CN104293960A - 一种用于同时检测嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的双重荧光pcr的检测试剂盒及引物和探针 - Google Patents

一种用于同时检测嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的双重荧光pcr的检测试剂盒及引物和探针 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于同时检测嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的双重荧光PCR的检测试剂盒及引物和探针。所述检测用引物和探针为序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6，其中序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别为检测嗜吞噬细胞无形体的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：3为检测嗜吞噬细胞无形体的荧光探针，序列SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5分别为检测查菲埃里克体的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：6为检测查菲埃里克体的荧光探针。本发明还提供了嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的检测试剂盒。本发明所选引物和探针特异性非常强，且一次能检测两种病毒，提高效率。

Description

一种用于同时检测嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的双重荧光PCR的检测试剂盒及引物和探针
技术领域
本发明涉及嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体检测用引物、探针及检测试剂盒。
背景技术
嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体均是细胞内寄生菌。嗜吞噬细胞无形体侵染人末梢血中性粒细胞引起人粒细胞无形体病(Human granulocytic anaplasmosis，HGA)，以发热伴白细胞、血小板减少和多脏器功能损害为主要临床表现。查菲埃里克体侵染人单核巨噬细胞，引起人单核细胞埃立克体病((human monocytic ehrlichiosis，HME)，与人粒细胞无形体病临床症状十分相似，以发热、淋巴结肿大和出现异型淋巴细胞为主要临床表现。HGA和HME都是自然疫源性人畜共患病，呈世界性分布，主要经蜱叮咬传播。
立克次体病临床表现一般缺乏特异性，如表现为不明原因的高热、头痛、全身酸痛、食欲不振等，常常误诊为其它传染病，确诊主要依靠实验室检查，包括血清学检测和病原的分离与鉴定。特异性抗体的检出一般在发病2周以后，所以血清学检测不能用于立克次体感染的早期诊断。由于大多数立克次体不能在人工培养基上生长，需要靠动物接种、细胞培养等对立克次体病原进行分离。立克次体病原分离操作复杂，费时费力且成功率很低。因此立克次体的传统检测方法已逐渐被酶联免疫吸附技术、PCR技术、芯片技术等现代检测方法所代替。如今，研究的趋势更是进一步转向了在一个检测平台上同时检测多种致病菌，以此缩短检测周期、减少检测成本。因此，能同时快速有效检测多种病原微生物的高通量检测技术已成为临床疾病检测，国境口岸卫生检疫，公共安全等领域研究的热点。
本研究着重研究影响检测鼠源性立克次体病多重荧光PCR技术方法的关键因素，提出解决方案，促使形成技术升级的同时，形成产业化。
发明内容
本发明的目的是提供一组特异性强、灵敏度高的同时检测嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的核苷酸序列，包括引物和探针。
本发明的另一目的是提供快速、准确、使用方便的检测嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的检测试剂盒。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了检测嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的引物和探针，具体如下：
通过序列比较，根据嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum，AP)主要外膜蛋白(msp2)基因的序列(GenBank：KC954740)，在其保守区169-245位置设计一对引物及一条探针：
1)AP正义引物(AP-F)5'ATGGAAGGTAGTGTTGGTTATGGTATT 3'(SEQ IDNO：1)；
2)AP反义引物(AP-R)5'TTGGTCTTGAAGCGCTCGTA 3'(SEQ ID NO：2)；
3)AP探针(AP-probe)5'(JOE)TGGTGCCAGGGTTGAGCTTGAGATTG(TAMRA)3'(SEQ ID NO：3)，该探针的5’端标记报告荧光基团JOE，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA；
扩增目的片段为77bp。
通过序列比较，根据查菲埃里克体(Ehrlichia chaffeensis，EC)16SrRNA基因的序列(GenBank：KJ942243)，在其保守区17-97位置设计一对引物及一条探针：
4)EC正义引物(EC-F)5’GCGGCAAGCCTAACACATG 3’(SEQ ID NO：4)；
5)EC反义引物(EC-R)5’CCCGTCTGCCACTAACAATTATT 3’(SEQ ID NO：5)；
6)EC探针(EC-probe)
5’(FAM)AGTCGAACGGACAATTGCTTATAACCTTTTGGT(TAMRA)3’(SEQID NO：6)，该探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA；
扩增目的基因大小为80bp。
本发明还提供了一种嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的检测试剂盒，由以下组分组成：
1)DNA提取试剂；通常可以使用商业购买的DNA提取试剂盒或按照常规方法来提取DNA，所述商业化的DNA提取试剂盒例如TIANamp Genomic DNA Kit,cat.noDP304；
2)DNA标准品：为嗜吞噬细胞无形体主要外膜蛋白(msp2)基因的DNA片段,如序列表SEQ ID No：9；和查菲埃里克体16SrRNA基因的DNA片段，如序列表SEQID No：12；
3)实时定量PCR反应液，其包括：PCR反应混合液，荧光定量PCR参比染料，检测嗜吞噬细胞无形体的正义引物、反义引物和荧光探针，检测查菲埃里克体的正义引物、反义引物和荧光探针，
优选为：2×PCR反应混合液，1×荧光定量PCR参比染料，检测嗜吞噬细胞无形体的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM，检测查菲埃里克体的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM；
