CN109266785A - 一种黄鳝弹状病毒CrERV RT-LAMP检测引物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于病毒检测领域，具体公开了一种黄鳝弹状病毒CrERV RT‑LAMP检测引物及应用，发明人首次从患病黄鳝幼苗中分离出了一种黄鳝弹状病毒，该病毒为黄鳝弹状病毒（Chinese rice‑field eel rhabdovirus）CrERV，针对该病毒序列设计引物，F3：5'‑TCCTCCCAGGATATACGACC‑3'，B3：5'‑AGACAGGGGGGTAGTGGT‑3'；FIP：5'–TTCCGATCTGCTGCAAGACACT‑ATGGTTTGGACCTGGAGTGA‑3'，BIP：5'‑AGCTGCTCCTTCTGCGGATG‑TGGGGCCATCAGATTCATG‑3'，可对黄鳝弹状病毒进行检测，该引物的特异性好，灵敏度高。

Description

一种黄鳝弹状病毒CrERV RT-LAMP检测引物及应用

技术领域

本发明属于病毒分子检测技术领域，具体涉及一种黄鳝弹状病毒CrERV RT-LAMP检 测引物及应用。

技术背景

弹状病毒科(Rhabdoviridae)病毒是一类具有广泛宿主的负链RNA病毒，其颗粒呈现 子弹状或棒状。其中狂犬病病毒(Rabies virus)最为人熟知，能引起人或其他温血动物的 狂犬病，病死率几乎为100％，引起了世界范围的广泛关注，造成社会对养殖宠物安全度的 恐慌。因此，对弹状病毒进行深入研究具有重要意义。此外，弹状病毒还能引起家畜多种急 性传染病(如牛流行热，ephemeral fever)，以及鱼类和多种农作物的感染性疾病。国际病 毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)于2017年发表了最 新的病毒分类第十次报告，将弹状病毒科(Rhabdoviridae)划分为18个属，其中能够感染鱼 类的弹状病毒有Perhabdovirus,Sprivivirus和Novirhabdovirus三个属。目前以上三个属能够 感染多种养殖鱼类，具有强烈的致病性，死亡率可以达到100％，给全球的海淡水养殖业造 成重大的经济损失，尤其根据《进出口活水生动物检验检疫协议》，进出境的养殖鱼类，例 如鲈鱼、鲤鱼、虹鳟、鲫鱼、牙鲆等养殖和种苗用鱼种，均要进行弹状病毒(IHNV、SVC V、HIRRV)疫病检测，口岸安全意义重大，影响进出口经济贸易。

目前对感染鱼类弹状病毒科的研究主要集中在Sprivivirus和Novirhabdovirus两个属， 而Perhabdovirus属作为2017年弹状病毒科新命名的一个属，对其研究甚少。目前该属中包 括鳜鱼弹状病毒，该病毒能够引起鳜鱼大量死亡。目前，黄鳝弹状病毒(Chineserice-field eel rhabdovirus，CrERV)全长序列尚无公开报道，更也无有效的检测方法。

本申请首次从染病的黄鳝中分离得到黄鳝弹状病毒(Chinese rice-field eelrhabdovirus， CrERV)，针对鳜鱼弹状病毒和黄鳝弹状病毒在P基因结构的区别设计特异性引物，建立RT -LAMP检测方法不仅用于检测和监测养殖黄鳝的健康状况，而且通过序列比对能够区别黄 鳝弹状病毒和鳜鱼弹状病毒，为黄鳝和鳜鱼养殖及早病原检测和监测提供保障。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄鳝弹状病毒CrERV RT-LAMP检测引物，所述的引物为F3： 5'-TCCTCCCAGGATATACGACC-3'，B3：5'-AGACAGGGGGGTAGTGGT-3'；FIP：5'–TTC CGATCTGCTGCAAGACACTATGGTTTGGACCTGGAGTGA-3'，BIP：5'-AGCTGCTCCTTCTGCGGATGTGGGGCCATCAGATTCATG-3'。

本发明的另一个目的在于提供一种黄鳝弹状病毒CrERV RT-LAMP检测引物的应用， 包括利用所述的引物制备成黄鳝弹状病毒检测试剂盒。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种黄鳝弹状病毒CrERV RT-LAMP检测引物，包括F3：5'-TCCTCCCAGGATATACGACC-3'，B3：5'-AGACAGGGGGGTAGTGGT-3'；FIP：5'–TTCCGATCTGCTGCAAGACACTATGGTTTGGACCTGGAGTGA-3'，BIP：5'-AGCTGCTCCTTCTGCGGATGTGGGGCCATC AGATTCATG-3'，所述的黄鳝弹状病毒CrERV的保藏编号为：CCTCC NO：V201819。

