CN111663008A - 禽肾炎病毒和h9亚型禽流感病毒二重lamp检测试剂盒及其引物组 - Google Patents
禽肾炎病毒和h9亚型禽流感病毒二重lamp检测试剂盒及其引物组 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒二重LAMP检测引物组,包括用于检测禽肾炎病毒的引物1至引物5以及探针1和用于H9亚型禽流感病毒的引物6至引物10以及探针2。据此,发明人还建立了的LAMP检测方法。优化反应条件后,本发明所建立的LAMP检测方法只需要在63℃恒温反应55min即可完成,能特异地检测禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒,并且检测的灵敏度非常高,最低能检测到3.83fg/μL的禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒核酸混合样品。总之,本发明具有比常规检测方法更特异、更敏感的特点,且通过荧光基团的颜色检测阳性结果,有效的抑制了假阳性结果,并且减少了气溶胶污染,具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒检测技术领域,尤其涉及一种禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒二重LAMP检测试剂盒及其引物组。
背景技术
禽肾炎病毒(Avian Nephritis Virus,ANV)是禽类星状病毒的一种,1976年学者从肉鸡的直肠内容物中分离出。该病毒经口接种雏鸡或易感染鸡接触病毒,引起不同程度的肾炎并使雏鸡生长发育变迟缓,表现出不同的致病性,产生从亚临床感染到死亡的不同表现形式。禽流感(Avian Influenza,AIV)是由A型禽流感病毒(AIV)引起的病毒性烈性传染病,对禽类的经济发展和公共卫生安全造成了严重威胁。以H9亚型为代表的低致病性禽流感引起的症状较轻微且死亡率低,但感染后会引起禽类的呼吸道症状和免疫抑制,并可诱发混合感染。
传统的检测方法,如二温式PCR,PCR和荧光PCR,需要使用昂贵的仪器和试剂,且操作繁琐,耗时耗力等。而环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)是由Notomi等于2000年建立的一种新型核酸扩增技术,该技术具有操作简便、反应快速、成本低廉和结果可视化等优点。现如今,LAMP法已经广泛应用于病原微生物检测。
目前,国内外均未见有建立禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒二重LAMP可视化检测试剂盒和方法的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异、敏感、准确且污染少的禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒二重LAMP检测试剂盒及其引物组。
为解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案:
禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒二重LAMP检测引物组,包括用于检测禽肾炎病毒的引物1至引物5以及探针1和用于H9亚型禽流感病毒的引物6至引物10以及探针2,它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6和SEQ.ID.NO.7至SEQ.ID.NO.12的碱基序列。
探针1在5’端和3’端分别标记CY5荧光基团和淬灭基团BHQ-2,探针2在5’端和3’端分别标记FAM荧光基团和淬灭基团BHQ-1。
引物1至引物5的摩尔比为8:8:1:1:4,引物6至引物10的摩尔比为8:8:1:1:4。
上述二重LAMP检测引物组在环介导等温扩增中的应用。
环介导等温扩增的条件为63℃反应50min,80℃作用5min灭活。
环介导等温扩增中引物1、引物2、引物6和引物7在环介导等温扩增试剂中的终浓度均为40μmol/L,引物3、引物4、引物8和引物9在环介导等温扩增试剂中的终浓度均为5μmol/L,引物5和引物10在环介导等温扩增试剂中的终浓度均为5μmol/L。
禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒二重LAMP检测试剂盒,包括用于检测禽肾炎病毒的引物1至引物5以及探针1和用于H9亚型禽流感病毒的引物6至引物10以及探针2,它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6和SEQ.ID.NO.7至SEQ.ID.NO.12的碱基序列。
针对目前禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒检测存在的问题,发明人根据ANV的ORF基因和AIV-H9的NA基因序的保守序列设计了禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒二重LAMP检测引物组,包括用于检测禽肾炎病毒的引物1至引物5以及探针1和用于H9亚型禽流感病毒的引物6至引物10以及探针2,它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6和SEQ.ID.NO.7至SEQ.ID.NO.12的碱基序列。该引物组针对病毒的8个特异区域,使扩增反应具有很高的特异性,在F3-B3区间设计探针ANV-P和AIV-H9-P,探针ANV-P 5′用CY5标记,3′用BHQ2标记,在694nm波长下呈现大红色。探针AIV-H9-P5′用FAM标记,3′用BHQ1标记,在520nm下呈现绿色,通过荧光基团的显色来降低了LAMP反应的污染几率。据此,发明人还建立了的LAMP检测方法。优化反应条件后,本发明所建立的LAMP检测方法只需要在63℃恒温反应55min即可完成,能特异地检测禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒,并且检测的灵敏度非常高,最低能检测到3.83fg/μL的禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒核酸混合样品。总之,本发明具有比常规检测方法更特异、更敏感的特点,且通过荧光基团的颜色检测阳性结果,有效的抑制了假阳性结果,并且减少了气溶胶污染,具有较好的应用前景。
