KR20210060105A - 마이코박테리움 속 미생물의 감염 저항성을 예측하기 위한 조성물, 키트 및 방법 - Google Patents

마이코박테리움 속 미생물의 감염 저항성을 예측하기 위한 조성물, 키트 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20210060105A
KR20210060105A KR1020190147727A KR20190147727A KR20210060105A KR 20210060105 A KR20210060105 A KR 20210060105A KR 1020190147727 A KR1020190147727 A KR 1020190147727A KR 20190147727 A KR20190147727 A KR 20190147727A KR 20210060105 A KR20210060105 A KR 20210060105A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
base
thymine
cytosine
guanine
adenine
Prior art date
Application number
KR1020190147727A
Other languages
English (en)
Inventor
김희발
원소영
장지성
클레멘타인 샤텅
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Priority to KR1020190147727A priority Critical patent/KR20210060105A/ko
Publication of KR20210060105A publication Critical patent/KR20210060105A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

마이코박테리움 속 미생물의 감염 저항성을 예측하기 위한 조성물, 키트 및 방법에 관한 것으로, 마이코박테리움 속 미생물의 감염에 대한 저항성과 연관되는 다수의 SNP 정보를 단독으로 또는 조합함으로써 마이코박테리움 속 미생물 감염을 예측하고 저항성이 높은 개체를 선별하는데 이용될 수 있다.

Description

마이코박테리움 속 미생물의 감염 저항성을 예측하기 위한 조성물, 키트 및 방법 {Composition, kit and method for predicting resistance of Mycobacterium genus microorganism infection}
마이코박테리움 속 미생물의 감염 저항성을 예측하기 위한 조성물, 키트 및 방법에 관한 것이다.
결핵은 가장 치명적인 전염성 질병의 하나로, 매년 약 이백만 명이 결핵으로 사망한다. 사람의 결핵 사례 중 일부는 소 결핵의 병원체인 Mycobacterium bovis에서 기인한다. 소 결핵 (bovine tuberculosis: bTB) 박테리아는 대부분 공기 중으로 전파되지만, 살균되지 않은 우유나 고기를 섭취함으로써도 전파될 수 있다. 오늘날, 몇 개의 나라는 엄격한 시험과 도살 및 동물 이동 통제를 통해 소 결핵을 근절시켰고, 고소득 국가에서는 소 결핵이 사람에게 전파되는 사례가 줄어들었다. 그러나, 저소득 국가에서는 가축 관리 계획을 시행하기에는 비용이 너무 많이 들어 사람과 동물이 같은 생활 환경을 공유하고, 우유를 대부분 살균되지 않은 상태로 소비한다. 결과적으로, 개발도상국에서는 사람에서 발병하는 결핵 중 10 내지 15 %가 소 결핵 균주에 의한 것이라고 알려져 있다. 따라서, 소 결핵은 공중보건의 중요한 위험 요소 중 하나이며 축우산업에서 상당한 경제적 손실을 야기한다.
이러한 기술적 배경 하에서, 결핵을 진단하기 위한 다각적인 연구가 진행되고 있으나(한국 등록특허 제10-1045666호), 아직은 미비한 실정이다.
단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 이용하여 마이코박테리움(Mycobacterium) 속(genus) 미생물 감염에 대한 개체의 저항성 예측용 조성물을 제공한다.
SNP를 이용하여 마이코박테리움 속 미생물 감염에 대한 개체의 저항성 예측용 키트를 제공한다.
개체에서 분리된 생물학적 시료로부터 SNP를 검출하는 단계를 포함하는, 마이코박테리움 속 미생물 감염에 대한 개체의 저항성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
일 양상은 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP) rs444640705, rs210272832, rs210127948, rs210518866, rs208660713, rs209557929, rs469606353, rs210536056, rs109551090, rs434272906, rs55617297, rs55617311, rs55617324, rs55617437, rs55617310, rs210580164, rs207882984, rs68268279, rs68343176, rs68268275, rs68268272, rs208209126, rs208893447, rs109038488, rs209439695, rs208796762, rs457663910, rs208850822, rs208211019, rs522980029, rs516025239, rs109032207, rs520313532, rs382772154, rs207697469, rs380363097, rs381290416, rs716464475, rs444785629, rs519867726, rs432398016, rs209906905, rs210598311, 및 rs437576913로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP 유전형을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 마이코박테리움(Mycobacterium) 속(genus) 미생물 감염에 대한 개체의 저항성 예측용 조성물을 제공한다.
