JP6797296B2 - 整列した複数の反応容器内の複数の分析物を光学的に励起し、該分析物からの蛍光を検知するための方法および装置 - Google Patents

Description

本発明は、請求項１および請求項２に記載の、整列した複数の反応容器内の複数の分析物を光学的に励起し、該分析物からの蛍光を検知するための方法および装置に関する。より具体的には、本発明は、反応容器内の生物学的分析物または生物学的試料に励起光を照射することにより光学的に励起させて蛍光を発生させ、続いて発生した蛍光の強度を測定することに関する。

励起光（たとえばＵＶ光）を分析物に照射して励起し、この励起によって分析物に発生した蛍光の強度を検知および測定するための方法および装置は、特に、タンパク質、ＲＮＡまたはＤＮＡを含有する生物学的分析物の検査において使用されている。

特に重要な適用分野としては、ＤＮＡ配列を増幅するために使用されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に関するものが挙げられる。定量ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲでは、特定のＤＮＡ配列を含む液体分析物に、蛍光色素（SYBR GreenやEvaGreenなど）または配列特異的標識ＤＮＡプローブ（HyBeacon、加水分解プローブまたはLight-ON/OFFプローブ）を加え、次いで周期的に加熱と冷却を行うことによって分析物中に含まれるＤＮＡ配列を増幅する。使用した蛍光色素またはＤＮＡプローブは、ＰＣＲ反応生成物のみに結合し、結合状態において適切な励起光で励起すると蛍光を発生する。したがって、反応生成物の量が増加すると、分析物中に発生する蛍光強度が増加し、適切な検出器を使用して各増幅サイクルにおいてリアルタイムで光学的に蛍光を測定することによって蛍光強度を決定することができる。決定した蛍光強度を標準分析物と比較することによって、測定した分析物中の各ＤＮＡ濃度を定量することができる。適切なコンピュータソフトウェアを用いて、得られた測定データをサイクル数に関して対数グラフにプロットすることにより、増幅したＤＮＡの相対量または絶対量を決定することができる。

蛍光を測定する類似の方法および装置は、たとえば、加熱した際のＤＮＡの分解特性を温度に関して測定する融解曲線分析（ＭＣＡ）でも使用される場合がある。

光学蛍光測定によって分析物中のＤＮＡに対して定量ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲを実施するための装置は、「リアルタイムサイクラー」と呼ばれることが多い。

このようなリアルタイムサイクラーは、定量ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲの各サイクルにおいて整列した複数の反応容器内に含まれる分析物の加熱と冷却を交互に行ったり、融解曲線分析において分析物を加熱したりするための装置と、分析物中の蛍光色素を励起するための励起光源と、励起により発生した蛍光の強度を検知し、測定するための光学蛍光検出器とを備える。

反応容器は、通常、リアルタイムサイクラー内に交換可能に設置することができるマイクロウェルプレートの一部を構成するものであり、反応容器は、マイクロウェルプレートにおいて特定の配列で（整列して）配置されている。前記用途に一般に使用される９６ウェルのマイクロウェルプレートでは、縦８列×横１２行に複数の反応容器が整列されている。これらの反応容器内に分析物を導入した後、マイクロウェルプレートの上面に透明な密封蓋を装着または接着して反応容器を密閉し、汚染を防止する。反応容器は、ウェルまたは反応キャビティとも呼ばれる。

蒸発した分析物がカバーの裏面で凝縮することを防ぐため、使用されるリアルタイムサイクラーの多くには、通常、孔が設けられた加熱可能な蓋が備えられている。励起光は、該孔を通して上方から蓋の下方の反応容器内へと入射され、分析物において発生した蛍光は、蛍光検出器によって上方から検知される。蓋の各孔の配置は、蓋の下方の反応容器の配置に対応しており、１個の反応容器に対して１個の孔が割り当てられている。反応容器の深さは、反応容器の上端の開口の直径よりも大幅に大きいため、現在使用されている光学リアルタイムサイクラーのほとんどでは、励起光源と蓋との間および蓋と蛍光検出器との間にフィールドレンズを備えたテレセントリックレンズ系が使用されている。フィールドレンズは、励起光源から放出された励起光を蓋と平行に配向して蓋の孔を通過させることによって、蓋の孔を通過する励起光光線束の光軸を反応容器の長手方向中心軸と一致させることができる。また、フィールドレンズは、反応容器内の分析物から発生し、蓋の孔を通って上方向に放出される平行な蛍光からなる光線束を一点に集中または収斂させ、収束させた光線束を検出器に入射させる役割も果たす。

