CN103215364A - 一种基因点突变的实时pcr检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因突变检测领域，具体涉及一种基因点突变的实时PCR检测方法及其应用。该方法包括以下步骤：(1)实时PCR的DNA扩增循环程序；(2)解链曲线分析程序，(3)判定所测基因有无突变；其中双探针，所述上游探针的尾端接一个Fluorescein，所述下游探针的头端标记一LC荧光色团，双探針之一覆盖突变点，突变点和双杂交探针在引物的下游尽量靠近另一个引物；本发明重复性好，筒单，快速，只需很少量的DNA样品(2-3ng)，特别适用于大量样品检测，本方法的另外一个最重要的特点是不会引起PCR产物的污染，可以极大地降低运作成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基因点突变的检测方法。
背景技术
随着人类基因图谱草图的公布和各种病原体基因序列的揭示，这都将极大的促进疾病相关基因的结构和功能研究，特别是基因缺失、错位、突变(有义突变)等与疾病的关系。在众多导致人类疾病的基因有义突变、病原体亚型以及耐药基因的有义突变中，单碱基突变占了相当大的比例，其检测方法的探索一直是基因诊断研究中的重要课题，特别是对已知有义突变的检测，将是临床进行基因诊断的重要手段之一。PCR扩增技术问世以来，建立于扩增基础上的突变检测技术使检测靶DNA(目的DNA)含量和/或突变靶序列比例过低、检测灵敏度不足等难题得以克服，使得分子诊断技术进入了新阶段。
在过去十多年中，曾出现了多种点突变的检测方法。
1.经典的PCR-RFLP等点突变的检测方法。RFLP连琐分析技术是最早用于分析已知点突变的方法，其检测特点是：具有较高的特异性，可以确定突变的部位及性质，重复性好。但不足之处是仅适合于多态性的检测：即突变频率大于1％才能被检测到；因此，RFLP分析对于检测突变的早期，尤其是在野生型远多于突变型时其敏感性就显得不足了。
2.反向限制性位点突变分析(iRSM)：在RFLP分析之前用另一种内切酶对靶序列进行消化，减少了野生型序列的含量(一般消化率＞99％)，因而大大 提高了突变序列的检出率。但是，由于聚合酶的关系，可能在PCR扩增后导致iRSM分析出现假阳性。
3.基因芯片具有检测信息高通量和自动化程度高，一次性检测可检出多个位点突变，具有很大的发展潜力，但制备技术要求高。
4.DNA测序
Sanger DNA测序是点突变检测的金标准。但Sanger测序灵敏度低，测序准备时间长。另一个方法是焦磷酸测序，它的特点是准备时间短，测序也快。但是这两种方法都需要对PCR产物处理，需要非常小心地防止产物污染。
5.等位基因特异性扩增
一个引物的3’端与特定的突变碱基相配，特异性扩增这一突变的片断，灵敏度高，但一个反应只能检测一个突变。比如Therascreen KRAS RGQ PCR Kit，每个样品做8个PCR反应，也只能检测7个常见的突变，而KRAS在密码子12，13上可能的突变是12个。
6.等位基因区别实时PCR
在PCR反应中有两个特异的探针，区别野生型和突变型，灵敏度和特异性都低于特异性扩增，也是一个反应测定一个突变。
7.荧光PCR检测点突变
SYBR Green I结合熔解曲线分析点突变简单、快速、自动化程度较高，易于推广；但是所用的染料SYBY Green I与溴乙啶、YO-PRO-1[一样，缺乏序列特异性，因此不可避免的将会降低其敏感性。在扩增过程中产生的非特异性荧光，通常是由引物二聚体和其它污染物的扩增产物引起的，单以荧光很 难将其与靶序列发出的荧光相区分。另外扩增产物碱基序列数较大时，单个碱基置换引起的点突变其Tm变化较小，运用SYBR Green I和熔解曲线分析就很难检出。
荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)结合探针熔解曲线分析点突变。通过对杂交产物稳定性进行实时监测，并结合熔解曲线分析，提高了对点突变检测的分辨率
SYBR Green I法和FRET法对点突变的检测均依赖于熔解曲线分析，但存在着诸多限制条件，即：①熔解曲线的相对位置和宽度与所加入的染料浓度及温度转换率相关。
在分子生物学基因点突变的研究中，仍需加强研究，克服上述各方法的不足。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、简单、成本低，无PCR产物污染的风险，适用于大批量样品的检测，可以精确定位突变位点，所需的DNA样品量少的基因点突变检测方法。
为实现上述放目的，本发明采用如下技术方案：
一种基因点突变的实时PCR检测方法，包括以下步骤(1)实时PCR的DNA扩增循环程序；(2)解链曲线分析程序，(3)判定所测基因有无突变。
本方法使用LightCycIer仪器和LightCycler双杂交探针。LC仪器激发光只能激发Fluorescein，而LC荧光色团只能被Fluorescein发出的光激发。本放的基因点突变的实时PCR检测方法，所述的DNA扩增循环使用由上游探 针和下游探针组成的双探针，所述上游探针的尾端接一个Fluorescein，所述下游探针的头端标记一LC荧光色团，双探針之一覆盖突变点，突变点和双杂交探针在引物的下游尽量靠近另一个引物。引物位于突变点两侧，LC的双杂交探针头尾串联，仅相隔一，二个核苷酸。
本发明的实时PCR检测方法，所述的DNA扩增循环包括：1)聚合酶被激活、样品DNA变性双链分开成两条单链。2)接着温度下降至使DNA退火，3)引物联合在样品DNA单链上形成双链，聚合酶以样品DNA为模板开始合成，同时双杂交探针也在其中一条样品单链上；4)上游探针的尾端和下游探针头端靠近，发生荧光共振能量传递，LC机器发光激活Fluorescein，Fluorescein发光激活LC荧光色团，LC荧光色团发出的光被机器纪录。5)然后温度升至72℃左右，在这个温度下，杂交探针已变性离开杂交位置，聚合酶快速合成DNA形成两条双链，6)温度又上升至90-95℃，扩增开始第二轮循环。
本发明的实时PCR检测方法，1)所述的聚合酶被激活是在95℃高温10分钟，所述DNA退火温度，52～58℃。用于PCR检测的样品DNA，稀释至5-20ng/ul。
反应试剂中的多聚酶是热启动的DNA聚合酶，提高扩增的特异性。
用解链曲线检测基因突变。
本发明的实时PCR检测方法，(2)所述的解链曲线分析程序包括升高温度变性扩增的DNA，降低温度让探针与单链DNA杂交，然后缓慢升高温度让探针与扩增的DNA片断变行解链。
本发明的实时PCR检测方法，其特征在于，变性扩增的DNA温度为95℃，退火让探针与单链DNA杂交的温度为40℃，LC荧光色团被激发发光。然后很 缓慢地加热探针扩增片断杂交体，机器开始连续记录荧光强度。温度上升到一定程度使一条探针变性离开原来的位置，两个荧光团分开，荧光共振能量传递消失，LC荧光色团不发光。在一个温度点，半数杂交体上的探针离开扩增的片断，这就是这个探针的解链温度。所述让探针与扩增的DNA片断变性解链的温度由荧光(F)和温度(T)的负导数(-dF/dT)确定。设计时覆盖突变点的探针是匹配野生型的。确定长度和序列的探针在确定反应条件下，解链温度是一定的，波动小于1℃。
本发明的实时PCR检测方法，(3)所述判定所测基因有无突变是根据探针解链的温度来判定：如果有突变，突变点的一个或两个碱基改变了，与探针相应碱基不匹配，探针与突变型的杂交能力下降，低于野生型的解链温度就能使它变性分离。用解链曲线分析，突变型基因的解链温度会发生左移，比野生型低3℃，杂合基因有两个解链温度峰；无突变，解链温度不发生左移，有一个解链温度峰。
