CN110714088A - 一种基于gMLST技术的沙门氏菌溯源分型的方法及应用 - Google Patents

一种基于gMLST技术的沙门氏菌溯源分型的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于gMLST技术的沙门氏菌溯源分型的方法，步骤如下：⑴沙门氏菌的分离鉴定；⑵DNA提取、含量检测；⑶全基因组测序及g MLST分型；⑷MLST分型；⑸耐药基因分析和毒力基因分析；⑹进化树分析。本方法针对重要的食源性致病菌，如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌或副溶血性弧菌等，建立沙门氏菌全基因组多位点序列分型技术，用于流行病学溯源，进而将此方法推广到食源性致病菌的溯源。

Description

一种基于gMLST技术的沙门氏菌溯源分型的方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是一种基于gMLST技术的沙门氏菌溯源分型的方法及应用。
背景技术
随着食品贸易国际化的发展及广谱高效抗菌药物的广泛使用，变异菌株不断出现，加之食源性致病菌的分型方式、型别复杂，常规的表型分型方法如生化反应、血清学分型和噬菌体分型等，已经不能满足细菌分型、变异菌株鉴定以及致病菌追踪溯源的要求，无法用于菌株之间的相关性分析。目前基于DNA 序列分析的分子分型成为主要的技术手段。常见的病原微生物分型的方法有：随机扩增引物多态性(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、脉冲场凝胶电泳 (PFGE)、多位点酶电泳(MLEE)、多位点序列分析(MLST)等。其中，PFGE由于其极高的分辨率和重复性被称为细菌分子分型的金标准，能在细菌基因组很庞大的情况下反映较多的变异。MLST多位点序列分型(Multilocus sequence typing， MLST)是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法，通过PCR扩增多个管家基因内部片段，测定其序列，分析菌株的变异，从而进行分型。但以上方法均存在或多或少的缺点，比如PFGE实验操作复杂、耗时长，实验数据只能用于比对相似性，不能用于解释菌株之间的克隆性；MLST分辨力低，对不同暴发或者没有直接流行病学关联的菌株区分能力差；MLVA的重复性受位点本身的特点和使用的片段长长度检测方法影响较大，实验室间可比性差，不容易实现标准化和网络化应用。所以，需要一种能被所有菌种通用的、分辨率高、分型力和重复性好、快速高通量的技术作为新的分型方法，以弥补上述方法的缺点和解决目前不能解决的问题。
近年来，食源性病原菌污染食品引起的食源性疾病逐年呈上升趋势，引起了人们的广泛关注。由于食源性致病菌的广泛空间性、时间性复杂因子的存在，一直难以得到及时有效的监控。因此，建立一种可以对不同地理来源的食源性致病菌进行有效溯源的关键性技术将对于控制食源性感染，追溯食品中致病菌的来源起到至关重要的作用。目前全基因组测序(WGS，whole-genome sequencing)可以对爆发的菌株进行高分辨率跟踪，但目前的基于WGS的方法缺乏标准化，使其不太适用于实验室间的前瞻性监测。为了克服这个限制，我们急需开发一种全新的分型技术进行快速、标准化、高分辨率的菌株疫情追踪。
多位点测序分型(MLST)技术是近年才发展起来的新型分子分型方法，它是对病原体持家基因设计引物进行PCR扩增和测序，根据得出的每株病原体各个座位等位基因数目进行等位基因图谱或序列类型鉴定，进行聚类分析。MLST 是由多位点酶电泳(MLEE)衍生出来的一种分型方法，由Maiden等研究设计，于1998年首先应用于脑膜炎奈色球菌(Neisseria meningitides)，后来被广泛应用于其它病原菌、环境菌和真核生物中。
目前全基因组测序(WGS，whole-genome sequencing)可以对爆发的菌株进行高分辨率跟踪，但目前基于WGS的方法缺乏标准化，使其不太适用于实验室间的前瞻性监测。基于WGS的致病菌分子分型方法中，目前使用比较多的两种技术是基于全基因组测序的单核苷酸多态性分型(whole genome-based single-nucleotide polymorphisms，wgSNP)和全基因组多位点序列分型(genome multilocus sequence typing，gMLST)。gMLST是使用某一个种的细菌核心基因组中的成百上千个基因位点的序列差异对菌株进行区分和分型的方法。它与传统的MLST分型不同：MLST检测和比对7个基因位点的序列差异，而gMLST检测和比对成百上千个基因位点的序列差异。gMLST沿用传统MLST的数据分析方法，以基因比对的方式在核心基因组中搜寻等位基因差异，赋予每株菌一组等位基因编号来进行分型。这种以基因为单元的比对和分型方法，不但比传统的 MLST方法具有更高的分辨力，而且与wgSNP分型相比降低了对生物信息分析的要求，在结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜肺军团菌等多种病原菌的分型和分子流行病学研究中已经显示了应用前景。