一种黄鳝弹状病毒CrERV RT-LAMP检测引物的应用，包括利用上述引物制备成用于 检测黄鳝弹状病毒检测试剂盒，或直接用于黄鳝弹状病毒的检测，所述的黄鳝弹状病毒Cr ERV的保藏编号为：CCTCC NO：V201819。

一种黄鳝弹状病毒非诊断性检测方法，包括下述步骤：

利用本发明提供的RT-LAMP检测引物检测为阳性后，根据黄鳝感染后的临床症状进行 判断，若黄鳝头部肿大，则判定为感染的是黄鳝弹状病毒CrERV；若黄鳝出现的是出血现 象，则判定为感染的是鳜鱼弹状病毒，所述的黄鳝弹状病毒CrERV的保藏编号为：CCTCCNO：V201819。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明首次自黄鳝中分离并克隆了弹状病毒的全长序列，对于黄鳝弹状病毒的研究 具备开拓性的意义。

2.本发明的方法快速简便：本发明所建的RT-LAMP方法只需1h，相比较传统病毒分离方法数天时间和传统RT-PCR数小时，极大的提高了检测效率。

3.本发明的方法特异性强：引物对靶序列的特异序列区的识别，保证了RT-LAMP方法扩增的高度特异性。

附图说明

图1为本发明提供的感染黄鳝弹状病毒的黄鳝苗种主要临床症状为头部肿大示意图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未 特别说明，均购自商业渠道或是已公开。

实施例1：

一种黄鳝弹状病毒CrERV，其分离过程如下：

1)将携带病毒的黄鳝脾、肾等组织取出并碾磨后，培养基稀释100倍，2000rpm离心后取上清过滤，接种到鲫脑细胞系(GibelCarpBrain,GiCB)单层，25℃培养7天，产生细 胞病变效应(CPE)，可见GiCB细胞收缩变圆、折光度增加，部分细胞开始脱落，细胞单 层开始破裂。

培养基：M199，10％胎牛血清，pH 7.0～7.2

2)收集病变细胞，利用透射电镜进行形态学鉴定。

3)收集病毒，对其进行全基因组测序，序列为SEQ ID NO.1所示。

黄鳝弹状病毒的形态特征：病毒子弹状或梭形，病毒具有双层脂质囊膜，与典型的弹 状病毒形态相符，该病毒已于2018年4月24日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分 类命名：黄鳝弹状病毒(Chinese rice-field eel rhabdovirus)CrERV，保藏编号：CCTCC N O：V201819，地址：中国武汉武汉大学。

有研究表明鳜鱼弹状病毒可以感染黄鳝，但是通过临床症状特征对比结果显示，感染鳜 鱼弹状病毒的黄鳝主要出现出血现象，但是本申请中从患病黄鳝中分离的弹状病毒临床症状 主要为头部肿大，两者形成鲜明对比(图1)，全序列分析结果显示，鳜鱼弹状病毒与本申 请中分离鉴定的黄鳝弹状病毒同源性最高为92％，但是通过基因结构分析发现本申请中分 离鉴定的黄鳝弹状病毒磷酸化蛋白基因(phosphoprotein gene,P)由一个大的开放阅读框(O RF)组成(864bp)，与鳜鱼弹状病毒P基因包含的两个ORF形成明显区别(大的ORF大 小为849bp，小的ORF大小为219bp)，而且两株弹状病毒的开放阅读框的大小也不同。两 株病毒在宿主感染的倾向性不同，而且感染后表现的临床症状也有明显区别，因此，两株病 毒无法归为一株病毒。其中，本申请中涉及到的黄鳝弹状病毒的分类地位属于Perhabdovir us属。

实施例2：

基于黄鳝弹状病毒CrERV的全序列(SEQ ID NO.1所示)与其他病毒的全序列的差异 设计的引物：

一种黄鳝弹状病毒CrERV RT-LAMP检测引物，包括F3：5'-TCCTCCCAGGATATACGACC-3'，B3：5'-AGACAGGGGGGTAGTGGT-3'；FIP：5'–TTCCGATCTGCTGCAAGACACTATGGTTTGGACCTGGAGTGA-3'，BIP：5'-AGCTGCTCCTTCTGCGGATGTGGGGCCATC AGATTCATG-3'。

实施例3：

利用黄鳝弹状病毒CrERV RT-LAMP检测引物对黄鳝弹状病毒的检测，方法包括：

1.黄鳝组织或感染细胞总RNA的提取及cDNA的合成：采用提取待测样品的总RNA。配置逆转录反应体系：3μL总RNA，Oligo(dT)18primer 1μL，灭菌双蒸水8μ L，混匀65℃5min后立刻冰浴；将5×Reaction Buffer 4μl，RNase抑制剂1μl，5mM dNT Ps 2μL，M-MLV逆转录酶1μL加入冰浴的反应液中，混匀后，42℃1h，95℃5min，将获 得cDNA模板-20℃保存备用。

