CN113025753B

CN113025753B - 一种猴B病毒通用型TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR方法

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Publication number: CN113025753B
Application number: CN202110323991.7A
Authority: CN
Inventors: 马玉媛; 贾俊婷; 章金刚; 马丽敏; 孙珍珠; 王蕊; 王强
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2021-03-26
Filing date: 2021-03-26
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2041-03-26
Also published as: CN113025753A

Abstract

本发明公开了一种猴B病毒通用型TaqMan‑MGB探针实时荧光定量PCR方法。本发明提供了实时荧光定量PCR的成套引物和探针，由如下gD‑5F引物、gD‑5R引物和gD‑5P探针组成；所述gD‑5F引物为序列表中序列1所示的单链DNA分子或其衍生物；所述gD‑5R引物为序列表中序列2所示的单链DNA分子或其衍生物；所述gD‑5P探针为序列表中序列3所示的单链DNA分子或其衍生物。本发明设计能同时检测猴B病毒5种基因型的实时荧光定量PCR检测引物gD‑5F、gD‑5R与探针gD‑5P，利用其对猴B病毒或其gD蛋白进行检测，检测下限为10¹copies/μL，特异性好。

Description

一种猴B病毒通用型TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种猴B病毒通用型TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR方法。

背景技术

猴B病毒(monkey B virus，即macacine alphaherpesvirus 1)属疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科、单纯疱疹病毒属。关于猴B病毒的基因型分型问题迄今尚无一致意见，最初有人认为仅存在3种基因型，之后陆续有文献分别报道了猴B病毒的第4种和第5种基因型，而国内有文献认为存在3种基因型，也有文献认为存在4种基因型。目前通过对猴B病毒基因型相关文献的调研，结合基于猴B病毒gB蛋白(UL27)、UL19蛋白的核苷酸序列系统发育分析结果，认为猴B病毒应分为5种基因型，且基因型与其宿主种系直接相关，分别为来源于恒河猴、日本猕猴、食蟹猴、豚尾猴和狮尾猴的猴B病毒。

猴B病毒是一种人畜共患病原。猴B病毒自然宿主是猕猴，在猴群中广泛存在，多呈良性经过。人类感染猴B病毒后可引起脑脊髓炎甚至致死，死亡率可高达80％。猴B病毒是目前确定的35种非人灵长类疱疹病毒中唯一一种已知对人有致病性的病毒。随着生物医学研究中非人灵长类动物(non-human primates，NHP)在生物医学研究中的应用越来越广泛，其对工作人员的健康及对试验研究的影响也日益受到重视。根据2011年我国颁布实施的实验动物微生物学等级及检测国家标准，猴B病毒已被列为普通级实验用猴应排除的病原微生物。因此，建立快速准确检测猴B病毒的方法对于暴露后的快速诊断和及时治疗以及对建立高质量的实验猴群都具有重要意义。

猴B病毒与同属于疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科、单纯疱疹病毒属的人单纯疱疹病毒HSV-1、HSV-2具有高度相似性，导致针对猴B病毒的检测试剂常与HSV-1和HSV-2发生交叉反应，很大程度上影响了猴B病毒的检测特异性。

猴B病毒检测方法主要包括病毒分离培养、血清学检测和核酸检测。其中，病毒分离培养是猴B病毒感染检测的金标准，但是该方法灵敏度低、耗时长，并且由于猴B病毒是生物安全四级病原微生物，该方法仅能在国家规定的特定实验室进行。而猴B病毒与人单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)、非洲绿猴疱疹病毒(simian agent 8，SA8)、狒狒疱疹病毒(herpesvirus papio 2，HVP2)存在的广泛抗原交叉性，常导致血清学检测结果出现假阳性。核酸检测方法由于其快速、灵敏、特异性高并且减少了病毒培养的危险性而具有很大优势。但是猴B病毒普通PCR检测方法需要对扩增产物进行电泳检测，或结合进一步的限制性酶切、杂交探针检测等手段进行特异性鉴定，操作步骤繁琐的同时也增大了污染几率。

实时荧光定量PCR法操作简便且灵敏度高，国内外已有少量猴B病毒qPCR检测方法的报道，但普遍存在猴B病毒检测引物探针特异性或通用性差的问题，易导致假阳性或假阴性检测结果的发生。

