CN114574606B - 检测宏基因组中结核分枝杆菌的引物组及高通量测序方法 - Google Patents

检测宏基因组中结核分枝杆菌的引物组及高通量测序方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测宏基因组中结核分枝杆菌的引物组，所述引物组包括至少36对引物组，每对所述引物对由正向引物与反向引物组成，所述引物对选自SEQIDNO：1～72所示核苷酸；所述核苷酸是结核分枝杆菌特异性基因IS6110引物组。本发明提供的检测宏基因组中结核分枝杆菌的引物组及高通量测序方法能够快速高效设计特异性引物，为鉴定出整个基因或者基因组的变异情况提供了高效方法。本发明的方法相较于传统mNGS方法，提高了结核分枝杆菌的检测灵敏度80倍以上。

Description

检测宏基因组中结核分枝杆菌的引物组及高通量测序方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种检测结核分枝杆菌的高通量测序的方法。
背景技术
结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)是引起结核病(TB)的致病菌，作为传染性疾病，通过患有活动性呼吸系统疾病的人的喉咙和肺部的飞沫在人与人之间传播的。流行病学研究发现，肺结核仍然是一种严重威胁人类健康的传染性疾病，特别是在中低收入国家。全球每年新增结核病例约有1000万例，其中死亡人数约有150万。
据WHO报告，2019年全球新发结核病约1000万例，约140万人死亡。而且结核病经常在学校等人员聚集地方发生并快速传播，加之结核分枝杆菌的耐药问题比较突出，患者医疗负担较重，防治任务十分艰巨。加大筛查力度，提高肺结核患者病原学阳性比例和治疗成功率，是解决结核病防治的关键。
目前仍有大量的结核分枝杆菌感染者由于缺乏病原学依据，使得临床诊断变得极为困难，而且很容易造成漏诊和误诊，从而导致结核病的广泛传播。传统方法学上，抗酸染色镜检和实验室培养是结核病原学检测最常用的方法，但总体上检出率较低，而且非常耗时耗力。近年来随着分子生物学和生物技术的发展，基于核酸扩增的检测技术不断涌现，如实时定量PCR、环介导等温扩增技术以及宏基因组测序(metagenomic next-generationsequencing，mNGS)，均具有快速、灵敏的特点，已被广泛使用以确定临床样本中结核分枝杆菌的存在。
近几年，精准医学在病原诊断方面也势头渐起。从1995年完成第一株流感嗜血杆菌全基因组测序后，当代医学对病原的基因研究如雨后春笋般涌现，对病原基因的认识也有了突飞猛进的进展。mNGS检测可以直接对临床标本中全部微生物的核酸进行高通量测序，通过微生物专用数据库比对和智能化算法分析，获得疑似致病微生物的种属信息，无偏性的检测细菌、真菌、病毒、寄生虫等各种病原体。然而，根据最新基因组学研究发现，这些诊断技术仍然存在诸多问题如灵敏度不足、不能鉴定出整个基因或者基因组的变异情况等问题。
发明内容
针对上述内容中所记载的技术问题中的一种，本发明提出了一种检测宏基因组中结核分枝杆菌的引物组及高通量测序方法，通过本发明的高通量引物设计方法能够获得多重基因特异性引物组，并设置基于mNGS检测结核分枝杆菌的建库方法，提高了结核分枝杆菌检测的灵敏性，而且能够鉴定出整个基因组。
第一方面，本发明提供了一种检测宏基因组中结核分枝杆菌的引物组，所述引物组包括至少36对引物组，每对所述引物对由正向引物与反向引物组成，所述引物对选自SEQID NO：1～72所示核苷酸；所述核苷酸是结核分枝杆菌特异性基因IS6110特异性引物组。
第二个方面，本发明提供了一种用于检测宏基因组中结核分枝杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述36对引物组。
第三个方面，本发明还提供了一种检测宏基因组中结核分枝杆菌高通量测序方法，所述高通量测序方法包括结核分枝杆菌特异性基因IS6110特异性引物组高通量设计方法和基于mNGS检测结核分枝杆菌的建库方法；所述结核分枝杆菌特异性基因IS6110特异性引物组高通量设计方法包括下载多重基因组、获取IS6110序列、高通量设计候选引物组和引物筛选。
具体地，本发明所述结核分枝杆菌特异性基因IS6110特异性引物组高通量设计方法包括如下步骤：
(1)下载多重基因组：从基因组数据库下载结核分枝杆菌的M1个基因组序列；所述100<M1<7000；
(2)获取IS6110序列：从下载的结核分枝杆菌基因组中利用同源比对获取IS6110序列，并将这些序列用MUSCLE进行多重比对；
(3)高通量设计候选引物组：将匹配好的多重基因组序列分割成有150-300nt重叠的300-500nt片段，在每个片段两端截取30-60nt作为引物设计区域，针对该引物设计区域遍历设计多个13～25nt的正向或者反向引物，组成该基因待合并引物组；将每个区域的合并引物组的所有引物按照出现频率排序，选择出现频率最高且不含不确定碱基的引物，删除与该引物序列相同的所有引物，对剩余的引物再次进行排序筛选，重复M2次后，得到候选引物组；所述2<M2<10；
(4)引物筛选：对候选引物组经过二次筛选，删除以下任意或者多个情况的引物：Tm值与平均值偏离达到2个标准差以上、可能形成自身二聚体或者交叉二聚体、存在5个以上的均聚物重复碱基，经过筛选后剔除得到最终多重基因引物组。
更加具体地，本发明所述高通量设计候选引物组是将匹配好的多重基因组序列分割成有200nt重叠的400nt片段，在每个片段两端截取50nt作为引物设计区域，针对该引物设计区域遍历设计多个15nt的正向或者反向引物，组成该基因待合并引物组。
具体的本发明一种基于mNGS检测结核分枝杆菌的建库方法，包括如下步骤：
(1)多重基因特异性引物组制备步骤：设计并筛选多重基因特异性引物步骤；
(2)PCR扩增：利用设计的多重基因特异性引物组进行多重PCR扩增；
(3)文库构建：对多重PCR产物进行文库构建；
(4)二代上机测序；
(5)数据分析与结果解读。
第四个方面，本发明提供了一种非诊断目的的检测结核分枝杆菌的方法，所述方法包括对上述得到的测序文库进行高通量测序获得测序数据，然后对所述测序数据进行分析以获取结核分枝杆菌检测结果。
通过实施本发明的技术方案，可以达到以下有益效果:
本发明提供的检测宏基因组中结核分枝杆菌的引物组及高通量测序方法能够快速高效设计特异性引物，为鉴定出整个基因或者基因组的变异情况提供了高效方法。
本发明的方法相较于传统方法，提高了结核分枝杆菌的检测灵敏度50倍以上。
附图说明
图1是本发明方法的IS6110引物设计流程图；
图2是本发明方法的PCR扩增示意图；
图2中：第一列是DNAmarker；第二列是空白对照；第三列是Sample 1；第四列是Sample 2；第五列是Sample 3；
具体实施方式
下面将结合说明书附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
结合以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可进一步地理解本发明的内容。
实施例一：结核分枝杆菌特异性基因IS6110特异性引物组高通量设计方法
结核分枝杆菌特异性基因IS6110特异性引物组高通量设计方法包括如下步骤：
(1)下载基因组：从基因组数据库下载结核分枝杆菌的M1个基因组序列；所述100<M1<7000；
(2)获取IS6110序列：从下载的结核分枝杆菌基因组中利用同源比对获取IS6110序列，并将这些序列用MUSCLE进行多重比对；