在金黄色葡萄球菌的研究中，Leopold等利用GenBank中已公布的39株金黄色葡萄球菌基因组筛选出1861个基因用于分型，建立了该菌的cgMLST方法。随后应用该方法对18株流行病学背景清晰的t001克隆的MRSA进行了分析，结果显示cgMLST分型结果与流行病学特征完全吻合，能把具有直接流行病学关联的菌株聚集成簇，将未发现直接流行病学关联的菌株区分开。同时应用cgMLST可以揭示传统方法不能揭示的菌株传播关系。
新西兰学者Mark等在2015年开发了一种用于屎肠球菌的核心基因组MLST(cgMLST)方案。cgMLST将全基因组单核苷酸多态性(SNP)多样性转移到标准化和便携式的等位基因编号系统中，其计算密集程度远低于基于SNP的WGS 数据分析。他们对来自荷兰，丹麦和德国五家不同医院的103个爆发分离株进行了WGS分析。研究表明cgMLST方案在区分流行病学相关和不相关的分离株方面表现良好。
2017年中国疾控中心Haijian Zhou等学者发现MLST的区分能力不能满足鉴别非爆发肺炎克雷伯菌菌株。因此他们使用肺炎链球菌菌株HKUOPLC的完整基因组作为参考基因组，并从NCBI数据库中下载907个肺炎克雷伯杆菌基因组作为原始基因组数据，以确定cgMLST靶基因。采用核心基因多位点序列分型 (cgMLST)全基因组序列的方法解决了这些传统的分子分型方法的缺点。
Kohl等使用7个结核分枝杆菌的全基因组序列，筛选出3257个核心基因，建立了该菌的cgMLST方法。随后应用cgMLST方法对26株具有相同IS6110DNA 指纹图谱和spoligotyping型别的暴发菌株进行了分型。结果显示26株菌有3041 个核心基因，将26株菌分为16个cgMLST型，提示cgMLST具有比其它两种传统分型方法更高的分辨力。同时将cgMLST和SNP-based WGS分型进行了比较，结果显示两种分型方法对26株菌的分型和分组效果一致，均能够精确地揭示不同结核病患者间的流行病学关联。
2017年美国Gonzalez-Escalona N等研究筛选出副溶血弧菌cgMLST方案的 2254个合适的核心基因。他们对92个新测序的基因组进行了cgMLST分析，加上NCBI数据库可获得的142个具有基因组的菌株。cgMLST分析能够区分相关和不相关的菌株，包括具有相同ST的菌株，清楚地显示出采用cgMLST大大增强了常规MLST分析中的分辨率。
gMLST为全基因组多位点序列分型(Genome Multilocus Sequence Typing)，是多位点序列分型MLST的拓展方法，与MLST只选择数个保守基因不同，gMLST 技术以大量菌株为基础的核心基因组作为序列分型标记。在多种菌株分型方法中，gMLST的标记位点最多且密度最高，因此该技术对菌株之间的细微变异也更为敏感。与其他常用的分型标记相比，gMLST的高密度标记可以将菌株分型鉴定的分辨率提高到克隆级别，相比16S rDNA的种级别和常规7位点MLST的支系级别，分辨率有极大的提升。因此，gMLST分型技术作为一种高精度的物种分型和进化研究工具，对于常见的菌株进化和流行病学研究有着非常重要的意义。gMLST构建高分辨率的物种分型结果可以提供目标菌株的权威核心基因列表，对测序菌株进行序列分型和菌种鉴定，对传染病的爆发时间进行解释、预测和印证，分析目标菌种的群体结构和遗传进化规律，进而为疾病的预防和控制提供数据基础。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种基于gMLST技术的沙门氏菌溯源分型的方法及应用，该方法针对重要的食源性致病菌，如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌或副溶血性弧菌等，建立沙门氏菌全基因组多位点序列分型技术，用于流行病学溯源，进而将此方法推广到食源性致病菌的溯源。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种基于gMLST技术的沙门氏菌溯源分型的方法，步骤如下：
⑴沙门氏菌的分离鉴定：
按照国标4789.4-2016，采集同一地区40份以上的肉类样品，进行沙门氏菌的分离鉴定，2株参考菌株为标准菌株，为肠炎沙门氏菌ATCC9184、伤寒沙门氏菌CMCC 50071；
⑵DNA提取、含量检测：
提取肉类样品中分离得到的沙门氏菌样品的DNA，将提取好的DNA放在冰上融化后，吹打混匀离心待检测；采用琼脂糖凝胶电泳检测样品的完整性，用于构建DNA文库；
⑶全基因组测序及g MLST分型
①全基因组测序：对细菌基因组de novo进行测序，用检测合格的样品构建文库，采用超声法将大片段DNA随机打断并产生短的DNA片段，然后将打断形成的粘性末端修复成平末端，再通过3‘端加碱基A，使得DNA片段能与3‘端带有T碱基特殊接头连接，用电泳法选择需回收的目的连接产物，再使用PCR 扩增两端带有接头的DNA片段；最后用合格的文库进行cluster制备和测序；
②基因组预估：基于illumina数据，通过K-mer分析初步判断样品的基因组大小、杂合情况和重复序列信息；
