KR102415856B1 - 반응 용기의 어레이에서 복수의 분석물을 광학적으로 여기시키고 분석물로부터 형광을 감지하는 방법 및 장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 반응 용기들(14)의 어레이 내에서 다수의 분석물들(12)을 광학 여기하고 상기 분석물들(12)로부터 형광을 검출하기 위한 방법 및 장치에 관한 것으로, 여기 광원(38)으로부터 여기 광이 상기 분석물들(12)로 공급되고, 상기 분석물들(12)로부터 형광이 동시에 형광 측정기(34)로 공급되고, 상기 여기 광의 다수의 빔 다발들(30)이 반응 용기들(14)의 상기 어레이 위에 배치된 커버(28) 내의 홀들(26)의 어레이를 통해서 상기 커버(28)의 아래에서 상기 반응 용기들(14)로 조향되고, 상기 반응 용기들(14)로부터 상기 형광의 다수의 빔 다발들(32)이 상기 형광 측정기(34)에 도달한다. 본 발명에 따르면 상기 여기 광의 상기 다수의 빔 다발들(30)의 상기 메인 빔들(76) 상기 홀들(26)의 내부 및 하부에서 상기 반응 용기들(14) 내부로 분기하고 및/또는 상기 형광의 상기 다수의 빔 다발들(78)은 홀들의 내부 및 상부에서 상기 형광 측정기(34)를 향해서 수렴한다.

Description

반응 용기의 어레이에서 복수의 분석물을 광학적으로 여기시키고 분석물로부터 형광을 감지하는 방법 및 장치

청구항 제1 및 제2의 각각의 전제부에 따르면, 본 발명은 반응 용기의 어레이에서 복수의 분석물을 광학적으로 여기(excitation)시키고 상기 분석물로부터 형광을 감지하는 방법 및 장치에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 형광을 생성하고 그 이후에 생성된 형광의 강도를 측정하기 위해 여기 광을 조사함에 의한 반응 용기 내 생물학적 분석물 또는 샘플의 광학적 여기에 관한 것이다.

여기에 의해 분석물 내에서 생성되는 형광의 강도를 센싱 및 측정하는 것뿐만 아니라, 예를 들어 자외선과 같은 여기 광을 조사하여 분석물을 여기하기 위한 방법 및 장치는 단백질, RNA 또는 DNA를 포함하는 생물학적 분석물의 검사에 이용된다.

특히 중요한 채택 분야는 DNA 서열(DNA sequences)을 증폭하는데 사용되는 폴리메라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)과 관련하여 발견될 수 있다. 정량적 또는 실시간 PCR에서, 사이버 그린(Sybr green) 또는 에바 그린(Eva green)과 같은 형광 염료 또는 표지된 서열-특이 DNA 프로브(Hybeacon, 가수 분해 프로브 또는 광-ON/OFF 프로브)는 특이 DNA 서열을 포함하는 액체 분석물에 추가되고, 포함된 DNA 서열의 양을 증폭시키기 위하여 주기적으로 가열되고 냉각된다. 사용된 형광 염료 또는 DNA 프로브는 상기 PCR의 반응 생성물에만 결합하고, 결합 상태에서 적절한 여기 광으로 여기될 때 형광을 방출한다. 따라서, 상기 반응 생성물의 양의 증가는, 적정한 측정기에 의한 광학 형광 측정에 의해 실시간으로 각 증폭 사이클에서 결정될 수 있는, 분석물 내에서 생성되는 형광의 강도를 증가시킨다. 표준 분석물과 비교함으로써 분석물 내의 각 DNA 농도의 정량적 결정을 허용한다. 획득된 측정 데이터는 적절한 컴퓨터 소트웨어에 의해 증폭된 상기 DNA의 상대적인 또는 절대적인 양을 결정하기 위해 사이클 수에 대한 대수 차트 내에서 플로팅 될 수 있다.

형광 측정을 위한 유사한 방법 및 장치는 또한, 예를 들어, 가열시 온도에 대한 DNA의 분해 특성을 측정하는 멜팅 커브 분석(melting curve analysis) 내에 적용될 수 있다.

분석물 내에서 DNA에 대한 광학 형광 측정을 통해 정량적 또는 실시간 PCR을 수행하는 장치는 종종 "실시간 사이클러(real-time cycler)"로 불린다

이러한 실시간 사이클러는 상기 정량적 또는 실시간 PCR의 사이클 동안 반응 용기의 어레이 내에서 분석물을 교대로 가열 및 냉각하고 상기 멜팅 커브 분석 동안 분석물을 가열하기 위한 설비를 포함하고, 여기의 결과로 방출되는 형광의 강도를 센싱하고 측정하기 위한 광학 형광 측정기뿐만 아니라 상기 분석물 내에서 상기 형광 염료를 여기하기 위한 여기 광원을 포함한다.

상기 반응 용기는 일반적으로 실시간 사이클러 내에서 교체 가능하게 배치될 수 있고 상기 반응 용기들은 특정 배열(어레이)인 마이크로웰 플레이트(microwell plate)의 일부분이다. 이를 위해 일반적으로 사용되는 96 마이크로웰 플레이트에서는, 반응 용기들의 어레이는, 상기 반응 용기들을 닫고 오염을 막기 위해서 투명한 밀봉된 커버가 상기 마이크로웰 플레이트의 상면에 용접되거나 붙기 전에 분석물들이 도입된 반응 용기들 내에서의 8 x 12 어레이이다. 상기 반응 용기들은 또한 작은 볼(bowl) 또는 반응 구멍(cavity)이라고도 한다.

