CN105695633A - 手足口病病原体检测引物组及试剂盒 - Google Patents

手足口病病原体检测引物组及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了手足口病病原体检测引物组及试剂盒，属于病毒检测技术领域。该手足口病病原体检测引物组包括柯萨奇病毒A16型和/或肠道病毒71型的RT-LAMP引物，由其组成的检测试剂盒包括微流控芯片和检测液。本发明的引物体系，减少了扩增反应背景，灵敏度和特异性都非常好。试剂盒的检测液体系省略了单独的RT-PCR的二次扩增步骤，缩短了检测时间，且没有核酸的变复性过程，减少了RNA酶和扩增核酸的污染机会，提高了检测的敏感性和安全性。采用微流控芯片检测系统，降低了对实验硬件的要求，减少了反应试剂用量，降低了检测成本，检测结果可直接通过颜色变化判定，它具有安全、特异、灵敏、便捷的优势。

Description

手足口病病原体检测引物组及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种手足口病病原体检测引物组，以及基于微流控芯片技术的手足口病现场快速检测试剂盒。
背景技术
手足口病是一种婴幼儿常见的传染病。发病特征为发热、痛性口腔溃疡、手足臀部出现疱疹。手足口病病毒可通过直接接触感染者鼻咽分泌物、唾液、疱疹液或粪便进行传播。感染者发病后一周内传染性最强，但传染期可持续数周。柯萨奇病毒A16(CoxA16型病毒)是引起手足口病的最常见病毒，通常导致较轻的自限性疾病，而肠道病毒71(EV71)可引起手足口病，常引发严重并发症甚至死亡。
手足口病于2008年5月2日被列为国家监测系统的丙类法定传染病，要求对每一例病例都应在诊断后24小时内上报至国家法定传染病报告系统(NNDRS)。2010年报告了约175万病例，其中包括905例死亡；2011年报告了160万病例，其中509例死亡。世卫组织制定并发布了《手足口病(HFMD)临床管理及公共卫生应对指南》，由于手足口病广泛的传染性，疫情不易控制，易感者人群多为10岁以下儿童，手足口病的现场检测则变得尤为重要，市售已有基于环介导等温扩增技术的手足口病试剂盒，但该类产品需要严格的实验室环境，不适合现场取样和检测。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为了解决现有检测技术中的上述缺陷，着眼于疾病防控的需要，本发明提供了一种手足口病病原体检测引物组，特异性和灵敏度高。本发明还提供了一种基于微流控芯片技术的手足口病病原体检测试剂盒，能够准确快速地现场检测样品，无需复杂辅助仪器，操作方便，检测时间短，使用范围广。
本发明提供的手足口病病原体检测引物组，包括柯萨奇病毒A16型和/或肠道病毒71型的RT-LAMP引物，具体核苷酸序列如下：
柯萨奇病毒A16型RT-LAMP引物：
CoxA16-F3：SEQIDNO:1，
CoxA16-B3：SEQIDNO:2，
CoxA16-FIP：SEQIDNO:3，
CoxA16-BIP：SEQIDNO:4，
CoxA16-LF：SEQIDNO:5，
CoxA16-LB：SEQIDNO:6；
肠道病毒71型RT-LAMP引物：
EV71-F3：SEQIDNO:7，
EV71-B3：SEQIDNO:8，
EV71-FIP：SEQIDNO:9，
EV71-BIP：SEQIDNO:10，
EV71-LF：SEQIDNO:11，
EV71-LB：SEQIDNO:12。
本发明提供的手足口病病原体检测试剂盒，包括上述手足口病病原体检测引物组，还包括检测液，所述检测液中包括LAMP缓冲液、dNTPs和有链置换特性的DNA聚合酶、反转录酶、Betaine、MgSO4、HNB和ddH2O。
检测液单独包装在一个小瓶内，由于针对的是手足口病病原体的检测，而病原体为RNA病毒，因此检测液中反转录酶和DNA聚合酶是必不可少的，Betaine(甜菜碱，化学名称为三甲铵乙内酯)用以调节解链温度。HNB即羟基萘酚蓝，羟基萘酚蓝是一种钙镁离子指示剂，在反应中镁离子与dNTP反应形成焦磷酸镁，消耗镁离子，羟基萘酚蓝会从紫罗兰色变为蓝色。检测液中加入反转录酶，省略了单独的RT-PCR的二次扩增步骤，只需一步就可完成实验操作，没有核酸的变复性过程，减少了RNA酶和扩增核酸的污染机会，提高了检测的敏感性和安全性，同时RT-PCR也缩短了检测所需的时间。