③基因组组装：使用SOAP denovo短序列组装软件对Clean Data进行组装，获得各样品最优组装结果；然后将reads比对回组装获得的Contig上，再根据 reads的paired-end和overlap关系，对组装结果进行局部组装和优化；
④基因组组分分析及基因预测：获得样品组装序列后，对样品中各功能元件进行预测，蛋白编码基因使用Glimmer3和Prokka软件进行预测；同时对tRNA 和rRNA进行预测；
⑤基因功能分析：预测出基因后，对基因进行数据库比对注释；
⑥比较基因组分析：基于测序样品的基因组序列，同参考序列进行比较，分析测序样品与参考基因的差异及亲缘关系；
⑷MLST分型
根据全基因组测序结果分析7个管家基因aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、 suc A、thrA，每株菌的7个位点组合获得一个ST型别，然后通过Eburst对沙门氏菌分离株进行亲缘关系分析；
⑸耐药基因分析和毒力基因分析
基于沙门氏菌的全基因组测序结果，对耐药基因进行分析；
采用毒力因子数据库数据库对毒力岛基因、侵袭基因InvA\InvF、细胞致死膨胀素cdtB、毒力基因spvB进行分析；
⑹进化树分析
基于全基因组gMLST分型构建系统进化树，系统发生树是表明被认为具有共同祖先的各物种相互间演化关系的树，它用来表示系统发生研究的结果，用它描述物种之间的进化关系。
而且，所述步骤⑴中地区为中国北京地区。
而且，所述步骤⑵中琼脂糖凝胶电泳的条件为：胶浓度1％；电压150V，电泳时间40min。
而且，所述步骤⑶中采用illumina平台对沙门氏菌进行测序。
而且，所述步骤⑶④中功能元件包括基因成分、重复序列、基因岛。
而且，所述步骤⑷中Eburst为http：//eburst.mlst.net。
而且，所述步骤⑸中耐药基因分析使用抗性基因数据库CARD分析，具体为：在CARD数据库网站，点击Analyze选项可进入耐药基因预测界面，耐药基因预测分析通过选择BLAST和RG两种模式来实现；将序列与CARD参考序列进行比对，获得注释信息。
而且，所述步骤⑸中耐药基因包括氨基糖苷类、β-Lactarn内酰胺类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类、喹诺酮类；
所述步骤⑸中毒力岛基因包括sopE、sptB、sseA/B/CD、mgtC、sopB、sopD、 soxR。
而且，所述步骤⑹中采用MEGA5.0软件制作系统进化树。
如上所述的基于gMLST技术的沙门氏菌溯源分型的方法在食源性致病菌的溯源方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明针对重要的食源性致病菌，如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌或副溶血性弧菌等，建立沙门氏菌全基因组多位点序列分型技术，用于流行病学溯源，进而将此方法推广到食源性致病菌的溯源。利用gMLST技术，通过全基因组测序对食品中不同致病菌基因型进行分析，判断其污染来源，建立食品中食源性致病菌溯源体系。
2、通过调查研究北京地区肉类中沙门氏菌的污染状况，我们基于全基因组测序gMLST分析其耐药性和致病性，发现耐药基因分析结果与耐药表型相关，其中β-Lactamase耐药基因与其耐药表型的相关性较高，为监控北京地区的沙门氏菌耐药基因和毒力基因的传播方式提供一定的理论基础。
3、本发明基于gMLST技术将实现食源性致病菌的高通量快速分析，将有助于我们在食品中食源性致病菌溯源分型技术上开发一种新的方法，建立一整套食源性致病菌的快速溯源机制，进而对污染情况进行调查分析，具有很强的创新性。
4、gMLST(Genome multilocus sequence typing，gMLST)是全基因组多位点序列分型技术，是一种基于MLST技术的分子生物学分析方法。gMLST技术以现有MLST数据为基础，在构建核心基因组和分型的过程中，一方面确保已有 MLST管家基因存在于核心基因集合中，另一方面将构建获得的最小生成树与已有数据进行比对，保证了分型结果的一致性，其严格的流程确认，保证核心基因集合最终结果的权威型和可靠性。它结合了高通量序列测定和生物信息学的方法，具有高的分辨率，能够反映细菌群体的变异进化，为整体流行病的监测和微生物分型、进化的基础研究提供了一种简便可行的方法。
5、gMLST全基因组多位点序列分型方法具有较高的分辨能力，可分析不同时间和不同地区临床分离株的遗传相关性，并通过国际互联网对致病菌株在全球范围内的传播和分布情况进行监控，还能长期追踪和不断补充完善该菌株的进化亲缘关系树。gMLST构建高分辨率的物种分型结果可以提供目标菌株的权威核心基因列表，对测序菌株进行序列分型和菌种鉴定，对传染病的爆发时间进行解释、预测和印证，分析目标菌种的群体结构和遗传进化规律，进而为疾病的预防和控制提供数据基础。
附图说明
图1为本发明方法的一种工艺流程图；
图2为本发明中的一种系统进化树；
图3琼脂糖凝胶电泳图谱检测DNA图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