커버에서 증발된 분석물의 응축을 막기 위해서, 실시간 사이클러는 일반적으로, 대부분의 실시간 사이클러에서 사용하는, 홀이 있는 가열 가능한 커버를 갖는다. 한편으로, 상기 홀의 위에서 부터 상기 커버 아래로 여기 광이 상기 반응 용기들 내로 조향하고, 다른 한편으로, 상기 분석물 내에서 생성된 형광은 위에서 부터 형광 측정기에 의해서 감지된다. 상기 커버 내의 홀들의 배열은 상기 커버 아래의 반응 용기들의 배열에 대응하고, 하나의 홀은 각각의 반응 용기에 할당된다. 상기 반응 용기들의 깊이는 반응 용기 상단의 개부구의 직경보다 훨씬 크기 때문에 오늘날 사용되는 대부분의 광학 실시간 사이클러들은 한편으로는 여기 광원과 커버 사이에 할당되고 다른 한편으로는 또한 커버와 형광 측정기 사이에 할당되는 대물렌즈(field lens)를 갖는 텔레센트릭 렌즈 시스템(telecentric lens system)을 갖는다. 대물렌즈는 여기 광이 상기 홀들을 통과하기 전에 상기 커버 내에 평행하게 상기 여기 광원으로부터 여기 광을 배향시키기 위한 것으로, 상기 커버 내에서 상기 홀들을 통과하는 빔의 광학 축은 상기 반응 용기들의 종방향 중심축(longitudinal center axes)에 정렬된다. 그러나, 상기 대물렌즈는 또한 상기 반응 용기들 내에서 분석물에 의해 방출되는 형광의 빔 다발(bean bundles)을 묶거나 초점을 맞추기 위한 것으로, 빔 다발은 측정기로 모인다.

예를 들어, 미국공개공보 2006/0133080에 기재된 바와 같이, 소정의 광원(LEDs)들이 사용된다면, 대물렌즈는 필요하지 않다. 그러나, 그러한 장치들은 본 발명에서 개시한 바와 같이 여기 광원뿐만 아니라 LEDs를 가진다. 미국등록공보 5,355,215는 액체로 코팅된 세포 배양층의 형광을 측정하는 방법을 개시한다. 형광 측정과 마찬가지로 조명은 아래로부터 있다. 배양기의 바닥에 붙어있는 세포들은 형광 염료를 갖는 세포 매체와 다른 형광을 보인다. 여기서, 액체층 내의 형광을 결정하기 위해 가열할 수 있는 커버로 상기 반응 용기을 닫을 필요는 없다. 대물렌즈가 없는 현재까지 알려진 해결 방안은 본 문제에는 적합하지 않다.

텔레센트릭 렌즈 시스템을 갖는 오늘날 사용되는 광학 실시간 사이클러들은 EP 1 619 491 B1, EP 1 681 555 B1, EP 1 681 556 B1, 또는 US 7,687,260 B2에서 개시된다. EP 1 619 491 B1은 대물렌즈가 프레넬(Fresnel) 렌즈로 설정된 광학 실시간 사이클러를 개시한다. 또한, 실시간 사이클러들은 하나의 큰 대물렌즈 대신에, 반응 용기들 위에 각각 배열된 작은 대물렌즈들의 어레이를 가지는 것으로 알려져 있다.

만약 하나의 대물렌즈만을 사용한다면 커버의 모든 홀에서 나온 형광을 대물렌즈로 묶어서 측정기 쪽으로 조향 시키도록 상대적으로 큰 직경을 가져야만 한다. 또한, 상기 대물렌즈는 광학 간섭을 최소화하여 형광의 손실을 최소화하기 위해 매우 높은 광학 특성을 가져야 한다. 결과적으로, 그러한 대물렌즈들의 개발 및 제조는 비용이 많이 들고 시간 소모적이며, 실시간 사이클러의 생산 비용에도 반영된다. 또한, 이들 문제점은 복수의 소형 대물렌즈에 의해 피할 수도 없다.

이로부터 시작되는 본 발명은 상기의 문제에 기반한 것으로, 처음에 언급한 종류의 방법 및 장치를 개선하여, 하나 이상의 대물렌즈들 또는 텔레센트릭 렌즈 시스템으로부터 각각 억제될 수 있다.

이러한 문제를 해결하기 위해, 본 발명에 따른 방법은 커버의 홀들을 통해 분기하는 메인 빔을 갖는 여기 광의 복수의 빔 다발을 위에서부터 반응 용기들 내부로 조향하거나 및/또는 상기 커버의 상기 홀들을 통해 수렴하는 메인 빔을 갖는 여기 광의 복수의 빔 다발을 밑에서부터 조향하고, 그 다음 형광 측정기 쪽으로 조사하는 것을 제안한다. 본 발명에 따른 장치는 상기 여기 광의 다수의 빔 다발의 메인 빔들이 상기 홀들의 내부 및 하부에서 상기 반응 용기들로 분기하고 및/또는 형광의 다수의 빔 다발의 메인 빔들이 상기 홀들의 내부 및 상부에서 상기 형광 측정기 쪽으로 수렴한는 것을 특징으로 한다.

따라서, 본 발명에 따른 해결 방안은 한편으로는 빔 다발들이 상기 커버의 상기 홀들을 통과하기 전에 대물렌즈에 의해 평행하게 상기 여기 광의 다수의 빔 다발들을 배향시키는 것을 억제하지만, 상기 커버의 상기 홀들을 통하여 여기 광원으로부터 여기 광을 직접 조향한다. 점-형상 또는 일반적인 점-형상의 여기 광원을 사용하는 경우 이는 상기 반응 용기들로 들어오는 상기 빔 다발들이 상기 커버 내부 및 하부로 분기해야만 한다는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 상기 해결 방안은 한편으로는 상기 형광 측정기 상의 대물렌즈에 의해 빔 다발들이 상기 커버의 상기 홀들을 통과한 후에 상기 형광의 상기 빔 다발들을 집중시키는 것을 억제하고, 그런 다음 모든 상기 반응 용기들의 상기 형광의 강도를 동시에 측정한다. 상기 홀들을 배향시킨 결과는 상기 홀들로부터 나오는 상기 빔 다발들이 상기 형광 측정기 쪽으로 수렴하는 것을 의미한다.

