WO2023218588A1 - 計測デバイスおよび測定方法 - Google Patents

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WO2023218588A1
WO2023218588A1 PCT/JP2022/020026 JP2022020026W WO2023218588A1 WO 2023218588 A1 WO2023218588 A1 WO 2023218588A1 JP 2022020026 W JP2022020026 W JP 2022020026W WO 2023218588 A1 WO2023218588 A1 WO 2023218588A1
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WO
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substrate
reflection suppression
measuring
measurement
reflection
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Application number
PCT/JP2022/020026
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Inventor
惟夫 香村
淳子 田中
猛 石田
Original Assignee
株式会社日立ハイテク
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Definitions

  • the present invention relates to a measuring device and a measuring method, and particularly relates to digital PCR.
  • PCR and real-time PCR have been used for genetic testing. These techniques have had the problem of low measurement accuracy when the amount of the target to be measured (nucleic acid) is minute. In order to solve this problem, digital PCR technology has attracted attention in recent years.
  • a sample containing DNA to be detected is divided into a large number of micro regions, and PCR is performed on each micro region.
  • the type of DNA present in each microregion is determined by distinguishing between sections that contain the DNA to be detected and sections that do not, based on the fluorescence intensity.
  • Patent Document 1 discloses a DNA detection method using digital PCR in which the melting temperature of DNA and a fluorescently labeled probe is measured in a droplet containing a fluorescently labeled probe that hybridizes to the DNA. ing.
  • melting curves differ depending on the type of target gene and fluorescently labeled probe, it is possible to determine the type of target gene by measuring the melting curve.
  • fluorescence intensity and melting curves When measuring a large number of genes simultaneously, it is necessary to measure fluorescence intensity and melting curves with high precision and to reduce measurement variations for each gene.
  • An object of the present invention is to provide a measurement device that can suppress unevenness in fluorescence images and fluctuations in fluorescence intensity caused by bubbles in melting curve analysis of a target gene.
  • An example of the measurement device is a substrate having a plurality of through holes for introducing and dividing a nucleic acid solution; an oil that covers a first surface of the substrate and a second surface of the substrate opposite to the first surface to block the through hole; a heat conductive plate provided on the second surface side for heating the substrate; a reflection suppression mechanism that suppresses reflection of excitation light irradiated from the first surface side; It is characterized by having the following.
  • the measurement method includes: A measuring method using a measuring device,
  • the measurement device is a substrate having a plurality of through holes; a thermally conductive plate provided to change the temperature of the substrate; a reflection suppression mechanism that suppresses reflection of excitation light irradiated from a first surface side of the substrate opposite to the heat conduction plate side; has
  • the measurement method is a step of introducing a nucleic acid solution to the substrate and fractionating it; introducing oil to cover the through hole into which the nucleic acid solution has been introduced, on a first surface of the substrate and a second surface of the substrate opposite to the first surface; , changing the temperature of the substrate by the thermally conductive plate; irradiating excitation light from the first surface side of the substrate while changing the temperature, detecting fluorescence from the first surface side, and measuring the nucleic acid solution; has.
  • the present invention it is possible to provide a measurement device and a measurement method that can suppress the influence of bubbles, measure fluorescence intensity and melting curves with high precision, and discriminate the type of gene with high precision.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating the intensity measured when air bubbles are generated at the bottom of a through-hole well in a measurement device in a conventional example.
  • a reflection image illustrating that in a conventional example, reflected light from a heat conduction plate at the bottom of a measurement device is observed through a through-hole well.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating that, in Example 1 of the present invention, by subjecting the heat conductive plate at the bottom of the measurement device to a black surface treatment, the influence of air bubbles does not increase on the measured intensity.
  • 2 is a reflection image illustrating that, in Example 1 of the present invention, by blackening the heat conduction plate at the bottom of the measurement device, reflected light from the heat conduction plate is not observed through the through-hole well.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating that, in Example 2 of the present invention, by introducing fine particles into the lower part of the through-hole well, the measured intensity is not influenced by air bubbles.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating that the average reflected light intensity in the reflected image of the through-hole well is reduced by introducing fine particles into the lower part of the through-hole well in Example 2 of the present invention.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating that, in Example 3 of the present invention, by making the heat conductive plate at the bottom of the measurement device transparent, the influence of air bubbles is not added to the measured intensity.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating that the influence of air bubbles does not increase the measured intensity by making the heat conductive plate at the bottom of the measurement device have an uneven structure in Example 4 of the present invention.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating that the influence of air bubbles is not added to the measured intensity by coloring the oil in the measuring device black in Example 5 of the present invention.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating that the influence of air bubbles is not increased on the measured intensity by introducing ink into the lower part of the through-hole well in Example 6 of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating changes in fluorescence intensity observed when a measurement device without a reflection suppression mechanism is heated at 85° C. for a certain period of time in a comparative example.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating changes in fluorescence intensity observed when a measurement device in which a reflection suppression mechanism is introduced between a through-hole well and a heat conduction plate is heated at 85° C. for a certain period of time in Example 7 of the present invention.
  • FIG. 8 is a flow diagram of fluorescence intensity measurement with respect to temperature change in a measurement device incorporating a reflection suppression mechanism in Example 8 of the present invention.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating changes in fluorescence intensity with respect to temperature changes in a measurement device that does not incorporate a reflection suppression mechanism in a comparative example.
  • FIG. 8 is a diagram illustrating changes in fluorescence intensity with respect to temperature changes in a measurement device incorporating a reflection suppression mechanism in Example 8 of the present invention.
  • FIG. 9 is a flowchart of fluorescence intensity measurement and reflection image measurement with respect to temperature changes in a measurement device incorporating a reflection suppression mechanism in Example 9 of the present invention.
  • FIG. 9 is a diagram illustrating changes in the coefficient of variation of reflected light intensity in a measurement device before and after introducing a reflection suppression mechanism in Example 9 of the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic diagram when fluorescence measurement is performed using a conventional measurement device holding a through-hole well 1.
  • This measurement device is composed of a substrate 2 holding a plurality of through-hole wells 1, a mixed solution 3 of nucleic acid and fluorescently labeled probe injected into the wells, oil 4 covering the through-hole wells 1, and a thermally conductive plate 5.
  • excitation light 6 is irradiated into the through-hole well 1.
  • a part of the excitation light 6 becomes transmitted light 7 that passes through the through-hole well 1 .
  • the transmitted light 7 is reflected by the heat conduction plate 5 and becomes reflected light 8.
  • the reflected light 8 passes through the through-hole well 1 again, and the reflected light intensity 10 as well as the fluorescence intensity 9 are measured as the measurement light intensity of the well.
  • the transmitted light 7 of the through-hole well 1 is diffused at the lower part of the through-hole well 1 by the air bubbles 11. Therefore, the light 12 that is not reflected by the thermally conductive plate 5 is not detected as strongly as the reflected light intensity 10. That is, when bubbles exist, the measured light intensity is the sum of the fluorescence intensity 9 and the reflected light intensity 13 which is attenuated compared to the original reflected light intensity 10.
  • FIG. 2 is a reflection image of the substrate 101 holding the through-hole well 100 observed at low magnification (FIG. 2(a)) and high magnification (FIG. 2(b)). If we pay attention to the reflected image of the through-hole well 100, it is bright. Therefore, the excitation light 6 passes through the through-hole well 1 and is reflected by the thermally conductive plate 5. Further, when comparing the through-hole well 100 and the through-hole well 102, there are variations in brightness. This is due to in-plane variations in the reflectance of the heat conductive plate 5.
  • Example 1 will be described below with reference to FIGS. 3 and 4.
  • the thermally conductive plate is treated with black color to make it difficult to observe bubbles.
  • FIG. 3 is a schematic diagram illustrating that by applying a black surface treatment film 201 to the heat conduction plate 200 at the bottom of the measurement device, the bubbles 202 observed in FIG. 1 become difficult to observe.
  • the measurement device has a substrate 209 having a plurality of through-hole wells 203 (through-holes) for introducing and dividing a mixed solution 208.
  • the measurement device has an oil 210 covering the through-hole well 203 on a first side 209a of the substrate 209 and on a second side 209b of the substrate opposite to the first side.
  • the mixed solution 208 contains a nucleic acid solution.
  • references to mixed solutions can be interpreted as references to nucleic acid solutions.
  • the measurement device has a heat conductive plate 200 provided on the second surface 209b side in order to change the temperature of the substrate 209 (for example, to heat the substrate 209).