一种基于gMLST技术的沙门氏菌溯源分型的方法，步骤如下：
⑴沙门氏菌的分离鉴定：
按照国标4789.4-2016，采集同一地区40份以上的肉类样品，进行沙门氏菌的分离鉴定，2株参考菌株为标准菌株，为肠炎沙门氏菌ATCC9184、伤寒沙门氏菌CMCC 50071；
⑵DNA提取、含量检测：
提取肉类样品中分离得到的沙门氏菌样品的DNA，将提取好的DNA放在冰上融化后，吹打混匀离心待检测；采用琼脂糖凝胶电泳检测样品的完整性，用于构建DNA文库；
⑶全基因组测序及g MLST分型
①全基因组测序：对细菌基因组de novo进行测序，用检测合格的样品构建文库，采用超声法将大片段DNA随机打断并产生短的DNA片段，然后将打断形成的粘性末端修复成平末端，再通过3‘端加碱基A，使得DNA片段能与3‘端带有T碱基特殊接头连接，用电泳法选择需回收的目的连接产物，再使用PCR 扩增两端带有接头的DNA片段；最后用合格的文库进行cluster制备和测序；
②基因组预估：基于illumina数据，通过K-mer分析初步判断样品的基因组大小、杂合情况和重复序列信息；
③基因组组装：使用SOAP denovo短序列组装软件对Clean Data进行组装，获得各样品最优组装结果；然后将reads比对回组装获得的Contig上，再根据 reads的paired-end和overlap关系，对组装结果进行局部组装和优化；
④基因组组分分析及基因预测：获得样品组装序列后，对样品中各功能元件进行预测，蛋白编码基因使用Glimmer3和Prokka软件进行预测；同时对tRNA 和rRNA进行预测；
⑤基因功能分析：预测出基因后，对基因进行数据库比对注释；
⑥比较基因组分析：基于测序样品的基因组序列，同参考序列进行比较，分析测序样品与参考基因的差异及亲缘关系；
⑷MLST分型
根据全基因组测序结果分析7个管家基因aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、 suc A、thrA，每株菌的7个位点组合获得一个ST型别，然后通过Eburst对沙门氏菌分离株进行亲缘关系分析；
⑸耐药基因分析和毒力基因分析
基于沙门氏菌的全基因组测序结果，对耐药基因进行分析；
采用毒力因子数据库数据库对毒力岛基因、侵袭基因InvA\InvF、细胞致死膨胀素cdtB、毒力基因spvB进行分析；
⑹进化树分析
基于全基因组gMLST分型构建系统进化树，系统发生树是表明被认为具有共同祖先的各物种相互间演化关系的树，它用来表示系统发生研究的结果，用它描述物种之间的进化关系。
较优地，所述步骤⑴中地区为中国北京地区。
较优地，所述步骤⑵中琼脂糖凝胶电泳的条件为：胶浓度1％；电压150V，电泳时间40min。
较优地，所述步骤⑶中采用illumina平台对沙门氏菌进行测序。
较优地，所述步骤⑶④中功能元件包括基因成分、重复序列、基因岛。
较优地，所述步骤⑷中Eburst为http：//eburst.mlst.net。
较优地，所述步骤⑸中耐药基因分析使用抗性基因数据库CARD分析，具体为：在CARD数据库网站，点击Analyze选项可进入耐药基因预测界面，耐药基因预测分析通过选择BLAST和RG两种模式来实现；将序列与CARD参考序列进行比对，获得注释信息。
较优地，所述步骤⑸中耐药基因包括氨基糖苷类、β-Lactarn内酰胺类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类、喹诺酮类；
所述步骤⑸中毒力岛基因包括sopE、sptB、sseA/B/CD、mgtC、sopB、sopD、 soxR。
较优地，所述步骤⑹中采用MEGA5.0软件制作系统进化树。
如上所述的基于gMLST技术的沙门氏菌溯源分型的方法在食源性致病菌的溯源方面中的应用。
实施例2
一种基于gMLST技术的沙门氏菌溯源分型的方法，步骤如下：(一)沙门氏菌的分离鉴定。
按照国标4789.4-2016，将北京地区采集的285份肉类样品进行分离鉴定并保存菌株。2株参考菌株标准菌株为肠炎沙门氏菌ATCC9184、伤寒沙门氏菌 CMCC 50071(美国ATCC菌种保藏中心)
(二)DNA提取、含量检测。
按照DNA提取试剂盒的提取步骤，把40个样品提取好的DNA放在冰上融化后，吹打混匀离心待检测。采用琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1％；电压150V，电泳时间40min)检测样品的完整性，用于构建DNA文库。
(三)全基因组测序及g MLST分型
(1)全基因组测序：细菌基因组de novo测序。采用illumina平台对上述沙门氏菌进行测序。用上述检测合格的样品构建文库，采用超声法将大片段DNA 随机打断并产生某种长度的DNA片段，然后用T4 DNA聚合酶等将打断形成的粘性末端修复成平末端，再通过3‘端加碱基A,使得DNA片段能与3‘端带有“T”碱基特殊接头连接，用电泳法选择需回收的目的连接产物，再使用PCR扩增两端带有接头的DNA片段；最后用合格的文库进行cluster制备和测序。