(3)高通量设计候选引物组：高通量设计候选引物组是将匹配好的多重基因组序列分割成有200nt重叠的400nt片段，在每个片段两端截取50nt作为引物设计区域，针对该引物设计区域遍历设计多个15nt的正向或者反向引物，组成该基因待合并引物组，流程图见图1；
(4)引物筛选：对候选引物组经过二次筛选，删除以下任意或者多个情况的引物：Tm值与平均值偏离达到2个标准差以上、可能形成自身二聚体或者交叉二聚体、存在5个以上的均聚物重复碱基，经过筛选后剔除得到最终多重基因引物组；
(5)结果与分析：对本实施例方法的设计的部分引物序列进行分析。
实施例二：结核分枝杆菌特异性基因IS6110特异性引物组高通量设计方法
和实施例一不同的是，本实施例高通量设计候选引物组将匹配好的多重基因组序列分割成有150nt重叠的300nt片段，在每个片段两端截取30nt作为引物设计区域，针对该引物设计区域遍历设计多个13nt的正向或者反向引物，组成该基因待合并引物组；将每个区域的合并引物组的所有引物按照出现频率从高到低进行排序，选择出现频率最高且不含不确定碱基的引物，删除与该引物序列相同的所有引物，对剩余的引物再次进行排序筛选，重复M2次后，得到候选引物组；所述2<M2<10。
实施例三：结核分枝杆菌特异性基因IS6110特异性引物组高通量设计方法
和实施例一不同的是，本实施例高通量设计候选引物组将匹配好的多重基因组序列分割成有300nt重叠的500nt片段，在每个片段两端截取60nt作为引物设计区域，针对该引物设计区域遍历设计多个25nt的正向或者反向引物，组成该基因待合并引物组；将每个区域的合并引物组的所有引物按照出现频率从高到低进行排序，选择出现频率最高且不含不确定碱基的引物，删除与该引物序列相同的所有引物，对剩余的引物再次进行排序筛选，重复M2次后，得到候选引物组；所述2<M2<10。
实施例四：本发明基于mNGS检测结核分枝杆菌的建库方法
本发明基于mNGS检测结核分枝杆菌的建库方法包括如下步骤：
(1)多重基因特异性引物组制备步骤：设计并筛选多重基因特异性引物步骤；
(2)PCR扩增：利用设计的多重基因特异性引物组进行多重PCR扩增；结果见图2；图中多个条带的原因在于IS6110的多拷贝数导致；
(3)文库构建：对多重PCR产物进行文库构建；本方法按照TruePrep Flexible DNALibrary Prep Kit for Illumina(Vazyme；货号：TD504)进行文库构建；
(4)二代上机测序；按照Illumina NextSeq 550Dx试剂盒操作指南(货号：20028870)进行上机测序；
(5)数据分析与结果解读：从下表1可以看出，本实施例方法设计的特异性引物可以稳定扩增并鉴定出结核分枝杆菌的特异性基因IS6110。
表1：本实施例基于mNGS检测结核分枝杆菌构建的文库数据分析和结果
样本名称 引物名称 总测序reads数 IS6110 reads数 IS6110 RPM
Sample 1 20For 8507905 1167953 137279
Sample 2 20Rev 6006226 1116272 1885852
Sample 3 20For+Rev 10301908 3467190 336558
实施例五：检测宏基因组中结核分枝杆菌的引物组
本实施例1所述的结核分枝杆菌特异性基因IS6110特异性引物组高通量设计方法获得所述引物组包括至少36对引物组，每对所述引物对由正向引物与反向引物组成，所述引物对选自SEQ ID NO：1～72所示核苷酸；所述核苷酸是结核分枝杆菌特异性基因IS6110特异性引物组。
具体如下表2所示
引物名称 序列 SEQ ID NO 引物名称 序列 SEQ ID NO
IS6110_13for1 GCCGGTCGAGCTC 1 IS6110_16for1 AGCGTGCTGGCCGGTC 37
IS6110_13for2 GGCTCCCGGTTGA 2 IS6110_16for2 GCGGCTGGGCTCCCGG 38
IS6110_13for3 CCCGGACAGGCCG 3 IS6110_16for3 GGTCCCGGACAGGCCG 39
IS6110_13for4 GGACCACCCGCGG 4 IS6110_16for4 ACTACGACCACATCAA 40
IS6110_13for5 GACCACATCAACC 5 IS6110_16for5 ACCCGCGGCAAAGCCC 41
IS6110_13rev1 GACAATGCACTAG 6 IS6110_16for6 ACAGGCCGAGGTTTGT 42
IS6110_13rev2 GGACCACGACCGA 7 IS6110_16rev1 GCGCAGGTCGATGCCG 43
IS6110_13rev3 GGGGTCATGTCAG 8 IS6110_16rev2 GTCGGTCGGAGCGGTC 44
IS6110_13rev4 TTCGACGGTGCAT 9 IS6110_16rev3 TTGGAAAGGATGGGGT 45
IS6110_13rev5 GGTGGATAACGTC 10 IS6110_16rev4 TCGATGTGTACTGAGA 46
IS6110_13rev6 CGGCACACCCAGC 11 IS6110_16rev5 CAGCTGTGTGCAGATC 47
IS6110_14for1 TGCTGGCCGGTCGA 12 IS6110_17for1 GTGCTGGCCGGTCGAGC 48
IS6110_14for2 CGGTTGATGTGGTC 13 IS6110_17for2 GCTGGGCTCCCGGTTGA 49
IS6110_14for3 CCCGGACAGGCCGA 14 IS6110_17for3 CCGGACAGGCCGAGTTT 50
IS611014for4 GACCACGATCGCTG 15 IS6110_17for4 CTACGACCACATCAACC 51
IS6110_14for5 ACCGGGAGCCCAGC 16 IS6110_17for5 GACCACCCGCGGCAAAG 52
IS6110_14for6 CGGTCGGAAGCTCC 17 IS6110_17for6 GGCCCGGACAGGCCGAG 53
IS6110_14rev1 AGGCGCAGGTCGAT 18 IS6110_17rev1 GGAGCGGTCGGAAGCTC 54
IS6110_14rev2 GGATGGGGTCATGT 19 IS6110_17rev2 GCGCAGGTCGATGCCGG 55
IS6110_14rev3 ATCGATGTGTACTG 20 IS6110_17rev3 GTCATGTCAGGTGGTTC 56
IS6110_14rev4 CTGTGTGCAGATCG 21 IS6110_17rev4 ACTGAGATCCCCTATCC 57
IS6110_14rev5 TTGGTCATCAGCCG 22 IS6110_17rev5 GGTCAGCTGTGTGCAGA 58
IS6110_14rev6 CCGCCCCGGCATGT 23 IS6110_17rev6 GAGTTTGGTCATCAGCC 59
IS6110_15for1 CCGGTTGATGTGGTC 24 IS6110_17rev7 TGAACCGCCCCGGCATG 60
IS6110_15for2 GCTGGCCGGTCGAGC 25 IS6110_17rev8 AACCGCCCCGGTGAGTC 61
IS6110_15for3 CCCGGACAGGCCGAG 26 IS6110_18for1 CTCCCGGTTGATGTGGTC 62
IS6110_15for4 CGGGACCACCCGCGG 27 IS6110_18for2 GTGCTGGCCGGTCGAGCT 63
