CN111724859A - 一种基于核心基因组snp分析的副溶血性弧菌溯源方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于核心基因组SNP分析的副溶血性弧菌溯源方法，所述方法对研究样品菌株和参考菌株核心基因组的SNP进行分析，判断其与各参考菌株之间的双尾SNP距离，可得到样品菌株与参考菌株之间的溯源关系，并可进一步用于样品菌致病性研究。本发明的副溶血性弧菌菌株溯源方法，可精确地反映样品菌与已知参考菌之间的分化时间，能较好地解释不同菌株之间的克隆性。相对于传统的分型方法，本发明方法通量更高，分辨率、准确性和重复性都更好，有助于确定不同菌株之间是否存在直接传播关系，对于不同菌株的流行病学关联研究、疾病防控具有重要的意义。

Description

一种基于核心基因组SNP分析的副溶血性弧菌溯源方法
技术领域
本发明属于生物信息领域，涉及一种基于核心基因组SNP分析的副溶血性弧菌溯源方法。
背景技术
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是革兰氏阴性、嗜盐性细菌，是我国一种重要的食源性致病细菌，广泛存在于海水，咸水湖及海产品中，能够感染虾、蟹、牡蛎、各种贝类等各种水产经济动物，引起鱼类皮肤溃疡、虾红体病等弧菌病，威胁海洋渔业和水产养殖业的发展。同时，人们食用了携带致病性副溶血性弧菌的食物往往会造成急性胃肠炎，其主要症状有恶心、呕吐、腹泻、头痛及低烧，严重者可导致败血症。在该菌所致的食源性疾病暴发事件中，能否及时、准确追溯其潜在污染源，是采取有效的控制和预警措施的关键。目前对该菌的溯源主要采取分子分型技术，包括脉冲场凝胶电泳分析(pulsed-field gelelectrophoresis，PFGE)、共有重复序列PCR(Entero-bacterial repetitive intergenicconsersisi-PCR，ERIC-PCR)、多位点序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)等。
已有的分子分型技术均存在一定程度的局限性，比如PFGE实验操作复杂、耗时长，实验数据只能用于菌株的相似性比对，不能解释不同菌株之间的克隆性；MLST基于有限的7个管家基因位点，分辨力低，对不同暴发或者没有直接流行病学关联的菌株区分能力差。而且目前所有的分子分型技术均不能很好地解决分辨率低的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种高分辨率、准确性高、重复性好的高通量的分型技术。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种副溶血性弧菌溯源方法，包括如下步骤：
(1)全基因组测序：构建样品副溶血性弧菌基因组文库并进行全基因组测序和组装，得到样品副溶血性弧菌全基因组序列；
(2)核心基因组SNP分析：以包括RIMD2210633参考菌株的已知副溶血性弧菌的基因组序列作为参考基因组集，对样品菌株核心基因组SNP进行分析；
(3)过滤重组区域及系统发育分析：预测并过滤副溶血性弧菌菌株基因组上潜在的重组区域，过滤后的对齐序列进行系统发育分析、构建进化树；
(4)进化树可视化及溯源分析：将分析结果可视化，根据样品菌株与参考菌株之间的双尾SNP距离进行溯源分析。
核心基因组单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)普遍存在于机体DNA序列中，是第三代遗传标记，通过检测待测菌的特定SNP位点上的碱基类型即可鉴别出待测的分枝杆菌的种类。本发明以RIMD2210633序列为标准参考序列，从而确定不同菌株的SNP位点。
以不同的已知副溶血性弧菌菌株基因组数据为参考基因组集，可以得到不同的分析结果；此处不同的分析结果指含有的不同菌之间的比较结果的有无，而非同样的两种菌之间相关性结果的不同。参考菌株的公开数据可从NCBI等网站的公开数据库中得到。所述双尾SNP距离(pair-wise SNP distance)，指两两菌株之间的SNP距离。
根据文献报道，副溶血性弧菌的核心基因组每年平均出现约3.3个位点突变(Martinez-Urtaza et al.,2017)。因此，当两两菌株间双尾SNP距离≤3时，可认为相关性较高。若双尾SNP距离≤3，则样品中的副溶血性弧菌与所对比的参考菌有直接流行病学关联。
作为本发明的优选实施方式，还包括对样品中的副溶血性弧菌进行分离和鉴定的过程，并提取样品中鉴定得到的副溶血性弧菌DNA的过程。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(1)中测序深度≥100×，测序产出的reads经过滤后需符合Q30≥85％，测序结果通过SPAdes软件对clean reads进行组装，参数设置为：spades.py--careful-1Reads_1.fastq-2Reads_2.fastq-k 21,33,55,77,99,127--cov-cutoff auto-o./assembly。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(2)中的已知副溶血性弧菌选取于样品来源地相关性高的已知副溶血性弧菌。