(2)基因组预估：基于illumina数据，通过K-mer分析初步判断样品的基因组大小、杂合情况和重复序列信息。
(3)基因组组装：使用SOAP denovo短序列组装软件对Clean Data进行组装，获得各样品最优组装结果；然后将reads比对回组装获得的Contig上，再根据reads的paired-end和overlap关系，对组装结果进行局部组装和优化。
(4)基因组组分分析及基因预测：获得样品组装序列后，对样品中各功能元件进行预测，包括基因成分、重复序列、基因岛等。蛋白编码基因使用Glimmer3 和Prokka软件进行预测；同时对tRNA和rRNA进行预测。
(5)基因功能分析：预测出基因后，对基因进行数据库比对注释。
(6)比较基因组分析：基于测序样品的基因组序列，同参考序列进行比较，分析测序样品与参考基因的差异及亲缘关系。
(四)MLST分型
根据全基因组测序结果分析7个管家基因(aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、 suc A、thrA),每株菌的7个位点组合获得一个ST型别。然后通过Eburst(http： //eburst.mlst.net)对沙门氏菌分离株进行亲缘关系分析。
(五)耐药基因分析和毒力基因分析
基于38株沙门氏菌的全基因组测序结果，耐药基因分析使用抗性基因数据库CARD(the Comprehensive Antibiotic Research Database)分析。在CARD数据库网站，点击Analyze选项可进入耐药基因预测界面。耐药基因预测分析可通过选择BLAST和RGI(Resistance Gene Identifier)两种模式来实现。将序列与CARD 参考序列进行比对，获得相关的注释信息。包括氨基糖苷类、β-Lactarn内酰胺类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类、喹诺酮类等耐药基因。
采用毒力因子数据库(virulence Factors Database,VFDB)数据库对毒力岛(Salmonella pathogenicity islands,SPI)基因包括sopE、sptB、sseA/B/CD、mgtC、 sopB、sopD、soxR等基因及侵袭基因InvA\InvF、细胞致死膨胀素cdtB、毒力基因spvB等进行分析。
(六)进化树分析
基于全基因组gMLST分型构建系统进化树。系统发生树(phylogenetic tree) 是表明被认为具有共同祖先的各物种相互间演化关系的树。它用来表示系统发生研究的结果，用它描述物种之间的进化关系。用MEGA5.0软件制作系统进化树。
本发明的相关检测及结果：
1、北京地区肉类中沙门氏菌污染情况调查
按照国标GB4789.4-2016对2017年4月到6月北京地区采集的285份样品进行检测，共检出阳性样品38份，分别来自鸡源、鸭源和猪源，平均污染率为 13.3％(13/285)。阳性菌株中鸡源占65.8％，鸭源占28.9％，猪源占5.3％。
2、DNA完整性检测
琼脂糖凝胶电泳图谱见图3，以33号-40号样品为例。
分析：40株样品DNA完整性使用琼脂糖凝胶电泳法检测，所有检测条带均位于20000bp左右。因此，所有DNA样品均合格可用于构建DNA文库。
3、全基因组测序分析结果
全基因组测序使用第二代高通量测序技术，采用Illumina测序平台。原始数据经过去除adapter污染、去除duplication污染等处理后，菌株的测序Reads 读长为150:150bp，测序的平均深度为100X，即基因组上的每个位点都有100 条reads支持。
基于全基因组测序结果，采用Prokka软件进行基因预测，38株沙门氏菌共获得8个基因型(如表1所示)。全基因组测序分型以肠炎沙门氏菌为优势型，有17株，占所有菌株的44.73％；其次是鼠伤寒沙门氏菌，共14株，丰度达 36.84％。通过系统进化树可以看出，全基因组测序分型获得的肠炎沙门氏菌与标准菌株ATCC9184亲缘关系较近，可能来源于同一始祖菌(如图2所示)。
表1 38株沙门氏菌全基因组分型结果
Figure RE-GDA0002286318740000121
4、沙门氏菌MLST分型结果
38株沙门氏菌MLST分型结果，共获得11个ST型，结果见表2、表3。其中获得优势的ST型为ST11，有16株占42.1％，其次为ST19，有8株，占21.1％。其中ST11与ST78标准菌株的7个管家基因中，5个基因完全相同，亲缘关系较近，均为肠炎沙门氏菌；ST19与ST34的7个管家基因中，5个基因完全相同，亲缘关系较近，均为鼠伤寒沙门氏菌。
根据MLST分型结果构建系统进化树(如图2所示)，ST19与ST34亲缘关系较近，ST241和ST96亲缘关系较近。标准菌株9184为ST 78与ST11亲缘关系较近。
表2沙门氏菌MLST管家基因的结果统计
Figure RE-GDA0002286318740000122
Figure RE-GDA0002286318740000131
分析：40株沙门氏菌中，共产生13种型别，其中ST 11占40％，ST19占 20％。