  • the second surface 209b can be said to be the surface of the substrate 209 on the thermally conductive plate 200 side.
  • the material of the heat conductive plate 200 is, for example, metal or resin, but may also be glass. By using such materials, it is possible to construct a thermally conductive plate suitable for the requirements of the measurement device. Note that materials other than these may also be used.
  • the measurement device has a reflection suppression mechanism that suppresses reflection of the excitation light 207 irradiated from the first surface 209a side (for example, reflection toward the first surface 209a side).
  • the reflection suppression mechanism is a colored surface treatment structure of the thermally conductive plate 200.
  • the reflection suppression mechanism includes a black surface treatment film 201 as a reflection suppression film.
  • the surface treatment film 201 is placed on the heat conduction plate 200, and the surface treatment film 201 absorbs excitation light (or light having the same wavelength as the excitation light).
  • the black surface treatment film 201 absorbs excitation light (or light having the same wavelength as the excitation light).
  • the reflected light 204 from the heat conduction plate 200 produces an attenuated reflected light intensity 205. Therefore, the measured light intensity of each through-hole well 203 is the sum of the fluorescence intensity 206 and the attenuated reflected light intensity 205. Therefore, bubbles are prevented from being observed as unevenness on the measurement image.
  • the structure and formation method of the surface treatment film 201 can be appropriately designed by those skilled in the art, and the thickness varies depending on the surface treatment process.
  • an anodized film such as alumite treatment has a thickness of about 5 to 40 ⁇ m
  • a film treated by electroplating has a thickness of about 2 to 20 ⁇ m.
  • the film formed by spray coating is approximately 15 to 30 ⁇ m. In the case of this example, the film thickness is preferably 40 ⁇ m or less.
  • FIG. 4 is a reflection image observed at low magnification (FIG. 4(a)) and high magnification (FIG. 4(b)) of the substrate 300 after the black surface treatment film 201 has been applied to the heat conductive plate. . If we pay attention to the reflected image inside the through-hole well 301, we can see that it is dark. Further, in comparing the reflected light intensity between the through-hole well 301 and the through-hole well 302, it can be seen that there is no variation in the reflected light intensity, and the overall reflected light intensity is small. From this reflected image, it can be said that the reflection from the heat conductive plate 200 is suppressed.
  • the black surface treatment film 201 was used as the colored surface treatment structure, but its reflectance is important in order to suppress reflection from the heat conduction plate 200.
  • "colored" means that the reflectance is 10% or less over a wavelength of 400 nm to 700 nm, and specifically means black.
  • Such a colored surface treatment structure suppresses reflection from the thermally conductive plate 200.
  • the measurement device According to the measurement device according to the present example, it is possible to suppress unevenness in fluorescence images and fluctuations in fluorescence intensity caused by the influence of air bubbles in melting curve analysis of a target gene.
  • Example 2 will be described below with reference to FIGS. 5 and 6.
  • fine particles 401 are injected into the lower part of the through-hole well 400 to make it difficult for bubbles 402 to be observed.
  • fluorescence intensity measurement can be performed without being affected by the bubbles 402.
  • descriptions of parts common to Example 1 may be omitted.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of fluorescence measurement when microparticles 401 are introduced at the bottom of a mixed solution 403 of nucleic acid and fluorescently labeled probe injected into a through-hole well 400 in a measurement device.
  • the reflection suppression mechanism according to this embodiment includes fine particles 401 introduced into a through-hole well 400. Preferably, the fine particles 401 do not allow the excitation light 404 to pass therethrough.
  • the measurement light intensity is the sum of the fluorescence intensity 406 and the attenuated reflected light intensity 407. This makes it difficult for bubbles 402 to be observed in the measurement image.
  • FIG. 6 shows a comparison of the reflected images of the measurement devices shown in FIGS. 1 and 5.
  • FIG. 6(a) is a reflected image observed of a conventional measuring device
  • FIG. 6(b) is a reflected image observed of a measuring device according to this embodiment in which fine particles are injected.
  • the average reflected light intensity averaged over 50 through-hole wells was 133 (arbitrary units), and in the example of FIG. 6(b), the average reflected light intensity was 99. . Focusing on the average reflected light intensity of the plurality of through-hole wells, the average reflected light intensity of the plurality of wells is reduced by injecting fine particles into the through-hole well. Therefore, the excitation light is prevented from passing through the through-hole well and being reflected on the heat conductive plate.
  • Conditions for the fine particles to be injected include size, specific gravity, surface treatment, and number.
  • the size (for example, diameter) is desirably 30 nm or more.
  • the scattering phenomenon is based on Mie's scattering theory. Since Mie scattering shows significant scattering intensity from about 30 nm, this value can be set as the lower limit.
  • the size of the microparticles is preferably smaller than the through-hole well into which the microparticles are injected. Therefore, when the well size is 60 ⁇ m, the upper limit of the fine particles can be 60 ⁇ m.
  • the fine particles settle at the bottom of the through-hole well. Therefore, it is preferable to increase the specific gravity of the microparticles relative to the mixed solution of nucleic acid and fluorescently labeled probe injected into the through-hole well. That is, it is preferable that the fine particles have a higher specific gravity than the mixed solution.
  • fine particles examples include polymer fine particles (polystyrene, specific gravity: 1.04 to 1.07 g/cm 3 ), magnetic fine particles (iron, specific gravity: 7.85 g/cm 3 ), and metal fine particles (silver, specific gravity: 10.49 g/cm 3 ). 3 ), etc., with a specific gravity greater than 1 are used (that is, the specific gravity of the particles is 1 g/cm 3 or more).
  • the microparticles then settle within the through-hole wells.
  • a mixed solution of nucleic acids and fluorescently labeled probe is an aqueous solution
  • hydrophilic treatment for example, by hydrophilic coating
  • the surface of the fine particles be negatively charged.
  • the fine particles are made to exhibit hydrophilicity by performing a treatment that places carboxy groups on the surface of the fine particles.
  • the condition required from the viewpoint of the number of particles is that the cross-sectional area of microparticles x the number of particles injected is equal to or less than the bottom area of the through-hole well: (Particle cross-sectional area) x (Number of particles to be injected) ⁇ (Bottom area of through-hole well)... (Formula 1) It is preferable to satisfy the following. Note that it is not necessarily necessary to cover the entire bottom area of the through-hole well with the particles. In one example, it has been confirmed that the effect of air bubbles is reduced by using a condition in which about 10% of the bottom area of the well is covered with fine particles.
  • the measurement device According to the measurement device according to the present example, it is possible to suppress unevenness in fluorescence images and fluctuations in fluorescence intensity caused by the influence of air bubbles in melting curve analysis of a target gene.
  • Example 3 will be described below with reference to FIG.
  • a transparent heat conductive plate 500 is used at the bottom of the measurement device to make it difficult for bubbles 501 to be observed.
  • fluorescence intensity measurement can be performed without being affected by the bubbles 501.
  • descriptions of parts common to Embodiment 1 or 2 may be omitted.
  • FIG. 7 is a schematic diagram of fluorescence measurement when the lower part of the measurement device is made of a transparent heat conduction plate 500.
  • Excitation light 502 passes through through-hole well 503 and reaches transparent thermally conductive plate 500 . At this time, the excitation light 502 becomes light 504 that passes through the transparent heat conduction plate 500. This makes it possible to suppress reflection of excitation light.
  • the measurement light intensity is the sum of the fluorescence intensity 505 and the attenuated reflected light intensity 506. This makes it difficult for bubbles 501 to be observed in the measurement image.
  • the material of the transparent heat conductive plate 500 include plastic such as polycarbonate, glass, and the like. Further, the transparent heat conductive plate 500 may be a transparent conductive substrate made of a glass substrate doped with indium tin oxide or the like.
  • the measurement device According to the measurement device according to the present example, it is possible to suppress unevenness in fluorescence images and fluctuations in fluorescence intensity caused by the influence of air bubbles in melting curve analysis of a target gene.
  • Example 4 will be described below using FIG. 8.
  • bubbles 601 are made difficult to be observed by using a heat conductive plate 600 having an uneven structure.
  • the measurement device By using the measurement device according to this embodiment, it is possible to measure fluorescence intensity without being affected by the bubbles 601.
  • descriptions of parts common to Examples 1 to 3 may be omitted.
  • FIG. 8 is a schematic diagram of fluorescence measurement when the lower part of the measurement device is a heat conduction plate 600 with an uneven structure.
  • the reflection suppressing mechanism according to this embodiment has a concave-convex structure, and the concave-convex structure is arranged on the heat conductive plate 600 having the concave-convex structure.