优选地，上述手足口病病原体检测试剂盒中，检测液中各成分的浓度为：
有链置换特性的DNA聚合酶0.4U/μL，
优选地，上述手足口病病原体检测试剂盒中，还包括用于现场检测的微流控芯片，该芯片包括封接在一起的基板和盖片，基板上设有多个检测单元，每个检测单元由依次连通的进样通道、反应池和连接通道组成，盖片上设有进样孔和排气孔，进样孔对应于进样通道的末端(即进样通道远离反应池的一端)，排气孔对应于连接通道的末端(即连接通道远离反应池的一端)，排气孔的内部或表面有疏水透气介质。
其中，微流控芯片的材料可以为多种，例如高分子化合物、金属、玻璃、石英、硅、陶瓷、高分子化合物、橡胶和硅铝酸盐化合物等，而以聚碳酸酯、聚丙烯或聚乙烯醇等高分子材料为最佳，附着效果最好。疏水透气介质可以是聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯或聚丙烯等。
优选地，上述手足口病病原体检测试剂盒中，所述反应池中附着有上述的手足口病病原体检测引物组(柯萨奇病毒A16型和/或肠道病毒71型的RT-LAMP引物)，一个反应池对应于一种病毒的RT-LAMP引物。
优选地，上述手足口病病原体检测试剂盒，芯片上每个反应池内的RT-LAMP引物量为：F3与B3均5pmol，BIP与FIP均40pmol，LP与LB均20pmol。
本发明还提供了以上任一所述的手足口病现场快速检测试剂盒的使用方法，是将待检测样品提取RNA，与检测液混合后，滴入进样孔，待其移动到各个反应池后用不透水不透气的封口膜封住进样孔和排气孔，将芯片在63℃环境下反应1小时，然后85℃灭活5分钟，结束反应；肉眼观察反应池中颜色变化，仍然为紫罗兰色的为阴性，从紫罗兰色变为天蓝色的为阳性。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
本发明的试剂盒是对目前对EV71型病毒和CoxA16病毒检测技术手段的改进和补充，该试剂盒的检测体系在63℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异性、高灵敏度地检测到柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型，它具有安全、特异、灵敏、便捷的优势。这主要体现在以下几个方面。
首先，扩增反应只有在六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配的情况下才能顺利进行，所有这些特性都在很大程度上减少了扩增反应的背景，从而使检测特异性得到改善。
第二，该技术省略了单独的RT-PCR的二次扩增步骤，只需一步就可完成实验操作，没有核酸的变复性过程，减少了RNA酶和扩增核酸的污染机会，提高了检测的敏感性和安全性。
第三，所有的扩增过程都可在63℃同温下完成，引入微流控芯片技术，降低了对实验硬件的要求，降低反应体积降低成本，颜色反应可以肉眼直接判定检测结果，无需电泳，无需PCR等复杂仪器。
第四，较RT-PCR缩短了检测所需的时间。
附图说明
图1为实施例1中附着有柯萨奇病毒A16型RT-LAMP引物的微流控芯片上样后的显色结果；
图2为实施例1中附着有肠道病毒71型RT-LAMP引物的微流控芯片上样后的显色结果；
图3为EV71芯片对不同浓度EV71型RNA的检测结果；
图4为不同浓度EV71型RNA的浊度仪检测曲线；
图5为CoxA16芯片对不同浓度CoxA16型病毒RNA的检测结果；
图6为不同浓度CoxA16型病毒RNA的浊度仪检测曲线。
图中，1.为含阴性对照ddH2O的检测液，2为含EV71型RNA的检测液，3为含CoxA16型病毒RNA的检测液，4为含脊髓灰质炎病毒质粒的检测液，5为含埃可病毒11质粒的检测液，6、7、8均为空反应池，仅含检测液；V1～V7代表样品RNA浓度，其中V1：105拷贝/μL，V2：104拷贝/μL，V3：103拷贝/μL，V4：102拷贝/μL，V5：101拷贝/μL，V6：100拷贝/μL，V7:0拷贝/μL，V8：阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明，以助于理解本发明的内容。