위의 조치에 의해 고-품질이고 간섭이 없는 대물렌즈의 개발을 억제할 수 있으며 이와 관련된 상당한 비용을 절감할 수 있다. 또한, 대물렌즈 없이 커버 아래쪽으로 형광을 역반사시키지 않기 때문에 광 효율을 향상할 수 있다. 더욱이, 대물렌즈의 표면 또는 대물렌즈들 상에서 여기 광의 간섭 반사가 방지된다.

형광을 검출하고 동시에 형광의 강도를 측정하기 위하여, 상기 형광 측정기는 다양한 반응 용기들로부터 수렴한 형광 빔 다발을 검출하는 반도체 센서(예를 들어, CCD 또는 CMOS) 카메라를 유리하게 포함하며, 형광 빔 다발은 개별적인 반응 용기에 할당되고 감지된 형광의 밝기를 평가하는 CCD 또는 CMOS 어레이의 다른 섹터들 상에서 위쪽으로 상기 커버의 홀들을 통과한다.

상기 여기 광원은 점-형상 또는 일반적인 점-형상의 광원이다. 가장 바람직하게는, 정의된 파장 스펙트럼을 갖는 여기 광을 방출하는 발광 다이오드(LED)가 사용된다. 적절하게는, 여기 광학 시스템은 여기 광원과 상기 커버 사이에 위치한 균일 광원(homogeneous light source), 여기 대물렌즈, 및 여기 필터를 포함한다. 상기 균일 광원은 상기 여기 광원으로부터 멀어지고 상기 여기 대물렌즈로 향하기 전에 균일한 광 분포를 갖는 광 스팟을 형성하는 것으로 가정한다. 상기 장치는 균일한 광 분포를 제공한다. 상기 여기 필터는 여기 광에서 원하지 않는 파장을 필터링한다. 광 혼합기, 상기 여기 대물렌즈, 및 상기 여기 필터의 상기 광학 축이 또한 공간에서 수평적으로 배향하는 것을 허용하기 위해 부가적으로 커플링-인(coupling-in) 미러가 상기 여기 광을 상기 커버 밑쪽으로 반사하도록 상기 여기 대물렌즈와 상기 커버 사이에 제공될 수 있다.

대물렌즈가 없는 표준 광학 시스템인 광학 측정 시스템은 상기 커버와 상기 형광 측정기 사이에 배열된다. 상기 광학 측정 시스템은 유리하게 텔레센트릭 속성(telecentric properties) 없이 상업적인 대물렌즈에 적합한 측정 필터 및 측정 대물렌즈를 포함한다. 상기 측정 필터는 형광 중에서 원하지 않는 파장을 필터링한다. 유리하게도, 상기 측정 필터 및 상기 측정 대물렌즈에 부가하여 상기 커버 및 상기 측정기 사이의 형광의 광로 상에 어떠한 렌즈, 프리즘, 또는 다른 광학 부재들이 더 배치되지 않는다.

한편으로 상기 커버의 홀들을 통과해서 상기 반응 용기들 내로 가능한 많은 여기 광을 조향하기 위하여, 그리고 다른 한편으로는 상기 측정기에 의하여 검출되는 형광의 양을 증가하기 위하여, 상기 홀들은 실시간 사이클러에서 텔레센트릭 렌즈 시스템으로 알려진 상기 커버의 평면과 수직 방향을 향할 뿐 아니라, 상기 커버의 상면과 하면 사이에 분기된 종방향 중심축을 갖는다. 본 발명의 또 다른 바람직한 전개에 따르면, 이러한 종방향 중심축들은 바람직하게 상기 측정 대물렌즈 내에 있는 공통 교차점 내에서 상기 커버의 위쪽을 교차하며, 상기 홀들은 상기 측정 대물렌즈 쪽으로, 따라서 상기 형광 측정기를 향하여 직접 형광을 조향 한다. 또한 이것은, 중간 수직선(midperpendicular) 또는 상기 커버의 평면의 수직선 각각에 대한 상기 홀들의 경사각과 종방향 중심축의 경사각이 상기 커버의 중심으로부터 바깥쪽으로 증가한다는 것을 의미한다.

여기서, 상기 커버의 각 홀의 상기 종방향 중심축은 각각의 홀을 통과하는 여기 광의 빔 다발 또는 각각의 홀을 통과하는 형광의 빔 다발의 메인 빔과 정렬되도록 배향될 수 있다.

더욱이, 상기 커버 내에서 각 홀의 상기 종방향 중심축은 또한 각 홀을 통과하는 여기 광 및 형광의 빔 다발들의 메인 빔들의 각도 이등분선(bisector)에 정렬된다.

다른 구현 예에서 각 홀의 상기 종방향 중심축은 상기 커버의 오른쪽 각에 배향될 수 있다; 그러나, 이것은 상기 홀이 큰 직경을 가진다는 것을 의미한다. 따라서, 이 구현 예는 상기 커버가 적절한 온도(일반적으로 105도 초과)에 의한 응축 보호를 만족스럽게 수행될 수 있을 때만 선택될 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 전개는, 상기 여기 광원과 상기 커버 사이에 배치된 상기 여기 광학 시스템의 상기 광학 축에 따라, 여기 광의 모든 빔 다발의 공통 광학 축은 상기 커버의 평면 및/또는 반응 용기의 상기 어레이의 평면과 90도와 동일하지 않은 각도를 포함하도록 배향되는 것을 제공한다.

