CN117070643A

CN117070643A - 与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的snp分子标记及其应用

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Publication number: CN117070643A
Application number: CN202311311450.8A
Authority: CN
Inventors: 丁家波; 何晓红; 武上杰; 蒋琳; 马月辉
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2023-10-11
Filing date: 2023-10-11
Publication date: 2023-11-17
Anticipated expiration: 2043-10-11
Also published as: CN117070643B

Abstract

本发明涉及分子标记辅助育种技术领域，具体涉及与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的SNP分子标记及其应用。本发明提供的与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的SNP分子标记含有如SEQ ID NO.1所示序列第101位的多态性为T/G的核苷酸序列。该SNP分子标记与绵羊布鲁氏菌病抗性性状显著相关，可用于绵羊布鲁氏菌病抗性的检测和分子标记辅助育种，在绵羊布鲁氏菌病抗性育种中具有较高的应用价值。

Description

与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记辅助育种技术领域，尤其涉及与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

布鲁氏菌病（brucellosis）是由布鲁氏菌（Brucella）所引起的动物源性传染病，是一种人畜共患病。布鲁氏菌病的临床症状包括波浪热、关节炎和繁殖障碍（公畜睾丸炎和附睾炎，母畜流产和不孕）等。动物机体通过先天免疫可清除大部分布鲁氏菌，淋巴系统在其中承担重要功能。布鲁氏菌具有免疫逃避和隐性感染的特性，其中羊种布鲁氏菌的毒力和感染性最强，不仅对绵羊养殖业造成巨大经济损失，还成为公共卫生的重大安全隐患。在宿主动物绵羊中挖掘与抗布鲁氏菌病性状相关的分子标记，并应用于辅助绵羊的抗病育种，对于抗布鲁氏菌病绵羊的育种以及布鲁氏菌病的防控具有重要意义。

发明内容

本发明提供与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的SNP分子标记及其应用。

本发明通过在萨福克、东佛里生、白萨福克和特克塞尔等不同品种绵羊群体中进行全基因组关联分析，发现了绵羊基因组中与布鲁氏菌病抗性相关的SNP分子标记，通过大样本量的绵羊群体验证，证明该SNP分子标记与绵羊布鲁氏菌病抗性存在显著相关性，可用于检测绵羊对布鲁氏菌病的抗性高低。为便于检测，本发明还开发了用于检测该SNP分子标记的引物组合。

基于上述发现，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记含有如SEQ ID NO.1所示序列第101位的多态性为T/G的核苷酸序列。

以上所述的SNP分子标记的多态性位点位于版本号为Oar_v1.0，2017年11月的绵羊参考基因组的第7号染色体第33892826位，多态性为T/G。

上述SNP分子标记与绵羊对布鲁氏菌病的抗性高低存在显著相关性，能够针对不同品种绵羊较为准确地鉴定其对布鲁氏菌病的抗性，用于绵羊抗布鲁氏菌病的分子标记辅助育种和品种改良，提高分子育种效率。

基于上述版本号为Oar_v1.0，2017年11月的绵羊参考基因组的第7号染色体第33892826位多态性位点所开发的SNP分子标记，为便于检测，本发明针对该多态性位点的上下游序列开发了用于扩增该SNP分子标记的引物。结合该多态性位点的上下游序列，本发明获得了SEQ ID NO.1所示序列。本领域技术人员可以理解的是，基于上述多态性位点及其上下游序列可开发不同长度的序列片段作为SNP分子标记用于该位点的扩增和检测，因此SEQID NO.1所示序列并不构成对本发明的SNP分子标记的限制，只要包含版本号为Oar_v1.0，2017年11月的绵羊参考基因组的第7号染色体第33892826位多态性位点的序列片段均在本发明的SNP分子标记的保护范围内。

在本发明的一些实施方式中，以上所述的与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，多态性位点位于如SEQ ID NO.1所示序列的第101位，多态性为T/G。

SEQ ID NO.1：

GTTAAGAGGGAGGCGGGAGAGAAATCCGTTTGAGGGGTGGAGCAGGCCTGAAAAGCTAGGGCGCGTGGCCCCCTTTCCCGAACTCCTTGTTTCGAAACTCKGCACCGGGGACCCACGGCAAAGACGCGGAGGGGCCCGGCTGGCAGCACTTCTTTGGGAGAAAGTGTTGCTGCCTCGCGGGGCTATTTTTCAGAGGCTCTG。其中，K为SNP分子标记的多态性位点，K=T或G。