  • the excitation light 602 passes through the through-hole well 603 and reaches the heat conductive plate 600 having an uneven structure. At this time, the reflected light 604 of the excitation light can be suppressed by the uneven structure. Therefore, the measurement light intensity is the sum of the fluorescence intensity 605 and the attenuated reflected light intensity 606. This makes it difficult for bubbles 601 to be observed in the measurement image.
  • the structure be periodic, and it is more preferable that the pitch (spatial repetition period) of the uneven structure be 1 ⁇ m or less.
  • the measurement device According to the measurement device according to the present example, it is possible to suppress unevenness in fluorescence images and fluctuations in fluorescence intensity caused by the influence of air bubbles in melting curve analysis of a target gene.
  • Example 5 will be described below with reference to FIG.
  • the oil covering the through holes is colored to make it difficult to observe the bubbles 700.
  • fluorescence intensity measurement can be performed without being affected by the bubbles 700.
  • descriptions of parts common to Examples 1 to 4 may be omitted.
  • FIG. 9 is a schematic diagram of fluorescence measurement when the through-hole well 702 is covered with colored oil 701 in the measurement device.
  • the oil 701 is colored black, but the colored oil 701 is not necessarily colored, and the color is not limited to black.
  • the excitation light 703 is absorbed by the colored oil 701. Therefore, it is possible to suppress the reflected light 705 by the heat conductive plate 704. This makes it difficult for the bubbles 700 to be observed in the measurement image.
  • What is important in oil coloring is the reflectance of the coloring pigment.
  • "colored" means that the reflectance is 10% or less over a wavelength of 400 nm to 700 nm, for example. With such a reflectance, reflection of excitation light can be efficiently suppressed.
  • the oil 701 may actually exist above the through-hole well 702, and in that case, the fluorescence may also be blocked.
  • the reflectance of the excitation light and fluorescence in the oil 701 is 10% and the transmittance is 10%
  • 10% of the total amount of excitation light is 100%
  • enters the through-hole well 702 1% is reflected at the lower end of the through-hole well 702, and 0.1% is transmitted to the upper side of the through-hole well 702 and detected.
  • the total amount of fluorescence is 100%, 10% is transmitted to the upper side of the through-hole well 702 and detected. In this way, above the through-hole well 702, the excitation light is negligible compared to the fluorescence, and it can be said that reflection of the excitation light is effectively suppressed.
  • the measurement device According to the measurement device according to the present example, it is possible to suppress unevenness in fluorescence images and fluctuations in fluorescence intensity caused by the influence of air bubbles in melting curve analysis of a target gene.
  • Example 6 will be described below with reference to FIG.
  • ink 801 is introduced into the lower part of through-hole well 800, thereby making it difficult for bubbles 802 to be observed.
  • the measurement device according to this embodiment it is possible to measure fluorescence intensity without being affected by the bubbles 802.
  • descriptions of parts common to Examples 1 to 5 may be omitted.
  • FIG. 10 is a schematic diagram of fluorescence measurement when ink 801 is injected into the lower part of through-hole well 800.
  • the reflection suppression mechanism includes ink 801 introduced into a through-hole well 800. After the excitation light 803 passes through the through-hole well 800, it is absorbed by the ink 801. This makes it difficult for bubbles 802 to be observed in the measurement image.
  • the ink 801 is preferably a pigment ink.
  • the specific gravity is larger than that of a mixed solution of a nucleic acid and a fluorescently labeled probe. That is, it is preferable that the ink 801 has a higher specific gravity than the mixed solution 805. By satisfying this condition, it is possible to cause the ink to settle in the lower part of the through-hole well.
  • the specific gravity of the ink 801 is preferably 1 g/cm 3 or more.
  • carbon black (specific gravity: 1.7 to 1.8 g/cm 3 ) or the like may be used as the pigment ink.
  • the measurement device According to the measurement device according to the present example, it is possible to suppress unevenness in fluorescence images and fluctuations in fluorescence intensity caused by the influence of air bubbles in melting curve analysis of a target gene.
  • Example 7 will be described below with reference to FIGS. 11 and 12.
  • Example 7 shows the effect of using the measurement device according to Example 1, in which bubbles are actually no longer observed.
  • the measurement device is heated for a certain period of time to maintain it at 85°C, and the measurement device is irradiated with excitation light in the visible range to obtain a fluorescence image.
  • the exposure time when acquiring a fluorescence image is 1300 ms, and 80 or more fluorescence images are continuously photographed to evaluate the presence or absence of the influence of air bubbles.
  • FIG. 11 shows a fluorescence intensity change 901 of a single well 900 in the measurement device shown in FIG. 1 without a reflection suppression mechanism.
  • a portion of the fluorescence image of the through-hole well is shown in the upper right corner of the graph (for visibility, only the single well 900 has been corrected to white).
  • the horizontal axis represents the number of fluorescence images
  • the vertical axis represents the fluorescence intensity.
  • the image number represents the order in which the images were acquired, so the horizontal axis corresponds to time.
  • the data in the graph is the fluorescence intensity change of a single well 900 in each fluorescence image.
  • the fluorescence intensity does not always show a constant value, and a steep fluorescence intensity change 902 occurs.
  • this steep fluorescence intensity change 902 occurs, air bubbles are present at the bottom of the well. Therefore, the presence of bubbles can be confirmed from the steep fluorescence intensity change 902.
  • FIG. 12 shows a fluorescence intensity change 1000 of a single well in the measurement device according to Example 1 which is provided with a reflection suppression mechanism. It can be seen that, compared to the case in FIG. 11, no steep fluorescence intensity change was observed. Therefore, by using Example 1, it is possible to suppress the influence of bubbles. It is thought that the measurement devices according to Examples 2 to 6 have similar effects.
  • the measurement device According to the measurement device according to the present example, it is possible to suppress unevenness in fluorescence images and fluctuations in fluorescence intensity caused by the influence of air bubbles in melting curve analysis of a target gene.
  • Example 8 will be described below with reference to FIGS. 13 to 15.
  • Example 8 shows a measurement method for melting curve analysis using the measurement devices of Examples 1 to 6. By using the measurement device according to this embodiment, highly accurate measurement of melting curve analysis is possible.
  • FIG. 13 shows a measurement flow from injecting a mixed solution of nucleic acids and fluorescently labeled probes into the measurement device according to this example to performing melting curve analysis.
  • a mixed solution of nucleic acids and fluorescently labeled probes is introduced into the measurement device and fractionated into each of the through-hole wells, thereby fractionating the nucleic acids into the through-hole wells (S1100).
  • oil is introduced so as to cover the periphery of the through-hole well (S1101).
  • the through-hole well 203 into which the mixed solution 208 has been introduced is blocked on the first surface 209a of the substrate 209 and the second surface 209b of the substrate 209 on the opposite side to the first surface 209a. Introduce covering oil.
  • PCR is performed to amplify the nucleic acid in the through-hole well (S1102).
  • the temperature of the measurement device is changed by the heat conduction plate 200.
  • excitation light is irradiated while changing the temperature of the measurement device, and the fluorescence intensity from the mixed solution of nucleic acid and fluorescently labeled probe in the through-hole well is detected (S1103).
  • excitation light 207 is irradiated from the first surface 209a side of the substrate 209, fluorescence is detected from the first surface 209a side, and the mixed solution 208 is thereby measured.
  • FIG. 14 shows an example of melting curve analysis results for a conventional measurement device without a reflection suppression mechanism.
  • FIG. 14(a) is a graph plotting changes in fluorescence intensity against changes in temperature in a single well within the measurement device. A decrease in fluorescence intensity can be confirmed. If bubbles are observed during this decrease, a steep decrease in fluorescence intensity 1200 is observed.
  • FIG. 14(b) shows the temperature differential of the fluorescence intensity change in FIG. 14(a), and the differential curve of the melting curve is calculated.
  • the melting temperature is calculated from the peak of the differential curve.
  • a melting temperature artifact 1202 is observed in the differential curve where bubbles are observed. This artifact is caused by a steep decrease in fluorescence intensity 1200. Therefore, the effect of air bubbles greatly affects the melting curve analysis.
  • FIG. 15 shows an example of the melting curve analysis results in this example.
  • FIG. 15(a) is a plot of fluorescence intensity changes with respect to temperature changes in a single well within the measurement device. A monotonous decrease in fluorescence intensity can be confirmed.