发明内容

为了实现猴B病毒的检测，本发明提供了如下新的技术方案：

本发明的一个目的是提供一种与人单纯疱疹病毒HSV-1和HSV-2无交叉反应的、对猴B病毒五种基因型均可进行定性和定量检测的实时荧光定量PCR的成套引物和探针。

本发明提供了实时荧光定量PCR的成套引物和探针，由如下gD-5F引物、gD-5R引物和gD-5P探针组成；

所述gD-5F引物为序列表中序列1所示的单链DNA分子或其衍生物；

所述gD-5R引物为序列表中序列2所示的单链DNA分子或其衍生物；

所述gD-5P探针为序列表中序列3所示的单链DNA分子或其衍生物。

上述的引物和探针中，所述gD-5P探针的两端分别标记荧光基团和淬灭基团。

上述的引物和探针中，所述各单链DNA分子的衍生物为如下1)-3)中任一种：

1)、将各单链DNA分子的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与各单链DNA分子的核苷酸序列具有相同功能的DNA分子；

2)、与各单链DNA分子的核苷酸序列具有大于等于85％同源性且与各单链DNA分子的核苷酸序列具有相同功能的DNA分子；

3)、各单链DNA分子核苷酸序列的反向互补序列。

上述探针的两端分别标记荧光基团和淬灭基团，在本发明的实施例中，荧光基团为FAM，淬灭基团为非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher,NFQ)。

本发明还提供如下任一种生物材料：

1)含有上述成套引物和探针的PCR试剂；

2)含有上述成套引物和探针的试剂盒或含有所述PCR试剂的试剂盒。

在所述PCR试剂中，所述gD-5F引物、所述gD-5R引物和所述gD-5P探针的摩尔比为16:16:9。

在所述PCR试剂中，所述引物中的gD-5F引物和gD-5R引物的浓度为800nM；

所述探针的浓度为450nM。

本发明还提供了上述成套引物和探针或上述生物材料在如下至少一种中的应用：

1)检测或辅助检测猴B病毒；

2)检测或辅助检测待测样本是否感染猴B病毒；

3)检测或辅助检测待测病毒是否为猴B病毒；

4)检测或辅助检测待测样本是否含有猴B病毒中gD蛋白或其编码基因或其编码基因的部分片段；

5)制备检测或辅助检测猴B病毒产品；

6)制备检测或辅助检测待测样本是否感染猴B病毒产品；

7)制备检测或辅助检测待测病毒是否为猴B病毒产品；

8)制备检测或辅助检测待测样本是否含有猴B病毒中gD蛋白或其编码基因或其编码基因的部分片段产品。

本发明还有一个目的是提供如下方法：

本发明提供了一种检测或辅助检测待测病毒是否为猴B病毒的方法，包括如下步骤：用上述成套引物和探针对待测病毒进行实时荧光定量PCR，于每一个PCR循环收集一次PCR反应产物的荧光强度信号，从而形成荧光扩增曲线；若待测病毒的扩增曲线为“S”型，则待测病毒为或候选为猴B病毒；

或，本发明提供了一种检测或辅助检测待测样本是否感染猴B病毒的方法，包括如下步骤：用上述成套引物和探针对待测样本的核酸进行实时荧光定量PCR，获得扩增曲线；若待测样本的扩增曲线为“S”型，则待测样本感染或候选感染猴B病毒；

或，本发明提供了一种检测或辅助检测待测样本是否含有猴B病毒gD蛋白或其编码基因或其编码基因的部分片段的方法，包括如下步骤：用上述成套引物和探针对待测样本的核酸进行实时荧光定量PCR，获得扩增曲线；若待测样本的扩增曲线为“S”型，则待测样本含有猴B病毒gD蛋白或其编码基因或其编码基因的部分片段。

或，本发明提供了一种定量检测待测样本中猴B病毒gD蛋白或其编码基因或其编码基因的部分片段的方法，包括如下步骤：

1)用上述成套引物和探针对待测样本和不同浓度含有gD蛋白编码基因或其部分片段的参考品质粒进行实时荧光定量PCR，得到待测样本的Cq值和不同浓度参考品质粒的Cq值；