たとえば米国特許第2006/0133080号明細書に記載されているように、数個の光源（ＬＥＤ）を使用する場合、フィールドレンズを使用する必要はない。しかし、このような装置は、前記明細書に開示されているように、１個の励起光源ではなく、複数個のＬＥＤを備えている。一方、米国特許第5,355,215号明細書では、液体培地中に沈んだ細胞培養層の蛍光を測定する方法が開示されている。光源は下方から照射されており、蛍光の測定も下方から行われる。蛍光色素を含む細胞培養用培地に加えて、培養容器の底に接着した細胞からも蛍光が発生する。この方法では、液層中の蛍光を測定する必要はなく、反応容器を加熱可能な蓋で密閉する必要もない。フィールドレンズを使用していない現在公知の解決策は、本発明の課題の解決には適していない。

テレセントリックレンズ系を備えた現在使用されている光学リアルタイムサイクラーの一例は、欧州特許第1619491号明細書（B1）、欧州特許第1681555号明細書（B1）、欧州特許第1681556号明細書（B1）または米国特許第7,687,260号明細書（B2）に開示されている。欧州特許第1619491号明細書（B1）には、フィールドレンズをフレネルレンズとして構成した光学リアルタイムサイクラーがさらに開示されている。また、１個の大型フィールドレンズの代わりに、各反応容器の上方に小型のフィールドレンズがそれぞれ配置されたリアルタイムサイクラーも知られている。

１個のフィールドレンズしか使用しない場合、蓋の孔のすべてから放出される蛍光をこの１個のフィールドレンズによって収束させて検出器に入射することができるように、このフィールドレンズは、比較的大きな直径を有する必要がある。さらに、光学的干渉を最小限に抑え、ひいては蛍光の損失を最小限に抑えるために、フィールドレンズの光学的品質は非常に高いものでなければならない。したがって、このようなフィールドレンズを開発および製造するにはコストや時間がかかり、リアルタイムサイクラーの製造コストも高くなる。また、小型のフィールドレンズを複数個使用しても、コストや時間の問題を回避することはできない。

前記問題を踏まえ、本発明は、１個以上のフィールドレンズやテレセントリックレンズ系を使用することなく、前記方法および装置を改良することを目的とする。

前記問題を解決するため、本発明の方法は、励起光からなる複数の光線束の主光線を分散させて、蓋の孔の上方から該孔を通して反応容器内に入射させること、および／または蓋の孔の下方から該孔を通して発せられる蛍光からなる複数の光線束の主光線を収束させて蛍光検出器に入射させることを提案する。本発明の装置は、励起光からなる複数の光線束の主光線が、孔の内部およびその下方で分散して反応容器内に入射すること、および／または蛍光からなる複数の光線束の主光線が、孔の内部およびその上方で収束して蛍光検出器に入射することを特徴とする。

したがって、本発明による解決策では、フィールドレンズによって励起光からなる複数の光線束を平行に配向させて蓋の孔を通過させるのではなく、励起光源から発生した励起光を蓋の孔に直接通過させる。これは、点状の励起光源または概ね点状の励起光源を使用する場合、反応容器内に入射する光線束も蓋の内部およびその下方で分散させる必要があることを意味する。

また、本発明による解決策では、蓋の孔を通過した蛍光からなる光線束を、蛍光検出器上のフィールドレンズによって収束することなく、すべての反応容器から発せられた蛍光の強度を蛍光検出器で同時に測定する。孔を配向することによって、該孔を通過した光線束が収束されて蛍光検出器に入射する。

前記解決策によって、高品質で干渉のないフィールドレンズを開発する必要を省くことができ、これに伴う大幅なコストの上昇を抑えることができる。また、フィールドレンズを使用しないことで、蓋の方向に向かった下方向の蛍光の再帰反射が起こらないため、光効率を向上させることもできる。さらに、１個以上のフィールドレンズの表面上で起こる励起光の干渉反射も防止することができる。

蛍光の検知と蛍光強度の測定を同時に行うため、蛍光検出器は、複数の反応容器から蓋の孔を上方向に通過して収束された蛍光光線束を検知する半導体センサ（たとえば、ＣＣＤまたはＣＭＯＳ）を有するカメラを備えていると有利である。カメラのＣＣＤアレイまたはＣＭＯＳアレイの異なるセクタを各反応容器に割り当てて蛍光光線束を検知し、検知した蛍光の強度を評価する。

