, la fluorescencia en el intervalo de longitud de onda de emisión para la rodamina permaneció bajo para estas muestras, que indican la ausencia del alelo mutante. En contraste, el perfil de la fluorescencia se invirtió para muestras que contienen el ADN derivado sólo del exon 2 mutante (Figura 4B) . En este caso, la fluorescencia ROX aumentó fuertemente y la fluorescencia FAM permaneció baja. En muestras que contienen el ADN tanto de tipo silvestre como mutante (Figura 4C) , la fluorescencia de ambos fluoróforos aumentó fuertemente, que indica la presencia de ambos alelos en una sola muestra. Además, se ha encontrado que substituyendo un apresto de amplificación que tiene la secuencia CGA TAC GCT CCT GAC TTC TCG GGA CAA ACG GCG ACT CTC AT (SEC ID NO: 17 por la SEC NO.12 en la reacción se suministra una amplificación más eficiente del objetivo de exon 2. Además, un apresto detector N-l que tiene la secuencia Rox-TA GCG CCC GAG CGC T(dabcvl)AT GTT CGT GTT CTA CTA TGA TC*a (SEC ID NO: 18) suministra una discriminación de alelo mejorada cuando se usa en combinación con el apresto de amplificación alternativa SEC ID NO: 17.

EJEMPLO 5 Este ejemplo ilustra el uso de las secuencias de cola 5 ' en los aprestos del detector para modular la reactividad cruzada de las múltiples sondas específicas de alelos en las reacciones de amplificación del ácido nucleico. Aunque este ejemplo emplea el SDA, resultados similares se esperan para otros métodos de amplificación conocidos en el arte, que incluyen la PCR, NASBA, 3SR, etc. que implican la extensión de una sonda rotulada o apresto para discriminar entre los dos alelos. Los Ejemplos 3 y 4 describen las reacciones del SDA que contienen dos aprestos de detector/señal rotulados diferencialmente, uno específico para el alelo de tipo silvestre y el otro especifico para el alelo mutante. Asi, cada mezcla de reacción es capaz de detectar cualquier alelo mutante, el alelo de tipo silvestre o ambos alelos simultáneamente. La habilidad de analizar una muestra para cualquier alelo es más conveniente y confiable, requiere menos muestra y menos costo que el acercamiento alternativo de dividir la misma muestra y realizar dos ensayos separados del apresto de un solo detector. Sin embargo, se ha observado que en las mezclas de reacción que contienen dos o más aprestos de detector rotulados diferencialmente, un nivel aumentado de una señal reactiva cruzada espuria puede ser generada por un apresto de detector cuando el objetivo de un segundo apresto de detector está presente. Los solicitantes creen que esta reactividad cruzada es causada o aumentada por la presencia simultánea de ambos aprestos del detector en la misma mezcla de reacción, conforme la reactividad cruzada disminuye o está ausente en las mezclas de reacción del apresto de un solo detector. Se ha descubierto que la reactividad cruzada puede ser disminuida substancialmente en tales múltiples mezclas de reacción de apresto del detector, diseñando aprestos de detector de modo que las secuencias de cola 5 ' de los dos aprestos del detector sean substancialmente diferentes. Este resultado fue inesperado, ya que las colas de no son complementarias a las secuencias objetivo originales y los nucleótidos específicos de alelos se ubican alejados de las colas 5 ' en o cerca de los extremos 3 ' de los aprestos del detector. La Figura 5 ilustra la posible fuente de este reactividad cruzada inesperada, usando el SDA como un ejemplo ilustrativo. El objetivo de "tipo silvestre" ilustrado contiene una C en la posición del nucleótido que se va a diagnosticar. El apresto del detector para este alelo, por lo tanto, contiene una G en la terminal 3', como se muestra. Para fines de esta ilustración. el alelo "mutante" (no mostrado) contiene una T en la posición de diagnóstico, y su apresto de detector contiene una A en la terminal 3 ' . Ambos aprestos de detector están presentes en la reacción de amplificación. Durante la amplificación, el apresto del detector específico de C hibridiza al objetivo y se extiende y convierte a la forma de doble cordón, el cual se puede desdoblar para separar la pareja de tintes de donador/extinguidor. El aumento resultante en la luorescencia indica la presencia del objetivo que contiene C. Las especies remanentes de doble cordón que sufren la amplificación lineal, como esta especie contiene un sitio de restricción de muesca. La amplificación lineal produce una especie de un solo cordón que contiene una C en la