其中ST11与ST78标准菌株的7个管家基因中，5个基因完全相同，亲缘关系较近，均为肠炎沙门氏菌；ST19与ST34的7个管家基因中，5个基因完全相同，亲缘关系较近，均为鼠伤寒沙门氏菌。
表3 38株沙门氏菌MLST分型结果
5、沙门氏菌耐药性分析
选取氨基糖苷类、氯霉素类、β-内酰胺类、大环内酯类对38株分离株进行药敏检测，其中13株对3种及3种以上抗生素表现出多重耐药(见表4)。使用抗生素氨苄西林和萘啶酸，17株肠炎沙门氏菌产生的耐药性高达75％和93.8％；萘啶酸对于鸡源鼠伤寒沙门氏菌的耐药性甚至达100％。仅一株鸭源的鼠伤寒沙门氏菌对氨苄西林产生耐药性；猪源的鼠伤寒沙门氏菌仅对四环素产生耐药性。其中1株胥伐成格隆沙门氏菌，耐药情况很严重，对10种抗生素均产生耐药性。
表4 38株沙门菌株名称及耐药表型
Figure RE-GDA0002286318740000141
对38株沙门氏菌进行15种抗生素耐药性检测，其中34.2％为多重耐药株， 68.4％的沙门氏菌对喹诺酮萘啶酸耐药，42.1％分离株对氨苄西林耐药。肠炎沙门氏菌中47.1％分离株对3种及3种以上抗生素耐药，21.4％鼠伤寒沙门氏菌对3种及3种以上抗生素耐药(如表5所示)。
表5多重耐药情况统计表
Figure RE-GDA0002286318740000151
6、耐药基因分析
表6 38株沙门氏菌耐药基因分析
Figure RE-GDA0002286318740000152
Figure RE-GDA0002286318740000161
通过耐药基因分析发现38株沙门氏菌中均携带有aaC(6')、pbp、Acr(A)、 Acr(B)、tet(B)、AcrEF、EmrAB、NorR基因。其中18株分离菌携带氨基糖苷类aacC(3')基因，阳性率为47.37％；38株沙门氏菌有15株携带β-Lactarn内酰胺类bla-tem耐药基因，阳性率为42.1％；3株携带bla-CTX-M-1，阳性率7.9％； 3株携带bla-oxa-1，阳性率7.9％；氨基糖苷类aacC(3')、aaC(6')耐药基因主要分布于肠炎沙门氏菌，分别占66.7％，和44.7％；17株肠炎沙门氏菌，其中9 株携带β-Lactarn内酰胺类BlaTEM耐药基因，高达56.3％。氯霉素类cat耐药基因也主要分布于肠炎沙门氏菌(63.6％，14/22)。
全基因组耐药基因分析表明AadA1、blaCTX-M-1、blaToho-1、CmlA1是胥伐成格隆沙门菌特有的耐药基因，与其多重耐药性有关，同时它携带aaC(6')、pbp、 tet(B)、tet(C)、BlaTEM、Sul2、Sul3，这些耐药基因分别与β-内酰胺类药物、喹诺酮类药物、氨基糖苷类药物和四环素类药物的耐药性形成有关。该胥伐成格隆沙门菌分别对氨苄西林、舒巴坦、四环素类、β-内酰胺类、喹诺酮、氯霉素类、头孢西丁、头孢唑林、磺胺、环丙沙星10种抗生素耐药。因此我们推测全基因组基因分析与耐药表型具有一定的关联性。
其他外排基因OqxB9是汤卜逊沙门菌特有的外排基因，可能与其多重耐药性有关，同时它携带aaC(6')、pbp、BlaTEM、Sul2、Sul3、cat等耐药性基因，对氨苄西林、舒巴坦、头孢噻肟、头孢西丁、头孢唑林、磺胺6种抗生素耐药与耐药基因分析结果相一致。与全基因组分型相比，耐药表型分布较为分散，多重耐药菌株聚类于肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、胥伐成格隆沙门菌、汤卜逊沙门菌。
综上，结果表明全基因组耐药基因分析结果与耐药表型相关，其中β-Lactamase耐药基因与其耐药表型的相关性较高。β-Lactamase内酰胺酶基因和氨基糖苷类耐药基因多数存在于基因岛SGI，可以导致耐药基因在不同种属之间传播。肠炎沙门氏菌主要携带blaTEM耐药基因，而胥伐成格隆沙门菌同时携带blaCTX-M-1、blaToho-1、blaoxa-1，它们都编码β-内酰胺酶，可使β-Lactamase内酰胺酶类开环灭活，导致多重耐药的产生。与表型结果类似，不同血清型携带的耐药基因不同，可能由于不同菌株的耐药压力不同，而导致耐药基因的产生及传播方式不同。
7.毒力基因分析
表7 38株沙门氏菌毒力基因分析
分析：将38株沙门氏菌进行全基因组重测序，选用VFDB数据库对菌株毒力岛(Salmonella pathogenicity islands,SPI)SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5 进行分析，发现除sopE、sopE2外其余致病岛基因均为保守基因。60％肠炎沙门氏菌携带sopE，36％鼠伤寒氏菌携带sopE。肠炎沙门氏菌中41.6％的菌株携带sopE2，鼠伤寒沙门氏菌中33.3％的菌株携带sopE2。