2.聚合酶链式反应扩增：

采用25μl反应体系：包括：内引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μ M，dNTPs 1mM，Betaine 0.5M，DTT 4mM，MgCl2 6mM，Bst DNA聚合酶8U，AMV 逆转录酶5U，模板RNA5μl，1×ThermoPol Reaction Buffer。反应管于63℃温育60分钟 后，80℃灭活2分钟。

F3：5'-TCCTCCCAGGATATACGACC-3'，

B3：5'-AGACAGGGGGGTAGTGGT-3'；

FIP：5'–TTCCGATCTGCTGCAAGACACTATGGTTTGGACCTGGAGTGA-3'，

BIP：5'-AGCTGCTCCTTCTGCGGATGTGGGGCCATCAGATTCATG-3'。

RT-LAMP反应扩增产物分析：

1.取5μL扩增产物，用2％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片 显示梯状LAMP特征性条带，结果为阳性；若无任何条带，结果为阴性。

2.反应结束后向反应管中加入1000×SYBR Green I 2μL，静置1～5min后观察结果， 反应液变绿则为阳性，保持橙色则为阴性。

实施例4：

黄鳝弹状病毒RT-LAMP检测引物特异性试验

利用实施例3所述的方法，对表1中的待检病毒样品进行检测，同时设置阴性对照组(双 蒸水)和阳性对照组(CrERV)，待检病毒样品具体为：鲤春病毒血症病毒(SVCV)，草鱼呼肠孤病毒873(GCRV-873)，鳜鱼弹状病毒(SCRV)，传染性造血器官坏死病毒(IHNV)。

表1黄鳝弹状病毒RT-LAMP检测试剂盒特异性试验

结果如表1所示，仅阳性对照组(CrERV)和鳜鱼弹状病毒(SCRV)可检测到梯状LAMP特征性条带，其余组均无特征条带，说明黄鳝弹状病毒CrERVRT-LAMP检测引物具 备很强的特异性。通过黄鳝弹状病毒感染黄鳝和鳜鱼弹状病毒感染黄鳝的表征特征结果分析，感染黄鳝弹状病毒的患病黄鳝主要呈现头部肿大，尤其苗种头部肿大明显，目前未发现出血 现象；感染鳜鱼弹状病毒的黄鳝主要呈现体表出血症状，通过以上临床症状结果分析，可将 鳜鱼弹状病毒和黄鳝弹状病毒区分开来。

实施例5：

黄鳝弹状病毒RT-LAMP检测引物的灵敏度

将浓度为1500ng/μL的CrERVcDNA模板10倍梯度稀释，利用实施例3的方法，检测利用本发明提供的引物RT-LAMP的检测限，可见10⁶倍稀释还可检测到目的条带，也就是 最低可检测30.00pg/μL的cDNA模板。

实施例6：

黄鳝弹状病毒RT-LAMP检测引物在制备黄鳝弹状病毒检测试剂盒中的应用：

1.黄鳝组织总RNA的提取及cDNA的合成：采用提取感染黄鳝弹状病毒的黄鳝的脾肾等内脏组织的总RNA。配置逆转录反应体系：3μL总RNA，Oligo(dT)18prime r 1μL，灭菌双蒸水8μL，混匀65℃5min后立刻冰浴；将5×Reaction Buffer 4μl，RNase 抑制剂1μl，5mM dNTPs 2μL，M-MLV逆转录酶1μL加入冰浴的反应液中，混匀后，42℃ 1h，95℃5min，将获得cDNA模板-20℃保存备用。

2.RT-LAMP反应扩增：

采用25μl反应体系：浓度为40μM的两对引物F1、R1或F2、R2分别各取0.5μL加入 两只PCR反应管，再分别加入2.5mM dNTPs 2μL，25mM MgCl₂1.5μL，5U Taq聚合酶0. 5μL，模板cDNA 1μl，10×ThermoPol Reaction Buffer 2.5μl，用灭菌双蒸水将两管反应体系 均补齐至25μL。反应条件，95℃预变性5min；95℃30s、48℃30s、72℃30s，30个循环； 72℃延伸10min，4℃保存。

F3：5'-TCCTCCCAGGATATACGACC-3'，B3：5'-AGACAGGGGGGTAGTGGT-3'；

FIP：5'–TTCCGATCTGCTGCAAGACACTATGGTTTGGACCTGGAGTGA-3'，BIP：5'- AGCTGCTCCTTCTGCGGATGTGGGGCCATCAGATTCATG-3'