  • FIG. 15(b) shows the temperature differential of the fluorescence intensity change in FIG. 15(a). Since bubbles are difficult to observe in the measurement device of this example, it is difficult to observe a steep decrease in fluorescence intensity in the melting curve. Therefore, only the true melting temperature 1300 is observed in the differential curve of the melting curve. Therefore, the measurement device according to this embodiment can suppress unnecessary artifacts and enable highly accurate melting curve analysis.
  • the measurement device and measurement method according to the present example it is possible to suppress unevenness in fluorescence images and fluctuations in fluorescence intensity caused by the influence of bubbles in melting curve analysis of a target gene.
  • Example 9 will be described below with reference to FIGS. 16 and 17.
  • Example 9 shows a method for confirming that the black surface treatment of the thermally conductive plate of Example 1 and the injection of fine particles into the through-hole wells of Example 2 have the effect of making it difficult to observe bubbles. be.
  • FIG. 16 shows a measurement flow in which the reflection image measurement operation is added to the measurement flow diagram shown in FIG. 13 of Example 8.
  • S1400 to S1402 and S1404 in FIG. 16 can be the same as S1100 to S1102 and S1103 in FIG. 13, respectively.
  • the reflected image of the measurement device is measured (S1403).
  • the excitation light 207 or white light is irradiated from the first surface 209a side of the substrate 209, and the reflected image is measured.
  • the reflection image measurement operation is performed after PCR (S1402), but it may also be performed after the oil introduction step (S1401) to cover the through hole.
  • S1403 can be executed after S1401 and before the end of S1404.
  • FIG. 17 shows reflected images actually observed in each measurement device. An image focused on the thermally conductive plate is obtained as a reflected image.
  • the variation coefficient of the reflected light intensity is 10%.
  • the coefficient of variation is a value obtained by dividing the standard deviation of the reflected light intensity by the average of the reflected light intensity for a plurality of through-hole wells.
  • the measurement device and measurement method according to the present example it is possible to suppress unevenness in fluorescence images and fluctuations in fluorescence intensity caused by the influence of bubbles in melting curve analysis of a target gene.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiments, and includes various modifications.
  • the embodiments described above are described in detail to explain the present invention in an easy-to-understand manner, and the present invention is not necessarily limited to having all the configurations described.
  • it is possible to replace a part of the configuration of one embodiment with the configuration of another embodiment and it is also possible to add the configuration of another embodiment to the configuration of one embodiment.
  • Reflected light 605 Fluorescence intensity 606... Attenuated reflected light intensity 700... Bubbles 701... Colored oil (reflection suppression mechanism) 702...Through hole well (through hole) 703...Excitation light 704...Heat conduction plate 705...Reflected light 800...Through hole well (through hole) 801...Ink (reflection suppression mechanism) 802...Bubbles 803...Excitation light 805...Mixed solution (nucleic acid solution) 900...Single well (through hole) 901... Fluorescence intensity change 902... Steep fluorescence intensity change 1000... Fluorescence intensity change 1200... Steep fluorescence intensity decrease 1201... True melting temperature 1202... Melting temperature artifact 1300... True melting temperature

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Abstract

計測デバイスは、核酸溶液を導入し分割するための複数の貫通孔を有する基板と、前記基板の第１の面と、前記基板の前記第１の面とは反対側の第２の面とにおいて、前記貫通孔をふさぐために覆うオイルと、前記基板を加熱するために前記第２の面の側に設けられた熱伝導プレートと、前記第１の面の側から照射される励起光の反射を抑制する反射抑制機構と、を有する。