进一步地，所述PCR反应混合液(Premix Ex TaqTM)，购自大连宝生物公司(Takra)，货号RR390A。所述引物和探针均委托大连宝生物公司合成。
4)阴性对照：DEPC水；
5)DEPC水；1mL x2管，自来水两次蒸馏，经过Millipore纯水仪纯化，电阻率大于18.0MΩ.CM。
其中，检测嗜吞噬细胞无形体的正义引物为序列表SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No：2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ IDNo：3所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团JOE，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA；检测查菲埃里克体的正义引物为序列表SEQ ID No：4所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No：5所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No：6所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA。
本发明还提供了一种嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的检测试剂盒的使用方法：
1.样品采集、运送
解剖鼠取其脾脏置于冻存管中，或将检获蜱虫置于冻存管中，将冻存管置于干冰或液氮中运送回实验室。-70℃冻存备用。
2.DNA提取
按照TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒提供的方法提取立克次体DNA，具体方法如下：
(1)动物组织(脾组织用量应少10mg)应先打碎处理为细胞悬液，然后10,000rpm离心1min，倒尽上清，加200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。
(2)加入20μL Proteinase K溶液，混匀，在56℃放置，直至组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。
(3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(4)加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
(6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(8)重复操作步骤7。
(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
3.实时定量PCR反应：
96孔PCR板，第一排12孔作为标准曲线和阴性对照孔，其余为样品检测孔。
反应体系为20μL，见表1：
表1
其中荧光定量PCR参比染料为ROX Reference Dye。
所述的模板DNA，如果是制作标准曲线，用嗜吞噬细胞无形体msp2基因片段和查菲埃里克体16SrRNA基因片段的质粒DNA标准品作为模板，浓度为101～108，如果是样品检测，用鼠脾脏或蜱虫提取的DNA为模板，阴性对照模板为DEPC水，
检测条件为：在ABI7300荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为95℃10分钟，然后经过95℃15秒钟，58℃60秒钟40个循环。
本发明的优点是：
本方法在一个PCR管中同时检测两种立克次体，大大提高了检测效率，并能做到鉴别诊断两种立克次体。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。
实施例1试剂盒的组成
一、试剂盒的组成
1)DNA提取试剂；天根公司的DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit,cat.noDP304)；
2)DNA标准品：为嗜吞噬细胞无形体主要外膜蛋白(msp2)基因的DNA片段,如序列表SEQ ID No：9；和查菲埃里克体16SrRNA基因的DNA片段,如序列表SEQ IDNo：12；
3)实时定量PCR反应液，其包括：2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)混合液，检测嗜吞噬细胞无形体的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM，检测查菲埃里克体的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM，1×荧光定量PCR参比染料；
其中，所述2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)混合液购自Takra，(RR390A)，所述荧光定量PCR参比染料为ROX Reference Dye购自大连宝生物公司，货号(DR0X01)，所述引物和探针均委托大连宝生物公司合成。
4)阴性对照：DEPC水；
5)DEPC水；1mL x2管，自来水两次蒸馏，经过Millipore纯水仪纯化，电阻率大于18.0MΩ.CM。
其中，检测嗜吞噬细胞无形体的正义引物为序列表SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No：2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ IDNo：3所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团JOE，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA；检测查菲埃里克体的正义引物为序列表SEQ ID No：4所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No：5所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No：6所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA。
二、DNA标准品的制备
通过序列比较，根据嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum，AP)主要外膜蛋白(msp2)基因的序列(GenBank：KC954740)，在其保守区设计一对引物:
正义引物：MSP3F 5’-CCAGCGTTTAGCAAGATAAGAG-3’(SEQ ID No：7)
反义引物：MSP3R 5’-GCCCAGTAACAACATCATAAGC-3’(SEQ ID No：8)
扩增目的片段大小为334bp，见序列表SEQ ID No：9所示的核苷酸序列。
通过序列比较，根据查菲埃里克体(Ehrlichia chaffeensis，EC)16SrRNA基因的序列(GenBank：KJ942243)，在其保守区位置设计一对引物:
正义引物：HE15'CAATTGCTTATAACCTTTTGGTTATAAAT 3'(SEQ ID No：10)
反义引物：HE35'ATAGGGAAGATAATGACGGTACCTATA 3'(SEQ ID No：11)
扩增目的片段大小为389bp，见序列表SEQ ID No：12所示的核苷酸序列。
用上述所示的两对引物序列对阳性样本进行PCR反应，回收PCR产物，获得高纯度的334bp msp2保守区序列(SEQ ID No.)和389bp 16SrRNA基因保守区序列(SEQID No.)，与pGEM-Teasy载体进行连接，转化E.coli Competent Cells DH5α感受态细胞，进行培养，使用质粒提取试剂盒提取，经PCR和序列测定鉴定后获得阳性重组质粒，命名为pGEM-PA和pGEM-EC,以此阳性质粒为模板大量扩增DNA，并纯化，测其浓度和纯度。利用公式：(6.02x 1023拷贝数/摩尔)x(浓度g/ml)x10-3/(MW g/mol)＝拷贝/μL，分别计算出pGEM-PA和pGEM-EC拷贝数，共同十倍稀释，以103～107拷贝/μl的DNA为模板，在ABI7300荧光定量PCR仪上进行反应，反应体系为20μL，其中Premix Ex Taq(Probe qPCR)混合液10μL，AP-F和EC-F(10μM)各0.4μL，AP-R和EC-R(10μM)各0.4μL，AP-Probe和EC-Probe(10μM)各0.8μL，ROX Reference Dye(50x)0.4μL，模板RNA 2μL，DDW至25μL。反应条件为95℃10分钟，然后经过95℃15秒钟，58℃60秒钟40个循环。利用软件对数据进行分析，得到标准曲线。其R值分别为0.995746(AP)、0.998935(EC)。
实施例2试剂盒的特异性试验
1材料，
用于特异性评价的阴性鼠脾脏及蜱虫样本及常见立克次体以及其他细菌DNA样本来自本室和军事医学科学院微生物流行病研究所，包括非洲立克次体，莫氏立克次体，汉赛巴通体，出血性大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，鼠疫的DNA。
2方法：
利用本发明所述的试剂盒使用方法对阴性鼠脾脏及蜱虫样本及常见立克次体及细菌DNA进行检测，同时以105浓度的质粒DNA为阳性控制，验证其特异性。
3结果
阴性鼠脾脏及蜱虫样本及常见立克次体及细菌DNA样本检测结果均为阴性，说明该方法对上述病原体无交叉反应，表明该体系具有良好的特异性。
实施例3试剂盒的敏感性检测
为了验证本发明试剂盒的检测敏感性，以10倍稀释的DNA标准品(2×100～2×107拷贝/μL)为模板，每个稀释度的模板分别加2μL，同时设阴性对照，按照所建立的方法，在定量PCR仪上进行扩增反应，得出动力学曲线和标准曲线，当模板为2×10拷贝/μL时，其CT值仍在可检测范围内(CT<40)，表明本实验所建立的方法最低能检测到2×10拷贝/μL的DNA。
实施例4临床验证
利用本发明TaqMan双重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，对从北京、东北及国际航班截获的30只鼠及30只蜱虫样品及10份模拟样本进行了AP和EC的检测，同时设阴阳性对照。检测结果为：其中30只鼠及30只蜱虫样品HP、EC均为阴性，模拟标本中HP阳性1份，EC阳性2份，混合感染1份。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (7)

1.用于同时检测嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6所示，其中序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别为检测嗜吞噬细胞无形体的正义引物和反义引物，序列SEQ IDNO：3为检测嗜吞噬细胞无形体的荧光探针，序列SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5分别为检测查菲埃里克体的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：6为检测查菲埃里克体的荧光探针。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：所述探针SEQ ID NO：3的5’端标记报告荧光基团JOE，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA。
3.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：所述探针SEQ ID NO：6的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA。
4.一种嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的检测试剂盒，其特征在于，由以下组分组成：
1)DNA提取试剂；
2)DNA标准品：为嗜吞噬细胞无形体的DNA片段，如序列表SEQ ID No：9；和查菲埃里克体的DNA片段，如序列表SEQ ID No：12；
3)实时定量PCR反应液，其包括：PCR反应混合液，荧光定量PCR参比染料，检测嗜吞噬细胞无形体的正义引物、反义引物和荧光探针，检测查菲埃里克体的正义引物、反义引物和荧光探针；
4)阴性对照；
5)DEPC水；
其中，检测嗜吞噬细胞无形体的正义引物为序列表SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No：2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ IDNo：3所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团JOE，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA；检测查菲埃里克体的正义引物为序列表SEQ ID No：4所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No：5所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No：6所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA提取试剂为DNA提取试剂盒。
6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述实时定量PCR反应液包括：2×PCR反应混合液，检测嗜吞噬细胞无形体的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM，检测查菲埃里克体的正义引物0.2μM、反义引物0.2μM和荧光探针0.4μM；1×荧光定量PCR参比染料。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应混合液为Premix Ex TaqTM混合液，所述荧光定量PCR参比染料为ROX Reference Dye。
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