3.RT-LAMP反应扩增产物分析：

1.取5μL扩增产物，用2％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示梯状LAMP特征性条带，结果为阳性；若无任何条带，结果为阴性。

2.反应结束后向反应管中加入1000×SYBR Green I 2μL，静置1～5min后观察结果， 反应液变绿则为阳性，保持橙色则为阴性。

结果所示，阳性对照(黄鳝弹状病毒CrERV)显示梯形特征性条带，阴性对照(水)无明显条带，1-5号感染了黄鳝弹状病毒CrERV的黄鳝组织样品显示明显的梯形特征性条带， 说明样品1-5为黄鳝弹状病毒阳性，与实际情况相符。

序列表

<110> 中国水产科学研究院长江水产研究所

<120> 一种黄鳝弹状病毒CrERV RT-LAMP检测引物及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11545

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgagaaaaa agaaaccaat atacagaata tcaagattat tggatttctt tttctcgaca 60

ttaaaaatgt caacagacat catatctgaa cctccaagaa tggaaaacca aatcatcaag 120

agagtgtcta ctggagctga agtcaaggca gttctgcctg caactgaagc tcaggccact 180

tatccagcag atgggatggc agatggggcg atgccactca tcattattga attcaaagat 240

ctaaccgcat cggaaatcaa gcagatgatc ctcgccggaa ttcaagagag gagactggat 300

gcggacattg tggtccgcta tctctatgag gttgtccaac actggaatga agttaacaac 360

aatgagatct ggacatcctt tggaatcggg ttggctaaaa ttgggcaaga ggtcaacccc 420

ctcaacctgc tgaaagttcg ctatggaaga agggcagttc cagactttgc agtggctcaa 480

ggacagactg atgttcaaga caaggccctc gtgatcctgt tgttggggat ctaccgagtg 540

gcatctatca caaacgacgc gtataaaaca cgtgtcatgg atgcaatcca gcagcaagcc 600

ttagaggcag atcctaaagt ccagcttaac atcagagtac tagctggcaa caaacatttg 660

ctgtccaatc caaattatct cagaatggtg gcagcaattg acatgttctt ttacagattc 720

aaggagtctg agagagcgaa tgtcagagtt tcaactctga catccagatt taaagactgt 780

gcagctctat caacatttgc tcatgtcgca tcattcactg gattaaccct cagtggagtg 840

ctggattggg tgttcacgga gactgtcgca gctgaagtgg agaggatgat gaaaccaggc 900

caagagattg accaagaggc atcttacatg ccttatttaa aagacatggg actatctaaa 960

gtgtcccctt actctgccac aaagaatcca ggattccatg catggggaca atcggcttgc 1020

gccctcatgg gatccatcag atcacagaac gccctgcgag catcagagga caattggctg 1080

aacctcaagc tcaatgctga aatcatggcg ttcgccctgg gaacatctgc agagctggta 1140

aaggcttttg acatcggagg caacactgat gaccaagatg acggaggagc ttttgagggt 1200

gagctgaatc taacagaaga tgctggaatg cccaaaaaga gagatgccat ggagtggttc 1260

atgtacatgg aaggcagaga cttcaagctg acagaggaga tgaaggaagg actgaggaga 1320

atggccggaa atatcaagaa cccaaggcct ggaaccatcg gtgatctgct gaagcaccaa 1380

actttgtgag caatcctcga gtcaagagaa atgaaattat atgttattgt gccacatgaa 1440

tatggtctca agtgaccgct ttattgtgag aatgtggagg agcattagtt acttaagggt 1500

caataaggtg atgggatatg aaaaaaactt taacagagat catggcaaaa ccagttttcc 1560

agatatctta tgatcttgag aagttggcta ccaacttcga ggaactcaat ttggctgaat 1620

tgaagcgaaa tggagaggac ccagatgatc ccttggaatg gaaatcatcc cctgacttct 1680

tgccttacgc agcatctcag gaagcagagg agtatgaaca gggagagcaa gaaatggagt 1740

gtattgatga atatactcct gctgactctt cctggacagc agaagtctca ggaccaccaa 1800

tcctcccagg atatacgacc caatctagat ggtttggacc tggagtgaca gcagagacca 1860

agccaatcat attggaagag ttggctagtg tcttgcagca gatcggaatc aagctgattt 1920

cagctgctcc ttctgcggat gccaattatt acttgttata ccccaatgta cacatgaatc 1980

tgatggcccc aggagtcctt gagagtggaa gaccactacc cccctgtcta gctccagccg 2040

aagcacccaa accacccgcc gcgccagccc caggcctgct caaagagtta cctcctgctc 2100

caaggcagcc catccctgcc ctgttggggc aaagtttgac cgggccgatc ccaaatgatg 2160