posición - de diagnóstico. Dos trayectorias de reacción alternativas son luego posibles. En un caso, el producto de amplificación lineal puede hibridizar al apresto del detector apropiado específico de C y ser convertido al producto desdoblado como antes, aumentando así la señal específica de C. Alternativamente, el producto de reacción de la amplificación lineal puede hibridizar en forma espuria al apresto del detector específico de T. El desajuste sencillo en el extremo 31 del apresto del detector específico de T no será suficiente para impedir tal hibridización errante. Sin embargo, las secuencias de cola de 5" de los aprestos de detector específico de T y específico de C son idénticos, hibridizaciones pueden ocurrir y el apresto del detector específico de T hibridizado en forma espuria, puede ser convertido fácilmente en el producto fluorescente desdoblado, sin la necesidad de extensión del desajuste A:C. Esto resulta en una señal que india falsamente la presencia de un nucleótido T en la posición de diagnóstico. Sin embargo, si los aprestos de detectores específico de T y específico de C contienen diferentes secuencias de la cola 5', el apresto del detector específico de T, hibridizado espuriamente no sufrirá desdoblamiento, ya que la cola 51 no puede ser convertida a la forma de doble cordón por hibridización al producto de amplificación lineal. El apresto detector permanecerá luego desdoblado aún si se hibridiza en forma errónea al objetivo de tipo silvestre y no se producirá una señal falsa positiva. En el ejemplo ilustrado, el hecho que los dos aprestos del detector tengan el mismo sitio de restricción no será suficiente para permitir que las colas hibridicen suministrando el resto de la secuencia de cola 51 diferente. Aunque la Figura 5 ilustra un mecanismo para la generación espuria de señales positivas falsas en el SDA, reacciones similares ocurrirán en otros métodos de amplificación. Cada vez que un producto de extensión de apresto del detector, que contiene C de doble cordón se genere en la PCR, NASBA, 3SR, TMA o cualquier otra reacción de amplificación, puede hibridizar a cualquiera del apresto del detector específico de C (correctamente) o al apresto del detector específico de T (incorrectamente) . Si los dos aprestos del detector tienen idénticas secuencias de la cola 5', el producto de extensión será complementario a cualquiera de sus extremos 5 ' y los RERS serán de cordón doble y desdoblables.. Si los dos aprestos de detector tienen diferentes secuencias de cola 5 * , los RERS de cordón doble no serán generados cuando el apresto del detector hibridiza al objetivo incorrecto y la señal positiva no falsa será generada. Para ilustrar este fenómeno, cuatro reacciones de SDA se realizaron. Todas las reacciones contenían el apresto del detector específico de mutante, SEC ID NO: 2 (300 nM) . Las reacciones 1 y 2 contenían la SEC ID NO: 13 específica de tipo silvestre (FAM-TT CTC GAG T(dabcyl)TA CAT GGG TGC TCC ACC AGG C* (300 nM) , que tiene una secuencia de cola 51 idéntica a la SEC ID NO: 2. Las reacciones 3 y 4 contienen la SEC ID N0:1 (300 nM) de apresto del detector específico de tipo silvestre rotulado con fluoresceína en que la secuencia de cola 51 difiere de la SEC ID NO: 2, excepto por los RERS (CTCGAG) . Las mezclas de reacción también contienen ADN objetivos de tipo silvestre (reacciones 1 y 3) o mutante (reacciones 2 y 4) (10 copias por reacción) derivadas de exon 4 del gene HFE (véase el Ejemplo 3) . Las reacciones se llevaron a cabo como en el Ejemplo 3, excepto gue se detectaron sólo emisiones de fluorescencia de la fluoresceína. Los resultados se muestran en la Figura 6. La reacción 1 produjo un fuerte aumento en la fluorescencia de la fluoresceína, indicativa de la presencia del alelo de tipo silvestre en el objetivo. La reacción 2, que contiene el ADN mutante solamente, produjo un aumento de la fluorescencia disminuido pero substancial, aunque no estaba presente el ADN de tipo silvestre. Esta conversión espuria representada de señal del apresto del detector ¡específico" del tipo silvestre, posiblemente a través del mecanismo ilustrado en la Figura 5, como las secuencias de cola 51 de los dos aprestos del detector presentes en la reacción, son idénticas. Cuando la secuencia de cola 51 del apresto del detector de tipo silvestre se cambió (SEC ID NO:l), la señal de reacción cruzada se suprimió (reacción 4) sin afectar substancialmente la señal específica objetivo (reacción 3) .