在本发明的一些实施方式中，以上所述的SNP分子标记为以绵羊基因组为模板、由序列如SEQ ID NO.2-4所示的引物扩增得到。

以上所述的SNP分子标记的多态性位点的基因型为GG，对应于布鲁氏菌病高抗性，基因型为GT，对应于布鲁氏菌病低抗性。

上述SNP分子标记中，相较“GT”杂合基因型，“GG”纯合基因型的绵羊具有明显更高的布鲁氏菌病抗性。

第二方面，本发明提供一种引物组合，所述引物组合用于扩增以上所述的与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的SNP分子标记。

根据以上提供的SNP分子标记的多态性位点所在基因组的位置及其上下游序列，本领域技术人员可以开发用于扩增该SNP分子标记的各种类型的引物。

上述引物可以为任何能够用于检测SNP分子标记基因型的引物。

优选地，所述引物组合包括序列如SEQ ID NO.2-4所示的引物，其中序列如SEQ IDNO.2-3所示的引物为正向引物，序列如SEQ ID NO.4所示的引物为反向通用引物。

SEQ ID NO.2：5’-CCGAACTCCTTGTTTCGAAACTCT-3’；

SEQ ID NO.3：5’-CGAACTCCTTGTTTCGAAACTCG-3’；

SEQ ID NO.4：5’-GGCAGCAACACTTTCTCCCAAAGAA-3’。

以上所述的引物组合能够针对上述SNP分子标记实现高效的扩增和基因分型。

KASP，即竞争性等位基因特异性PCR，该技术可通过特异性荧光探针进行SNP的高精度双等位基因分型，且分析稳定准确、成本低、效率高，易于实现高通量和自动化。因此，为实现高效检测，本发明基于KASP技术开发了用于检测上述SNP分子标记的KASP引物组合。

优选地，所述KASP引物组合包括第一正向引物、第二正向引物以及反向通用引物，其中，所述第一正向引物的序列为顺次连接的特异性荧光标签序列以及SEQ ID NO.2所示序列，第二正向引物的序列为顺次连接的特异性荧光标签序列以及SEQ ID NO.3所示序列；反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

以上所述的第一正向引物和第二正向引物的荧光标签不同。

在本发明的一些实施方式中，所述引物组合包含SEQ ID NO.5-6所示的正向引物以及SEQ ID NO.4所示的反向通用引物。

第三方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含以上所述的引物组合。

为便于检测，所述试剂盒还可包含其他用于PCR扩增的试剂，包括但不限于DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、探针、dNTP、Mg²⁺、水等。

上述试剂可单独包装或经混合后作为预混液提供。

以上所述的试剂盒可具有以下任一种用途：

1）检测或辅助检测绵羊对布鲁氏菌病抗性高低；

2）筛选或鉴定高抗布鲁氏菌病的绵羊；

3）绵羊抗布鲁氏菌病性状的早期预测；

4）绵羊对布鲁氏菌病抗性的分子标记辅助育种；

5）绵羊对布鲁氏菌病抗性的品种改良。

第四方面，本发明提供SNP分子标记或所述SNP分子标记的检测引物的以下1）-8）中的任意一种应用：

1）在检测或辅助检测绵羊对布鲁氏菌病抗性高低中的应用；

2）在制备用于检测或辅助检测绵羊对布鲁氏菌病抗性高低的试剂中的应用；

3）在筛选或鉴定高抗布鲁氏菌病的绵羊中的应用；

4）在制备用于筛选或鉴定高抗布鲁氏菌病的绵羊的试剂中的应用；

5）在绵羊抗布鲁氏菌病性状的早期预测中的应用；

6）在制备用于绵羊抗布鲁氏菌病性状的早期预测试剂中的应用；

7）在绵羊对布鲁氏菌病抗性的分子标记辅助育种中的应用；

8）在绵羊对布鲁氏菌病抗性的品种改良中的应用；

所述SNP分子标记的多态性位点位于版本号为Oar_v1.0，2017年11月的绵羊参考基因组的第7号染色体第33892826位，多态性为T/G。

在本发明的一些实施方式中，上述应用中，所述SNP分子标记含有如SEQ ID NO.1所示序列第101位的多态性为T/G的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方式中，上述应用中，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，多态性位点位于如SEQ ID NO.1所示序列的第101位，多态性为T/G。

在本发明的一些实施方式中，上述应用中，所述SNP分子标记的检测引物包括序列如SEQ ID NO.2-4所示的引物，其中序列如SEQ ID NO.2-3所示的引物为正向引物，序列如SEQ ID NO.4所示的引物为反向通用引物。