本发明的实时PCR检测方法，其特征在于，扩增片断要大于150bps，福尔马林固定石蜡包埋的组织约200bps，血液或新鲜组织可以大至300bps。
LC机器温度变化快，达到20℃/秒，加上LC双杂交探针，LC实时PCR特异性高。实时PCR和曲线分析反应在玻璃毛细管中进行，反应体积可少至10ul，试剂用量少，成本费用低。操作简单，比如KRAS密码子12，13上有12种可能的突变，解链曲线法只需一个反应。获得DNA样品后，90分钟就能完成PCR和基因突变分析。灵敏度比测序法高，所需DNA样品量少，大约3ng就够了。实时PCR解链曲线分析法可用于各种基因的点突变检测。
本发明的实时PCR检测方法在基因点突变检测中的应用，可应用临床疾病 的分子诊断。
本发明的有益效果是重复性好，筒单，快速，只需很少量的DNA样品(2-3ng)，特别适用于大量样品检测，本方法的另外一个最重要的特点是不会引起PCR产物的污染，可以极大地降低运作成本。
附图说明
图1为采用本发明的KRAS基因突变实时PCR检测方法监测结果
具体实施方式
以下通过检测KRAS点突变为实施例进一步阐述本发明，但不限制本发明的保护范围。
实施例1.KRAS基因突变的实时PCR解链曲线分析法
KRAS是Ras-Raf-MEK-ERK信息通路上的关键点之一。这一信号通路与细胞的生长和分裂有关。
40％的结肠癌、30％的肺癌有KRAS基因突变。KRAS基因突变发生在外显子2内的12和13位密码子上。KRAS突变使新型抗EGFR药Cetuximab和Panitumumab治疗无效。
本试验是帮助医生了解结肠癌和肺癌患者的KRAS基因突变的分子水平诊断，并综合其他临床表现决定这个病人是不是能从抗EGFR疗法中获益。本试验对结肠癌和肺癌患者的正确治疗有着不可取代的积极意义。
实验原理
本试验用LC双杂交探针在LC机器上进行实时PCR，完成PCR后做解链曲线分析，根据解链温度峰的变化决定有无点突变。扩增的DNA片段覆盖突变的位点，感应探针覆盖突变位点，其序列与野生型相匹配，它的3’端标记荧 光素，下游的锚探针5’端标记LC Red640荧光色团。当这对探针与PCR扩增的DNA片断杂交后，被激发的感应探针上的荧光素发光激发邻近的锚探针上的LC Red640荧光色团发光。机器记录了LC Red640的荧光强度。当温度升高使任一探针变性离开杂交的DNA片断，LC Red640就不被激发发光了。突变型的因其位点上的一个DNA的碱基改变而不能与感应探针的相应碱基相配使感应探针的杂交力下降，比野生型低一点的温度就能使其变性。有突变的DNA的解链温度峰会左移3℃以上。
实验样品
直肠结肠癌的福尔马林固定石腊包埋的组织切片，刮下组织切片中的肿瘤部分，提取DNA。
所需试剂和仪器
1，LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Probes(Roche公司的产品，有PCR扩增用的酶，反应液，氯化镁和水)
2，LightCycler(实时PCR机器)
3，LightCycler用的玻璃毛细管(一种小试管)
4，PCR的引物和探针：
正向引物
反向引物
感应探针
锚探针
以上引物和探针的序列按照本领域常规的引物和探针设计理论，应用通用的引物设计软件如NTI软件设计。
实验过程
1，PCR引物加水配制成10uM浓度，探针加水配制成4uM浓度
2，按说明书混合LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Probes试剂盒中的酶和反应液。
3，每一个PCR反应中按下列量加入试剂和样品
水 6.5ul
酶和反应液混合物 1.2ul
MgCl2(25mM) 0.96ul