2)以不同浓度参考品质粒的浓度Log值和Cq值作标准曲线，再将所述待测样本的Cq值代入所述标准曲线中，计算得到待测样本中猴B病毒gD蛋白或其编码基因或其编码基因的部分片段的浓度，实现定量检测待测样本中猴B病毒gD蛋白或其编码基因或其编码基因的部分片段。

上述方法中，所述实时荧光定量PCR的反应程序为95℃30s；40cycles of：95℃5s、58℃30s。

上述猴B病毒为如下5种基因型中任一种：猴B病毒恒河猴(BVrh)基因型、食蟹猴(BVcy)基因型、逐尾猴(BVpt)基因型、日本猕猴(BVjp)基因型和狮尾猴(BVlt)基因型。

上述不同浓度含有gD蛋白编码基因或其部分片段的参考品质粒为gD-5参考品质粒。

本发明的实验证明，本发明设计能同时检测猴B病毒5种基因型的实时荧光定量PCR检测引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P，利用其对猴B病毒或其gD蛋白进行检测，具有良好的灵敏度，检测下限为10¹copies/μL；具有良好的特异性，与HSV-1、HSV-2、VZV、EBV和CMV均无交叉反应；且引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P能检测猴B病毒5种基因型。

附图说明

图1为引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P组合检测体系退火温度优化的结果图。

图2为引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P组合检测体系探针浓度优化的结果图。

图3为引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P组合检测体系引物浓度优化的结果图。

图4为引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P组合检测体系Mg²⁺浓度优化的结果图。

图5为引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P组合检测体系通用性的结果图。

图6为引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P组合检测体系检测下限结果图。

图7为引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P组合检测体系特异性评价的结果图。

图8为引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P组合检测体系重复性评价的结果图。

图9为使用引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P组合进行猴B病毒核酸定性检测结果图。

图10为以gD-5参考品质粒为模板，使用引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P组合进行实时荧光定量PCR的扩增曲线结果图。

图11为以gD-5参考品质粒为模板，使用引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P组合进行实时荧光定量PCR的标准曲线结果图。

图12为使用引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P组合进行猴B病毒核酸定量检测结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、猴B病毒实时荧光定量PCR检测引物及探针的设计

通过序列比对分析，确定猴B病毒gD蛋白(US6)的核苷酸序列相对保守。在GenBank数据库中获得所有猴B病毒gD基因序列，利用DNA Star软件进行序列比对，确定gD基因相对保守区域。将猴B病毒gD基因保守区域序列与人单纯疱疹病毒1型、2型序列进行比对，选取特异性较高的区域作为检测靶序列，设计能同时检测猴B病毒5种基因型的实时荧光定量PCR检测引物及MGB探针，分别获得检测引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P组合(见表1)。

表1为猴B病毒实时荧光定量PCR检测引物及探针序列

a：碱基位置参考猴B病毒毒株E2490(GenBank No.:AF533768，2002年7月31日)。

实施例2、猴B病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

一、实时荧光定量PCR参考品质粒的制备

由中美泰和生物技术(北京)有限公司根据猴B病毒代表株的gD基因序列(nt141296-142480，GenBank No.：AF533768，序列4)进行全基因合成，得到gD基因。

将gD基因克隆到pUC19载体(宝生物工程(大连)有限公司(Takara公司)，产品目录号：3219)的Hind Ⅲ和BamHⅠ位点之间，得到gD基因质粒。

以上述gD基因质粒为模板，使用gD-5F和gD-5R引物(表1)进行PCR扩增。扩增结束后PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。将目的产物DNA(153bp，序列5)纯化回收并与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取白色单菌落进行菌落PCR和酶切鉴定得到阳性克隆后，小量制备质粒DNA送中美泰和生物技术(北京)有限公司测序。

测序结果正确的重组质粒即为gD-5参考品质粒，该质粒为将gD基因部分片段(序列5所示)插入pMD18-T载体得到的质粒。

使用紫外分光光度计对gD-5参考品质粒进行准确定量后，根据以下公式计算出其拷贝数，并进行10倍梯度稀释，浓度依次为1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²拷贝/μL，保存于-20℃备用。