励起光源は、点状の光源または概ね点状の光源であることが好ましい。また、所定の波長スペクトルを有する励起光を発する発光ダイオード（ＬＥＤ）を使用することが最も好ましい。均質な光源、励起対物レンズおよび励起フィルタを有利に備える励起光学系が、励起光源と蓋の間に配置されていると好適である。均質な光源は、一端が励起光源の反対側に向き、他端が励起対物レンズ側に向いており、均質な配光の光点を発生することができるものである。この均質な光源によって、均質な配光が提供される。励起フィルタは、励起光から不要な波長を除去する。限られた空間において、光混合器の光軸、励起対物レンズおよび励起フィルタを水平一直線に配置することができるように、励起対物レンズと蓋の間に、励起光を蓋に向かって下方向に反射するカップリングミラーをさらに設けることができる。

検出光学系は、フィールドレンズを備えていない標準的な光学系であり、蓋と蛍光検出器の間に配置される。検出光学系は、テレセントリック特性を持たない市販の対物レンズであることが好適な検出対物レンズと、検出フィルタとを備えていると有利である。検出フィルタは、蛍光から不要な波長を除去する。蓋と蛍光検出器の間の蛍光光路には、検出フィルタおよび検出対物レンズ以外に、さらなるレンズ、プリズムまたはその他の光学部品を配置しないことが有利である。

蓋の孔を通して可能な限り多くの励起光を反応容器に入射させるため、かつ蛍光検出器によって検知される蛍光の収率をさらに増加させるため、リアルタイムサイクラーにおいて使用される公知のテレセントリックレンズ系のように蓋の平面に対して前記複数の孔を垂直に配向するのではなく、前記複数の孔の長手方向中心軸が蓋の上面から下面の間で分散することが好ましい。本発明のさらなる好ましい一実施形態によれば、前記複数の孔の長手方向中心軸は、蓋の上方の１つの共通交点、好ましくは検出対物レンズ内にある１つの共通交点において交わる。このようにして、前記複数の孔の誘導によって、蛍光が検出対物レンズに直接入射し、次いで蛍光検出器に直接入射する。また、このような構成は、蓋の平面の中央垂線または垂線に対する前記孔の傾斜角および前記孔の長手方向中心軸の傾斜角が、蓋の中心から遠ざかるにつれて増加することを意味する。

前記蓋の各孔の長手方向中心軸は、各孔を通過する励起光光線束の主光線と一致するように配向してもよく、または各孔を通過する蛍光光線束の主光線と一致するように配向してもよい。

また、前記蓋の各孔の長手方向中心軸は、各孔を通過する励起光光線束の主光線と蛍光光線束の主光線がなす角度を二等分する線と一致するように配向することもできる。

別の一実施形態では、各孔の長手方向中心軸は、前記蓋に対して直角に配向することができるが、この場合、各孔の直径は大きくなる。したがって、この実施形態は、適切な温度（通常は１０５℃を超える温度）において、蓋が凝縮を十分に防止できる場合にのみ選択することができる。

本発明のさらなる好ましい一実施形態において、励起光源と蓋の間に配置された励起光学系の光軸に対応するすべての励起光光線束に共通の光軸は、蓋の平面および／または整列した複数の反応容器の平面に対して９０°以外の角度となるように配向される。

これとは対照的に、本発明のさらに有利な一実施形態によれば、蓋と蛍光検出器の間に配置された検出光学系の光軸に対応するすべての蛍光光線束に共通する光軸は、蓋の平面および／または整列した複数の反応容器の平面に対して９０°の角度となり、かつすべての蛍光光線束に共通する光軸とすべての励起光光線束に共通する光軸とがなす角度が小さい角度αとなり、すべての蛍光光線束に共通する光軸と励起光学系の光軸とがなす角度が小さい角度αとなるように配向される。このような構成にすることによって、励起光の光路と蛍光の光路が分離される。