Description

計測デバイスおよび測定方法
　本発明は計測デバイスおよび測定方法に関し、とくにデジタルＰＣＲに関する。
　従来、遺伝子検査にはＰＣＲやリアルタイムＰＣＲが利用されていた。これらの技術では測定対象（核酸）が微量であるときに、測定精度が低いという課題があった。この課題を解決するために、近年ではデジタルＰＣＲ技術が注目されている。
　デジタルＰＣＲでは、検出対象のＤＮＡを含む試料を多数の微小領域に分割し、各々の微小領域に対してＰＣＲを行う。検出対象のＤＮＡを含む区画と含まない区画を蛍光強度で判別することで、各微小領域内に存在するＤＮＡの種類の判別を行う。
　特許文献１には、デジタルＰＣＲを用いたＤＮＡ検出方法として、ＤＮＡとＤＮＡにハイブリダイズする蛍光標識プローブを含むドロップレットにおいて、ＤＮＡと蛍光標識プローブとの融解温度を測定するＤＮＡ検出方法が開示されている。
特開２０１８－１０８０６３号公報
　融解曲線分析を組み合わせたデジタルＰＣＲにおいて、計測対象の遺伝子の種類は複数存在し、例えば、野生型や変異型の遺伝子を含む。融解曲線は対象遺伝子の種類と蛍光標識プローブにより異なるため、融解曲線を計測することで対象遺伝子の種類を判別することが可能である。多数の遺伝子を同時に計測する場合には、高精度に蛍光強度や融解曲線を計測し、各遺伝子の計測ばらつきを小さくする必要がある。
　蛍光強度や融解曲線の計測精度を低下させる要因のひとつとして、気泡の存在が挙げられる。温度上昇時に微小領域近傍に気泡が生じると、正確に蛍光強度測定ができず、融解曲線の計測精度、及び遺伝子種類の判別精度が低下する。
　なお、この気泡の課題は電気的ノイズとも異なるため、信号処理等により取り除くことも困難である。
　本発明の目的は、対象遺伝子の融解曲線分析において、気泡の影響で生じる蛍光画像のむらと蛍光強度のゆらぎを抑制することが可能な計測デバイスを提供することにある。本発明の前記並びにその他の目的と新規な特徴は、本明細書の記述及び添付図面から明らかになるであろう。
　本発明に係る計測デバイスの一例は、
　核酸溶液を導入し分割するための複数の貫通孔を有する基板と、
　前記基板の第１の面と、前記基板の前記第１の面とは反対側の第２の面とにおいて、前記貫通孔をふさぐために覆うオイルと、
　前記基板を加熱するために前記第２の面の側に設けられた熱伝導プレートと、
　前記第１の面の側から照射される励起光の反射を抑制する反射抑制機構と、
を有することを特徴とする。
　本発明に係る測定方法は、
　計測デバイスを用いた測定方法であって、
　前記計測デバイスは、
　複数の貫通孔を有する基板と、
　前記基板の温度を変化させるために設けられた熱伝導プレートと、
　前記基板の前記熱伝導プレート側とは反対側の第１の面の側から照射される励起光の反射を抑制する反射抑制機構と、
を有し、
　前記測定方法は、
　前記基板に対して、核酸溶液を導入し分画する工程と、
　前記基板の第１の面と、前記基板の前記第１の面とは反対側の第２の面とにおいて、前記核酸溶液が導入された前記貫通孔をふさぐために覆うオイルを導入する工程と、
　前記熱伝導プレートにより前記基板の温度を変化させる工程と、
　温度変化させながら前記基板の前記第１の面の側から励起光を照射し、前記第１の面の側から蛍光を検出し、前記核酸溶液を測定する工程と、
を有する。
　本発明によれば、気泡の影響を抑制して高精度に蛍光強度及び融解曲線計測ができ、高精度に遺伝子の種類を判別可能な計測デバイスおよび測定方法を提供することができる。
従来例において、計測デバイス中の貫通孔ウェル下部に気泡が発生したときに測定される強度を説明する図。 従来例において、貫通孔ウェルを通して計測デバイス下部の熱伝導プレートからの反射光が観察されることを説明する反射像。 本発明の実施例１において、計測デバイス下部の熱伝導プレートを黒色表面処理することで、測定強度に気泡の影響が乗らないことを説明する図。 本発明の実施例１において、計測デバイス下部の熱伝導プレートを黒色処理することで、貫通孔ウェルを通して熱伝導プレートからの反射光が観察されないことを説明する反射像。 本発明の実施例２において、貫通孔ウェル下部に微粒子を導入することで、測定強度に気泡の影響が乗らないことを説明する図。 本発明の実施例２において、貫通孔ウェル下部に微粒子を導入することで、貫通孔ウェルの反射像における平均反射光強度が減少することを説明する図。 本発明の実施例３において、計測デバイス下部の熱伝導プレートを透明にすることで、測定強度に気泡の影響が乗らないことを説明する図。 本発明の実施例４において、計測デバイス下部の熱伝導プレートを凹凸構造にすることで、測定強度に気泡の影響が乗らないことを説明する図。 本発明の実施例５において、計測デバイス内のオイルを黒く着色することで、測定強度に気泡の影響が乗らないことを説明する図。 本発明の実施例６において、貫通孔ウェル下部にインクを導入することで、測定強度に気泡の影響が乗らないことを説明する図。 比較例において、反射抑制機構を導入していない計測デバイスを８５℃で一定時間加熱した場合に観察される蛍光強度変化を説明する図。 本発明の実施例７において、貫通孔ウェルと熱伝導プレート間に反射抑制機構を導入した計測デバイスを８５℃で一定時間加熱した場合に観察される蛍光強度変化を説明する図。 本発明の実施例８において、反射抑制機構を導入した計測デバイスにおいて、温度変化に対する蛍光強度測定のフロー図。 比較例において、反射抑制機構を導入していない計測デバイスにおいて、温度変化に対する蛍光強度変化を説明する図。 本発明の実施例８において、反射抑制機構を導入した計測デバイスにおいて、温度変化に対する蛍光強度変化を説明する図。 本発明の実施例９において、反射抑制機構を導入した計測デバイスにおいて、温度変化に対する蛍光強度測定と反射像測定のフロー図。 本発明の実施例９において、反射抑制機構を導入前後の計測デバイスにおいて、反射光強度の変動係数の変化を説明する図。
　図１および図２を用いて、従来の例について説明する。
　図１は、貫通孔ウェル１を保持した従来の計測デバイスにおいて蛍光測定した際の概略図である。この計測デバイスは複数の貫通孔ウェル１を保持した基板２、ウェル内に注入した核酸と蛍光標識プローブの混合溶液３、貫通孔ウェル１を覆うオイル４、熱伝導プレート５で構成されている。
　計測デバイスを利用した蛍光測定では、励起光６が貫通孔ウェル１に照射される。励起光６の一部は貫通孔ウェル１を透過する透過光７となる。透過光７は熱伝導プレート５により反射され、反射光８となる。反射光８は再び貫通孔ウェル１を透過し、蛍光強度９と共に反射光強度１０がウェルの測定光強度として測定される。
　もし、貫通孔ウェル１の下部に気泡１１が存在すると、貫通孔ウェル１の透過光７は気泡１１により貫通孔ウェル１の下部において拡散される。したがって、熱伝導プレート５により反射されない光１２は、反射光強度１０ほど強くは検出されない。すなわち、気泡が存在すると、測定光強度は、蛍光強度９と、本来の反射光強度１０よりも減衰された反射光強度１３との和なる。
　以上より、気泡の有無により、ウェルの測定光強度にはむらが存在してしまうことがわかる。したがって、測定画像には、気泡が存在する部分が暗い測定強度として観察されてしまう。
　図２は、貫通孔ウェル１００を保持した基板１０１を、低倍率（図２（ａ））と高倍率（図２（ｂ））でそれぞれ観察した反射像である。貫通孔ウェル１００の反射像に着目すると、明るい。したがって、励起光６は貫通孔ウェル１を透過して、熱伝導プレート５で反射されている。また、貫通孔ウェル１００と貫通孔ウェル１０２を比較すると、明るさにばらつきが存在する。これは、熱伝導プレート５の反射率の面内ばらつきに由来している。
　以上により、従来の計測チップでは気泡１１が存在すると、測定に影響することを説明した。以降、熱伝導プレートに有色の表面処理を施すことで、気泡１１が測定に影響しないことを説明する。
　以下、本発明の実施例について説明する。上述の従来例と共通する部分については、説明を省略する場合がある。
［実施例１］
　以下、図３および図４を用いて、実施例１について説明する。実施例１は、熱伝導プレートを黒色処理することで気泡が観察されにくくするものである。本実施例に係る計測デバイスを用いることで、気泡の影響なく蛍光強度測定が可能になる。
　図３は、計測デバイス下部の熱伝導プレート２００に黒色の表面処理膜２０１を施すことで、図１で観察されていた気泡２０２が観察されにくくなることを説明する概略図である。計測デバイスは、混合溶液２０８を導入し分割するための複数の貫通孔ウェル２０３（貫通孔）を有する基板２０９を有する。計測デバイスは、基板２０９の第１の面２０９ａと、前記基板の前記第１の面とは反対側の第２の面２０９ｂとにおいて、貫通孔ウェル２０３をふさぐために覆うオイル２１０を有する。
　混合溶液２０８は核酸溶液を含む。本明細書および図面において、混合溶液に対する参照は、核酸溶液に対する参照として解釈することが可能である。
　計測デバイスは、基板２０９の温度を変化させるため（たとえば基板２０９を加熱するため）に第２の面２０９ｂ側に設けられた熱伝導プレート２００を有する。なお、第２の面２０９ｂは、基板２０９の熱伝導プレート２００側の面であるということができる。