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Nadeau, James G. Ga ic Stankovik, Ana Dean, Cheryl H. Scott, Patricia B. Spargo, Catherine A. <120> Oligonucleótidos para la Amplificación y Detección de Genes de Hemocromatosis <130> Oligos para Hemocromatosis <140> <141> <160> 18 <179> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 tcctcgagta tgggtgtcc accaggc 27 <210> 2 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2 ttctcgagtt acatgggtgc tccaccaggt 30 <210> 3 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 cgaacctaaa gacgtattcg ge 22 <210> 4 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 4 ccccaataga ttttctcagc tcc 23 <210> 5 <211> 40 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 accgcatcga ttgcatgtct cgggctggat acccttggct 40 <210> 6 <211> 44 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 6 cgattccgct ccagacttct cgggagatca caatgagggg ctga 44 <210> 7 <211> 34 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 7 tcctcgagtt accagctgtt cgtgttctat gatc 34 <210> 8 <211> 37 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 8 taccgcactg attaccagct gttcgtgttc tataatg 37 <210> 9 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 9 tgaacatgtg atcccaccct 20 <210> 10 <211> 23 <212> ADN <213> Ho o sapiens <400> 10 ccccaataga ttttctcagc tcc 23 <210> 11 <211> 44 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 11 accgcatcga atgcatgtct cgggagcttt gggctacgtg gatg 44 <210> 12 <211> 42 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 12 cgattccgct ccagacttct cggggctcca cacggcgact ct 42 <210> 13 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 13 ttctcgagtt acatgggtgc tccaccaggc 30 <210> 14 <211> 29 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 14 tcctcgagta tgggtgctcc acctgacac 29 <210> 15 <211> 42 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 15 acgcagcagc acacattctc ggggaagagc agagatatac gt 42 <210> 16 <211> 37 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 16 tagcagtccc gagactgcta tgggtgctcc accaggc 37 <210> 17 <211> 41 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 17 cgatacgctc ctgacttctc gggacaaacg gcgactctca t 41 <210> 18 <211> 35 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 18 tagcgcccga gcgctatgtt cgtgttctat gatea 35

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un apresto del detector, que comprende una secuencia objetivo de unión, seleccionada del grupo que consta de las secuencias objetivo de unión de la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 16 y SEC ID NO: 18.

2. El apresto del detector de la reivindicación 1, el cual se selecciona del grupo que consta de las SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 16 y SEC ID NO: 18.

3. Un oligonucleótido que consta de una secuencia objetivo de unión, seleccionada del grupo que consta de las secuencias objetivo de unión de la y, opcionalmente, una secuencia requerida para una reacción de amplificación del ácido nucleico.

4. El oligsnucleótido de la reivindicación 3 , el cual se selecciona del grupo que consta de la SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 15 y SEC ID NO: 17

5. Un método para detectar o identificar un polimorfismo de nucleótidos sencillo en un gene de HFE, este método comprende: a) amplificar una secuencia objetivo en el gene HFE, usando un oligonucleótido que consiste de una secuencia objetivo de unión, seleccionada del grupo que consta de las secuencias objetivo de unión de la SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 15 y SEC ID NO: 17 y, opcionalmente, una secuencia requerida para la reacción de amplificación del ácido nucleico, y b) detectar o identificar el polimorfismo de nucleótidos sencillo en la secuencia objetivo amplificada, usando un apresto de detector, que comprende una secuencia objetivo de unión seleccionada del grupo que consta de la SEC ID N0:1 , SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 16 y SEC ID NO: 18.

6. El método de la reivindicación 5, en que el apresto del detector se selecciona del grupo que consta de la SEC ID N0:l , SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 16 y SEC ID NO: 18.

7. El método de la reivindicación 5, en que el oligonucleótido se selecciona del grupo que consta de la SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 15 y SEC ID NO: 17.