前述のような構成にすると、反応容器のカバーまたは分析物の液面において励起光が反射されたとしても、入射角に対応した角度で反対側に反射されて、検出器には到達することがないという利点がある。このようにして、測定結果の質を高めることができる。このように励起光の反射を光軸から逸らすことのさらなる利点として、たとえば前述の米国特許第7,687,260号明細書（B2）で図示および説明されているようなビームスプリッターが不要であることが挙げられる。このようにして、ビームスプリッターにおいて励起光の５０％が失われることがなく、かつ蛍光の５０％が失われることもないため、蛍光の検知効率は４倍となる。さらに、光強度の低い励起光源を使用することができる。このような利点は、特に本発明のさらなる好ましい一実施形態において、反応容器内の斜影効果を最小限に抑えるために、前述した励起光学系の光軸と検出光学系の光軸との間の小さい角度αを、励起光学系の物体側開口角と検出光学系の物体側開口角の合計よりも大きくし、かつ１０°未満、好ましくは５°未満、最も好ましくはわずか３°とした場合に達成することができる。

しかし、通常、検知される蛍光から励起光を分離するために、ビームスプリッターまたは偏光ビームスプリッターを使用することも可能である。

本発明の別の有利な一実施形態によれば、複数の整列した隣り合う反応容器が互いに等間隔で配置された従来のマイクロウェルプレートの使用を可能にし、かつ斜影効果をさらに最小限に抑えるためには、孔の長手方向中心軸の分散を考慮に入れて、隣接した孔の長手方向中心軸間の距離を、隣接した反応容器の長手方向中心軸間の距離よりもわずかに短くする。このような構成とすることによって、各孔は、対応する各反応容器の直上から少しずれて配置され、このずれは、蓋の中心に向かうにつれて小さくなり、蓋の中心から遠ざかるにつれて大きくなる。

本発明のさらに好ましい一実施形態によれば、各反応容器の長手方向中心軸が互いに平行な従来のマイクロウェルプレートを使用する場合、各反応容器の長手方向中心軸が、対応する各孔の長手方向中心軸と各反応容器内で交わるため、斜影効果を最小限に抑えることができる。

前述の手段により光軸を数度傾けて励起光を照射して試験を行ったところ、励起光の顕著な斜影効果は反応容器内で観察されなかった。

蓋の孔は穿孔、すなわち円形断面の孔であると好適であり、この理由として、５軸加工または６軸加工により、所望の方向で蓋に孔を容易に作製できることが挙げられる。

反応容器の透明カバーの裏面において分析物が凝縮しないように、蓋が加熱可能であると有利である。

マイクロウェルプレートでは、複数の反応容器が直線状に整列して行と列をなすように配置されていることから、検出光学系の光軸が、マイクロウェルプレートにおいて反応容器の行と列がそれぞれ鏡面対称となる互いに垂直な２つの対称面の交線と一致していると有利である。このような構成であると、蓋の平面に対して垂直な検出光学系の光軸に対して回転対称に蓋の孔を配置することができ、軸加工におけるドリル加工のプログラミングが容易となる。

以下、図に示した例を参照しながら本発明を詳細に説明する。

リアルタイムサイクラーの一部を構成する本発明の装置の概略断面図である。 図１の詳細IIの拡大図である。 前記リアルタイムサイクラーと共に使用することができるマイクロウェルプレートの平面図であり、前記リアルタイムサイクラーの検出光学系の光軸とマイクロウェルプレートとの交点を示す。 マイクロウェルプレートのウェルとリアルタイムサイクラーの加熱可能な蓋の孔を重ね合わせて、上部から見た図である。

図１に部分的かつ概略的に示したリアルタイムサイクラー（10）は、マイクロウェルプレート（16）の反応容器すなわちウェル（14）に入れた液体分析物（12）において定量ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲを行うためのものである。各ウェル（14）において、液体分析物（12）中に含まれるＤＮＡ配列と蛍光色素が周期的に増幅された後、測定される。増幅を行うため、各ウェル（14）の分析物（12）は、すべて同時に交互に加熱と冷却を行うことによってサーマルサイクル処理が行われる。各加熱サイクルにおいて、分析物（12）中のＤＮＡ配列は、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される。反応生成物に結合した蛍光色素は、励起光で励起されると蛍光を発する。発生した蛍光の強度は反応生成物の量に依存するため、リアルタイムサイクラー（10）による光学蛍光測定を行い、標準分析物と比較することによって反応生成物の量を定量することができる。

マイクロウェルプレート（16）は、たとえば、図３に示すような、縦８列×横１２行に整列された９６個のウェル（14）を有するマイクロウェルプレートであってもよい。別の態様において、別の種類のマイクロウェルプレート、たとえば縦１６列×横２４行に整列された３８４個のウェルを有するマイクロウェルプレート、または縦６列×横８行に整列された４８個のウェルを有するマイクロウェルプレートと共に使用できるように、リアルタイムサイクラー（10）を適合させてもよい。各ウェル（14）は、底部（18）と、透明カバー（20）によって密閉された上部と、長手方向中心軸（24）と同心の側壁（22）とを有する。