分子量＝片段大小×660g/(mol·bp)

二、实时荧光定量PCR检测体系的优化及检测方法的建立

以猴B病毒检测引物gD-5F和gD-5R以及探针gD-5P组合的实时荧光定量PCR检测体系的优化为例。

1、退火温度的优化

以10⁷copies/μL浓度的gD-5参考品质粒为模板，使用含有实施例1制备的引物gD-5F和gD-5R以及探针gD-5P的qPCR反应体系在不同退火温度(56-66℃)下进行qPCR，每个退火温度样品设两个复孔。

上述qPCR反应体系为：Premix Ex Taq^TM(Probe qPCR，宝生物工程(大连)有限公司(Takara公司)，产品目录号：RR390)10μL，gD-5F 500nM，gD-5R 500nM，gD-5P250nM，模板3μL，加无菌去离子水至20μL。qPCR的反应条件为：95℃30s；95℃5s、56-66℃30s，40个循环。

使用BIO-RAD公司的实时荧光定量PCR仪CFX96 Real-Time System进行qPCR。结果如图1所示，退火温度分别为66℃、65.5℃、64.3℃、62.4℃、60℃、58℃、56.7℃、56℃时，参考品质粒的Cq值依次为21.80、20.93、20.99、20.73、22.06、20.71、20.85、21.68。因此，确定最佳退火温度分别为58℃。

2、探针浓度的优化

以10⁶copies/μL浓度的gD-5参考品质粒为模板，使用含有引物gD-5F和gD-5R(固定浓度：500nM)和探针gD-5P(不同浓度：200-600nM)的qPCR反应体系在最佳退火温度(58℃)条件下进行qPCR，每个探针浓度样品设三个复孔。

上述qPCR反应体系为：Premix Ex Taq^TM(Probe qPCR)10μL，gD-5F 500nM，gD-5R500nM，gD-5P分别为200、250、300、350、400、450、500、550、600nM，模板3μL，加无菌去离子水至20μL。qPCR的反应条件为：95℃30s；95℃5s、58℃30s，40个循环。

使用BIO-RAD公司的实时荧光定量PCR仪CFX96 Real-Time System进行qPCR。结果如图2所示，当探针终浓度分别为200、250、300、350、400、450、500、550、600nM时，参考品质粒的Cq值依次为25.03、24.74、24.75、24.75、24.54、24.42、24.50、24.54、24.72。因此，确定探针最佳终浓度为450nM。

3、引物浓度的优化

以10⁶copies/μL浓度的gD-5参考品质粒为模板，使用含有引物gD-5F和gD-5R(不同浓度：200-1200nM)和探针gD-5P(最佳浓度：450nM)的qPCR反应体系在最佳退火温度(58℃)条件下进行qPCR，每个探针浓度样品设三个复孔。

上述qPCR反应体系为：Premix Ex Taq^TM(Probe qPCR)10μL，gD-5F和gD-5R分别均为200、400、600、800、1000、1200nM，gD-5P 450nM，模板3μL，加无菌去离子水至20μL。qPCR的反应条件为：95℃30s；95℃5s、58℃30s，40个循环。

使用BIO-RAD公司的实时荧光定量PCR仪CFX96 Real-Time System进行qPCR。结果如图3所示，当引物浓度分别为200、400、600、800、1000、1200nM时，参考品质粒的Cq值依次为25.30、24.61、24.75、24.44、24.49、24.48。因此，确定最佳引物浓度为800nM。

4、Mg²⁺浓度的优化

本发明使用的Premix Ex Taq^TM(Probe qPCR)中已含有一定量Mg²⁺，进一步添加MgCl₂以优化反应体系。

以10⁶copies/μL浓度的gD-5参考品质粒为模板，使用最佳的引物浓度(800nM)、探针浓度(450nM)和最佳退火温度(58℃)，分别添加不同含量的MgCl₂(0-5nM)进行qPCR，每个MgCl₂浓度样品设三个复孔。qPCR反应体系为：Premix Ex Taq^TM(Probe qPCR)10μL，gD-5F800nM，gD-5R 800nM，gD-5P 450nM，MgCl₂添加量分别为0mM、2mM、3mM、4mM、5mM，模板3μL，加无菌去离子水至20μL。qPCR的反应条件为：95℃30s；95℃5s、58℃30s，40个循环。