正向引物(10uM) 0.6ul
反向引物(10uM) 0.6ul
感应探针(4uM) 0.6ul
锚探针(4uM) 0.6ul
样品DNA 1.0ul(3-30ng)
4.LightCycler程序
酶激活：一个循环
95℃ 10min
PCR扩增.：50个循环
95℃ 5sec
54℃ 10sec
75℃ 10sec
获取信号：单一，54℃
解链曲线：一个循环
95℃ 120sec
41℃ 25sec，以0.5℃/sec的步速上升并获取信号至
81℃ 0sec
冷却，一个循环，4℃.10sec
5.结果分析
野生型单个解链峰，约在65.5℃
突变型单个解链峰，约在61℃或两个解链峰，约在61℃和65.5℃
6，试验的灵敏度
所有12个突变，20％的肿瘤细胞。(直肠结肠癌肿瘤组织中肿瘤细胞多在30％以上)。
7，测试分析数据
样品1，4，5单个解链峰野生型
样品2，3，6两个解链峰突变型
8，对比研究
本发明不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种基因点突变的实时PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤(1)实时PCR的DNA扩增循环程序；(2)解链曲线分析程序，(3)判定所测基因有无突变。
2.根据权利要求1所述的基因点突变的实时PCR检测方法，其特征在于，(1)所述的DNA扩增循环使用由上游探针和下游探针组成的双探针，所述上游探针的尾端接一个Fluorescein，所述下游探针的头端标记一LC荧光色团，双探針之一覆盖突变点，突变点和双杂交探针在引物的下游尽量靠近另一个引物。
3.根据权利要求1所述的基因点突变的实时PCR检测方法，其特征在于，(1)所述的DNA扩增循环包括：1)聚合酶被激活、样品DNA变性双链分开成两条单链。2)接着温度下降至使DNA退火，3)引物联合在样品DNA单链上形成双链，聚合酶以样品DNA为模板开始合成，同时双杂交探针也在其中一条样品单链上；4)上游探针的尾端和下游探针头端靠近，发生荧光共振能量传递，5)然后温度升至72℃左右，在这个温度下，杂交探针已变性离开杂交位置，聚合酶快速合成DNA形成两条双链，6)温度又上升至90-95℃，扩增开始第二轮循环。
4.根据权利要求3所述的基因点突变的实时PCR检测方法，其特征在于，1)所述的聚合酶被激活是在95℃高温10分钟，所述DNA退火温度，52～58℃。
5.根据权利要求1所述的基因点突变的实时PCR检测方法，其特征在于，(2)所述的解链曲线分析程序包括升高温度变性扩增的DNA，降低温度让探针与单链DNA杂交，然后缓慢升高温度让探针与扩增的DNA片断变行解链。
6.根据权利要求5所述的基因点突变的实时PCR检测方法，其特征在于，变性扩增的DNA温度为95℃，退火让探针与单链DNA杂交的温度为40℃，所述让探针与扩增的DNA片断变性解链的温度由荧光(F)和温度(T)的负导数(-dF/dT)确定。
7.根据权利要求1所述的基因点突变的实时PCR检测方法，其特征在于，(3)所述判定所测基因有无突变是根据探针解链的温度来判定：如果有突变用解链曲线分析，突变型基因的解链温度会发生左移，比野生型低3℃，杂合基因有两个解链温度峰；无突变，解链温度不发生左移，有一个解链温度峰。
8.根据权利要求1所述的基因点突变的实时PCR检测方法，其特征在于，扩增片断要大于150bps，福尔马林固定石蜡包埋的组织约200bps，血液或新鲜组织可以大至300bps。
9.权利要求1所述的基因点突变的实时PCR检测方法在基因点突变检测中的应用，其特征在于，应用域临床疾病的分子诊断。
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