图1展示了本发明所述的微流控芯片大致结构，该芯片包括基板和盖片(均为透明的PMMA材质，作为商品使用时基板和盖片是封接在一起的)，基板上设有多个检测单元，每个检测单元由依次连通的进样通道、反应池和连接通道组成，盖片上设有进样孔和排气孔(图1中排气孔被封口膜挡住了，箭头示意封口膜下面为排气孔)，进样孔对应于进样通道的末端(图1的芯片，多个进样通道汇总成一个总进样通道，总进样通道与进样孔连通)，排气孔对应于连接通道的末端，排气孔的内部或表面有疏水透气介质(图中未示出)。
表1.手足口病病原体(CoxA16、EV71)的RT-LAMP的引物序列
实施例1试剂盒检测引物的特异性
试剂盒的微流控芯片包括封接在一起的基板和盖片，基板上设有8个检测单元，每个检测单元由依次连通的进样通道、反应池和连接通道组成，盖片上设有进样孔和排气孔，进样孔对应于进样通道的末端，排气孔对应于连接通道的末端，排气孔的内部或表面有疏水透气介质。该实施例中的盖片可以开启，用于将样品和检测液直接滴加到反应池中。芯片分为两种，一种用于检测CoxA16(命名为CoxA16芯片)，8个反应池内均附着相同量的CoxA16的RT-LAMP的引物；一种用于检测EV71(命名为EV71芯片)，8个反应池内均附着相同量的EV71的RT-LAMP的引物。每个反应池内附着的引物量：F3与B3各5pmol，BIP与FIP各40pmol，LF与LB各20pmol。
(1)待检样品制备：
柯萨奇病毒CoxA16、EV71型病毒、脊髓灰质炎病毒质粒、埃可病毒11型质粒均提取RNA，作为待检样品。
(2)检测液成分：
2.5μLBstDNA聚合酶缓冲液(10×)、1μLBstDNA聚合酶(8U/μL)、1μLAMV反转录酶(10U/μL)、2.5μLdNTP(10mmol/L)、8μLBetaine(250mmol/L)、1μLMgSO4(150mmol/L)、1μLHNB(2.4mmol/L)，1μLddH2O。
(3)CoxA16芯片和EV71芯片的特异性检测
每种待检样品取1μL，与步骤(2)的检测液混合后，加样到反应池中，如图1和图2所示，从左到右依次加样为：阴性对照，EV71型RNA，CoxA16型病毒RNA，脊髓灰质炎病毒质粒，埃可病毒11质粒，空反应池，空反应池，空反应池。加样结束后封住盖片以及进样孔和排气孔，芯片在63℃，水浴1h，85℃，5min灭活中止反应，观察颜色变化。
检测结果见图1(EV71芯片)，只有加入含EV71型RNA的检测液的反应池有颜色变化，变为天蓝色，而其他均为紫罗兰色。
图2为CoxA16芯片的检测结果，显示只有加入含CoxA16型病毒RNA的检测液的反应池有颜色变化，变为天蓝色，而其它均为紫罗兰色。
实施例2试剂盒灵敏度验证
芯片使用实施例1中的CoxA16芯片和EV71芯片。
(1)使用Qiagen试剂盒提取肠道病毒EV71的RNA，按梯度浓度稀释，每个浓度均与检测液混合后加样到EV71芯片对应的反应池中，63℃，水浴1h，85℃，5min灭活中止反应，观察颜色变化，结果如图3所示，其中，黑色：104拷贝/μL蓝色：103拷贝/μL绿色：102拷贝/μL天蓝色：101拷贝/μL粉色：100拷贝/μL。
使用Qiagen试剂盒提取肠道病毒EV71的RNA，按梯度浓度稀释，建立如下扩增反应体系：1μLRNA样品、2.5μLBstDNA聚合酶缓冲液(10×)、1μLBstDNA聚合酶(8U/μL)、1μLAMV反转录酶(10U/μL)、2.5μLdNTP(10mmol/L)、8μLBetaine(250mmol/L)、1μLMgSO4(150mmol/L)、1μLHNB(2.4mmol/L)，肠道病毒71型RT-LAMP的六条引物各1μL(引物浓度为EV71-F3与EV71-B3：5pmol/μL、EV71-FIP与EV71-BIP：40pmol/μL、EV71-LF与EV71-LB：20pmol/μL)、1μLddH2O。混匀，63℃，于浊度仪上反应1h，85℃，5min灭活中止反应，结果如图4。检出限为1拷贝/μL。对应芯片上的结果，如图3，两者结果一致。