상기 용어 "단일 염기 다형성(SNP)"란 하나의 유전자 좌위(locus)에 위치한 핵산 서열에서 단일의 뉴클레오티드의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이를 말한다. 상기 SNP는 특정 집단에서 1% 이상 또는 5% 이상의 빈도로 존재하는 2 개 이상의 대립 염기서열이 발생하는 위치일 수 있다. 상기 변이는 염기, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산의 치환 (substitution), 삽입 (insertion), 중복 (duplication), 결실 (deletion) (삽입 및 결실을 Insertion and Deletion: 'InDel'이라고도 함)에 의한 것일 수 있다. 상기 변이는 단일 염기의 치환인 것일 수 있다.
상기 SNP는 마이코박테리움(Mycobacterium) 속(genus)의 감염에 연관되는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 SNP는 KALRN 유전자에 존재하는 rs444640705, MARCO 유전자에 존재하는 rs210272832, rs210127948, rs210518866, rs208660713, rs209557929, rs469606353, 또는 rs210536056, SLC11A1 유전자에 존재하는 rs109551090, CTSS 유전자에 존재하는 rs434272906, TLR10 유전자에 존재하는 rs55617297, rs55617311, rs55617324, rs55617437, 또는 rs55617310, TLR6 유전자에 존재하는 rs210580164, rs207882984, rs68268279, rs68343176, rs68268275, 또는 rs68268272, IL9 유전자에 존재하는 rs208209126, 또는 rs208893447, IL18RAP 유전자에 존재하는 rs109038488, rs209439695, 또는 rs208796762, IL1A 유전자에 존재하는 rs457663910, CTSZ 유전자에 존재하는 rs208850822,
또는 rs208211019, HSF1 유전자에 존재하는 rs522980029, SHARPIN 유전자에 존재하는 rs516025239, RUNX1T1 유전자에 존재하는 rs109032207, IRF3 유전자에 존재하는 rs520313532, ATP6V0A1 유전자에 존재하는 rs382772154, SLC6A6 유전자에 존재하는 rs207697469, MAPK13 유전자에 존재하는 rs380363097, 또는 rs381290416, CTSW 유전자에 존재하는 rs716464475, rs444785629, rs519867726, rs432398016, rs209906905, rs210598311, 또는 rs437576913일 수 있다. 상기 SNP는 면역에 연관된 것일 수 있다. 또한, 상기 SNP는 단독으로 또는 조합하여 이용될 수 있다.
통상의 기술자라면 상기 rs 번호를 이용하여 변이의 위치 및 서열을 용이하게 확인할 수 있을 것이다. 한편, 이는 인터넷 사이트(https://asia.ensembl.org/)에서도 확인할 수 있다.
상기 마이코박테리움 속 미생물은 개체에게 감염을 일으킬 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 마이코박테리움 속 미생물은 마이코박테리움 보비스(M. bovis), 마이코박테리움 보비스 BCG(M. bovis BCG), 마이코박테리움 투베르큘로시스(M. tuberculosis), 마이코박테리움 아프리카눔(M. africanum) 및 마이코박테리움 마이크로티(M. microti)일 수 있다. 또한, 상기 미생물이 단독으로 또는 조합하여 개체에 감염을 일으키는 것일 수 있다.