図１に概略的に示すように、ウェル（14）を有するマイクロウェルプレート（16）は、各ウェルが、孔（26）を備えた平坦な蓋（28）の下方に配置されるようにリアルタイムサイクラー（10）内に配置される。蓋（28）の孔（26）の誘導によって、蓋（28）の上方から該蓋（28）に入射する励起光光線束（30）（図２）が、マイクロウェルプレート（16）の各ウェル（14）へと入射するが、余分な励起光は遮断される。さらに、孔（26）は、分析物（12）が励起されたことによって発生した蛍光光線束（32）（図２）を、マイクロウェルプレート（16）の各ウェル（14）から蛍光検出器（34）へと上方向に通過させる。蓋（28）の各孔（26）は、マイクロウェルプレート（16）の各ウェル（14）の上方に所定の高さで配置された穿孔であり、孔（26）の数は、リアルタイムサイクラー（10）に導入されるマイクロウェルプレート（16）のウェル（14）の数に一致する。

分析物（12）の汚染および／または蒸発を防止するために、透明カバー（図示せず）をウェル（14）の上端に装着または接着して密閉する。蓋（28）は、たとえば、蓋（28）を加熱することによってカバーの裏面での分析物（12）の凝縮を防ぐことが可能な一体型抵抗加熱器（図示せず）を含む。

リアルタイムサイクラー（10）は、マイクロウェルプレート（16）と蓋（28）の上方に、励起光で分析物（12）中の蛍光色素を励起し、これと同時に、励起によって発生した分析物（12）の蛍光の強度を検知または測定するための光学装置（36）を含む。この光学装置（36）は、励起光を放出する励起光源（38）と、励起光源（38）と蓋（28）の間に配置された励起光学系（40）と、すべての分析物（12）から放出される蛍光の強度を励起と同時に測定するための蛍光検出器（34）と、蓋（28）と蛍光検出器（34）の間に配置された検出光学系（42）とを備える。

励起光源（38）は発光ダイオード（ＬＥＤ）であり、蛍光検出器（34）は、蛍光に感応するＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラである。このカメラは、感光性ＣＣＤアレイまたは感光性ＣＭＯＳアレイを備え、いずれもマイクロウェルプレート（16）のウェル（14）のうちの１つから発せられた蛍光の強度を検知する。

簡易的に示した前記励起光学系（40）は、均質な光源（38）と、励起対物レンズ（46）と、励起フィルタ（48）と、カップリングミラー（50）とを備え、これらの部品は、励起光源（38）と蓋（28）との間において、励起光の進行方向にこの順序で配置される。励起対物レンズ（46）は、均質な光源（38）から放出された励起光を、マイクロウェルプレート（16）のウェル（14）の底部（18）から延びる焦点面（FE）に収束させるものであり、励起対物レンズ（46）は深い焦点深度を有する。励起フィルタ（48）は、励起光から不要な波長を除去する。カップリングミラー（50）は、励起光を蓋（28）に向かって下方向に反射する。

簡易的に示した前記検出光学系（42）は、検出フィルタ（56）と検出対物レンズ（58）とを備え、これらの部品は、蓋（28）と蛍光検出器（34）の間において、分析物（14）から蛍光検出器（34）に向かって発せられる蛍光の進行方向にこの順序で配置される。

マイクロウェルプレート（16）の隣接したウェル（14）からの蛍光による光学的クロストークをできるだけ低く抑えるため、検出対物レンズ（58）の焦点は、蓋（28）の上面にある。検出フィルタ（56）は、蛍光から不要な波長を除去する。

励起光学系（40）は、励起光源（38）とカップリングミラー（50）との間に水平方向に配向された光軸（64）を有し、この光軸（64）は、カップリングミラー（50）から蓋（28）に向かって下方向に８７〜８８°の傾斜角で延びる。検出光学系（42）は、蓋（28）またはマイクロウェルプレート（16）から延びる平面と焦点面（FE）に垂直な光軸（66）を有する。このような構成であると、励起光学系（40）の光軸（64）は、カップリングミラー（50）の下方で、検出光学系（42）の光軸（66）に対して２〜３°の小さい角度αで傾斜する。マイクロウェルプレート（16）のウェル（14）内の分析物（12）の液面（68）で励起光が直接反射されて蛍光検出器（34）に入射してしまうことを防ぐため、角度α（説明を簡便にするために図１に大きく拡大して示す）は、励起光学系（40）の物体側開口角と検出光学系（42）の物体側開口角の合計より大きい。