IS6110_15for5 CTACGACCACATCAA 28 IS6110_18for3 CCGGACAGGCCGAGTTTG 64
IS6110_15for6 CCAGGCGCAGGTCGA 29 IS6110_18for4 CGGGACCACCCGCGGCAA 65
IS6110_15rev1 CGGAGCGGTCGGAAG 30 IS6110_18for5 AACCGGGAGCCCAGCCGC 66
IS6110_15rev2 GGGTCATGTCAGGTG 31 IS6110_18for6 GCCCGGACAGGCCGAGGT 67
IS6110_15rev3 GATGTGTACTGAGAT 32 IS6110_18rev1 GGTCGATGCCGGCGCACG 68
IS6110_15rev4 CATCAGCCGTTCGAC 33 IS6110_18rev2 AACCGTCGGTCGGAGCGG 69
IS6110_15rev5 ACCCAGCTCGGTCAG 34 IS6110_18rev3 CATGTCAGGTGGTTCATC 70
IS6110_15rev6 CCGGCATGTCCGGAG 35 IS6110_18rev4 CTATCCGTATGGTGGATA 71
IS6110_15rev7 CCCCGGTGAGTCCGG 36 IS6110_18rev5 ACACCCAGCTCGGTCAGC 72
实施例六：用于检测宏基因组中结核分枝杆菌的试剂盒
用实施例5宏基因组中结核分枝杆菌的引物组构建的用于检测宏基因组中结核分枝杆菌的试剂盒。
实施例七：检测宏基因组中结核分枝杆菌高通量测序方法
本实施例提供了一种高通量测序方法，包括结核分枝杆菌特异性基因IS6110特异性引物组高通量设计方法和基于mNGS检测结核分枝杆菌的建库方法；所述结核分枝杆菌特异性基因IS6110特异性引物组高通量设计方法包括下载多重基因组、获取IS6110序列、高通量设计候选引物组和引物筛选。
实施例八：结核分枝杆菌中IS6110的基因覆盖度分析
本发明针对IS6110单基因，利用samtools depth命令进行测序深度和覆盖度的计算，所得结果如下表3所示：
样本名称 引物名称 总测序reads数 IS6110 reads数 IS6110 RPM IS6110基因覆盖度
Sample 1 20For 8507905 1167953 137279 57％
Sample 2 20Rev 6006226 1116272 1885852 62％
Sample 3 20For+Rev 10301908 3467190 336558 68％
本实施例提供了利用本方法提供引物与分析方法所得IS6110基因的基因覆盖度数据，可以发现，本实施例方法可以基本覆盖50％以上的基因区域，最高可达68％，完全能满足高通量测序的需求。
实施例九：本方法与常规mNGS方法性能对比
通过运用本方法筛选到的引物组，我们对引物组合20for+rev进行了扩增，并且用常规mNGS进行对比，即不经过PCR扩增即开始二代建库。通过对测序数据进行分析后得到如下对比结果。我们发现，常规方法的RPM值虽然达到102以上，但是与本方法相比较，仍然存在一定的差异，性能综合对比后相差85.3倍。因此，本方法可以大幅提升结核分枝杆菌的检测灵敏度，为进一步的分子诊断提供优化依据。
Figure GDA0004090943750000091
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Figure GDA0004090943750000101
Figure GDA0004090943750000111
Figure GDA0004090943750000121
Figure GDA0004090943750000131
Figure GDA0004090943750000141
Figure GDA0004090943750000151
Figure GDA0004090943750000161
Figure GDA0004090943750000171
Figure GDA0004090943750000181
Figure GDA0004090943750000191
Figure GDA0004090943750000201
Figure GDA0004090943750000211
Figure GDA0004090943750000221
                         序列表
<120>  检测宏基因组中结核分枝杆菌的引物组及高通量测序方法
<140>  202210351201.0
<141>  2022-04-02
<160>  72
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  13
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  1
gccggtcgag ctc                                                     13
<210>  2
<211>  13
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  2
ggctcccggt tga                                                     13
<210>  3
<211>  13
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  3
cccggacagg ccg                                                     13
<210>  4
<211>  13
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  4
ggaccacccg cgg                                                     13
<210>  5
<211>  13
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  5
gaccacatca acc                                                     13
<210>  6
<211>  13
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  6
gacaatgcac tag                                                     13
<210>  7
<211>  13
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  7
ggaccacgac cga                                                     13
<210>  8
<211>  13
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  8
ggggtcatgt cag                                                     13
<210>  9
<211>  13
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  9