一般地，参考菌株可根据样品菌的来源(如地理位置)等选择与其已知信息尽量相关的公开菌株数据，有利于得到与之相关性密切的分析结果，溯源更精准，减少数据量。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(2)为：使用Parsnp软件对样品菌株的全基因组序列进行比对分析，参数设置为：parsnp-p 16-d./dir-r./dir/RIMD2210633.fna-c-x。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(3)为：使用Gubbins软件预测并过滤副溶血性弧菌菌株基因组上潜在的重组区域，过滤后的对齐序列通过RAxML软件进行系统发育分析，构建进化树。
作为本发明的优选实施方式，所述步骤(4)的可视化过程通过iTOL在线软件实现。
通过将数据进行可视化处理，可更方便、清晰得到不同菌株之间的溯源关系。
作为本发明的优选实施方式，所述方法用于判断样品副溶血性弧菌的致病性；其中，所述步骤(2)中的参考基因组集包括已知致病性副溶血弧菌的基因组数据。
通过比较与已知致病菌之间的传播关系，有助于判断样品菌的潜在致病性。
本发明的副溶血性弧菌菌株溯源方法，以所有菌株中都存在的核心基因组区域上的SNP变异位点为溯源依据，通过有效分析核心基因组上的双尾SNP距离，可精确地反映样品菌与已知参考菌之间的分化时间，能较好地解释不同菌株之间的克隆性。相对于传统的分型方法，本发明方法通量更高，分辨率、准确性和重复性都更好，有助于确定不同菌株之间是否存在直接传播关系，对于不同菌株的流行病学关联研究、疾病防控具有重要的意义。
附图说明
图1为本发明方法用于样品中的副溶血性弧菌菌株溯源的流程图。
图2为本发明对副溶血性弧菌菌的分离鉴定过程的示意图。
图3为琼脂糖凝胶电泳图谱检测DNA标准的示意图。
图4为根据本发明方法构建的用于推断不同菌株之间起源关系的系统发育树示意图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例
本发明方法用于样品中的副溶血性弧菌菌株溯源的一种实施例(流程如图1所示)。
(1)、副溶血性弧菌菌株的分离鉴定
根据《食品安全国家标准食品微生物学检测总则(GB4789.1-2010)》中样品的采集规则进行采样，对采集到的样品根据《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验(GB4789.7-2014)》进行副溶血性弧菌的分离鉴定。
在广州某水产批发市场采集水产样品50份以上，然后按照图2示的流程进行副溶血性弧菌的分离鉴定，具体步骤如下：
A、无菌条件下将样品在彻底剪碎(若为固体样品)，称取样品25g(mL)加入到含有225mL 3％氯化钠碱性蛋白胨水中的均质袋中，用旋转刀片式均质器以8000r/min均质1min，制成1：10的均匀稀释液。
B、用灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL 3％氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，震荡摇匀震荡摇匀，制备1:100的稀释液。另按上述操作制备10倍递增稀释液，每递增一次，换用一支1mL灭菌吸管，最终选择3个连续的递增稀释梯度，每个稀释度接种三支含有9mL3％氯化钠碱性蛋白胨水加1mL稀释液的试管。置37℃恒温箱内，培养8h-18h。另将剩余混合液于置37℃恒温箱内，培养8h-18h。
C、在所有显示生长的试管或增菌液中用接种环沾取一环，于TCBS平板上划线，一支试管划线一块平板，于37℃培养18h-24h。典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2mm-3mm。从培养箱取出TCBS平板后，挑取菌落或标记要挑取的菌落。
D、从每个含有疑似菌落的TCBS平板上挑取可疑菌落，划线环凯弧菌显色平板，于37℃培养18h-24h。同时划线3％氯化钠胰蛋白胨斜面(TSA)。典型的副溶血性弧菌在环凯弧菌显色平板上呈圆形、半透明、表面光滑的紫色菌落，直径2mm-3mm。
E、染色镜检：将疑似菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽孢，有鞭毛。
F、API20E和MID生化鉴定：从环凯弧菌显色平板上刮取紫色的单个菌落，用生理盐水制备成浊度适当的细胞悬浮液，使用API20E和MID生化鉴定试剂盒鉴定。
G、将经过API20E鉴定为阳性的副溶血性弧菌，从3％氯化钠胰蛋白胨斜面上转接到3％氯化钠胰蛋白胨大豆肉汤中，37℃过夜复苏。在无菌条件下将菌液加入终浓度为30％甘油管中，保存于-80℃冰箱。
通过鉴定，从样品中得到副溶血性弧菌1株，分别命名为S062。
(2)、DNA提取、文库构建
将步骤(1)鉴定得到的菌液接入含有TSB(30％NaCl)液体培养基的1.5mL离心管中，盖好盖子，37℃培养12小时后，可用于基因组DNA提取。
使用细菌DNA提取试剂盒提取得到副溶血性弧菌DNA样品，通过琼脂糖凝胶电泳检测得到的样品DNA的完整性，并通过Nanodrop检测得到的样品DNA的纯度，Qubit检测得到的样品DNA的浓度；用于构建DNA文库必须同时满足以下要求：①DNA纯度满足1.8≤A260/280≤2.0同时2.0≤A260/230≤2.2；②基因组DNA相对完整，电泳观察无弥散条带(见图3)；③Qubit检测三次平均浓度≥20ng/μL。
文库构建采用酶切法打断基因组DNA，片段化的DNA进行末端修复和接头连接，随后使用磁珠进行片段筛选，之后通过PCR进行文库扩增。扩增后的文库最后利用磁珠进行片段纯化得到可用于测序的DNA文库。