上述应用中，所述SNP分子标记的多态性位点的基因型为GG，对应于布鲁氏菌病高抗性，基因型为GT，对应于布鲁氏菌病低抗性。

上述应用中，选择所述SNP分子标记的基因型为“GG”的绵羊作为亲本进行抗布鲁氏菌病性状育种。

第五方面，本发明提供一种检测绵羊对布鲁氏菌病抗性的方法，所述方法包括：检测绵羊基因组中与绵羊抗布鲁氏菌病性状相关的SNP分子标记的基因型，所述SNP分子标记的多态性位点位于版本号为Oar_v1.0，2017年11月的绵羊参考基因组的第7号染色体第33892826位，多态性为T/G；

所述SNP分子标记的多态性位点的基因型为GG，对应于布鲁氏菌病高抗性，基因型为GT，对应于布鲁氏菌病低抗性。

在本发明的一些实施方式中，所述SNP分子标记含有如SEQ ID NO.1所示序列第101位的多态性为T/G的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方式中，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，多态性位点位于如SEQ ID NO.1所示序列的第101位，多态性为T/G。

优选地，所述方法包括如下步骤：

1）提取待检测绵羊的基因组DNA；

2）以步骤1）的基因组DNA为模板，利用序列如SEQ ID NO.2-4所示的引物进行PCR扩增；

3）分析PCR扩增产物中所述SNP 分子标记的基因型，根据基因型判断待检测绵羊对布鲁氏菌病的抗性高低，若所述SNP分子标记的多态性位点的基因型为GG，则判断为布鲁氏菌病高抗性，若基因型为GT，则判断为布鲁氏菌病低抗性。

本发明的有益效果至少包括：本发明提供与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的SNP分子标记，该SNP分子标记与绵羊布鲁氏菌病抗性性状显著相关，能够较为准确地检测绵羊对布鲁氏菌病的抗性高低，可实现绵羊抗布鲁氏菌病性状的早期预测，不受绵羊的年龄、性别等限制，甚至绵羊刚出生即可进行准确筛选，可用于抗布鲁氏菌病绵羊的选育和绵羊抗布鲁氏菌病性状的分子标记辅助育种，能够显著促进抗布鲁氏菌病绵羊选育的育种进程，有效提高育种效率，在绵羊布鲁氏菌病抗性育种中具有较高的应用价值，对开发和利用绵羊优良品种的优良经济特性及保护和合理地利用品种资源具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例2中SNP分子标记的多态性位点的基因分型结果。

图2为本发明实施例2中SNP分子标记在绵羊群体中的扩群验证结果，其中，**代表p＜0.01。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的SNP分子标记及其应用，所述SNP分子标记的多态性位点位于绵羊参考基因组的第7号染色体第33892826 bp，该位点存在T/G碱基突变，与绵羊布鲁氏菌病抗性性状具有显著的相关性；推测该位点突变后可能会影响绵羊对布鲁氏菌的抵抗能力；在该多态性位点上，相较“GT”杂合基因型，“GG”纯合基因型的绵羊具有更强的布鲁氏菌病抗性；上述SNP分子标记的多态性位点的位置基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v1.0，2017年11月。本发明提供的SNP分子标记对于通过基因型区分和筛选具有抗布鲁氏菌病性状的绵羊具有重要的指导意义，能够提高绵羊抗布鲁氏菌病筛选的准确率和效率。

本发明对于检测所述SNP分子标记的基因型的方法没有特别的限制，利用本领域常规的基因型检测方法即可。在本发明的具体实施方式中，利用KASP方法来检测待测绵羊基因组中所述SNP分子标记的基因型。

本发明提供的与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的SNP分子标记或其检测引物可以联合其他与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的SNP分子标记或其检测引物使用，用于绵羊布鲁氏菌病抗性性状的鉴定。

实施例1 与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的SNP分子标记的开发

本实施例以萨福克、东佛里生、白萨福克和特克塞尔这4个品种的绵羊群体为样本，利用全基因组关联分析（GWAS）开发与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的SNP分子标记，具体如下：