使用BIO-RAD公司的实时荧光定量PCR仪CFX96 Real-Time System进行qPCR。结果如图4所示，当MgCl₂分别添加0mM、2mM、3mM、4mM、5mM，参考品质粒相应的Cq值分别为24.41、24.40、23.46、24.11、23.79。因此，确定最佳MgCl₂添加浓度为3mM。

综合以上结果，确定猴B病毒检测引物gD-5F和gD-5R以及探针gD-5P的最佳反应体系为Premix Ex Taq^TM(Probe qPCR)10μL，gD-5F 800nM，gD-5R 800nM，gD-5P450nM，MgCl₂3mM，模板3μL，加无菌去离子水至20μL。最佳反应条件为：95℃30s；95℃5s、58℃30s，40个循环。

确定猴B病毒检测方法为：使用猴B病毒检测引物gD-5F和gD-5R以及探针gD-5P，按照上述最佳反应体系和最佳反应条件进行待测样本核酸的qPCR检测，获得其扩增曲线，若待测样本的扩增曲线为“S”型，则该待测样本中含有或候选含有猴B病毒gD蛋白或其编码基因或其编码基因的部分片段(如序列5)，也就是该待测样本感染或候选感染猴B病毒；若待测样本的扩增曲线为直线，则该待测样本中不含有或候选不含有猴B病毒gD蛋白或其编码基因或其编码基因的部分片段(如序列5)，也就是该待测样本不感染或候选不感染猴B病毒。

三、通用性评价

1、猴B病毒各基因型扩增片段重组质粒的制备

以含有猴B病毒5种基因型代表株相应qPCR扩增靶序列(引物gD-5F和gD-5R的扩增片段序列)的质粒为模板，评估引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P检测猴B病毒5种基因型的能力，即通用性。

猴B病毒恒河猴(rhesus macaques,BVrh)的扩增靶序列与上述一中构建的gD-5参考品质粒的插入片段(序列5)完全一致，因此以gD-5参考品质粒代表猴B病毒恒河猴(BVrh)基因型。

由中美泰和生物技术(北京)有限公司分别根据猴B病毒食蟹猴(cymonolgusmacaques，BVcy)、逐尾猴(pigtail macaques，BVpt)、日本猕猴(Japanese macaques，BVjp)和狮尾猴(lion-tailed macaques，BVlt)4种基因型代表株相应的qPCR扩增靶序列进行全基因合成，序列分别为：BVcy(nt140704-140856，GenBank No.：KJ566591，序列6)；BVpt(nt142635-142787，GenBank No.：KY628969，序列7)；BVjp(nt140796-140948，GenBankNo.：KY628982，序列8)；BVlt(nt142263-142415，GenBank No.：KY628968，序列9)。

将上述各个靶序列分别克隆到pUC19载体(宝生物工程(大连)有限公司(Takara公司)，产品目录号：3219)的HindⅢ和BamHⅠ位点之间，得到猴B病毒食蟹猴(BVcy)基因型质粒、猴B病毒逐尾猴(BVpt)基因型质粒、猴B病毒日本猕猴(BVjp)基因型质粒和猴B病毒狮尾猴(BVlt)基因型质粒。

2、实时荧光定量PCR检测猴B病毒各基因型扩增片段重组质粒

使用检测引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P组合，用上述二的最佳反应体系和最佳反应程序，对猴B病毒5种基因型质粒：猴B病毒恒河猴(BVrh)基因型质粒、猴B病毒食蟹猴(BVcy)基因型质粒、猴B病毒逐尾猴(BVpt)基因型质粒、猴B病毒日本猕猴(BVjp)基因型质粒和猴B病毒狮尾猴(BVlt)基因型质粒按照上述二确定猴B病毒检测方法进行qPCR检测，同时设无模板阴性对照(NTC)，每个样品设3个复孔。

结果如图5所示，以猴B病毒5种基因型质粒为模板，均得到S型扩增曲线；NTC的扩增曲线均为直线，未超过荧光阈值。

说明，本发明设计的引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P组合能够检测猴B病毒5种基因型，具有很好的通用性。