ttcgacggtg cat                                                     13
<210>  10
<211>  13
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  10
ggtggataac gtc                                                     13
<210>  11
<211>  13
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  11
cggcacaccc agc                                                     13
<210>  12
<211>  14
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  12
tgctggccgg tcga                                                    14
<210>  13
<211>  14
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  13
cggttgatgt ggtc                                                    14
<210>  14
<211>  14
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  14
cccggacagg ccga                                                    14
<210>  15
<211>  14
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  15
gaccacgatc gctg                                                    14
<210>  16
<211>  14
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  16
accgggagcc cagc                                                    14
<210>  17
<211>  14
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  17
cggtcggaag ctcc                                                    14
<210>  18
<211>  14
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  18
aggcgcaggt cgat                                                    14
<210>  19
<211>  14
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  19
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<210>  20
<211>  14
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  20
atcgatgtgt actg                                                    14
<210>  21
<211>  14
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  21
ctgtgtgcag atcg                                                    14
<210>  22
<211>  14
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  22
ttggtcatca gccg                                                    14
<210>  23
<211>  14
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  23
ccgccccggc atgt                                                    14
<210>  24
<211>  15
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  24
ccggttgatg tggtc                                                   15
<210>  25
<211>  15
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  25
gctggccggt cgagc                                                   15
<210>  26
<211>  15
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  26
cccggacagg ccgag                                                   15
<210>  27
<211>  15
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  27
cgggaccacc cgcgg                                                   15
<210>  28
<211>  15
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  28
ctacgaccac atcaa                                                   15
<210>  29
<211>  15
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  29
ccaggcgcag gtcga                                                   15
<210>  30
<211>  15
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  30
cggagcggtc ggaag                                                   15
<210>  31
<211>  15
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  31
gggtcatgtc aggtg                                                   15