상기 마이코박테리움 속 미생물의 감염에 대한 저항성은 개체마다 상대적인 것을 수 있다. 예를 들면, 상기 저항성은 감염의 확률이 건강한 개체군에 비하여 증가되어 있는지, 또는 유사한지를 나타내는 것일 수 있다. 또한, 상기 저항성은 특정 대립인자 또는 유전형을 갖는 개체가 다른 특정 대립인자 또는 유전형을 갖는 개체에 비하여 마이코박테리움 속 미생물의 감염 확률이 증가되어 있는지, 유사한지, 또는 감소되어 있는지를 나타내는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 rs444640705의 염기가 티민(Thymine: T), rs210272832의 염기가 시토신(Cytosine: C), rs210127948의 염기가 아데닌(Adenine: A), rs210518866의 염기가 구아닌(Guanine: G), rs208660713의 염기가 시토신, rs209557929의 염기가 티민, rs469606353의 염기가 구아닌, rs210536056의 염기가 티민, rs109551090의 염기가 아데닌, rs434272906의 염기가 아데닌, rs55617297의 염기가 구아닌, rs55617311의 염기가 시토신, rs55617324의 염기가 시토신, rs55617437의 염기가 티민, rs55617310의 염기가 구아닌, rs210580164의 염기가 시토신, rs207882984의 염기가 시토신, rs68268279의 염기가 티민, rs68343176의 염기가 시토신, rs68268275의 염기가 시토신, rs68268272의 염기가 시토신, rs208209126의 염기가 티민, rs208893447의 염기가 티민, rs109038488의 염기가 구아닌, rs209439695의 염기가 티민, rs208796762의 염기가 티민, rs457663910의 염기가 구아닌, rs208850822의 염기가 구아닌, rs208211019의 염기가 티민, rs522980029의 염기가 아데닌, rs516025239의 염기가 티민, rs109032207의 염기가 시토신, rs520313532의 염기가 구아닌, rs382772154의 염기가 구아닌, rs207697469의 염기가 티민, rs380363097의 염기가 티민, rs381290416의 염기가 시토신, rs716464475의 염기가 구아닌, rs444785629의 염기가 구아닌, rs519867726의 염기가 티민, rs432398016의 염기가 아데닌, rs209906905의 염기가 티민, rs210598311의 염기가 시토신, rs437576913의 염기가 시토신 또는 이들의 조합인 경우, 다른 뉴클레오티드인 경우보다 마이코박테리움 속 미생물 감염에 대한 저항성이 증가된 개체인 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 rs444640705의 염기가 아데닌, rs210272832의 염기가 티민, rs210127948의 염기가 구아닌, rs210518866의 염기가 시토신, rs208660713의 염기가 티민, rs209557929의 염기가 아데닌, rs469606353의 염기가 아데닌, rs210536056의 염기가 시토신, rs109551090의 염기가 구아닌, rs434272906의 염기가 티민, rs55617297의 염기가 티민, rs55617311의 염기가 티민, rs55617324의 염기가 티민, rs55617437의 염기가 시토신, rs55617310의 염기가 아데닌, rs210580164의 염기가 티민, rs207882984의 염기가 티민, rs68268279의 염기가 시토신, rs68343176의 염기가 구아닌, rs68268275의 염기가 티민, rs68268272의 염기가 티민, rs208209126의 염기가 시토신, rs208893447의 염기가 시토신, rs109038488의 염기가 티민, rs209439695의 염기가 시토신, rs208796762의 염기가 시토신, rs457663910의 염기가 시토신, rs208850822의 염기가 아데닌, rs208211019의 염기가 시토신, rs522980029의 염기가 구아닌, rs516025239의 염기가 구아닌, rs109032207의 염기가 티민, rs520313532의 염기가 시토신, rs382772154의 염기가 아데닌, rs207697469의 염기가 시토신, rs380363097의 염기가 구아닌, rs381290416의 염기가 아데닌, rs716464475의 염기가 시토신, rs444785629의 염기가 아데닌, rs519867726의 염기가 시토신, rs432398016의 염기가 시토신, rs209906905의 염기가 아데닌, rs210598311의 염기가 티민, rs437576913의 염기가 티민 또는 이들의 조합인 경우, 다른 뉴클레오티드인 경우보다 마이코박테리움 속 미생물 감염에 대한 저항성이 감소된 개체인 것일 수 있다.
상기 "개체"는 마이코박테리움 속 미생물에 감염될 가능성이 있는 임의의 개체일 수 있다. 예를 들어, 상기 개체는 포유동물, 즉, 소, 인간, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다.
상기 소는 소(Bos) 속(genus)의 개체를 의미하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 소 속의 개체는 보스 타우루스(Bos taurus), 보스 인디쿠스(Bos indicus), 보스 아쿠티프론스(Bos acutifrons), 보스 애깁티아쿠스(Bos aegyptiacus), 보스 프론탈리스(Bos frontalis), 보스 가우루스(Bos gaurus), 보스 그룬니엔스(Bos grunniens), 보스 자바니쿠스(Bos javanicus), 보스 플라니프론스(Bos planifrons), 보스 프리미제니우스(Bos primigenius), 또는 보스 사우벨리(Bos sauveli)일 수 있다.
상기 "제제"는 상기 SNP를 포함하는 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 프라이머, 프로브, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 프라이머, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 상기 변이를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적으로 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다.