図１および図３に示すように、リアルタイムサイクラー（10）にマイクロウェルプレート（16）が導入されると、検出光学系（42）の光軸（66）は、マイクロウェルプレート（16）の中心を通ることから、検出光学系（42）の光軸（66）は、マイクロウェルプレート（16）のウェル（14）の行と列にそれぞれ平行なマイクロウェルプレート（16）の２つの対称面（70,72）がなす、蓋（28）の平面に対して垂直な交線と一致する。この交線は、蓋（28）の中央垂線と一致する。図３は、図１のＩ−Ｉ断面を示す。

リアルタイムサイクラー（10）において蓋（28）の上方にテレセントリック光学系やフィールドレンズを配置することなく、該リアルタイムサイクラー（10）が機能を果たせるように、図１の左側および図２に示すように、穿孔（26）を通って下方向に進行する励起光光線束（30）の主光線（76）と、穿孔（26）を通って上方向に進行する蛍光光線束（32）の主光線（78）とがなす角度αを二等分する線に穿孔（26）の長手方向中心軸（74）が一致するように、蓋（28）の各穿孔（26）を配向する。この場合、蓋（28）の穿孔（26）すべての長手方向軸（74）は、励起光学系（40）と検出光学系（42）との間の領域内で互いに交差するように配向され、穿孔（26）の長手方向軸（74）同士の交点は、励起光学系（40）の光軸（64）と検出光学系（42）の光軸（66）とがなす角度αを二等分する線上にある。

検出光学系（42）の光軸（66）と励起光学系（40）の光軸（64）は、蓋（28）の方向に向かってわずか数度の角度αで収束しているため、別の態様では、図２の左側に示すように、蓋（28）の穿孔（26）の長手方向中心軸（74）が、穿孔（26）を通して下方向に進む励起光光線束（30）の主光線（76）と一致するように、穿孔（26）を配向することができ、あるいは図２の右側に示すように、穿孔（26）を通して上方向に進む蛍光光線束（32）の主光線（78）と一致するように、穿孔（26）を配向することもできる。

前者の場合、すべての長手方向中心軸（74）同士が励起対物レンズ（46）内で交差するように穿孔（26）が配向され、その交点は、励起フィルタ（48）に隣接する励起対物レンズ（46）の主平面にある。後者の場合、穿孔（26）の長手方向中心軸（74）は、検出対物レンズ（58）内で互いに交差するように配向され、その交点は、検出フィルタ（56）に隣接する検出対物レンズ（58）の主平面にある。

穿孔（26）をこのように配向することによって、図１および図２に示すように、穿孔（26）を通過して下方向に進行し、マイクロウェルプレート（16）のウェル（14）内に入射する励起光光線束（30）が、穿孔（26）の内部および蓋（28）の下方ならびにウェル（14）の内部で分散する主光線（76）を有することができ、かつ穿孔（26）を通過する蛍光光線束（32）が、穿孔（26）の内部および蓋（28）の上方において、検出器（34）および検出光学系（42）に向かって上方向に収束する主光線（78）を有することができる。

このような構成は、図１に示すように、蓋の中心付近において穿孔（26）が、蓋（28）の中央垂線または蓋（28）の平面の垂線に対して、蓋の辺縁付近よりも小さい傾斜角で傾斜していることを意味する。ここでも図１に示すように、蓋の中央垂線または蓋の平面の垂線または平行な焦点面（FE）に対する穿孔（26）の長手方向中心軸（74）の傾斜角は、蓋の中心から遠ざかるにつれて増加し、ウェル（14）の上方に配置された蓋の中心から最も離れた位置の、マイクロウェルプレート（16）の四隅の穿孔（26）は、蓋（28）の中央垂線または蓋（28）の平面の垂線に対する傾斜角が最大となる。

これに対して、図２からよく分かるように、マイクロウェルプレート（16）の各ウェル（14）は、通常のマイクロウェルプレートに見られるように平行な長手方向中心軸（24）を有する。励起光光線束（30）を可能な限り完全にウェル（14）内の分析物（12）に入射させ、斜影効果を完全または少なくとも大幅に防止するため、穿孔（26）の長手方向中心軸（74）とウェル（14）の長手方向中心軸（24）が、各ウェル（14）の内部において交点（Ｓ）で交わるように、好ましくは各ウェル（14）内の分析物（12）の液面（68）の高さ付近で交わるように、マイクロウェルプレート（16）のウェル（14）に対して蓋（28）の穿孔（26）を配向する。これによって、入射光線束（30）をセンタリングすることができる。