(3)、全基因组测序
DNA文库进行测序前使用Agilent 2100进行质控检测，文库片段大小应为400-500bp之间。文库质检合格后方可进行cluster制备和测序。使用Illumina平台进行双端测序，测序深度应≥100×，测序产出的reads经过滤后需符合Q30≥85％。使用SPAdes软件对clean reads进行组装，参数设置为：spades.py--careful-1Reads_1.fastq-2Reads_2.fastq-k 21,33,55,77,99,127--cov-cutoff auto-o./assembly。
(4)、核心基因组SNP分析
以包括RIMD2210633菌株和其他公共数据库中采集地点为中国地区的所有菌株的基因组序列作为参考基因组集，使用Parsnp软件对参考基因组集以及测序的副溶血性弧菌菌株的核心基因组SNP进行比对分析，参数设置为：parsnp-p16-d./dir-r./dir/RIMD2210633.fna-c-x。
(5)、过滤重组及系统发育分析
使用Gubbins软件预测并过滤副溶血性弧菌菌株基因组上潜在的重组区域，过滤后得到的对齐序列通过RAxML软件进行系统发育分析，构建进化树。
(6)、进化树可视化及溯源分析
生成的系统发育树通过iTOL在线软件进行可视化(可视化结果如图4)，不同菌株之间的直接流行病学关系根据两两菌株之间的双尾SNP距离来确定。
本实施例中，目标菌株S062与参考基因组集中已知的临床致病性菌株S065和S086(已知的临床致病性菌株)如果根据传统的MLST分型分型，它们都是属于ST3型别的(表1)，无法再进一步区分其是否确切存在直接流行病学关联。
表1菌株S062、S065以及S086的MLST分型结果
Locus S062 S065 S086
dnaE_Allele 3 3 3
gyrB_Allele 4 4 4
recA_Allele 19 19 19
dtdS_Allele 4 4 4
pntA_Allele 29 29 29
pyrC_Allele 4 4 4
tnaA_Allele 22 22 22
ST型别 ST3 ST3 ST3
但是根据本发明提供的方法，菌株S062与菌株S065可认定为具有直接流行病学关联(双尾SNP距离＝1)，而菌株S086与上述两株菌可认定为无直接流行病学关联(双尾SNP距离>10)。
本实施例也说明本方法在进行副溶血性弧菌的溯源中具有更高的分辨率和准确性。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种副溶血性弧菌溯源方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)全基因组测序：构建样品副溶血性弧菌基因组文库并进行全基因组测序和组装，得到样品副溶血性弧菌全基因组序列；
(2)核心基因组SNP分析：以包括RIMD2210633参考菌株的已知副溶血性弧菌的基因组序列作为参考基因组集，对样品菌株核心基因组SNP进行分析；
(3)过滤重组区域及系统发育分析：预测并过滤副溶血性弧菌菌株基因组上潜在的重组区域，过滤后的对齐序列进行系统发育分析，构建进化树；
(4)进化树可视化及溯源分析：将分析结果可视化，根据样品菌株与参考菌株之间的双尾SNP距离进行溯源分析。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对样品中的副溶血性弧菌进行分离和鉴定的过程，并提取样品中鉴定得到的副溶血性弧菌DNA的过程。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中测序深度≥100×，测序产出的reads经过滤后需符合Q30≥85％，测序结果通过SPAdes软件对clean reads进行组装，参数设置为：spades.py--careful-1Reads_1.fastq-2Reads_2.fastq-k 21,33,55,77,99,127--cov-cutoff auto-o./assembly。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的已知副溶血性弧菌选取于样品来源地相关性高的已知副溶血性弧菌。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)为：使用Parsnp软件对样品菌株的全基因组序列进行比对分析，参数设置为：parsnp-p 16-d./dir-r./dir/RIMD2210633.fna-c-x。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)为：使用Gubbins软件预测并过滤副溶血性弧菌菌株基因组上潜在的重组区域，过滤后的对齐序列通过RAxML软件进行系统发育分析。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)的可视化过程通过iTOL在线软件实现。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法用于判断样品副溶血性弧菌的致病性；其中，所述步骤(2)中的参考基因组集包括已知致病性副溶血弧菌的基因组数据。
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