상기 "프라이머 (primer)"는 중합효소에 의한 뉴클레오티드의 중합반응에서, 개시점으로 작용할 수 있는 단일가닥의 폴리뉴클레오티드를 말한다. 예를 들면, 상기 프라이머는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건, 즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합효소의 존재 하에서 주형-지시(template-directed) DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일가닥의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예를 들어, 온도와 프라이머의 용도에 따라 달라질 수 있다. 상기 프라이머는 길이가 15 내지 30 뉴클레오티드인 것일 수 있다. 예를 들어, 프라이머의 길이가 짧을수록, 낮은 어닐링(annealing) 온도에서 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성할 수 있다. 상기 프라이머의 길이는 약 5 내지 약 100 뉴클레오티드(이하, 'nt'라고 함), 약 10 내지 약 80 nt, 약 10 내지 약 60 nt, 약 10 내지 약 50 nt, 약 10 내지 약 40 nt, 약 10 내지 약 30 nt, 또는 약 10 내지 약 20 nt일 수 있다.
상기 "프로브(probe)"는 표적 핵산에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프로브는 표지 물질에 결합된 것일 수 있다. 상기 프로브는 길이가 약 50 nt 내지 약 400 nt, 약 100 nt 내지 약 350 nt, 약 150 nt 내지 약 300 nt, 또는 약 200 nt 내지 약 250 nt일 수 있다.
상기 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체이다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 예를 들어, 6 내지 100 nt, 8 내지 60 nt, 10 내지 40 nt, 15 내지 30 nt, 또는 20 내지 25 nt일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성될 수 있다.
상기 "저항성"은 외부의 스트레스에 대해 견디는 성질을 의미한다. 구체적으로, 마이코박테리움 속 감염에 대한 내성을 가지거나, 감염의 확률이 낮은 것을 의미한다.
다른 양상은 상기 조성물을 포함하는, 마이코박테리움 속 미생물 감염에 대한 개체의 저항성 예측용 키트를 제공한다.
상기 조성물 또는 방법에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상술한 바와 같다.
상기 키트는 마이코박테리움 속 미생물 감염에 대한 개체의 저항성 예측에 필요한 시료를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 고체 지지체, 항체 또는 항원 결합 단편의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소, 형광물질로 표지된 2차 항체, 또는 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 키트는 핵산 검출을 위하여, 중합효소, 완충제, 핵산, 조효소, 형광물질, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 중합 효소는 예를 들어 Taq 중합효소이다.
또 다른 양상은 개체에서 분리된 생물학적 시료로부터 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP) rs444640705, rs210272832, rs210127948, rs210518866, rs208660713, rs209557929, rs469606353, rs210536056, rs109551090, rs434272906, rs55617297, rs55617311, rs55617324, rs55617437, rs55617310, rs210580164, rs207882984, rs68268279, rs68343176, rs68268275, rs68268272, rs208209126, rs208893447, rs109038488, rs209439695, rs208796762, rs457663910, rs208850822, rs208211019, rs522980029, rs516025239, rs109032207, rs520313532, rs382772154, rs207697469, rs380363097, rs381290416, rs716464475, rs444785629, rs519867726, rs432398016, rs209906905, rs210598311, 및 rs437576913로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP를 검출하는 단계를 포함하는, 마이코박테리움 속 미생물 감염에 대한 개체의 저항성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 조성물에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상술한 바와 같다.
상기 생물학적 시료는 개체로부터 수득된 시료를 의미한다. 상기 생물학적 시료는 혈액, 조직, 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈장, 혈청, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 생물학적 시료로부터 핵산 시료를 수득하는 단계는 통상의 핵산 분리방법에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 표적 핵산을 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR), 리가제 연쇄 반응 (ligase chain reaction: LCR), 전사 매개 증폭 (transcription mediated amplification), 또는 실시간-핵산 서열 기반 증폭(realtime-nucleic acid sequence based amplification: NASBA)을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 또는 표적 핵산은 조 분리된 핵산으로서 생물학적 시료의 파쇄물로부터 얻을 수 있다.
일 실시예에 따른 단일 염기 다형성의 변이는 마이코박테리움 속 미생물 감염에 대한 개체의 저항성 예측력이 우수하므로, 이를 이용하여 결핵에 감수성이 높은 개체를 미리 선별할 수 있다. 특히, 소 결핵 균인 마이코박테리움 보비스에 대한 개체의 감염 저항성 예측력이 우수하므로 축우산업에서 소 결핵에 의한 경제적 손실을 최소화할 수 있다.