四、灵敏度评价

分别以一系列10倍梯度稀释的gD-5参考品质粒(10⁸-100copies/μL)作为模板，加入如下PCR体系中：Premix Ex Taq^TM(Probe qPCR)10μL，gD-5F 800nM，gD-5R 800nM，gD-5P450nM，MgCl₂ 3mM，模板3μL，加无菌去离子水至20μL。每个稀释度样品设三个复孔，同时设无模板阴性对照(NTC)。

qPCR反应程序：95℃30s；95℃5s、58℃30s，40个循环。

结果如图6所示，以浓度分别为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹copies/μL的gD-5参考品质粒为模板，获得的扩增曲线均为S型；而浓度为100copies/μL的参考品质粒模板和NTC(无模板阴性对照)的扩增曲线均为直线，未超过荧光阈值。因此，本检测体系的检测下限为10¹copies/μL。

五、特异性评价

待测样本分别为HSV-1代表株Sm44(李晓波.猴B病毒检测方法的建立与初步应用[D].北京：中国药品生物制品检定所,2008)、HSV-2代表株G株(陈晓庆.天然产物抗单纯疫療病毒感染活性评价及机理研究[D].南京：南京大学,2014)、VZV(王卓,吕茂民,赵雄,马玉媛,赵媛媛,章金刚.水痘-带状疱疹病毒快速微量中和试验的建立与初步应用[J].军事医学,2015,39(03):179-183.)、EBV(EB病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒提供的EBV阳性定量参考品，购自达安基因股份有限公司)、CMV(AD-169)(购自美国标准生物品收藏中心，ATCC VR-538)的核酸，使用检测引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P组合，用上述二的最佳反应体系和最佳反应程序及确定猴B病毒检测方法进行检测。设gD-5参考品质粒为阳性对照，同时设无模板阴性对照(NTC)。

结果如图7所示，以gD-5参考品质粒(阳性对照)为模板的扩增曲线为S型，而以HSV-1、HSV-2、VZV、EBV和CMV核酸为模板以及NTC(无模板阴性对照)的扩增曲线均为直线(荧光信号未达到阈值)，证明本发明建立的猴B病毒通用核酸检测体系具有高度特异性。

六、重复性评价

以浓度为10⁸-10⁴copies/μL的gD-5参考品质粒为模板，使用检测引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P组合，用上述二的最佳反应体系和最佳反应程序及确定猴B病毒检测方法进行检测。分别进行5次批内重复和5次批间重复实验。

批内重复实验扩增曲线见图8。

根据标准曲线方程与测得的各参考品质粒Cq值计算其拷贝数，最后统计分析批内和批间重复实验中各参考品质粒Cq值与真实测拷贝数的平均值、标准差SD及其变异系数CV％。

结果可知，无论批内重复(表2)还是批间重复(表3)实验中，猴B病毒各浓度gD-5参考品质粒Cq值的标准偏差均低于0.5，且其变异系数(CV％)均低于2％。1×10⁴-1×10⁸copies/μL浓度范围的病毒参考品质粒，批内重复实验中，其拷贝数的平均变异系数(CV％)为21.06％(15.19％-25.53％)；批间重复实验中，平均变异系数(CV％)为9.99％(5.00％-13.00％)。

表2为猴B病毒通用核酸检测体系批内重复实验结果

表3为猴B病毒通用核酸检测体系批间重复实验结果

实施例3、引物及MGB探针在检测猴B病毒的核酸中的应用

(一)使用引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P组合进行猴B病毒核酸定性检测

1、待测样品的制备

待测样本1为gD基因质粒，该质粒是将gD蛋白编码序列(序列4)插入pUC19载体的Hind Ⅲ和BamHⅠ位点之间获得的。

待测样本2为健康人血浆(确诊没有感染猴B病毒)，使用High Pure ViralNucleic Acid Kit(Roche公司)并参照试剂盒说明书提取样品DNA。

2、样品检测

使用检测引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P组合，用上述二的最佳反应体系和最佳反应程序及确定猴B病毒检测方法，对两份待检样品核酸进行qPCR检测。设gD-5参考品质粒为阳性对照，同时设无模板阴性对照(NTC)，每个稀释度设3个复孔。