附图说明
图1是本发明LAMP方法检测禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒的特异性结果图,图中:A是实浊度仪loopam LA-320C生成检测结果,B是荧光基团显色结果;1ANV,2ANV+AIV-H9,3AIV-H9,4AIV-H6,5AIV-H13,6NDV,7MDV,8无菌水。
图2是LAMP方法检测禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒的敏感性结果图,图中:A是实浊度仪loopam LA-320C生成检测结果,B是荧光基团显色结果;1是38.3ng/μL,2是3.83ng/μL,3是0.383ng/μL,4是3.83pg/μL,5是0.383pg/μL,6是3.83fg/μL,7是0.383fg/μL,8是无菌水。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。其中,实验方法如无特殊说明,均为常规方法;所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例所用部分材料如下:LAMP DNA扩增试剂盒、Loopamp LA-320C实时浊度仪均购自日本荣研公司;DNA/RNA抽提试剂盒、PCR试剂和质粒提取试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司;反转录试剂购自宝生物工程(大连)有限公司;NanoDrop 2000核酸测定仪购自美国ThermoFisher Scientific公司;多色荧光成像分析系统购自美国BIO-RAD公司;禽肾炎病毒(ANV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)、H6亚型禽流感病毒(AIV-H6)、H13亚型禽流感病毒(AIV-H13)、新城疫病毒(NDV)、马立克病病毒(MDV)、腺病毒4型(FAV-4)均从广西壮族自治区兽医研究所获得。
实施例1、引物的设计
根据GenBank中ANV的ORF基因(登录号:AB046864.1)和AIV-H9的NA基因(登录号:KT779577.1)的保守序列,使用在线软件Primer Explorer V5(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计LAMP引物,引物由宝生物工程(大连)有限公司合成,最终所得引物和探针序列见表1。
表1 LAMP引物和探针
实施例2、禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒的LAMP检测方法的建立
一、标准品的制备
使用PCR分别扩增ANV ORF基因和AIV-H9 NA基因的目的片段,回收纯化的产物与pGM-T载体连接,经PCR筛选出阳性克隆菌,其阳性克隆菌的质粒用试剂盒提取,并使用反转录试剂盒转录为cDNA。通过核酸检测仪测定cDNA浓度,并根据相对分子质量及阿弗加德罗常数将浓度计算为拷贝数。于–70℃保存,备用。
二、优化LAMP反应体系、反应条件和试剂盒的构建
反应体系为20μL,分别为2μL DNA模板(含ANV和AIV-H9 DNA模板各1μL),10×buffer 2.5μL,MgSO4(100mM)1.5μL,dNTP Mix(10mM)3.5μL,Bst 2.0DNA Polymerase(8000U/mL)1μL,内引物各40pmol(ANV-FIP,ANV-BIP,AIV-H9-FIP和AIV-H9-BIP),外引物各5pmol(ANV-F3,ANV-B3,AIV-H9-B3和AIV-H9-F3),探针各1μL(ANV-P和AIV-H9-P),加水至25μL。各组份混合彻底,63℃(或58~68℃范围内均可反应)反应50min,最后80℃作用5min终止反应。
反应条件:温度按60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃依次递增反应50min,80℃作用5min灭活。
分别按照上述的反应条件进行摸索,获得下述的最佳反应和条件:
最佳反应体系如下:25μL LAMP反应体系:1μL dNTP Mix(10mmol/L,终浓度为1.4mM)、2.5μL 10×Bst buffer、1μL Bst DNA聚合酶8000U(终浓度为320U/mL)、1.5μLMgSO4(100mM,终浓度为6mM)、1μL探针(终浓度分别为ANV-P 100μmol/L、AIV-H9-P 100μmol/L)、1μL引物(FIP 40μmol/L、BIP 40μmol/L、B3 5μmol/L、F3 5μmol/L,其中各条引物的终浓度为FIP 1.6μmol/L、BIP 1.6μmol/L、B3 0.2μmol/L、F3 0.2μmol/L),模板cDNA 2μL(含ANV和AIV-H9 cDNA模板各1μL),加水至25μL。
最佳反应条件:63℃反应50min,80℃作用5min灭活。
为便于基层使用,可参照上述最佳反应体系(除去模板)制备LAMP检测试剂盒,其试剂包括FIP、BIP、F3、B3、LB的10条引物和ANV-P、AIV-H9-P 2条探针。
三、特异性检测
按照上述一制备禽肾炎病毒(ANV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)、新城疫病毒(NDV)、马立克病病毒(MDV)、腺病毒4型(FAV-4)、传染性喉气管炎病毒(AILTV)的cDNA/DNA模板,按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行LAMP反应。
LAMP反应结果判断:
使用多色荧光成像分析系统分析荧光基团颜色变化:若产物显色为黄色(黄绿色),则说明样品中同时含有禽肾炎病毒(ANV)和H9亚型禽流感病毒(AIV-H9);若产物显色为大红色,则说明样品中含有禽肾炎病毒(ANV);若产物显色为绿色,则说明样品中含有H9亚型禽流感病毒(AIV-H9),反之,则说明样品中不同时含有禽肾炎病毒(ANV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)或不含有H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)或不含有禽肾炎病毒(ANV)。