atgatgtcag agctgtgctc tgggcttctg gaataagggt agttgaaaag aagaccaaca 2220

aaacagctat cctcaagcca tgtgccttag gctggatgat agacgactgg ctgcaagtag 2280

acatcggggc ggaaacagac attgctgaaa tctttaaaaa gatgttggcg aaaactccca 2340

gccgaaaatt gatgatgtac aagtacatcc ctctcgaggt aattcagcaa atggtgctgt 2400

tctaataatc caaattaaat aagtatgtca tgacgattca aattgtgatc ttaattctaa 2460

tttcttttat actttagtgg tgtcggggag atatgaaaaa aactttaaca gatatcatag 2520

aatatccacg aaagatgcct ctgttcaaga agagcaacaa gaagttggct attaagccgt 2580

atcaagcacc tccgccgtac tcggcgactg cactcactcc gagtgctcct atggccctgc 2640

ctgacagtga ctatggaatc aaaacaatga tggtggagtt ggacttcaaa atcatatcca 2700

gcatcgagct gaaaacgatt ggcaagattt accaaattgc gcaatacatg ctggatgatt 2760

atactggtcc aattcggagt aagcctctgt atatgggcct gttcctcgca tcatgccaca 2820

atgccattaa tccatcaatg gtccatggaa agtggcatta tgagatacag tttaggggcc 2880

caataggatt caatctggca aacaacacac ccctggactg ggtctgtaac catgttgcca 2940

gatcttatga gtgttactct cgagatcaat cactggtcag ctacacctgc aatatgcgcg 3000

ccacatagat gagaggatca tctcgtgagt agatgttcca cgctgtgttg gtgcagcgct 3060

cagctgagtc tgtgttcgga attatccaga tggcagaagc agaggtccga ggagacgaca 3120

tgctgtatgt cctgagtgat cgtggtcgta gctggcatta ataagatcgg aacgaattga 3180

ctctgaatct acaaatgacc gacaccacga ggctcactct ctgaagaagg ctcatgacgt 3240

gaatcacctg cagaccatga gccaatcaga tccgactaca ttaatgcaac attcactttc 3300

tcttatatat ggggcacgtc ttacgttttt aaatgtataa ggtcacaatt atgtcatccg 3360

ccaatgcggc gtattagctg atacgcatat cgataattat atatgtatcc ttaactatta 3420

atcagtctga ttggtggtcg ttatgaaaaa aacttaacag atttcatcat gaaattaatc 3480

attgcactca cgttgatctc ccaggcgatt ggctatccac tgtttgttcc gatcagactt 3540

caaggatggc atgatgttaa actagatact ttgatgtgtc ccagttatgc atctgagctg 3600

aataaggagg ccgcttggcc acagattgga ttgagacatc tcgctgcgac agattattat 3660

ggagcaaaag ggacaatctg ccataagacc atctgggtga aaacttgtga tttcagatgg 3720

tatggaccta ggtatattac gaccaagatt tcgtacgcac ctataaccgg actagaatgt 3780

caacaggcag tagtcaaggc atccaaagat gagctagaga caccatacat gccagaagct 3840

aactgcaatt gggctacagt cagtgataat gaaaagacat ttatcacagt ccaaaagagc 3900

aacatcttca tggaccctta taacatggtc tatgtaagcg caatcttaaa aggaggaaaa 3960

tgtgcaagca aagtctgccc actcgagatg catggaggaa tttggatacc cagcgaagca 4020

cccaaagaga gttgcaaact gagcagcagc accactagcc acatcaatcc caacagtgcc 4080

tccaggttag taacagatgc aagttatttg gttacggagt atcatcgaca actgccgttc 4140

ttaggagctt gtaagatgtc aatgtgcgga gaggtaggaa tgaggtttaa gtctggagaa 4200

tggtacaaga ttgagtcaag cgacggacgg gtgctgtcct ttctcgatag tgttccaatg 4260

tgtgatggag agctgactgt ctccatccat gacagctcag ctacgtatca caaattgagc 4320

caggaaatcc ttgatctgtc cgcacaaatt gcttgcatat ccgaattgcg aagagccaga 4380

gagaagggag cagttagcaa ctacctcttg agtttcctaa caccaaacca tggagggttt 4440

gggacggcat accgggtgtt caacggacag ttgcaagctt ccaaggccac ttatgcaaga 4500

gtgagactcg gtgctctctc cactgcaaca aattggggac aattagataa tggcagtgca 4560

tactcttcag aagatgtcac aggcgagata atcgatggac ccctattcaa tgggaatcgg 4620

atggacaatg ggactcttag gatcgttcag aatgcaatat tgggccagac actagaagat 4680