本发明中38株沙门氏菌均携带有SPI1-SPI5代表性基因和调节基因，提示这些菌株都携带毒力岛SPI1-SPI5，它们是沙门氏菌具有高致病力的分子基础。 38株沙门菌株中，63.2％菌株含有毒性质粒spvB基因。肠炎沙门氏菌携带spvB 基因的高达82.4％、鼠伤寒沙门氏菌携带毒力基因spvB的占71.4％。分析结果表明胥伐成格隆沙门氏菌与肠炎沙门氏菌明显不同，两株胥伐成格隆沙门氏菌均未携带质粒毒力基因spvB、pefA、prot6E，反应出基因型差别对携带毒力基因的影响。在我国胥伐成格隆沙门氏菌携带毒力基因的研究比较少见。有些毒力因子可以直接产生毒素，如细胞致死膨胀毒素CdtB(Cytolethal distendingtoxin B)。分析结果表明细胞致死膨胀毒素CdtB、百日咳毒素亚基是胥伐成格隆沙门氏菌普遍存在的致病基因。百日咳类毒素(pertussis-like toxins)PltA在胥伐成格隆沙门氏菌中也普遍存在。
8、系统发育树
基于全基因组序列构建系统进化树。用MEGA5.0软件制作系统进化树。如图2所示。
8、讨论
本发明中，2017年4月至6月调查北京地区肉类中沙门氏菌的污染分布情况，污染率达13.3％。近年来国内外由沙门氏菌导致人体感染并爆发感染病例逐年上升，因此进一步加强监控食品显得尤为重要。
在北京地区，调查发现分离的阳性菌株中肠炎沙门氏菌大多属于鸡源，鼠伤寒沙门氏菌大多属于鸭源，德尔卑沙门氏菌主要来源于猪。研究结果与国内外一些报告相似。全基因组测序分型gMLST在流行病学分子溯源中表明，相同的分型表明来源于同一始祖菌。全基因组分型结果表明，88.2％的肠炎沙门氏菌与标准菌株ATCC9184亲缘关系较近，可能来源于同一始祖菌。38株沙门氏菌中，不同来源的沙门氏菌中优势菌株为鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌。它们是急性肠胃炎的主要病原菌之一，其宿主范围十分广泛，监管部门应加强对这两类沙门氏菌的控制，降低其污染程度。
研究表明沙门氏菌的耐药表型、致病性都与毒力基因相关。全基因组测序已经鉴定出多个毒力基因，包括菌毛粘附类因子、调节因子、毒力岛、质粒上的毒性基因、毒素等。
在沙门菌感染最初阶段是由毒力岛SPI-1控制的，可使病原菌入侵肠上皮细胞，引发炎症反应。一旦病原菌进入宿主巨噬细胞并在细胞内扩散增殖，毒力岛SPI-2上的相应基因可以表达。SPI-2Ⅲ型分泌系统编码sseL，可阻止宿主细胞中的免疫细胞迁移，减弱宿主清除细菌的能力，从而使细菌在体内持续慢性感染。SPI-3和SPI-4对沙门菌在膜性结构内存活和黏附在极化细胞的表面发挥重要作用。SPI-3编码10个开放式阅读框，其中mgtC与宿主的吞噬细胞的毒力相关。SPI-5为SPI-1和SPI-2分泌效应蛋白。SopB位于SPI-5，至感染后期，SopB控制SCV的运输，抑制其被溶酶体水解。侵袭基因和菌毛粘附决定子类毒性因子等在沙门氏菌中普遍存在。
本次调查中，38株沙门氏菌最常见的抗性基因属于青霉素(青霉素结合蛋白pbp基因)，氨基糖苷类aac(6)，氯霉素类Acr(A)和Acr(B)，四环素类tet (A)和tet(B)抗性相关的基因组。国外研究表明动物体分离的沙门氏菌中，最常见的β-内酰胺酶基因是BlaTEM-1和blaPSE-1编码对氨苄青霉素的抗性。目前全球已检测到其他β-内酰胺酶，包括bla TEM，blaCTX-M，blaIMP，bla VIM，bla KPC，bla SHV和blaOXA，这些基因的变异可编码超广谱β-内酰胺酶(ESBL)或碳青霉烯酶活性]。本发明发现1株胥伐成格隆沙门菌同时携带blaCTX-M-1、blaToho-1、blaoxa-1、 blaTEM，推测其编码超广谱β-内酰胺酶(ESBL)，从而导致多重耐药表型的产生。
在沙门氏菌中，cdtB、pltA、pltB基因编码组成细胞膨胀毒素CDT。国内外很多研究表明百日咳类毒素(pertussis-like toxins)PltA和PltB将代替CdtA和CdtC 发挥作用，由于它们在部分沙门氏菌亚种中会缺失。本发明发现cdtB基因在2 株胥伐成格隆沙门氏菌中均为阳性，因此推测在胥伐成格隆沙门菌普遍携带细胞膨胀毒素CDT。在NTS中，胥伐成格隆沙门菌原本是感染人体少见的血清型，但近年来数据显示该血清型已经在许多国家成为引起人沙门菌病及食源性疾病的主要病原菌之一。胥伐成格隆沙门氏菌在国内较少出现，仅在台湾地区出现为主要流行的血清型之一。台湾有关研究显示鸡肉、鸡内脏、零售鸡肉以及屠宰场和屠宰用具中胥伐成格隆沙门菌的发现率越来越高。此次胥伐成格隆沙门氏菌均从鸡大胸中分离产生，来源物种与台湾地区保持一致。其中一株为多重耐药株，耐药情况十分严重。除了对青霉素类和头孢菌素类耐药外，对喹诺酮类药物出现严重的耐药情况。如环丙沙星，兽医在临床上已经大量使用该药物，推测是导致抗生素耐药性不断增强从而导致多重耐药菌株出现的重要因素。抗生素滥用导致细菌选择压力增大，进而导致超级耐药菌的出现，需引起相关部门高度重视，规范抗生素的使用范围，避免其多重耐药菌株的产生迫在眉睫。
本发明分离的沙门氏菌对氨苄西林、喹诺酮表现出高耐药率。2010年王宇等发现上海市疾控分离的汤卜逊沙门菌对四环素、奥格西丁、氨苄西林、氯霉素、萘啶酸、磺胺异恶唑6种抗生素耐药。本次调查发现1株汤卜逊沙门菌对氨苄西林、舒巴坦、头孢西丁、头孢噻肟、头孢唑林、磺胺6种抗生素耐药。某种程度上几乎超过了超级细菌DT104鼠伤寒沙门氏菌的耐药性。分析原因可能是国内外畜禽等养殖者对抗生素的滥用导致某些沙门氏菌型为适应生态环境而改变，从而获得耐药基因的改造。这种突变的菌株是否可以形成稳定的克隆株急需网络化监控体系China PulseNet进行系统深入的研究。