이와 대조적으로, 본 발명의 더 유리한 전개에 따르면, 상기 커버 및 상기 형광 탐지기 사이에 배치된 상기 측정 광학 시스템의 광학 축에 따라서, 형광의 모든 빔 다발의 공통 광학 축은 상기 커버의 평면 및/또는 반응 용기들의 어레이의 평면과 90도와 같은 각도를 포함하도록 배향되고 상기 여기 광학 시스템의 여기 광 및 상기 광학 축의 모든 빔 다발의 공통 광학 축들을 갖는 작은 각도(α)를 포함하도록 배향된다. 이와 같이하여, 여기 광의 광로와 형광의 광로가 분리된다.

한편, 가능한 상기 반응 용기의 상기 커버 및 분석물의 액체 거울에서 반사되는 여기 광은 여기서 발생하는 각도에 대응하는 각도를 사용하여 반대쪽으로 반사되어 상기 측정기에 도달할 수 없는 이점이 있다. 이러한 방법에서, 측정 품질은 향상된다. 다른 한편으로, 더욱이 이러한 축을 벗어난 조명의 이득은, 전술한 US 7,687,260 B2에서 도시되고 기술된 것처럼, 빔 스플리터(beam splitter)가 비본질적이라는 것이다. 이러한 방식으로, 상기 빔 스플리터 내에서 여기 광의 50%도 손실되지 않고 형광의 50%도 손실되지 않기 때문에, 형광 측정의 효율은 4배 향상된다. 또한, 낮은 광 강도의 여기 광원이 채택될 수 있다. 언급된 장점은, 여기 광학 시스템과 측정 광학 시스템의 광학 축 사이의 전술한 작은 각도(α)가 상기 반응 용기 내에서 음영 효과를 최소화하기 위해서, 한편으로는 상기 여기 광학 시스템 및 상기 측정 광학 시스템의 객체 측 렌즈 구경들(object-side aperture)의 합보다 더 크지만, 다른 한편으로는 10도 미만, 바람직하게는 5도 미만, 가장 바람직하게는 3도 미만으로 하는 본 발명의 또 다른 바람직한 전개에 따라 달성된다.

그러나, 기본적으로 여기 광을 검출된 형광으로부터 분리하기 위하여, 빔 스플리터(beam splitter) 또는 편광 빔 스플리터(polarizing beam splitter)를 사용하는 것 또한 가능하다.

한편으로, 반응 용기들의 어레에서 인접한 반응 용기들은 똑같은 간격으로 서로 떨어져 있는 전통적인 마이크로웰 플레이트의 사용을 허용하기 위하여, 다른 한편으로 음영 효과를 더욱 최소화하기 위하여, 인접한 홀들의 종방향 중심축들은, 본 발명의 또 다른 이로운 전개에 따라서, 홀들의 분기(divergence)를 고려하여 인접한 반응 용기의 상기 종방향 중심축보다 약간 작은 거리를 갖는다. 상기 홀들에서의 이 측정 결과는 반응 용기들 위에 정확하게 배치되지는 않지만, 상기 커버의 중심 쪽으로 오프셋 되어 있으며, 상기 오프셋은 상기 커버의 중심으로부터 거리가 증가함에 따라 증가한다.

반응 용기들이 병렬적 종방향 중심축들을 갖는 전통적인 마이크로웰 플레이트의 사용시 본 발명의 더 바람직한 전개에서, 상기 반응 용기들의 종방향 중심축들은 관련된 홀들의 종방향 중심축을 갖는 반응 용기들 내에서 교차함으로 음영 효과는 또한 최소화된다.

테스트는 위의 측정을 통해 반응 용기들 내에서 몇 도 기울어진 축을 벗어난 조명으로 여기 광의 눈에 띄는 음영이 관찰될 수 없음을 보여주었다.

적합하게도, 5 또는 6 축 가공 중심(machining center)을 갖는 그러한 홀들은 원하는 방향으로 커버에 쉽게 도입될 수 있기 때문에, 상기 커버 내의 상기 홀들은, 예를 들어, 원형 단면의 홀들인 보어 홀(bore hole)이다.

유리하게는, 상기 커버는 상기 반응 용기들의 투명 커버상에 분석물들의 응축을 방지하기 위하여 가열될 수 있다.

마이크로웰 플레이트에서 반응 용기들의 어레이 내에 상기 반응 용기들은 직선 행과 열로 배치되기 때문에, 상기 측정 광학 시스템의 상기 광학 축들이 상기 마이크로웰 플레이트의 두 대칭 평면의 교차 행과 일치하고, 각각 서로 수직이고 상기 반응 용기들은 행과 열에서 각각 거울 대칭(mirror symmetrical)이라면 유리하다. 이러한 방식으로, 상기 커버 내의 홀들은 상기 커버의 평면과 수직인 상기 측정 광학 시스템의 광학축에 대해 회전-대칭적으로 배치될 수 있으며, 가공 중심에서 드릴링 작업을 쉽게 프로그래밍할 수 있다.

이하에서, 본 발명은 도면들에 도시된 실시 예를 사용하여 상세히 설명된다.
도 1은 실시간 사이클러의 일부분으로 본 발명에 따른 장치의 개략적인 단면도를 보여준다;
도 2는 도 1의 상세 II의 확대도를 보여준다;
도 3은 실시간 사이클러와 함께 사용될 수 있는 마이크로웰 플레이트의 평면도 및 실시간 사이클러의 광학 측정기의 광학 축과 마이크로 웰 플레이트의 교차점을 보여준다;
도 4는 마이크로웰 플레이트의 작은 볼과 위에서 본 실시간 사이클러의 가열 가능한 커버에 있는 홀들의 겹쳐진 도면을 보여준다.