<210>  32
<211>  15
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  32
gatgtgtact gagat                                                   15
<210>  33
<211>  15
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  33
catcagccgt tcgac                                                   15
<210>  34
<211>  15
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  34
acccagctcg gtcag                                                   15
<210>  35
<211>  15
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  35
ccggcatgtc cggag                                                   15
<210>  36
<211>  15
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  36
ccccggtgag tccgg                                                   15
<210>  37
<211>  16
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  37
agcgtgctgg ccggtc                                                  16
<210>  38
<211>  16
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  38
gcggctgggc tcccgg                                                  16
<210>  39
<211>  16
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  39
ggtcccggac aggccg                                                  16
<210>  40
<211>  16
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  40
actacgacca catcaa                                                  16
<210>  41
<211>  16
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  41
acccgcggca aagccc                                                  16
<210>  42
<211>  16
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  42
acaggccgag gtttgt                                                  16
<210>  43
<211>  16
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  43
gcgcaggtcg atgccg                                                  16
<210>  44
<211>  16
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  44
gtcggtcgga gcggtc                                                  16
<210>  45
<211>  16
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  45
ttggaaagga tggggt                                                  16
<210>  46
<211>  16
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  46
tcgatgtgta ctgaga                                                  16
<210>  47
<211>  15
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  47
cagctgtggc agatc                                                   15
<210>  48
<211>  17
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  48
gtgctggccg gtcgagc                                                 17
<210>  49
<211>  17
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  49
gctgggctcc cggttga                                                 17
<210>  50
<211>  17
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  50
ccggacaggc cgagttt                                                 17
<210>  51
<211>  17
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  51
ctacgaccac atcaacc                                                 17
<210>  52
<211>  17
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  52
gaccacccgc ggcaaag                                                 17
<210>  53
<211>  17
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  53
ggcccggaca ggccgag                                                 17
<210>  54
<211>  17
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  54