结果如图9所示，阳性对照和1号样品均出现S型扩增曲线，为猴B病毒核酸阳性，即含有猴B病毒中gD蛋白编码序列；2号样品和NTC的扩增曲线均为直线，未超过荧光阈值，为猴B病毒核酸阴性，即不含有猴B病毒中gD蛋白编码序列。

(二)使用引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P组合进行猴B病毒核酸定量检测

1、待测样品的制备

待测样本2为健康人血浆，使用High Pure Viral Nucleic Acid Kit(Roche公司)并参照试剂盒说明书提取样品DNA。

2、实时荧光定量PCR标准曲线的建立

以上述一制备的浓度分别为1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²拷贝/μL的gD-5参考品质粒为模板，使用检测引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P组合，用上述二的最佳反应体系和最佳反应程序及确定猴B病毒检测方法进行qPCR检测。同时设无模板阴性对照(NTC)，每个稀释度设2个复孔。

结果显示，各稀释度的gD-5参考品质粒均能产生荧光信号，Cq值分别是16.59、19.86、23.33、26.66、30.19、33.63、35.90，扩增曲线如图10所示。由扩增曲线得到的标准曲线斜率为-3.297，扩增效率为101％，R²＝0.997，线性方程为：y＝-3.297x+43.080(x为浓度的log值，y为Cq值)，标准曲线如图11所示。

3、样品检测

使用检测引物gD-5F、gD-5R与探针gD-5P组合，用上述二的最佳反应体系和最佳反应程序及确定猴B病毒检测方法，对两份待检样品核酸进行qPCR检测。同时设无模板阴性对照(NTC)，每个稀释度设3个复孔。

结果如图12所示，1号样品出现S型扩增曲线，为猴B病毒核酸阳性，其Cq值为20.83，根据标准曲线的线性方程得到1号样品中的猴B病毒起始浓度为5.60×10⁶拷贝/μL；2号样品和NTC的扩增曲线均为直线，未超过荧光阈值，为猴B病毒核酸阴性样品。

因此，本发明的引物和探针还可以用于定量检测待测样本中猴B病毒中gD蛋白编码基因的方法，具体如下：1)用上述引物和探针对待测样本和不同浓度参考品质粒进行实时荧光定量PCR，得到待测样本的Cq值和不同浓度参考品质粒的Cq值；2)以不同浓度参考品质粒的浓度Log值和Cq值作标准曲线，再将待测样本的Cq值代入所述标准曲线中，计算得到待测样本中猴B病毒中gD蛋白编码基因浓度，实现定量检测待测样本中猴B病毒中gD蛋白编码基因。参考品质粒为gD-5参考品质粒。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种猴B病毒通用型TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR方法

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

cggtgctcga agatgaactg 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gcgctggagc ttctacgac 19