도 1에서 단지 부분적이고 개략적으로 도시된 실시간 사이클러(10)는 마이크로웰 플레이트(16)의 반응 용기 또는 작은 볼(14) 내에서 액체 분석물(12)의 정량적 또는 실시간 PCR을 실행하기 위한 것이고, 각각의 작은 볼(14)에 대해 형광 염료와 함께 액체 분석물(12)에 포함된 DNA 서열의 양은 주기적으로 증폭되고 측정된다. 이를 위해, 작은 볼(14) 내의 분석물(12)은 함께 열 변환 처리(thermal alternating treatment)되어 교대로 가열 및 냉각된다. 각 가열 사이클에서 상기 분석물(12) 내의 DNA 서열의 양은 폴리메라제 연쇄 반응에 의하여 증폭된다. 반응 생산물에 결합된 형광 염료는 여기 광으로 여기 될 때 형광을 방출한다. 방출된 형광의 강도는 반응 생산물의 양에 의존하기 때문에, 실시간 사이클러(10) 및 표준 분해물의 비교를 통한 광학 형광 측정에 의하여 정량적으로 결정될 수 있다.

마이크로웰 플레이트(16)는 예를 들어, 8 x 12 작은 볼(14)의 96 어레이를 갖는 도 3에 도시된 마이크로웰 플레이트일 수 있다. 그러나, 그대신에 실시간 사이클러(10)는 또한 다른 마이크로웰 플레이트, 예를 들어 16 x 24 작은 볼을 갖는 384 어레이, 또는 6 x 8 작은 볼을 갖는 48 어레이와 함께 사용되도록 채택될 수 있다. 작은 볼(14)은 각각 하부면(18), 투명한 커버(20)로 닫혀 있는 상부면, 및 종방향 중심축(24)에 동심인 측면(22)을 가진다.

도 1에 개략적으로 도시된 바와 같이, 작은 볼들(14)을 갖는 마이크로웰 플레이트(16)는 실시간 사이클러(10) 내에 위치하여, 홀(26)이 있는 평평한 커버(28) 아래에 배열된다. 커버(28) 내의 홀들(26)은, 위쪽으로부터 각각의 마이크로웰 플레이(16)의 작은 볼(14) 안쪽으로 커버(28)로 입사되는 여기 광의 빔 다발(30)(도 2)을 조향시키고 나머지 여기 광을 차폐한다. 또한, 상기 홀들(26)은 마이크로웰 플레이트(16)의 각각의 작은 볼(14)로부터 상방으로 형광 측정기(34)로 분석물(12) 내에서 여기의 결과로 생성된 형광의 빔 다발(32)(도 2)을 통과시킨다. 상기 커버(28) 내의 상기 홀들(26)은 각각 상기 마이크로웰 플레이트(16)의 상기 작은 볼(14) 약간 위에 배치된 보어 홀(bore hole)이며, 그 수는 상기 실시간 사이클러(10)에 도입된 상기 마이크로웰 플레이트(16)의 작은 볼(14)의 수에 대응한다.

분석물(12)의 오염 및/또는 증발을 막기 위해서, 상단의 상기 작은 볼(14)은 용접되거나 접착된 투명 커버(도시되지 않음)에 의해 닫힌다. 커버(28)는, 예를 들어, 상기 커버에서 분석물(12)의 응축을 방지하기 위하여 커버(28)가 가열되는 것을 허용하는 통합된 저항 히터(도시되지 않음)를 포함한다.

상기 마이크로웰 플레이트(16) 및 상기 커버(28) 위의 상기 실시간 사이클러(10)는 여기 광으로 상기 분석물(12) 내에서 상기 형광 염료를 여기 시키고 동시에 상기 여기의 결과로써 각각 상기 분석물(12)에 의해 방출되는 형광의 상기 강도를 감지 또는 측정하기 위하여 광학 디바이스(36)를 포함한다. 상기 장치(36)는 여기 광을 방출하는 여기 광원(38), 상기 여기 광원(38)과 상기 커버(28) 사이에 배치된 여기 광학 시스템(40), 및 동시에 모든 분석물(12) 뿐만 아니라 상기 커버(28)와 상기 측정기(34) 사이에 배치된 측정 광학 시스템(42)에 의해서 방출되는 형광의 강도를 측정하기 위한 형광 측정기(34)를 포함한다.

상기 여기 광원(38)은 발광 다이오드(LED)이고, 상기 형광 측정기(34)는 형광에 민감한 CCD or CMOS 카메라이다. 상기 카메라는, 각각 상기 마이크로웰 플레이트(16)의 상기 작은 볼들(14) 중 하나에서 방출되는 형광의 강도를 감지 할 수 있는 빛에 민감한 CCD 또는 CMOS를 포함한다.

단순화된 여기 광학 시스템(40)은 균일 광원(38), 여기 대물렌즈(46), 여기 필터(48), 및 커플링-인 미러(50)를 포함하며, 이들은 상기 여기 광원(38)과 상기 커버(28) 사이에 상기의 순서로 여기 광의 상기 빔 방향 내에 배치되어 있다. 상기 여기 대물렌즈(46)는 상기 마이크로웰 플레이트(16)의 상기 작은 볼들(14)의 하부(18)로부터 펼쳐진 초점 평면(FE) 내에 상기 균일 광원(38)으로부터 여기 광의 초점을 맞추는 것으로 가정되며, 여기 대물렌즈는 큰 초점 깊이를 갖는다. 상기 여기 필터(48)는 여기 광으로부터 원하지 않는 파장을 필터링하고, 반면에 상기 커플링-인 미러(50)는 상기 커버(28)의 하향으로 여기 광을 반사한다.

또한, 단순화된 측정 광학 시스템(42)은 측정 필터(56) 및 측정 대물렌즈(58)를 포함하며, 이들은 상기 측정기(34) 쪽으로 상기 분석물(14)에 의하여 방출되는 형광의 빔 방향에서 상기 커버(28) 및 상기 측정기(34) 사이에 상기 순서로 정렬되어 있다.