　熱伝導プレート２００の材質は、たとえば金属または樹脂であるが、ガラスであってもよい。このような材質を用いることにより、計測デバイスの要件に適した熱伝導プレートを構成することができる。なお、これ以外の材料を用いてもよい。
　従来の構成では、貫通孔ウェル２０３下部の気泡２０２の有無に応じて、反射光強度にばらつきが存在した。しかし、本実施例に係る計測デバイスは、第１の面２０９ａの側から照射される励起光２０７の反射（たとえば第１の面２０９ａの側への反射）を抑制する反射抑制機構を有する。本実施例では、反射抑制機構は、熱伝導プレート２００の有色の表面処理構造である。
　具体例として、反射抑制機構は、反射抑制膜として黒色の表面処理膜２０１を備える。表面処理膜２０１は熱伝導プレート２００上に配置され、表面処理膜２０１は励起光（または励起光と同一の波長を有する光）を吸収する。熱伝導プレート２００に黒色の表面処理膜２０１を施すことで、熱伝導プレート２００による反射光２０４は、減衰された反射光強度２０５を生じる。そのため、各貫通孔ウェル２０３の測定光強度は、蛍光強度２０６と、減衰された反射光強度２０５との和となる。したがって、気泡が測定画像上のむらとして観察されることが抑制される。
　表面処理膜２０１の構造および形成方法は、当業者が適宜設計可能であり、厚さは表面処理工程により異なる。例をいくつか挙げると、アルマイト処理のような陽極酸化被膜では５～４０μｍ程度であり、電気メッキによる処理膜は２～２０μｍ程度である。さらに、スプレー塗装による膜は１５～３０μｍ程度である。本実施例の場合、膜厚は４０μｍ以下であることが望ましい。
　図４は、熱伝導プレートに黒色の表面処理膜２０１を施した後の基板３００を、低倍率（図４（ａ））と高倍率（図４（ｂ））でそれぞれ観察した反射像である。貫通孔ウェル３０１内の反射像に着目すると、暗いことがわかる。また、貫通孔ウェル３０１と貫通孔ウェル３０２との反射光強度の比較において、反射光強度のばらつきは存在せず、全体的に反射光強度が小さいこともわかる。この反射像より、熱伝導プレート２００からの反射が抑えられていると言える。
　本実施例では、有色の表面処理構造として黒色の表面処理膜２０１を用いたが、熱伝導プレート２００からの反射を抑えるためには、その反射率が重要になる。本実施例において、「有色」とは、たとえば波長４００ｎｍ～波長７００ｎｍにわたって反射率が１０％以下であることを意味し、具体例として黒色を意味する。このような有色の表面処理構造により、熱伝導プレート２００からの反射が抑えられる。
　以上説明するように、本実施例に係る計測デバイスによれば、対象遺伝子の融解曲線分析において、気泡の影響で生じる蛍光画像のむらと蛍光強度のゆらぎを抑制することが可能となる。
［実施例２］
　以下、図５と図６を用いて、実施例２について説明する。実施例２は、貫通孔ウェル４００の下部に微粒子４０１を注入することで、気泡４０２が観察されにくくするものである。本実施例に係る計測デバイスを用いることで、気泡４０２の影響なく蛍光強度測定が可能になる。以下、実施例１と共通する部分については、説明を省略する場合がある。
　図５は、計測デバイス内の貫通孔ウェル４００に注入されている核酸と蛍光標識プローブの混合溶液４０３の下部に微粒子４０１が導入されている場合に、蛍光測定した際の概略図である。本実施例に係る反射抑制機構は、貫通孔ウェル４００に導入される微粒子４０１を備える。微粒子４０１は励起光４０４を透過させないものであることが好ましい。
　微粒子４０１が存在しないと、図１と同様の現象が生じてしまう。しかし、微粒子４０１が存在することで励起光４０４がウェルを透過しなくなるので、熱伝導プレートにより反射光４０５は抑えられる。したがって、測定光強度は、蛍光強度４０６と、減衰された反射光強度４０７との和となる。これにより、測定画像には気泡４０２が観察されにくくなる。
　図６には、図１と図５に示した計測デバイスの反射像の比較を示す。図６（ａ）は従来の計測デバイスを観察した反射像であり、図６（ｂ）は微粒子を注入した本実施例に係る計測デバイスを観察した反射像である。
　図６（ａ）の例では、５０個の貫通孔ウェルについて平均した平均反射光強度は１３３（任意単位）であり、図６（ｂ）の例では、同じく平均反射光強度は９９であった。複数の貫通孔ウェルの平均反射光強度に着目すると、貫通孔ウェルに微粒子を注入することで、複数ウェルの平均反射光強度は減少している。したがって、励起光が貫通孔ウェルを透過して、熱伝導プレート上で反射することが抑制されている。
　注入する微粒子の条件として、サイズ、比重、表面処理、個数が挙げられる。サイズ（たとえば径）は、３０ｎｍ以上であることが望ましい。微粒子が可視域から近赤外域の光を散乱するとき、その散乱現象はＭｉｅの散乱理論に基づくものである。Ｍｉｅ散乱は３０ｎｍ程度から有意の散乱強度を示すため、この値を下限値とすることができる。一方、微粒子のサイズは、微粒子が注入される貫通孔ウェルよりも小さくすると好適である。したがって、ウェルサイズが６０μｍであるとき、微粒子の上限値は６０μｍとすることができる。
　比重の観点から求められる条件として、貫通孔ウェルの底に微粒子が沈降するようにすると好適である。したがって、貫通孔ウェル内に注入される核酸と蛍光標識プローブの混合溶液に対して微粒子の比重を高くすると好適である。すなわち、微粒子は混合溶液よりも比重が重いようにすると好適である。
　一例では微粒子としてポリマー微粒子（ポリスチレン、比重：１．０４～１．０７ｇ／ｃｍ３）、磁性微粒子（鉄、比重：７．８５ｇ／ｃｍ３）、金属微粒子（銀、比重：１０．４９ｇ／ｃｍ３）などの、比重が１よりも大きい微粒子を利用している（すなわち、微粒子の比重は、１ｇ／ｃｍ３以上である）。そのとき、微粒子は貫通孔ウェル内で沈降する。
　微粒子の表面処理の観点から求められる条件として、核酸と蛍光標識プローブの混合溶液との親和性を検討することが有益である。核酸と蛍光標識プローブの混合溶液は水溶性溶液であるため、微粒子を親水性処理する（たとえば親水性コーティングする）と好適である。また、核酸が微粒子に吸着することを防ぐために、微粒子の表面を負に帯電させると好適である。
　一例では、微粒子の表面にカルボキシ基を配置する処理を施すことで、微粒子が親水性を示すようにしている。別の例では、計測デバイス下部に磁石を設置し、親水性処理した磁性微粒子を磁力により貫通孔ウェル下部に沈降させることが可能である。貫通孔ウェル周囲はオイルであるため、親水性の磁性微粒子は貫通孔ウェル下部に滞留する。したがって、この手法を用いることで、磁性微粒子の位置制御が可能である。
　個数の観点から求められる条件として、微粒子断面積×注入個数が貫通孔ウェルの底面積と同等以下であるという条件：
　（微粒子断面積）×(注入する微粒子の個数)≦（貫通孔ウェル底面積）…（数式１）
を満たすようにすると好適である。なお、必ずしも貫通孔ウェルの底面積全てを微粒子で覆う必要はない。ある例では、ウェルの底面積の１０％程度を微粒子で覆うという条件を用い、気泡の影響が低減することが確認されている。
　以上説明するように、本実施例に係る計測デバイスによれば、対象遺伝子の融解曲線分析において、気泡の影響で生じる蛍光画像のむらと蛍光強度のゆらぎを抑制することが可能となる。
［実施例３］
　以下、図７を用いて、実施例３について説明する。実施例３は、反射抑制機構として、計測デバイスの下部を透明な熱伝導プレート５００にすることで、気泡５０１が観察されにくくするものである。本実施例に係る計測デバイスを用いることで、気泡５０１の影響なく蛍光強度測定が可能になる。以下、実施例１または２と共通する部分については、説明を省略する場合がある。
　図７は計測デバイス下部を透明な熱伝導プレート５００にした場合に、蛍光測定した際の概略図である。励起光５０２は貫通孔ウェル５０３を透過し、透明な熱伝導プレート５００に到達する。このとき、励起光５０２は透明な熱伝導プレート５００により、熱伝導プレートを透過する光５０４となる。これにより、励起光の反射を抑えることが可能である。
　したがって、測定光強度は、蛍光強度５０５と、減衰された反射光強度５０６との和となる。これにより、測定画像には気泡５０１が観察されにくくなる。
　透明な熱伝導プレート５００の材質の例として、ポリカーボネートなどのプラスチックや、ガラスなどが挙げられる。また、透明な熱伝導プレート５００は、ガラス基板に酸化インジウムスズなどをドープした透明導電性基板などであってもよい。
　以上説明するように、本実施例に係る計測デバイスによれば、対象遺伝子の融解曲線分析において、気泡の影響で生じる蛍光画像のむらと蛍光強度のゆらぎを抑制することが可能となる。
［実施例４］
　以下、図８を用いて、実施例４について説明する。実施例４は、凹凸構造の熱伝導プレート６００を用いることで、気泡６０１が観察されにくくするものである。本実施例に係る計測デバイスを用いることで、気泡６０１の影響なく蛍光強度測定が可能になる。以下、実施例１～３と共通する部分については、説明を省略する場合がある。
　図８は計測デバイス下部を凹凸構造の熱伝導プレート６００とした場合に、蛍光測定した際の概略図である。このように、本実施例に係る反射抑制機構は凹凸構造を備え、凹凸構造は凹凸構造の熱伝導プレート６００上に配置される。