さらに、蓋（28）の穿孔（26）の中心間距離は、マイクロウェルプレート（16）のウェル（14）の中心間距離と正確には一致しておらず、図４の重ね合わせた概略図に示したように、蓋（28）の穿孔（26）の中心間距離は、マイクロウェルプレート（16）のウェル（14）の中心間距離よりもわずかに短く、このような構成であることによって、穿孔（26）間の距離はウェル（14）間の距離よりもわずかに短い。この結果、蓋（28）の上面側および下面側の穿孔（26）の開口の中心は、対応するウェル（14）の長手方向中心軸（24）に対して蓋の中心寄りにわずかにずれており、図４に示すように、整列した穿孔またはウェルの各行および各列におけるずれは、蓋の中心から最も外側の穿孔またはウェルへと遠ざかるにつれて増加する。

不利な条件下で９６ウェルのマイクロウェルプレートを使用した場合、すなわち、ウェルの長手方向中心軸（24）に対する励起光光線束（30）の傾斜角が最大となるマイクロウェルプレート（16）の四隅に位置するウェル（14）を使用して５０μｌまたは１４μｌの分析物を測定した場合であっても、斜影効果は全く発生しないか、またはごくわずかにしか発生しない。３８４ウェルのマイクロウェルプレート（16）の四隅に位置するウェル（14）を使用して１０μｌの分析物を測定した場合、最大で約１６％の斜影効果が発生するが、これは許容範囲内である。

Claims (14)