측정 대물렌즈(58)의 초점은 마이크로웰 플레이트(16)의 인접한 작은 볼(14)로부터 가능한 형광의 낮은 광학 간섭 상태에서 얻기 위하여 상기 커버(28)의 상면에 있다. 상기 측정 필터(56)는 형광으로부터 원하지 않는 파장을 필터링한다.

상기 여기 광학 시스템(40)은 여기 광원(38)과 커플링-인 미러(50) 사이에 수평으로 배향된 광학 축(64)을 갖고, 87도와 88도 사이의 경사각을 가진 상기 커플링-인 미러(50)로부터 상기 커버(28)의 아래쪽으로 확장된다. 상기 측정 광학 시스템(42)은 상기 커버(28) 또는 상기 마이크로웰 플레이트(16)에서 확장된 평면과 각각 수직이며 초점 평면(FE)과 수직인 광학 축(66)을 가진다. 이와 같이, 상기 여기 광학 시스템(40)의 상기 광학 축(64)은 상기 커플링-인 미러(50)의 아래에서 상기 측정 광학 시스템(42)의 상기 광학 축(66)과 2도와 3도 사이의 작은 각도(α)로 기울어져 있다. 상기 마이크로웰 플레이트(16)의 상기 작은 볼(14) 내에서 상기 분석물(12)의 액체 미러(68)에서 여기 광이 상기 측정기(34)로 직접 반사되는 것을 막기 위해서, 이러한 각도(α)는 상기 여기 광학 시스템(40) 및 상기 측정 광학 시스템(42)의 객체 측 렌즈 구경들(object-side aperture)의 합보다 크며, 설명을 위하여 도 1에서는 크게 확대된다.

도 1 및 도 3에서 볼 수 있듯이, 상기 실시간 사이클러(10)에 도입될 때 상기 마이크로웰 플레이트(16)는 상기 측정 광학 시스템(42)의 상기 광학 축(66)의 중심에 있으며, 그 결과 상기 광학 축(66)은 상기 마이크로웰 플레이트(16)의 작은 볼(14) 각각의 행 또는 열과 평행한 상기 커버(28)의 평면과 수직인 상기 마이크로웰 플레이트(16) 두개의 대칭 평면(70, 72)의 교차점에 정렬된다. 상기 교차 행은 상기 커버(28)의 중간 수직선과 부합한다. 더욱이, 도 3은 도 1의 단면(I-I)을 보여준다.

도 1의 왼쪽과 도 2에 도시된 것처럼, 상기 실시간 사이클러(10)에서 상기 실시간 사이클러(10)가 텔레센트릭 옵틱스(telecentric optics) 없이 또는 상기 커버(28) 위에 배치된 대물렌즈 없이 상기 실시간 사이클러(10)이 동작하기 위해서, 종방향 중심축(74)이 상기 보어 홀(26)을 통해 아래쪽으로 통과하는 여기 광의 빔 다발(30)의 메인 빔(76)과 상기 보어 홀(26)을 통해 위쪽으로 통과하는 형광의 빔 다발(32)의 메인 빔(78) 사이 각도(α)의 각도 이등분선에 정렬되도록, 각 보어 홀(26)이 상기 커버(28) 내에서 배향된다. 이 경우, 상기 커버(28) 내의 모든 보어 홀(26)의 상기 중축 중심축(74)은 상기 여기 광학 시스템(40)과 상기 측정 광학 시스템(42) 사이의 영역에서 서로 교차하도록 배향되고, 상기 교차점은 각각 상기 여기 광학 시스템(40)과 상기 측정 광학 시스템(42)의 상기 광학 축들(64, 66)에 의해 둘러싸인 각도(α)의 각도 이등분선에 있다.

상기 측정 광학 시스템(42)의 상기 광학 축(66)과 상기 여기 광학 시스템(40)의 상기 광학 축(64)은 겨우 몇 도인 각도(α)로 상기 커버(28) 쪽으로 수렴하기 때문에, 상기 커버(28) 내의 상기 보어 홀(26)은, 도 2의 왼쪽에 도시된 바와 같이, 중축 중심축(74)이 상기 보어 홀들(26)을 아래쪽으로 통과하는 여기 광의 빔 다발(30)의 메인 빔들(76) 또는, 도 2의 오른쪽에 도시된 바와 같이, 상기 보어 홀들(26)을 위쪽으로 통과하는 형광의 빔 다발(32)의 상기 메인 빔(78)과 정렬되도록 또한 배향될 수 있다.

전자의 경우에서, 상기 보어 홀들(26)은 모든 종방향 중심축들(74)이 상기 여기 대물렌즈(46)에서 교차하고, 상기 교차점은 상기 여기 필터(48)에 인접한 상기 여기 대물렌즈(46)의 메인 평면 내에 있도록 배향된다. 후자의 경우에서, 상기 보어 홀들(26)의 상기 종방향 중심축들(74)은 이들이 상기 측정 대물렌즈(58) 내에서 서로 교차하고, 상기 교차점은 상기 측정 필터(56)에 인접한 상기 측정 대물렌즈(58)의 메인 평면 내에 있도록 배향된다.

상기 보어 홀들(26)의 배향으로, 한편으로, 도 1, 2에서 볼 수 있듯이, 상기 보어 홀들(26)을 아래쪽으로 통과하여 상기 마이크로웰 플레이트(16)의 상기 작은 볼(14)로 들어가는 여기 광의 빔 다발들(30)은 상기 보어 홀들(26) 및 상기 커버(28) 아래 뿐만 아니라 상기 작은 볼(14) 내에서 메인 빔들(76)을 또한 분기하고, 다른 한편으로, 상기 보어 홀들(26)을 통과하는 형광의 빔 다발들(32)은 상기 측정기(34) 또는 상기 측정 광학 시스템(42) 각각으로 상향 수렴하는 상기 보어 홀들(26) 내 및 상기 커버(28) 위에서 메인 빔들(78)을 가진다.