　励起光６０２は貫通孔ウェル６０３を透過し、凹凸構造の熱伝導プレート６００に到達する。このとき、凹凸構造により、励起光の反射光６０４を抑制することが可能である。したがって、測定光強度は、蛍光強度６０５と、減衰された反射光強度６０６との和となる。これにより、測定画像には気泡６０１が観察されにくくなる。凹凸によって反射を低減する観点から求められる条件として、構造を周期的とすると好適であり、凹凸構造のピッチ（空間的な繰り返し周期）を１μｍ以下とするとさらに好適である。
　以上説明するように、本実施例に係る計測デバイスによれば、対象遺伝子の融解曲線分析において、気泡の影響で生じる蛍光画像のむらと蛍光強度のゆらぎを抑制することが可能となる。
［実施例５］
　以下、図９を用いて、実施例５について説明する。実施例５は、貫通孔を覆うオイルを着色することで、気泡７００が観察されにくくするものである。本実施例に係る計測デバイスを用いることで、気泡７００の影響なく蛍光強度測定が可能になる。以下、実施例１～４と共通する部分については、説明を省略する場合がある。
　図９は計測デバイス内において有色のオイル７０１により貫通孔ウェル７０２を覆った場合に、蛍光測定した際の概略図である。本実施例では、オイル７０１は黒色に着色されたものであるが、有色のオイル７０１は必ずしも着色処理が施されたものに限らず、また色は黒色に限らない。
　着色したオイル７０１により、励起光７０３は光吸収される。したがって、熱伝導プレート７０４による反射光７０５を抑制することが可能である。これにより、測定画像には気泡７００が観察されにくくなる。オイルの着色において重要なことは、着色色素の反射率である。本実施例において、「有色」とは、たとえば波長４００ｎｍ～波長７００ｎｍにわたって反射率が１０％以下であることを意味する。このような反射率とすると、励起光の反射が効率的に抑えられる。
　なお、オイル７０１は実際には貫通孔ウェル７０２の上側にも存在する場合があり、その場合には蛍光も遮蔽される可能性がある。ここで、オイル７０１における励起光および蛍光の反射率を１０％と仮定し、透過率を１０％と仮定すると、励起光全量を１００％としたうち、１０％が貫通孔ウェル７０２に入射し、貫通孔ウェル７０２の下端で１％が反射され、０．１％が貫通孔ウェル７０２の上側に透過して検出される。一方で、蛍光全量を１００％としたうち、１０％が貫通孔ウェル７０２の上側に透過して検出される。このように、貫通孔ウェル７０２の上側では蛍光に対して励起光は無視できる程度となり、励起光の反射は効率的に抑制されていると言える。
　以上説明するように、本実施例に係る計測デバイスによれば、対象遺伝子の融解曲線分析において、気泡の影響で生じる蛍光画像のむらと蛍光強度のゆらぎを抑制することが可能となる。
［実施例６］
　以下、図１０を用いて、実施例６について説明する。実施例６は、貫通孔ウェル８００下部にインク８０１を導入することで、気泡８０２が観察されにくくするものである。本実施例に係る計測デバイスを用いることで、気泡８０２の影響なく蛍光強度測定が可能になる。以下、実施例１～５と共通する部分については、説明を省略する場合がある。
　図１０は貫通孔ウェル８００下部にインク８０１を注入した場合に、蛍光測定した際の概略図である。本実施例では、反射抑制機構は、貫通孔ウェル８００に導入されるインク８０１を備える。励起光８０３は貫通孔ウェル８００を透過した後に、インク８０１により光吸収される。これにより、測定画像には気泡８０２が観察されにくくなる。
　本実施例において、インク８０１は顔料インクであることが望ましい。顔料インクにおいて、比重の観点から求められる条件として、比重は核酸と蛍光標識プローブの混合溶液よりも大きくすると好適である。すなわち、インク８０１は混合溶液８０５よりも比重が重いようにすると好適である。この条件を満たすことで、インクを貫通孔ウェル下部に沈降させることが可能である。具体例として、インク８０１の比重は、１ｇ／ｃｍ３以上とすると好適である。また、顔料性インクとしてカーボンブラック（比重：１．７～１．８ｇ／ｃｍ３）などを用いてもよい。
　以上説明するように、本実施例に係る計測デバイスによれば、対象遺伝子の融解曲線分析において、気泡の影響で生じる蛍光画像のむらと蛍光強度のゆらぎを抑制することが可能となる。
［実施例７］
　以下、図１１と図１２を用いて、実施例７について説明する。実施例7は、実施例１に係る計測デバイスを用いることで、実際に気泡が観察されなくなる効果を示したものである。
　本測定では計測デバイスを８５℃に維持するよう一定時間加熱し、可視域の励起光を計測デバイスに照射し、蛍光画像を取得する。蛍光画像取得時の露光時間は１３００ｍｓであり、８０枚以上の蛍光画像を連続撮影し気泡の影響の有無を評価する。
　図１１は、比較例として、反射抑制機構を施していない図１で示した計測デバイスにおいて、単一ウェル９００の蛍光強度変化９０１を示している。また、グラフ内の右上には貫通孔ウェルの蛍光画像の一部分を示している（視認性のため、単一ウェル９００のみ白く修正されている）。グラフにおいて、横軸は蛍光画像の枚数を、縦軸は蛍光強度を示している。画像番号は画像が取得された順序を表し、したがって横軸は時間に対応する。
　グラフのデータは、各蛍光画像における単一ウェル９００の蛍光強度変化である。グラフにおいて、蛍光強度は常に一定の値を示しておらず、急峻な蛍光強度変化９０２が生じている。この急峻な蛍光強度変化９０２が生じているとき、ウェル下部には気泡が存在している。したがって、気泡が存在していることが蛍光強度の急峻な蛍光強度変化９０２から確認できる。
　図１２は、反射抑制機構を施した実施例１に係る計測デバイスにおける単一ウェルの蛍光強度変化１０００を示している。図１１の場合と比べ、急峻な蛍光強度変化は観測されていないことがわかる。したがって、本実施例１を利用することで、気泡の影響を抑制することが可能である。実施例２～６に係る計測デバイスについても効果は同様であると考えられる。
　以上説明するように、本実施例に係る計測デバイスによれば、対象遺伝子の融解曲線分析において、気泡の影響で生じる蛍光画像のむらと蛍光強度のゆらぎを抑制することが可能となる。
［実施例８］
　以下、図１３から図１５を用いて、実施例８について説明する。実施例８は、実施例１～６の計測デバイスを用いた融解曲線分析の測定方法を示したものである。本実施例に係る計測デバイスを用いることで、融解曲線分析の高精度な測定が可能となる。
　図１３は、本実施例に係る計測デバイスに核酸と蛍光標識プローブの混合溶液を注入し、融解曲線分析を行うまでの測定フローを示している。
　まず、計測デバイスに核酸と蛍光標識プローブの混合溶液を導入し、これを貫通孔ウェルの１つ１つに分画することにより、貫通孔ウェルに核酸を分画する（Ｓ１１００）。
　次に、貫通孔ウェルの周囲をカバーするようにオイルを導入する（Ｓ１１０１）。図３の例では、基板２０９の第１の面２０９ａと、基板２０９の第１の面２０９ａとは反対側の第２の面２０９ｂとにおいて、混合溶液２０８が導入された貫通孔ウェル２０３をふさぐために覆うオイルを導入する。
　オイル導入後、ＰＣＲを行い、貫通孔ウェル内の核酸増幅を行う（Ｓ１１０２）。図３の例では、熱伝導プレート２００により、計測デバイス（とくに基板２０９）の温度を変化させる。
　最後に、計測デバイスを温度変化させながら、励起光を照射し、貫通孔ウェル内の核酸と蛍光標識プローブの混合溶液からの蛍光強度を検出する（Ｓ１１０３）。図３の例では、基板２０９の第１の面２０９ａの側から励起光２０７を照射し、第１の面２０９ａの側から蛍光を検出し、これによって混合溶液２０８を測定する。
　図１４は、比較例として、反射抑制機構を施していない従来の計測デバイスにおける融解曲線分析結果の一例を示す。図１４（ａ）は、計測デバイス内の単一ウェルにおいて、温度変化に対する蛍光強度変化をプロットしたグラフである。蛍光強度の減少が確認できる。この減少時に気泡が観察されると、急峻な蛍光強度減少１２００が観察される。
　図１４（ｂ）は、図１４（ａ）の蛍光強度変化に対して温度の微分をとったものであり、融解曲線の微分曲線が算出されている。融解温度は微分曲線のピークから算出される。気泡が観察された微分曲線では、真の融解温度１２０１だけでなく、融解温度のアーティファクト１２０２が観測される。このアーティファクトは、急峻な蛍光強度減少１２００に起因するものである。したがって、気泡の影響は融解曲線分析に大きく影響する。
　図１５は、本実施例における融解曲線分析結果の一例を示す。図１５（ａ）は計測デバイス内の単一ウェルにおいて、温度変化に対する蛍光強度変化をプロットしたものである。蛍光強度の単調減少が確認できる。
　図１５（ｂ）は図１５（ａ）の蛍光強度変化に対して温度の微分をとったものである。本実施例の計測デバイスでは気泡が観察されにくいため、融解曲線には急峻な蛍光強度の減少などは観察されにくい。そのため、融解曲線の微分曲線には真の融解温度１３００のみが観察される。したがって、本実施例に係る計測デバイスにより、不要なアーティファクトを抑制することができ、高精度な融解曲線分析が可能となる。
　以上説明するように、本実施例に係る計測デバイスおよび測定方法によれば、対象遺伝子の融解曲線分析において、気泡の影響で生じる蛍光画像のむらと蛍光強度のゆらぎを抑制することが可能となる。
［実施例９］
　以下、図１６と図１７を用いて、実施例９について説明する。実施例９は、実施例１の熱伝導プレートの黒色表面処理や実施例２の微粒子の貫通孔ウェルの注入により、気泡を観察されにくくする効果が得られることを確認する方法を示したものである。