结果如图1所示,A图为由时实浊度仪loopam LA-320C生成检测结果,B图为荧光基团显色结果,其中1为禽肾炎病毒(ANV)模板、2为禽肾炎病毒(ANV)和H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)混合模板、3为H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)模板、4为H6亚型禽流感病毒(AIV-H6)、5为H13亚型禽流感病毒(AIV-H13)、6为新城疫病毒(NDV)、7为马立克病病毒(MDV)、8为阴性对照(无菌水),其余病毒特异性检测未在图中标出。可以看出,只有ANV模板(1)、ANV与AIV-H9混合模板(2)、AIV-H9模板(3)检测为阳性结果(荧光基团显色分别为绿色、黄色和红色),而H6、H13、NDV、MDV、FAV-4、AILTV的检测均为阴性(结果无颜色变化)。
四、灵敏度检测
将禽肾炎病毒(ANV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)混合模板cDNA按10倍倍比稀释至38.3ng/μL、3.83ng/μL、0.383ng/μL、3.83pg/μL、0.383pg/μL、3.83fg/μL和0.383fg/μL为模板,按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行LAMP反应。
结果如图2所示,A图为由时实浊度仪loopam LA-320C生成检测结果,B图为荧光基团显色结果,其中1为38.3ng/μL、2为3.83ng/μL、3为0.383ng/μL、4为3.83pg/μL、5为0.383pg/μL和6为3.83fg/μL、7为0.383fg/μL、8为阴性对照(水);可以看出,LAMP对禽肾炎病毒(ANV)和H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)的混合cDNA模板的最小检测限为3.83fg/μL。
序列表
<110> 广西壮族自治区兽医研究所
<120> 禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒二重LAMP检测试剂盒及其引物组
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttgaatggt cacggtttgc ccgccaggac ttcaaacgct 40
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccattatgct ctgtgtggag caactaacag aaaacaatgt ccct 44
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<400> 7
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 9
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<400> 9
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<211> 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgggacaacc tcttatttta gacac 25
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tattttagac acctgcacca t 21
Claims (7)
1.禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒二重LAMP检测引物组,其特征在于包括用于检测禽肾炎病毒的引物1至引物5以及探针1和用于H9亚型禽流感病毒的引物6至引物10以及探针2,它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6和SEQ.ID.NO.7至SEQ.ID.NO.12的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的二重LAMP检测引物组,其特征在于:所述探针1在5’端和3’端分别标记CY5荧光基团和淬灭基团BHQ-2,所述探针2在5’端和3’端分别标记FAM荧光基团和淬灭基团BHQ-1。
3.根据权利要求1所述的二重LAMP检测引物组,其特征在于:所述引物1至引物5的摩尔比为8:8:1:1:4,所述引物6至引物10的摩尔比为8:8:1:1:4。
4.权利要求1所述的二重LAMP检测引物组在环介导等温扩增中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于环介导等温扩增的条件为63℃反应50min,80℃作用5min灭活。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于环介导等温扩增中引物1、引物2、引物6和引物7在环介导等温扩增试剂中的终浓度均为40μmol/L,引物3、引物4、引物8和引物9在环介导等温扩增试剂中的终浓度均为5μmol/L,引物5和引物10在环介导等温扩增试剂中的终浓度均为5μmol/L。
7.禽肾炎病毒和H9亚型禽流感病毒二重LAMP检测试剂盒,其特征在于包括用于检测禽肾炎病毒的引物1至引物5以及探针1和用于H9亚型禽流感病毒的引物6至引物10以及探针2,它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.6和SEQ.ID.NO.7至SEQ.ID.NO.12的碱基序列。
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彭宜;谢芝勋;刘加波;庞耀珊;邓显文;谢志勤;谢丽基;范晴;: "H9亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立" * |
彭宜等: "禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技术的建立" * |
谢志勤;谢芝勋;范晴;邓显文;谢丽基;罗思思;黄莉;黄娇玲;张艳芳;王盛;张民秀;奉彬;刘加波;庞耀珊;: "H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒二重RT-PCR检测方法的建立" * |
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