도 1에서 볼 수 있듯이, 이는 상기 커버의 중심 근처에서 상기 보어 홀들(26)이 상기 커버(28)의 중간 수직선에 대해 또는 상기 커버(28)의 평면의 수직선에 대해 상기 커버의 가장자리에서 보다 작은 경사 각도로 경사져있다는 것을 의미한다. 여기서, 상기 커버의 중간 수직선 또는 상기 커버 평면의 수직선 또는 상기 평행 초점 평면(FE)에 대한 상기 보어 홀들(26)의 상기 종방향 중심축(74)의 기울기 각도는 상기 커버의 중심으로부터 바깥쪽으로 증가하고, 도 1에서 볼 수 있듯이, 상기 마이크로웰 플레이트(16)의 네 모퉁이 내의 작은 볼(14) 위의 상기 커버의 중앙에서 가장 멀리 떨어져 있는 상기 보어 홀들(26)은 상기 커버(28)의 중간 수직선 또는 상기 커버(28) 평면의 수직선에 대해 가장 큰 기울기 각도를 가진다.

도 2에 잘 도시되어 있듯이, 대조적으로 상기 마이크로웰 플레이트(16)의 모든 작은 볼(14)은 공지된 방식으로 평행한 종방향 중심축(24)을 가진다. 여기 광의 빔 다발들(30)이 상기 작은 볼(14) 내의 상기 분석물(12)로 가능한 완벽하게 들어가고 음영을 완벽하게 또는 적어도 크게 방지하기 위하여, 상기 커버(28) 내의 상기 보어 홀들(26)은 마이크로웰 플레이트(16)의 상기 작은 볼들(14)에 대해 배향되고, 그 결과 상기 보어 홀들(26)의 상기 종방향 중심축(74)과 상기 작은 볼들(14)의 상기 종방향 중심축(24)은 바람직하게는 대략적으로 작은 볼들(14) 내의 상기 분석물(12)의 상기 액체 거울(68)의 레벨인 각각 교차점(S) 내의 상기 작은 볼들(14) 내에 교차한다. 이는 입사 빔 다발(30)의 중심점을 제공한다.

또한, 상기 커버(28)의 보어 홀들(26)의 중심-에서-중심 거리들은 상기 마이크로웰 플레이트(16)의 작은 볼(14)의 중심-에서-중심 거리와 정확하게 대응되지 않고, 도 4의 중첩된 부분에서 개략적 도시했듯이, 약간 작으며, 이에 따라 상기 보어 홀들(26)은 상기 작은 볼들(14)보다 약간 작은 래스터 디멘션(raster dimension)을 갖는다. 결과적으로 상기 커버(28)의 상면 및 하면에서 상기 보어 홀들(26)의 입구의 중심들은 관련된 작은 볼들(14)의 상기 종방향 중심축(24)에 대해 상기 커버의 중심 쪽으로 약간 오프셋 되고, 상기 보어 홀 또는 작은 볼들의 어레이의 각 행과 열 내에서 상기 오프셋은 각각 상기 커버의 중심에서 가장 바깥쪽 보어 홀들 또는 작은 볼들 쪽으로 각각 증가하며, 도 4에서 각각 볼 수 있다.

불리한 조건에서도 96-마이크로웰 플레이트를 사용하여 예를 들어, 50 ㎕ 또는 14 ㎕의 분석물 볼륨으로 여기 광의 빔 다발(30)의 기울기 각도가 상기 작은 볼들의 상기 종방향 중심축(24)에 대해 가장 큰 값을 갖는 곳인 상기 마이크로웰 플레이트(16)의 모퉁이들에 있는 상기 작은 볼들(14) 내에서 음영 효과가 없거나 낮으며, 10 ㎕의 분석물 볼륨으로 상기 마이크로웰 플레이트(16)의 모퉁이의 작은 볼들(14) 내의 384-마이크로웰 플레이트에서 약 16%의 최대 음영이 발생한다.

Claims (15)