(2)使用Qiagen试剂盒提取柯萨奇病毒CoxA16的RNA，按梯度浓度稀释，每个浓度均与检测液混合后加样到CoxA16芯片对应的反应池中，63℃，水浴1h，85℃，5min灭活中止反应，观察颜色变化，结果如图5所示。
使用Qiagen试剂盒提取柯萨奇病毒CoxA16的RNA，按梯度浓度稀释，建立如下扩增反应体系：1μLRNA样品、2.5μLBstDNA聚合酶缓冲液(10×)、1μLBstDNA聚合酶(8U/μL)、1μLAMV反转录酶(10U/μL)、2.5μLdNTP(10mmol/L)、8μLBetaine(250mmol/L)、1μLMgSO4(150mmol/L)、1μLHNB(2.4mmol/L)，肠道病毒71型RT-LAMP的六条引物各1μL(引物浓度为CoxA16-F3与CoxA16-B3：5pmol/μL、CoxA16-FIP与CoxA16-BIP：40pmol/μL、CoxA16-LF与CoxA16-LB：20pmol/μL)、1μLddH2O。混匀，63℃，于浊度仪上反应1h，85℃，5min灭活中止反应，结果如图6。检出限为1拷贝/μL。对应芯片上的结果，如图5，两者结果一致。
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Claims (7)

1.手足口病病原体检测引物组，其特征在于，包括柯萨奇病毒A16型和/或肠道病毒71型的RT-LAMP引物，具体核苷酸序列如下：
柯萨奇病毒A16型RT-LAMP引物：
CoxA16-F3：SEQIDNO:1，
CoxA16-B3：SEQIDNO:2，
CoxA16-FIP：SEQIDNO:3，
CoxA16-BIP：SEQIDNO:4，
CoxA16-LF：SEQIDNO:5，
CoxA16-LB：SEQIDNO:6；
肠道病毒71型RT-LAMP引物：
EV71-F3：SEQIDNO:7，
EV71-B3：SEQIDNO:8，
EV71-FIP：SEQIDNO:9，
EV71-BIP：SEQIDNO:10，
EV71-LF：SEQIDNO:11，
EV71-LB：SEQIDNO:12。
2.一种手足口病病原体检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的手足口病病原体检测引物组，还包括检测液，所述检测液中包括LAMP缓冲液、dNTPs、有链置换特性的DNA聚合酶、反转录酶、Betaine、MgSO4、HNB和ddH2O。
3.根据权利要求2所述的手足口病病原体检测试剂盒，其特征在于，检测液中各成分的浓度为：
4.根据权利要求2或3所述的手足口病病原体检测试剂盒，其特征在于，还包括用于现场检测的微流控芯片，该芯片包括封接在一起的基板和盖片，基板上设有多个检测单元，每个检测单元由依次连通的进样通道、反应池和连接通道组成，盖片上设有进样孔和排气孔，进样孔对应于进样通道的末端，排气孔对应于连接通道的末端，排气孔的内部或表面有疏水透气介质。
5.根据权利要求4所述的手足口病病原体检测试剂盒，其特征在于，所述反应池中附着有权利要求1所述的手足口病病原体检测引物组，一个反应池对应于一种病毒的RT-LAMP引物。
6.根据权利要求5所述的手足口病病原体检测试剂盒，其特征在于，一个反应池内的RT-LAMP引物量为：F3与B3均5pmol，BIP与FIP均40pmol，LP与LB均20pmol。
7.权利要求5或6所述的手足口病病原体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，待检测样品提取RNA，与检测液混合后，滴入进样孔，待其移动到各个反应池后用不透水不透气的封口膜封住进样孔和排气孔，将芯片在63℃环境下反应1小时，然后85℃灭活5分钟，结束反应；肉眼观察反应池中颜色变化，仍然为紫罗兰色的为阴性，从紫罗兰色变为天蓝色的为阳性。
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