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

tgacctccac ccacc 15

<210> 4

<211> 1185

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

atggggcccg gcatcgccgc ggttctgctg tcgctggcgg ttgcgctcgc ccgcgttccg 60

gcgggcgggg gcgagtacgt gccggtggag cggtccctga ctcgggtgaa ccccggtcgc 120

ttccgcgggg cccacctggc gccgctggag cagaagacgg acccccccga cgtgaggcgc 180

gtgtaccacg tgcagccgtt cgtggagaac ccgttccaga cccccagcgt ccccgtcgcc 240

gtgtactacg ccgtgctgga gcgcgcctgc cgcagcgtcc tcctctgggc gccgacggag 300

gcggtccagg tcgtgcgggg agcccccgag gcgacgcggc cggacgcgcg ctacaacctc 360

accgtggcct ggtaccgcac gagcgacgac tgcgccatcc cgatcctcgt catggagtac 420

gccgagtgcc cgtacgaccg gcccctgggc gcctgccccg tccgcaacct gccgcgctgg 480

agcttctacg acaacttcgg cgccacgagc gacgacgacc tgggcctcgt catgcacgcg 540

cccgccttcg agaccgcggg gacctacgtg cgcctggtga aggtcaacgg gtgggtggag 600

gtcacgcagt tcatcttcga gcaccgcggc aagggcccct gtcggtacac gcttccgctg 660

cgcatcctcc ccgcggcctg cctccgcggc ccggtcttcg agcagggcgt gacggtggac 720

ggcatcggca tgctcccccg gttcatcccg gagaaccagc gcatcgtggc cgtctacagc 780

ctgcaggccg cggggtggca cggcccgaag gcgccgttca cgagcaccct gctcccgccc 840

gaggtggtgg agacggccaa cgccacccgg cccgagctgg ccccggagga cgaggacgag 900

caggccccgg gcgacgagcc cgcccccgcg gtcgcggccc agctgccgcc caactggcac 960

gttccggagg cctccgacgt caccatccag ggccccgccc ccgcgccctc cggccacacg 1020

ggcgccatcg ttggcgcgct ggccggcgcg gggctggccg ccggcgtcgt cgtgctggcc 1080

gtatacctgg tgcgccgccg cgcccgcgcg gccggcaagc acgtgcggct cccggagctc 1140

ctggacgagg gccccgggcc ggcgcggcgg ggcgcgccct actga 1185

<210> 5

<211> 153

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

cggtgctcga agatgaactg cgtgacctcc acccacccgt tgaccttcac caggcgcacg 60

taggtccccg cggtctcgaa ggcgggcgcg tgcatgacga ggcccaggtc gtcgtcgctc 120

gtggcgccga agttgtcgta gaagctccag cgc 153

<210> 6

<211> 153

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

gcgctggagc ttctacgaca gcttcagcgc cacgagcgac gacgacctgg gcctcctcat 60

gcacgcgccc gccttcgaga ccgcggggac ctacgtacgc ctggtgaagg tcaacgggtg 120

ggtggaggtc acgcagttca tcttcgagca ccg 153

<210> 7

<211> 153

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

gcgctggagc ttctacgaca acttcagcgc gacgagcgag gacgacctgg gcctcgtcat 60

gcacgcgccc gccttcgaga ccgcggggac ctacgtgcgc ctggtgaagg tcaacgggtg 120

ggtggaggtc acgcagttca tcttcgagca ccg 153

<210> 8

<211> 153

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

gcgctggagc ttctacgaca acttcagcgc cacgagcgac gacgacctgg gcctcgtcat 60

gcacgcgccc gccttcgaga ccgcggggac ctacgtgcgc ctggtgaagg tcaacgggtg 120

ggtggaggtc acgcagttca tcttcgagca ccg 153

<210> 9

<211> 153

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

gcgctggagc ttctacgaca gcttcagcgc cacgggcgag gacgacctgg gcctgctcat 60

gcacgcgccc gccttcgaga cggcgggcac ctacgtgcgc ctggtgaagg tcaacgggtg 120

ggtggaggtc acgcagttca tcttcgagca ccg 153

Claims

1.成套引物和探针在如下A1)-A4)至少一种中的应用：

或，生物材料在如下A1)-A4)至少一种中的应用：

A1)制备检测或辅助检测猴B病毒产品；

A2)制备检测或辅助检测待测样本是否感染猴B病毒产品；

A3)制备检测或辅助检测待测病毒是否为猴B病毒产品；

A4)制备检测或辅助检测待测样本是否含有猴B病毒中gD蛋白或其编码基因或其编码基因的部分片段产品；

所述猴B病毒的基因型为猴B病毒恒河猴基因型、猴B病毒食蟹猴基因型、猴B病毒逐尾猴基因型、猴B病毒日本猕猴基因型或猴B病毒狮尾猴基因型；

所述成套引物和探针，由如下由gD-5F引物、gD-5R引物和gD-5P探针组成；

所述gD-5F引物为序列表中序列1所示的单链DNA分子；

所述gD-5R引物为序列表中序列2所示的单链DNA分子；

所述gD-5P探针为序列表中序列3所示的单链DNA分子；

所述gD-5P探针的两端分别标记荧光基团和淬灭基团；

所述生物材料为如下任一种：

B1)含有所述成套引物和探针的PCR试剂；

B2)含有所述成套引物和探针的试剂盒或含有所述PCR试剂的试剂盒。