将萨福克、东佛里生、白萨福克和特克塞尔品种绵羊在相同条件饲养，自然感染布鲁氏菌病，采集绵羊血样，分别采用竞争酶联免疫吸附实验（cELSA）、间接酶联免疫吸附实验（iELISA）和荧光偏振实验（FPA）检测绵羊是否感染布鲁氏菌病，各方法的阳性判定阈值线为：cELISA：30，iELISA：15，FPA：20，高于上述阈值线判断为阳性。若上述三种方法的检测结果均为阳性则判定为患布鲁氏菌，均为阴性则判定为健康，其余则判定为可疑。最后选择25只判定为患布鲁氏菌病的绵羊作为实验组，25只判定为健康的绵羊作为对照组，对上述50只绵羊进行全基因组关联分析（GWAS），其中，患病绵羊的信息及其血样检测结果如表1所示，健康绵羊的信息及其血样检测结果如表2所示。

表1

表2

将上述50只绵羊的血液DNA样品进行全基因组重测序，测序平台为华大基因T7，测序深度为20×，总测序量为2.6 T。对测序数据进行序列比对与质量控制，其中，数据过滤使用软件fastp，比对和变异检测使用软件GTX，获得大小为71.08 GB的比对后VCF文件。质量控制使用软件PLINK，质控标准如下：--mind 0.1 --geno 0.1 --maf 0.05 --hwe 1e-5，质控后有效SNP数为24,683,444。使用软件PLINK，代码：plink --bfile filename --pca 10 --out filename_pca --chr-set 27 --allow-extra-chr进行主成分分析。选择数量性状（iELISA值）、使用GEMMA (Version 0.95 )软件、以为模型基础、Genome assembly Oar_rambouillet_v1.0为参考基因组进行全基因组关联分析。然后进行SNP注释与富集分析，其中，SNP位点注释使用工具为https://asia.ensembl.org/index.html，参考基因组为Genome assembly Oar_rambouillet_v1.0，GO富集分析使用工具为https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost，参考基因组为Homosapiens（Human）、Ovis aries（Sheep），KEGG富集分析使用工具为：https://david.ncifcrf.gov，参考基因组为Homo sapiens（Human）、Ovis aries（Sheep）。

在全基因组关联分析中，Top 1000 SNP的-log₁₀(P)取值在4.56~7.36之间，注释到100个基因，其中，-log₁₀(P)取值在6以上的SNP共有48个，注释到13个基因。在这48个SNP中筛选与绵羊布鲁氏菌病抗病表型存在明显关联的SNP分子标记。最终，本发明获得了与绵羊布鲁氏菌病抗性性状相关的SNP分子标记，该SNP分子标记的多态性位点位于绵羊参考基因组的第7号染色体第33892826位。（绵羊基因组序列信息版本号为Oar_v1.0，2017年11月），该位点存在T/G碱基突变，与绵羊布鲁氏菌病抗性性状具有显著的相关性，该多态性位点为“GG”纯合基因型的绵羊个体的cELISA值、iELISA值、FPA值均显著低于“GT”杂合基因型（p＜0.01），即相较“GT”杂合基因型，“GG”纯合基因型的绵羊具有更强的布鲁氏菌病抗性；“GG”是抗布鲁氏菌绵羊的优势基因型。上述SNP分子标记对应于如SEQ ID NO.1所示序列，其中，多态性位点位于第101 bp，多态性为T或G。

基于上述SNP分子标记，本发明进一步开发了用于检测该SNP分子标记的KASP引物，具体如下：

Primer X:

5’-gaaggtgaccaagttcatgctCCGAACTCCTTGTTTCGAAACTCT-3’（SEQ ID NO.5，小写字母部分为特异性荧光标签序列FAM）；

Primer Y:

5’-gaaggtcggagtcaacggattCGAACTCCTTGTTTCGAAACTCG-3’（SEQ ID NO.6，小写字母部分为特异性荧光标签序列VIC）;

Primer R: 5’-GGCAGCAACACTTTCTCCCAAAGAA-3’（SEQ ID NO.4）。

利用上述KASP引物可在本实施例的绵羊群体中将上述获得的SNP分子标记的多态性位点区分出“GT”杂合基因型和“GG”纯合基因型。

实施例2 与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的SNP分子标记的应用

对实施例1开发的与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的SNP分子标记进行扩大群体验证，具体如下：

1、采集待测绵羊血液样品并鉴定血清抗体浓度

从自然感染布鲁氏菌的养殖场中采集未接种疫苗的120只萨福克绵羊、133只东佛里生绵羊、129只白萨福克绵羊和25只特克塞尔绵羊的颈静脉血液。采用间接酶联免疫吸附实验（iELISA）方法检测血清布鲁氏菌抗体浓度。个体iELISA值可作为表征其抗病能力的指标，即iELISA值越低则表明该个体抗布鲁氏菌病能力越强，反之则越弱。在本实施例中iELISA结果阴性与阳性的判定阈值设置为15。