综上所述，通过调查研究北京地区肉类中沙门氏菌的污染状况，基于全基因组测序gMLST分析其耐药性和致病性，发现耐药基因分析结果与耐药表型相关，其中β-Lactamase耐药基因与其耐药表型的相关性较高，为监控北京地区的沙门氏菌耐药基因和毒力基因的传播方式提供一定的理论基础。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

Claims (10)

1.一种基于gMLST技术的沙门氏菌溯源分型的方法，其特征在于：步骤如下：
⑴沙门氏菌的分离鉴定：
按照国标4789.4-2016，采集同一地区40份以上的肉类样品，进行沙门氏菌的分离鉴定，2株参考菌株为标准菌株，为肠炎沙门氏菌ATCC9184、伤寒沙门氏菌CMCC 50071；
⑵DNA提取、含量检测：
提取肉类样品中分离得到的沙门氏菌样品的DNA，将提取好的DNA放在冰上融化后，吹打混匀离心待检测；采用琼脂糖凝胶电泳检测样品的完整性，用于构建DNA文库；
⑶全基因组测序及g MLST分型
①全基因组测序：对细菌基因组de novo进行测序，用检测合格的样品构建文库，采用超声法将大片段DNA随机打断并产生短的DNA片段，然后将打断形成的粘性末端修复成平末端，再通过3‘端加碱基A，使得DNA片段能与3‘端带有T碱基特殊接头连接，用电泳法选择需回收的目的连接产物，再使用PCR扩增两端带有接头的DNA片段；最后用合格的文库进行cluster制备和测序；
②基因组预估：基于illumina数据，通过K-mer分析初步判断样品的基因组大小、杂合情况和重复序列信息；
③基因组组装：使用SOAP denovo短序列组装软件对Clean Data进行组装，获得各样品最优组装结果；然后将reads比对回组装获得的Contig上，再根据reads的paired-end和overlap关系，对组装结果进行局部组装和优化；
④基因组组分分析及基因预测：获得样品组装序列后，对样品中各功能元件进行预测，蛋白编码基因使用Glimmer3和Prokka软件进行预测；同时对tRNA和rRNA进行预测；
⑤基因功能分析：预测出基因后，对基因进行数据库比对注释；
⑥比较基因组分析：基于测序样品的基因组序列，同参考序列进行比较，分析测序样品与参考基因的差异及亲缘关系；
⑷MLST分型
根据全基因组测序结果分析7个管家基因aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA、thrA，每株菌的7个位点组合获得一个ST型别，然后通过Eburst对沙门氏菌分离株进行亲缘关系分析；
⑸耐药基因分析和毒力基因分析
基于沙门氏菌的全基因组测序结果，对耐药基因进行分析；
采用毒力因子数据库数据库对毒力岛基因、侵袭基因InvA\InvF、细胞致死膨胀素cdtB、毒力基因spvB进行分析；
⑹进化树分析
基于全基因组gMLST分型构建系统进化树，系统发生树是表明被认为具有共同祖先的各物种相互间演化关系的树，它用来表示系统发生研究的结果，用它描述物种之间的进化关系。
2.根据权利要求1所述的基于gMLST技术的沙门氏菌溯源分型的方法，其特征在于：所述步骤⑴中地区为中国北京地区。
3.根据权利要求1所述的基于gMLST技术的沙门氏菌溯源分型的方法，其特征在于：所述步骤⑵中琼脂糖凝胶电泳的条件为：胶浓度1％；电压150V，电泳时间40min。
4.根据权利要求1所述的基于gMLST技术的沙门氏菌溯源分型的方法，其特征在于：所述步骤⑶中采用illumina平台对沙门氏菌进行测序。
5.根据权利要求1所述的基于gMLST技术的沙门氏菌溯源分型的方法，其特征在于：所述步骤⑶④中功能元件包括基因成分、重复序列、基因岛。
6.根据权利要求1所述的基于gMLST技术的沙门氏菌溯源分型的方法，其特征在于：所述步骤⑷中Eburst为http：//eburst.mlst.net。
7.根据权利要求1所述的基于gMLST技术的沙门氏菌溯源分型的方法，其特征在于：所述步骤⑸中耐药基因分析使用抗性基因数据库CARD分析，具体为：在CARD数据库网站，点击Analyze选项可进入耐药基因预测界面，耐药基因预测分析通过选择BLAST和RG两种模式来实现；将序列与CARD参考序列进行比对，获得注释信息。
8.根据权利要求1所述的基于gMLST技术的沙门氏菌溯源分型的方法，其特征在于：所述步骤⑸中耐药基因包括氨基糖苷类、β-Lactarn内酰胺类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类、喹诺酮类；
所述步骤⑸中毒力岛基因包括sopE、sptB、sseA/B/CD、mgtC、sopB、sopD、soxR。
9.根据权利要求1所述的基于gMLST技术的沙门氏菌溯源分型的方法，其特征在于：所述步骤⑹中采用MEGA5.0软件制作系统进化树。
10.如权利要求1至9任一项所述的基于gMLST技术的沙门氏菌溯源分型的方法在食源性致病菌的溯源方面中的应用。
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