1. 반응 용기들(14)의 어레이에서 다수의 분석물(12)을 광학적으로 여기시키고 상기 분석물(12)로부터 형광을 검출하기 위한 방법으로서,
   여기 광원(38)으로부터 분기하는(diverging) 여기 광이 상기 반응 용기들(14) 내의 분석물(12)로 공급되며, 상기 반응 용기들(14) 내의 상기 분석물(12)로부터의 수렴하는 상기 형광이 형광 측정기(34)로 공급되고,
   반응 용기(14)의 어레이 위에 배열된 커버(28) 내의 홀들(26)의 어레이를 통해 상기 커버(28) 아래쪽에서 상기 여기 광의 다수의 빔 다발들(30)이 상기 반응 용기들(14) 내로 조향되고,
   동시에 상기 반응 용기들(14)로부터 형광의 다수의 빔 다발들(32)이 상기 형광 측정기(34)에 도달하며,
   대물렌즈는 사용되지 않고, 메인 빔들(76)을 분기시켜 상기 여기 광의 상기 다수의 빔 다발들(30)이 위에서부터 상기 홀들(26)을 통과하여 상기 반응 용기들(14) 내로 조향되고, 메인 빔들(76)을 수렴시켜 상기 형광의 상기 다수의 빔 다발들(32)이 상기 반응 용기들(14)로부터 아래에서 상기 홀들(26)을 통과하며, 그 이후에 상기 형광 측정기(34)에 도달하며, 상기 커버(28) 내의 상기 홀들(26)은 상기 커버(28)의 상면 및 하면 사이에서 아래쪽으로 분기하는 종방향 중심축들(74)을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
2. 다수의 분석물(12)을 광학적으로 여기시키고 대물렌즈 없이 상기 분석물(12)로부터 형광을 검출하기 위한 장치로서,
   상기 분석물(12)을 수용하기 위한 반응 용기들(14)의 어레이,
   분기하는 여기 광으로 상기 반응 용기들(14) 내에서 상기 분석물(12)을 조사하기 위한 여기 광원(38),
   동시에 상기 반응 용기들(14) 내에서 상기 분석물(12)로부터의 수렴하는 형광을 검출하기 위한 형광 측정기(34), 및
   반응 용기들(14)의 어레이 위쪽에 배치되며, 상기 여기 광원(38)으로부터 상기 여기 광의 다수의 빔 다발들(30)이 상기 반응 용기들(14)로 들어갈 수 있고 상기 분석물(12)로부터 상기 형광의 다수의 빔 다발들(32)이 상기 형광 측정기(34)에 도달할 수 있도록 통과하는 홀들(26)의 어레이를 갖는, 커버(28)를 포함하고,
   상기 커버(28) 내의 상기 홀들(26)은 상기 커버(28)의 상면 및 하면 사이에서 아래쪽으로 분기하는 종방향 중심축들(74)을 가져, 상기 여기 광의 상기 다수의 빔 다발들(30)의 메인 빔들(76)이 상기 홀들(26)의 내부 및 하부에서 상기 반응 용기들(14)로 분기하고, 상기 형광의 다수의 빔 다발들(32)의 메인 빔들(78)이 상기 홀들(26)의 내부 및 상부에서 상기 형광 측정기(34)를 향해 수렴하는 것을 특징으로 하는, 장치.
3. 제2항에 있어서,
   상기 여기 광원(38)과 상기 커버(28) 사이에 배치된 여기 광학 시스템(40) 및 상기 커버(28)와 상기 형광 측정기(34) 사이에 배치된 측정 광학 시스템(42)으로서,
   상기 측정 광학 시스템(42)은 상기 커버(28) 및/또는 반응 용기들(14)의 어레이의 평면과 수직으로 배향된 광학 축(66)을 갖고,
   상기 여기 광학 시스템(40)은 상기 측정 광학 시스템(42)의 상기 광학 축에 대하여 각도(α) 만큼 기울어진 광학 축(64)을 갖는 것을 특징으로 하는, 장치.
4. 제3항에 있어서,
   상기 측정 광학 시스템(42)과 상기 여기 광학 시스템(40)의 상기 광학 축(64) 사이의 상기 각도(α)는 상기 여기 광학 시스템(40) 및 상기 측정 광학 시스템(42)의 객체 측 렌즈 구경들(object-side aperture)의 합보다 크고, 5도 미만인 것을 특징으로 하는, 장치.
5. 삭제
6. 제2항에 있어서,
   각 홀(26)의 상기 종방향 중심축(74)은, 상기 홀(26)을 통과한 상기 여기 광의 상기 빔 다발(30)의 상기 메인 빔(76), 또는 상기 홀(26)을 통과한 상기 형광의 상기 빔 다발(32)의 상기 메인 빔(78), 또는 상기 홀(26)을 통과한 상기 여기 및 형광의 상기 빔 다발들(30, 32)의 상기 메인 빔들(76, 78)의 각도 이등분선(bisector)과 정렬되도록 배향되는 것을 특징으로 하는, 장치.
7. 제2항에 있어서,
   홀들(26)의 상기 종방향 중심축들(74)의 기울기 각도는, 상기 커버(28) 및/또는 반응 용기들(14)의 상기 어레이의 중간 수직선(midperpendicular)에 대해 상기 커버의 상기 중심으로부터 바깥쪽으로 멀어질수록 증가하는 것을 특징으로 하는, 장치.
8. 제2항에 있어서,
   홀들(26)의 상기 종방향 중심축들(74)은 공통 교차점에서 교차하는 것을 특징으로 하는, 장치.
9. 제2항에 있어서,
   상기 반응 용기들(14)은 상기 반응 용기들(14) 내에서 관련된 상기 홀들(26)의 상기 종방향 중심축들(74)과 각각 교차하는 평행한 종방향 중심축들(24)을 갖는 것을 특징으로 하는, 장치.
10. 제2항에 있어서,
    인접한 홀들(26)의 상기 종방향 중심축들(74)은 인접한 반응 용기들(14)의 종방향 중심축들(24)보다 약간 작은 거리를 갖는 것을 특징으로 하는, 장치.
11. 제3항에 있어서,
    상기 반응 용기들(14)은 반응 용기들(14)의 상기 어레이 내에서 직선의 행 및 열에 배치되고,
    상기 커버(28) 및/또는 반응 용기들(14)의 상기 어레이의 평면에 수직으로 배향된 상기 측정 광학 시스템(42)의 광학 축(66)은 두 대칭 평면들(70, 72)의 교차선에 정렬되며, 이들은 각각 서로 수직이며, 이들에 대하여 상기 반응 용기들(14)은 상기 행과 열에서 거울-대칭(mirror-symmetrical)인 것을 특징으로 하는, 장치.
12. 제2항에 있어서,
    상기 홀들(26)은 보어 홀들(bore hole)인 것을 특징으로 하는, 장치.
13. 제2항에 있어서,
    상기 커버(28)는 가열할 수 있는 것을 특징으로 하는, 장치.
14. 제2항에 있어서,
    검출되는 상기 형광으로부터 여기 광을 분리하기 위해 빔 스플리터(beam splitter) 또는 편광 빔 스플리터(polarizing beam splitter)가 제공되는 것을 특징으로 하는, 장치.
15. 제1항의 방법 또는 제2항 내지 제4항 및 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항의 장치를 사용하는, 정량적 또는 실시간 PCR 또는 멜팅 커브 분석(melting curve analysis) 방법.

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