2、提取待测绵羊血液样品中的基因组DNA

采用磁珠法提取待测绵羊血液样品中的基因组DNA。

3、SNP分子标记片段的扩增

以上述2中提取的基因组DNA为模板，采用实施例1开发的KASP引物组合（SEQ IDNO.5-6、SEQ ID NO.4）进行PCR扩增，具体如下：

（1）KASP扩增体系：

1.6 μL反应体系包括：50-100 ng/μL的基因组DNA 0.8μL，引物混液 0.022μL（优选引物混液配比：100μmol/L的正向引物Primer X和Primer Y各60μL，100μmol/L的通用反向引物Primer R 150μL，10 mM的Tris·HCl 230μL），2×Master mix 0.4μL，双蒸水补足1.6μL。

以上反应体系为Douglas Array Tape平台的优选反应体系，其它合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。

其中，2×Master mix包括荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真Taq酶、dNTP和Mg²⁺等。荧光探针A序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，其5’末端连接1个荧光基团FAM；荧光探针B序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT -3’，其5’末端连接1个荧光基团VIC；淬灭探针A的核苷酸序列为5’- AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’，其3’末端连接1个荧光基团BHQ；淬灭探针B的核苷酸序列为5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’，其3’末端连接1个荧光基团BHQ。

（2）PCR反应条件：

DNA片段扩增：94℃预变性15 min，设置一个循环；94℃变性20 s，61-55℃梯度退火延伸60 s，设置10个循环，每个循环降低0.6℃。

荧光信号增强：94℃变性20 s，55℃退火延伸60 s，设置26个循环。

4、采用Douglas Array Tape平台检测PCR扩增产物，获得SNP分子标记的多态性位点的基因型。

对上述407只绵羊的SNP分子标记的多态性位点基因型进行检测，结果如表3和图1所示，在检测的绵羊群体中区分出“GG”、“GT”和“TT”三种基因型。将基因型与布鲁氏菌抗性性状进行关联分析，结果如图2所示，“GG”基因型绵羊个体的iELISA值显著低于“GT”基因型，表明“GG”基因型绵羊个体的布鲁氏菌病抗性强于“GT”基因型，这也表明“GG”是抗病绵羊的优势基因型，本发明提供的SNP分子标记用于布鲁氏菌病抗性性状鉴定具有较高的准确性。

表3 绵羊群体中SNP分子标记的多态性位点不同基因型的个体数

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记含有如SEQ ID NO.1所示序列第101位的多态性为T/G的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，多态性位点位于如SEQ ID NO.1所示序列的第101位，多态性为T/G。

3.根据权利要求1所述的与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记为以绵羊基因组为模板、由序列如SEQ ID NO.2-4所示的引物扩增得到。

4.根据权利要求1~3任一项所述的与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的多态性位点的基因型为GG，对应于布鲁氏菌病高抗性，基因型为GT，对应于布鲁氏菌病低抗性。

5.引物组合，其特征在于，所述引物组合用于扩增权利要求1~4任一项所述的与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的SNP分子标记。

6.根据权利要求5所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括序列如SEQ IDNO.2-4所示的引物，其中序列如SEQ ID NO.2-3所示的引物为正向引物，序列如SEQ IDNO.4所示的引物为反向通用引物。

7.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求5或6所述的引物组合。

8.SNP分子标记或所述SNP分子标记的检测引物的以下1）-8）中的任意一种应用：

1）在检测或辅助检测绵羊对布鲁氏菌病抗性高低中的应用；

3）在筛选或鉴定高抗布鲁氏菌病的绵羊中的应用；

5）在绵羊抗布鲁氏菌病性状的早期预测中的应用；

7）在绵羊对布鲁氏菌病抗性的分子标记辅助育种中的应用；

8）在绵羊对布鲁氏菌病抗性的品种改良中的应用；

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，多态性位点位于如SEQ ID NO.1所示序列的第101位，多态性为T/G；

和/或，所述SNP分子标记的检测引物包括序列如SEQ ID NO.2-4所示的引物，其中序列如SEQ ID NO.2-3所示的引物为正向引物，序列如SEQ ID NO.4所示的引物为反向通用引物。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述SNP分子标记的多态性位点的基因型为GG，对应于布鲁氏菌病高抗性，基因型为GT，对应于布鲁氏菌病低抗性。