1. 整列した複数の反応容器（14）内の複数の分析物（12）を光学的に励起し、該分析物（12）からの蛍光を検知する方法であって、
   複数の分析物（12）を収容するための整列した複数の反応容器（14）と；
   前記反応容器（14）内の前記分析物（12）に励起光を照射するための励起光源（38）と；
   前記励起光の照射と同時に、前記反応容器（14）内の前記分析物（12）からの蛍光を検知するための蛍光検出器（34）と；
   整列した複数の孔（26）を有し、前記整列した複数の反応容器（14）の上方に配置された蓋（28）と
   を備え、
   前記励起光源（38）からの励起光からなる複数の光線束（30）が、前記孔（26）を通過して前記反応容器（14）内に入射することができ、かつ前記分析物（12）からの蛍光からなる複数の光線束（32）が、前記孔（26）を通過して前記蛍光検出器（34）に到達することができること、ならびに
   前記励起光からなる複数の光線束（30）の主光線（76）が、前記孔（26）の内部およびその下方で分散して前記反応容器（14）内に入射し、前記蛍光からなる複数の光線束（32）の主光線（78）が、前記孔（26）の内部およびその上方で収束して前記蛍光検出器（34）に入射し、前記蓋（28）の前記複数の孔（26）の長手方向中心軸（74）が、前記蓋（28）の上面から下面の間で下方向に分散していることを特徴とする装置を使用して、
   励起光源（38）からの励起光を、整列した複数の反応容器（14）内の複数の分析物（12）に供給すること、および
   前記反応容器（14）内の前記分析物（12）からの蛍光を蛍光検出器（34）に供給すること
   を含み、
   前記励起光からなる複数の光線束（30）が、前記整列した複数の反応容器（14）の上方に配置された蓋（28）の整列した複数の孔（26）を通過して該蓋（28）の下方の前記反応容器（14）に入射し、これと同時に、該反応容器（14）からの蛍光からなる複数の光線束（32）が、前記蛍光検出器（34）に到達すること、
   前記励起光からなる複数の光線束（30）が、分散する複数の主光線（76）を有し、前記孔（26）の上方から該孔（26）を通過して前記反応容器（14）内に入射すること、
   前記蛍光からなる複数の光線束（32）が、収束する複数の主光線（76）を有し、前記孔（26）の下方の前記反応容器（14）から該孔（26）を通過して前記蛍光検出器（34）に到達すること、および
   フィールドレンズを使用しないこと
   を特徴とする方法。
2. フィールドレンズを使用せずに、複数の分析物（12）を光学的に励起し、該分析物（12）からの蛍光を検知するための装置であって、
   複数の分析物（12）を収容するための整列した複数の反応容器（14）と；
   前記反応容器（14）内の前記分析物（12）に励起光を照射するための励起光源（38）と；
   前記励起光の照射と同時に、前記反応容器（14）内の前記分析物（12）からの蛍光を検知するための蛍光検出器（34）と；
   整列した複数の孔（26）を有し、前記整列した複数の反応容器（14）の上方に配置された蓋（28）と
   を備え、
   前記励起光源（38）からの励起光からなる複数の光線束（30）が、前記孔（26）を通過して前記反応容器（14）内に入射することができ、かつ前記分析物（12）からの蛍光からなる複数の光線束（32）が、前記孔（26）を通過して前記蛍光検出器（34）に到達することができること、ならびに
   前記励起光からなる複数の光線束（30）の主光線（76）が、前記孔（26）の内部およびその下方で分散して前記反応容器（14）内に入射し、前記蛍光からなる複数の光線束（32）の主光線（78）が、前記孔（26）の内部およびその上方で収束して前記蛍光検出器（34）に入射し、前記蓋（28）の前記複数の孔（26）の長手方向中心軸（74）が、前記蓋（28）の上面から下面の間で下方向に分散していることを特徴とする装置。
3. 前記励起光源（38）と前記蓋（28）の間に配置された励起光学系（40）と、前記蓋（28）と前記蛍光検出器（34）の間に配置された検出光学系（42）とを備え、
   前記検出光学系（42）が、前記蓋（28）の平面および／または前記整列した複数の反応容器（14）の平面に対して垂直に向いた光軸（66）を有すること、ならびに
   前記励起光学系（40）が、前記検出光学系（42）の前記光軸に対して傾斜した角度（α）の光軸（64）を有すること
   を特徴とする、請求項２に記載の装置。
4. 前記励起光学系（40）の光軸（64）と前記検出光学系（42）の光軸の間の角度（α）が、前記励起光学系（40）の物体側開口角と前記検出光学系（42）の物体側開口角の合計よりも大きく、かつ５°未満である、請求項３に記載の装置。
5. 各孔（26）の長手方向中心軸（74）が、該孔（26）を通過する前記励起光の光線束（30）の主光線（76）と一致するように配向されているか、該孔（26）を通過する前記蛍光の光線束（32）の主光線（78）と一致するように配向されているか、または該孔（26）を通過する前記励起光の光線束と前記蛍光の光線束（30,32）の主光線（76,78）同士がなす角度を二等分する線と一致するように配向されている、請求項２〜４のいずれかに記載の装置。
6. 前記蓋（28）および／または前記整列した複数の反応容器（14）の中央垂線に対する前記複数の孔（26）の長手方向中心軸（74）の傾斜角が、前記蓋の中心から遠ざかるにつれて増加する、請求項２〜５のいずれかに記載の装置。
7. 前記複数の孔（26）の長手方向中心軸（74）が１つの共通交点で交わる、請求項２〜６のいずれかに記載の装置。
8. 前記複数の反応容器（14）が、互いに平行な長手方向中心軸（24）を有し、該長手方向中心軸（24）が、各反応容器（14）に対応する前記孔（26）の長手方向中心軸（74）と該反応容器（14）内で交わる、請求項２〜７のいずれかに記載の装置。
9. 隣接する孔（26）の長手方向中心軸（24）間の距離が、隣接する反応容器（14）の長手方向中心軸（24）間の距離よりもわずかに短い、請求項２〜８のいずれかに記載の装置。
10. 前記複数の反応容器（14）が、直線状に整列して複数の行と列をなすように配置されていること、および
    前記蓋（28）の平面および／または前記整列した複数の反応容器（14）の平面と垂直になるように配向されている前記検出光学系（42）の光軸（66）が、前記複数の反応容器（14）の行と列がそれぞれ鏡面対称となる互いに垂直な２つの対称面（70,72）の交線と一致すること
    を特徴とする、請求項２〜９のいずれかに記載の装置。
11. 前記孔（26）が穿孔である、請求項２〜１０のいずれかに記載の装置。
12. 前記蓋（28）が加熱可能である、請求項２〜１１のいずれかに記載の装置。
13. 検知される前記蛍光から前記励起光を分離するために、ビームスプリッターまたは偏光ビームスプリッターが備えられている、請求項２〜１２のいずれかに記載の装置。
14. 定量ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲまたは融解曲線分析における、請求項１に記載の方法および／または請求項２〜１３のいずれかに記載の装置の使用。