gaagatttat atgaacattc agcaaaagag attctccatc cgcatctgac aatcctaagc 4740

aataatgaat cggacgtgct gtctgcattt cgtcctgtag gtgcccaagg cgatatcata 4800

catgcagtgg gtgagtgggt aggaactgga gtgagtggat ttatccatac tattgtctat 4860

ctggtggtct tctgtggcat cattcttctc ctttacagat gtttgccata tttcctgaaa 4920

aaacgaaaat cacagtcggc gggtcgggtg actcctcaaa tgatcccttt gcagcaatat 4980

caatttgttc cctaaatgac ttgtattgat tgaaccattg ttatactctt tattacaagc 5040

tcttgaatgg gtgattcttc ttcttcatga tatattatct agatgatggg ttaataaagt 5100

gggtatgaaa aaaactttaa cagtgatcat ggattattct caggaatatg tcgatgatta 5160

cgatgatcca tttgcggaat acgaggcttt ctcaaatttt caagattttt ttgaaaaagg 5220

gagaccactg aatcagaaag attacaacct gaattctccg ttgatcggag atgagattga 5280

tgcattcctc acatacctca aaacacacag tatctctgca agatttgtga gagacaaaaa 5340

aagatgggag ctttacaaag agcatgtact gtatcctcac ttgatgatcc aagaccacac 5400

tgtcatacat aaatggttag ggaatcattt gctgaatatg caacaaacac aagaatataa 5460

aactttggtg agtcgtgtaa atgaaatgac aagatcggca gatgagatac ttcaaccttt 5520

tctaaaggga tggaaaggtg agtccacatc accaactaga aaagacccaa atttgttaca 5580

acatacaggt ctggaatatg gatcaggatt tctcggctgg cacaaagtta cactattgat 5640

gaatagtcag acaagattag aaagagaaaa tctgataaca tctgagttcc aaggcctgga 5700

gtctgttcta gaatcagatg acttatggat agggagaatc aaagatccat gtattggtac 5760

ttggatcatc actgataatc tagtctggag caacaaaagt ggaattctac tagacaaaaa 5820

tacagttatg atgatcaaag acaccttgat aggccgcatt cagacgctat tgagcttaat 5880

aaatcgagaa gacaaaaaat ttgatgacca aacacccaag aaactctaca atctatacag 5940

attgggagac aaaatgctca agaacaaggg ggatgacgcc tatgaggcta ttaagatgct 6000

ggaaccaatg tgtaatcttc agctatctaa actggcacat gaatatcgtc ctctcatccc 6060

tgatttccct cactttgaaa accatgtgag gaaaacatgc ggcgacctat cacaagagca 6120

cccagaagtc ttagaaatac tagagctagt gttgtcatta agaaacgtcg aagaggcact 6180

tctcttcttc ggatctttca gacactgggg gcatccattc attgattact ttgagggcct 6240

taaaaaactg aacaaacaag tcacattgca aaaggagata gatgacaaat atgcgaatgc 6300

attagcaagt gatctggcct atatagtcct taagaaggaa tttgacaaga agaagcactg 6360

ggcagtcaac aaagaagcga tgagtgagaa acatccattc taccagcatg tctctgaaca 6420

cacctggcca acaccaaaac aagtagacga ctttggagac aattggcata aactgccact 6480

tataaaagtg ttcgaaatcc cggacgtcat tgatccgtcc atcatatact cagacaagag 6540

ccattccatg caaaaatcag aggtgctaga tagtatcatg aaccatccca atactcccat 6600

cccaactagg aaagtattgt cctctctctt agagaaacca gcaacagatt ggccgaaatt 6660

tctagagtca gtagatctaa atgggttaga tgaagaagat ctggttatcg gattgaaagg 6720

gaaagaaaga gaattaaaga aagcaggacg tttcttctcc ctaatgtcat ggaaattacg 6780

agagtatttc gtcatgacag aatatctgat caaacacaac tttgtcccac tatttcatgg 6840

attgactatg gcagatgaca tgactcaagt tatgaagaaa atgttagaca gaagccaagg 6900

gcaaggagag aatgactacc agagagtcag tattgcaaac catattgact atgaaaagtg 6960

gaacaatcac caaaggaaag aatcaaatgg accaacattt cgagtgatgg gacaattctt 7020

gggctatcca tctttgatcg aaaggacgca tgagttcttc gagaaaagcc tgatatacta 7080

caatggtagg ccggatttga tgcaagtgac cggaaaccag gtgattaact ccactgataa 7140

acttgtttgc tggcaaggac aaaagggagg gctagaggga ctaagacaga aaggatggag 7200