ggagcggtcg gaagctc                                                 17
<210>  55
<211>  17
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  55
gcgcaggtcg atgccgg                                                 17
<210>  56
<211>  17
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  56
gtcatgtcag gtggttc                                                 17
<210>  57
<211>  17
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  57
actgagatcc cctatcc                                                 17
<210>  58
<211>  17
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  58
ggtcagctgt gtgcaga                                                 17
<210>  59
<211>  17
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  59
gagtttggtc atcagcc                                                 17
<210>  60
<211>  17
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  60
tgaaccgccc cggcatg                                                 17
<210>  61
<211>  17
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  61
aaccgccccg gtgagtc                                                 17
<210>  62
<211>  18
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  62
ctcccggttg atgtggtc                                                18
<210>  63
<211>  18
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  63
gtgctggccg gtcgagct                                                18
<210>  64
<211>  18
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  64
ccggacaggc cgagtttg                                                18
<210>  65
<211>  18
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  65
cgggaccacc cgcggcaa                                                18
<210>  66
<211>  18
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  66
aaccgggagc ccagccgc                                                18
<210>  67
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<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  67
gcccggacag gccgaggt                                                18
<210>  68
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<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  68
ggtcgatgcc ggcgcacg                                                18
<210>  69
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<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  69
aaccgtcggt cggagcgg                                                18
<210>  70
<211>  18
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  70
catgtcaggt ggttcatc                                                18
<210>  71
<211>  18
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  71
ctatccgtat ggtggata                                                18
<210>  72
<211>  18
<212>  DNA
<213>  结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis complex)
<400>  72
acacccagct cggtcagc                                                18

Claims (3)

1.一种检测宏基因组中结核分枝杆菌的引物组，其特征在于，所述引物组由36对引物对组成，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO：1~72所示。
2.一种用于检测宏基因组中结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。
3.一种非诊断目的的检测结核分枝杆菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）利用如权利要求1所述的引物组进行多重PCR扩增；
（2）文库构建：对多重PCR产物进行文库构建；
（3）二代上机测序；
（4）数据分析与结果解读。
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