　図１６は、実施例８の図１３で示した測定フロー図に、反射像測定の操作を追記した測定フローを示している。図１６のＳ１４００～Ｓ１４０２およびＳ１４０４は、それぞれ図１３のＳ１１００～Ｓ１１０２およびＳ１１０３と同様とすることができる。
　Ｓ１４０２の後、計測デバイスの反射像の測定を行う（Ｓ１４０３）。図３の例では、基板２０９の第１の面２０９ａの側から励起光２０７または白色光を照射して、反射像を測定する。
　上記はあくまで一例であり、反射像測定の操作をＰＣＲ（Ｓ１４０２）後に行っているが、貫通孔をカバーするオイル導入工程（Ｓ１４０１）後でも良い。Ｓ１４０３の工程は、Ｓ１４０１の後、Ｓ１４０４が終わる前までの間に実行することができる。
　図１７は、各計測デバイスにおいて実際に観測される反射像を示す。反射像として、熱伝導プレートに焦点を合わせた画像を取得する。
　反射抑制機構等の処理をしていない従来の計測デバイス（図１７（ａ））の場合、反射光のむらが観察される。また、反射光強度の変動係数は１０％となる。ここで、変動係数は、複数の貫通孔ウェルについて、反射光強度の標準偏差を、反射光強度の平均で除算した値である。
　一方で、磁性微粒子の注入（実施例２、図１７（ｂ））や熱伝導プレートの黒色表面処理（実施例１、図１７（ｃ））の反射抑制機構を施した場合、反射光強度の変動係数はそれぞれ３％と４％となる。
　これらの値は、あくまで例である。しかし、従来の計測デバイスと比較して、本発明の各実施例に係る計測デバイスでは、反射光強度の変動係数が減少する。したがって、融解曲線分析を行う前に、反射像の評価を行うことで、本実施例に係る計測デバイスの性能を評価することができる。
　以上説明するように、本実施例に係る計測デバイスおよび測定方法によれば、対象遺伝子の融解曲線分析において、気泡の影響で生じる蛍光画像のむらと蛍光強度のゆらぎを抑制することが可能となる。
　なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
　２００…熱伝導プレート
　２０１…表面処理膜（反射抑制機構、反射抑制膜）
　２０２…気泡
　２０３…貫通孔ウェル（貫通孔）
　２０４…反射光
　２０５…減衰された反射光強度
　２０６…蛍光強度
　２０７…励起光
　２０８…混合溶液（核酸溶液）
　２０９…基板
　２０９ａ…第１の面
　２０９ｂ…第２の面
　２１０…オイル
　３００…基板
　３０１…貫通孔ウェル（貫通孔）
　３０２…貫通孔ウェル（貫通孔）
　４００…貫通孔ウェル（貫通孔）
　４０１…微粒子（反射抑制機構）
　４０２…気泡
　４０３…混合溶液（核酸溶液）
　４０４…励起光
　４０５…反射光
　４０６…蛍光強度
　４０７…減衰された反射光強度
　５００…透明な熱伝導プレート（反射抑制機構）
　５０１…気泡
　５０２…励起光
　５０３…貫通孔ウェル（貫通孔）
　５０４…熱伝導プレートを透過する光
　５０５…蛍光強度
　５０６…減衰された反射光強度
　６００…凹凸構造の熱伝導プレート（反射抑制機構）
　６０１…気泡
　６０２…励起光
　６０３…貫通孔ウェル（貫通孔）
　６０４…反射光
　６０５…蛍光強度
　６０６…減衰された反射光強度
　７００…気泡
　７０１…有色のオイル（反射抑制機構）
　７０２…貫通孔ウェル（貫通孔）
　７０３…励起光
　７０４…熱伝導プレート
　７０５…反射光
　８００…貫通孔ウェル（貫通孔）
　８０１…インク（反射抑制機構）
　８０２…気泡
　８０３…励起光
　８０５…混合溶液（核酸溶液）
　９００…単一ウェル（貫通孔）
　９０１…蛍光強度変化
　９０２…急峻な蛍光強度変化
　１０００…蛍光強度変化
　１２００…急峻な蛍光強度減少
　１２０１…真の融解温度
　１２０２…融解温度のアーティファクト
　１３００…真の融解温度

Claims (24)

  1. 　計測デバイスであって、
    　核酸溶液を導入し分割するための複数の貫通孔を有する基板と、
    　前記基板の第１の面と、前記基板の前記第１の面とは反対側の第２の面とにおいて、前記貫通孔をふさぐために覆うオイルと、
    　前記基板を加熱するために前記第２の面の側に設けられた熱伝導プレートと、
    　前記第１の面の側から照射される励起光の反射を抑制する反射抑制機構と、
    を有することを特徴とする、計測デバイス。
  2. 　前記反射抑制機構は、前記貫通孔に導入される微粒子を備え、前記微粒子は親水性コーティングされており、前記微粒子は前記核酸溶液よりも比重が重いことを特徴とする、請求項１に記載の計測デバイス。
  3. 　前記微粒子の前記比重は、１ｇ／ｃｍ３以上であることを特徴とする、請求項２に記載の計測デバイス。
  4. 　前記反射抑制機構は、前記貫通孔に導入されるインクを備え、前記インクは前記核酸溶液よりも比重が重いことを特徴とする、請求項１に記載の計測デバイス。
  5. 　前記インクの比重は、１ｇ／ｃｍ３以上であることを特徴とする、請求項４に記載の計測デバイス。
  6. 　前記反射抑制機構は反射抑制膜を備え、前記反射抑制膜は前記熱伝導プレート上に配置され、前記反射抑制膜は前記励起光を吸収することを特徴とする、請求項１に記載の計測デバイス。
  7. 　前記反射抑制機構は凹凸構造を備え、前記凹凸構造は前記熱伝導プレート上に配置され、前記凹凸構造のピッチは１μｍ以下であることを特徴とする、請求項１に記載の計測デバイス。
  8. 　前記反射抑制機構は、前記熱伝導プレートの有色の表面処理構造であることを特徴とする、請求項１に記載の計測デバイス。
  9. 　前記熱伝導プレートの材質は、金属、樹脂、ガラスのいずれかであることを特徴とする、請求項１に記載の計測デバイス。
  10. 　前記オイルは有色であることを特徴とする、請求項１に記載の計測デバイス。
  11. 　前記有色は、波長４００ｎｍ～波長７００ｎｍにわたって反射率が１０％以下であることを意味することを特徴とする、請求項８または１０に記載の計測デバイス。
  12. 　計測デバイスを用いた測定方法であって、
    　前記計測デバイスは、
    　複数の貫通孔を有する基板と、
    　前記基板の温度を変化させるために設けられた熱伝導プレートと、
    　前記基板の前記熱伝導プレート側とは反対側の第１の面の側から照射される励起光の反射を抑制する反射抑制機構と、
    を有し、
    　前記測定方法は、
    　前記基板に対して、核酸溶液を導入し分画する工程と、
    　前記基板の第１の面と、前記基板の前記第１の面とは反対側の第２の面とにおいて、前記核酸溶液が導入された前記貫通孔をふさぐために覆うオイルを導入する工程と、
    　前記熱伝導プレートにより前記基板の温度を変化させる工程と、
    　温度変化させながら前記基板の前記第１の面の側から励起光を照射し、前記第１の面の側から蛍光を検出し、前記核酸溶液を測定する工程と、
    を有する、測定方法。
  13. 　前記反射抑制機構は微粒子を備え、前記微粒子は親水性コーティングされており、前記微粒子は前記核酸溶液よりも比重が重いことを特徴とする、請求項１２に記載の測定方法。
  14. 　前記微粒子の前記比重は、１ｇ／ｃｍ３以上であることを特徴とする、請求項１３に記載の測定方法。
  15. 　前記反射抑制機構は、前記貫通孔に導入されるインクを備え、前記インクは前記核酸溶液よりも比重が重いことを特徴とする、請求項１２に記載の測定方法。
  16. 　前記インクの前記比重は、１ｇ／ｃｍ３以上であることを特徴とする、請求項１５に記載の測定方法。
  17. 　前記測定方法はさらに、前記オイルを導入する工程の後、前記核酸溶液を測定する工程が終わる前までの間に、前記基板の前記第１の面の側から前記励起光または白色光を照射して、反射像を測定する工程を有することを特徴とする、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の測定方法。
  18. 　前記反射抑制機構は反射抑制膜を備え、前記反射抑制膜は前記熱伝導プレート上に配置され、前記反射抑制膜は前記励起光を吸収することを特徴とする、請求項１２に記載の測定方法。
  19. 　前記反射抑制機構は凹凸構造を備え、前記凹凸構造は前記熱伝導プレート上に配置され、前記凹凸構造のピッチは１μｍ以下であることを特徴とする、請求項１２に記載の測定方法。
  20. 　前記反射抑制機構は、前記熱伝導プレートの有色の表面処理構造であることを特徴とする、請求項１２に記載の測定方法。
  21. 　前記熱伝導プレートの材質は、金属、樹脂、ガラスのいずれかであることを特徴とする、請求項１２に記載の測定方法。
  22. 　前記オイルは有色であることを特徴とする、請求項１２に記載の測定方法。
  23. 　前記有色は、波長４００ｎｍ～波長７００ｎｍにわたって反射率が１０％以下であることを意味することを特徴とする、請求項２０または２２に記載の測定方法。
  24. 　前記測定方法はさらに、前記オイルを導入する工程の後、前記核酸溶液を測定する工程が終わる前までの間に、前記基板の前記第１の面の側から励起光または白色光を照射して、反射像を測定する工程を有することを特徴とする、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の測定方法。
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