cattttaaat ctgttaatca tcaggagaga atctaaaatt cggaacactc gggtccagac 7260

cctggcgcaa ggagacaatc aagtcatttg cacccaatac atgctcagcc ccagcagaga 7320

tgagaaagag ctgaaagaga agctgaaaca catagcagaa aacaatgggg ttattatgga 7380

cgccatcgag aggggcacaa ataaactggg tttgattatc aacaacgatg agactatcca 7440

gtcagcagat ttcctgacat atgggaaaat accaatcttc cgcggaaaca ttcgttgtct 7500

agaagggaaa agatggtcca gggtgacatg tgtgaccaat gatcaacttc caaatttatc 7560

taatgttttg tcatcagtct caacaaatgc tctaaccgtc tctcactttg acatttcacc 7620

attgaatgct atgcgacagt attgtttctt cggatgcttt gctcttaaac tggtctccat 7680

gcacaatccc gctctgcgag gatcccacga gtcacgctta ggatttgata tatcaaccga 7740

ttctacaatc gcagctactt tgtttcttga tccatcattg ggaggagcca gtgggatgtc 7800

cctgacacga ttcttaatga gaatgtttcc agatccagtc accgaggggc tagcgttttg 7860

gaaggtggtc tacaacaaca cagatttagg ttgggtgaag aaattgtgta caaaggctgg 7920

tcatcccaaa ttagctaaag gagagatgaa caacatcggg aagctgatag agaatccatc 7980

tgctctcaat ttaaagaaag agacatcagc aatcagtatc ataaaaaacg aagtgaaaag 8040

attcttatac gacaaatgca ttgatttcgg gaatagagtt atatcagccg caatcgaaga 8100

aaccagagag gaagagccat acctggacaa cttcctcgca tccatctatc ctctatttcc 8160

aagattcttg gccgaattca aagctgcatc gttccttgga atcacagatt ccctggtcag 8220

cctgttccag aactccaaga ctatcagagg tgtgttcaaa aacaagtatg caaaagaaat 8280

agagttaaag gtcctgactt gcgagatcaa cttactgaaa ttaatacatg actttgaaaa 8340

ggcagaaatt ttcccgatgt gggattgctc ctccttacat gctaagattt tgagacaaga 8400

atcctgggga atgccagtgc atggagctac cattccgcac cctttagaga tgttatctct 8460

gaaagatttt catcatagat gtgagataat ggattatatc acagtctctg taattgagcc 8520

attaaacaaa tgcttagaat ccaagggcag attgccagct tacttgggat caaagacatc 8580

ggagaccaca agcatcatcc aaccatggga cagagaaaca aacatcccaa tgatcaaaag 8640

agcagccaag ctaaggaatg ccatatcatg gtttgtgaac cctgactcca atctagcaaa 8700

aagcataatg aacaatttag aaggactcac tggcgaaaaa tgggatggtg cattggaggg 8760

attcaaacga accgggtccg ctctgcaccg tttctctagc gctcgagtca gctcaggtgg 8820

cttttccgca cagagtcctg caaaattgac aaggatgatg tccacaactg atacctttag 8880

ggatataggg accgacaatt acgacttcat gtttcagtcc ttgctaatcc attcacagat 8940

cacagcaggc gaagtcctcg gagattctga tgcaacagga acattgcatt ttcatttgga 9000

ttgcaaaagt tgcctgtcta gaatagaaga ggtagtcctg gaatcaagag tcacctacag 9060

tccagaagac agatctggat tacttaacag gtggaagcca gagggatcaa catggtcaac 9120

agaaagaacc agaccggaga tccagagtac cgccatagag aggttaaata aatcatccat 9180

tcattataac atgggaaggg ctcaaggatt tatttacgga gatcagaaga tgaccggaag 9240

aggaggagac gagtcatcat tgttccctct ctccatccag tacaaagtaa aggctgatct 9300

gtttttgaaa ggactgatgg acggtttggt ttatgcatca tctctcgcaa caatccacag 9360

gaggaatttt gaccatccga ccaaattcca agcaacacag tatgggacat tggagtactt 9420

ggtagaagag ctgacaagtc atccgccatt tctcaatctt ttgagatcag gtcctttatc 9480

agaaatattg agaagtgtcc ctcacagagt ccctccatct tacccattga cgaacaggga 9540

tttgggggca ttggcacgaa attacttgag atacatgcta caaactttga aacagagcca 9600

ccaaagaaag gactacgatg caaatttgat aatttttgct gacatgatgt ccccagacgt 9660

catataccct tacgccctag cgcaaaagtg tgcaagatta gcatttaagc ctaagtggac 9720

accaaaggac acagaaactt tgagacaact gagagaaact gcatccagca tgagagcgaa 9780

tcctgacttc aagatgtatc tgtcaaacaa gatagtcgca gtagaccatg agattcgcca 9840

tgcatccaaa accatacaag agaaaacctc cttcaaagaa gaaaagctcg actgggggaa 9900

ggaattgtct gggaaagtga caatctcaga tgttgtagtc agtaatgaga agcaggcagt 9960

cccttcagaa acagtcaagc agcggaaaga tccattaata tctggattgc gacatttcca 10020

gatggccaca ggagcacatt ataaattgag atcaatcttg gatgctaaaa agatcactta 10080

ccgtgatttc atctgtggtg gagatggatc aggggggttg acatcatgtc tcttaagaca 10140

atctccagct agtcgaggac tcttcaacag tttgttggag ataaaggaaa cagatctgag 10200

gggcagttct ccgagtccac catctgctgt gttccatttg ggaccagaga gtcagagatg 10260

ctgcaatcta ctgtctgcat gggaaaatcc cagtgatcta agtcaggcac ttacttggga 10320

ctactttcgc tcagaaatga caaagaataa ccttaaagtg gatctcatga catttgacat 10380

ggaagtgcgg gatgtagaaa tgtctgtaaa aatagaaacc atgattgaag agaacttaga 10440

cctgttgtct gagaaaggaa cattgatcta caagacttac ttgagccgat ttgcatccgt 10500

ggatgtttgt gcaccagaga ggttcagcaa gtacttttca aaagctgagt tgatttcaac 10560

tcaattcact agcagtcata gctcagaagt ttatcttgtg tgcactggga aacgaagaaa 10620

tccaaaaaat ttgaaatttg tcaattggaa aacgacttgg gcactcgcaa aagttcacaa 10680

gtgttggaat gacacggaaa ccgagttgaa acgggctttc gagctgcagc agatggacat 10740

gtatcaggga gtgccgaaga agttgatatc tgattgggaa aacgatcttc tggctttgac 10800

tctggggctc cgagtagaga gtgggatagc ctcagtattg tgctcatttc tgagtaccca 10860

tcgacgaatc ttgtccggga cgacactcct tgccatctgg gctcatgtgg cactctacca 10920

aagaagaccc ggaaccagtc ctccttctat cagacactgc caggaaattg gtatcatttc 10980

tattggattt ctctactgct tagctcttgc tagagctgat gtctcattgt atagcaagat 11040

gaaaatgatg acggacaatg cctttccctt tcattaccaa aaatccagat ggaacacagc 11100

cactggattg aatcaaaccg tcaggctgga caataaaatg gcaagtcttg gaagtgtgat 11160

cagattgttt tccagacttg gtttacaggg ggatgcagac tggaggaaag tggatgaatc 11220

atgccgactg attgtaccgc agtgcacaat gaaatggata ttggcacaca ctgggctggc 11280

aggattgaca aaaggtgagt ggtcattggg ggaagtgatt gctcaggaag agtgggagga 11340

gagagaggct gcgtggacgg aataagcctt aaatgtattg tatttttgtg atggtttgct 11400

tttgggatat tttgaaaact taggcttact ttcatgtgtt taatcattag agtaataagg 11460

gatgtttttt tgatatgaaa aaaactcaca attactgaga aaccgaaccg gtttgctaat 11520

cagagactgt gtttgttttt ctcgt 11545

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcctcccagg atatacgacc 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agacaggggg gtagtggt 18

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttccgatctg ctgcaagaca ctatggtttg gacctggagt ga 42

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agctgctcct tctgcggatg tggggccatc agattcatg 39

Claims (3)

1.一种黄鳝弹状病毒CrERVRT-LAMP检测引物，所述的引物为F3：5'-TCCTCCCAGGATATACGACC-3'，B3：5'-AGACAGGGGGGTAGTGGT-3'；FIP：5'–TTCCGATCTGCTGCAAGACACT-ATGGTTTGGACCTGGAGTGA-3'，BIP：5'-AGCTGCTCCTTCTGCGGATG-TGGGGCCATCAGATTCATG-3'，所述的黄鳝弹状病毒CrERV的保藏编号为：CCTCC NO：V201819。

2.权利要求1所述的引物在制备黄鳝弹状病毒检测试剂盒中的应用，所述的黄鳝弹状病毒CrERV的保藏编号为：CCTCC NO：V201819。

3.一种黄鳝弹状病毒非诊断性检测方法，包括下述步骤：

利用权利要求1提供的RT-LAMP检测引物检测为阳性后，根据黄鳝感染后的临床症状进行判断，若黄鳝头部肿大，则判定为感染的是黄鳝弹状病毒CrERV；若黄鳝出现的是出血现象，则判定为感染的是鳜鱼弹状病毒，所述的黄鳝弹状病毒CrERV的保藏编号为：CCTCC NO：V201819。