도 1은 결핵 감염 저항성에 연관된 단일 염기 다형성을 선별하는 단계를 나타낸 플로우차트이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 소 결핵 저항성 예측을 위한 유전자의 선별
1-1. 혈액 샘플 준비
소 결핵에 저항성이 상이한 것으로 기록된 다섯 종의 소 품종을 사용하였다. 구체적으로, 소 결핵에 비교적 민감한 것으로 선택된 소 품종은 taurine 품종인 Bos taurus에 속하는 Holstein 및 Jersey였다. 소 결핵에 대해 비교적 저항성이 있는 것으로 선택된 품종은 Bos indicus에 속하는 3 가지 아프리카 토착 품종인 zebu(indicine), Arsi, Ethiopian Boran 및 Kenyan Boran이었다. 각 품종마다 총 10 마리를 시퀀싱하였다. 통상적인 수의과 처리를 통하여 혈액 샘플을 수집하였다.
1-2. 시퀀싱 및 변형체 추출(variant calling)
G-DEXTMIIb 게놈 DNA 추출 키트(iNtRoN Biotechnology)를 사용하여 각 개체당 전혈(whole blood) 10 mL로부터 DNA를 추출하였다. Covaris System을 사용하여 약 300 bp까지의 절편(inserts)를 생성하기 위해 3 μg의 게놈 DNA를 무작위로 전단하였다. TruSeq DNA Sample Prep. Kit (Illumina)를 사용하여 전단된 DNA의 단편을 말단 수복(end-repaired), 어댑터 연결(adaptor ligated), 및 증폭하였다. 수복 말단 시퀀싱을 TruSeq SBS Kit v3-HS를 갖는 HiSeq2000 platform (Illumina)을 사용하여 수행하였고, HiSeq system(Illumina)을 사용하여 시퀀싱 데이터를 구성하였다.
그 다음, 수득된 상기 데이터를 하기에 개시된 방법에 따라 처리하였다. fastQC software (http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc)를 사용하여 베이스(base)마다 시퀀스 품질 검사를 수행하고, 낮은 품질의 베이스 및 인공 서열을 Trimommatic (Bolger et al., 2014)을 이용하여 제거하였다. 이어서 참조 소 게놈(UMD 3.1)에 대한 수복 말단 시퀀스 리드를 맵핑하기 위해 The software Bowtie2 (Langmead and Salzberg, 2012)를 사용하였다. 그 결과 50개 샘플에 대해 98.81 %의 정렬률 (alignment rate) 및 전체 데이터 세트에 대해 11.04x의 평균 리드 깊이(read depth)를 얻었다. 상기 리드는 전체 샘플에 대해 평균적으로 게놈의 98.57 %를 차지하였다. "REMOVE_DUPLICATES = true"의 옵션을 가진 Picard tool인 MarkDuplicates command-line tool을 사용하여 맵핑된 리드에서 잠재적인 PCR 중복을 필터링하였다. Picard의 FixMateInformation command-line tool를 이용하여 쌍 정보(mate pair)를 평가하고 고정(fix)하였다. 참조용 인덱스 파일 및 bam 파일을 SAMtools(Li et al., 2009)를 이용하여 생성하였다. Genome analysis toolkit 1.4 (GATK, McKenna et al., 2010)로부터 RealignerTargetCreator 및 IndelRealigner를 사용하여 파일의 부분 재정렬 및 Indel의 존재로 인해 발생한 잘못 정렬된 부분의 수정을 수행하였다. GATK에서 BaseRecalibrator 및 PrintReads를 사용하여 베이스 품질 재보정을 수행하였다.
GATK UnifiedGenoytper 및 SelectVariants를 사용하여 후보 SNP 및 InDel들을 bam 파일로 불러들였다. Principal Component Analysis (PCA) 및 혼합 분석을 포함하는 일련의 분석을 수행하여 추가적인 분석 전에 데이터 세트의 집단(population) 구조를 이해하였다.
1-3. 선택 시그니처(selection signature)의 검출
통계적 방법인 교차-집단 확장 하플로타입 동형접합성(cross-population extended haplotype homozygosity: XP-EHH) 및 교차-집단 복합 우도 비율 시험(cross-population composite likelihood ratio test: XP-CLR)을 사용하여 선택 시그니처를 식별하였다. 상기 XP-CLR 방법은 영향을 받는 영역의 크기로 평가할 때 유전자좌의 대립 유전자 빈도가 매우 신속히 변화한 게놈에서 최근의 선택적 스윕(sweep) 영역을 검출하도록 설계되었다 (Chen et al., 2010). 상기 XP-CLR 방법은 https://github.com/hardingnj/xpclr에서 이용가능한 스크립트를 사용하여 구현되었으며 Chen, Patterson, & Reich (2010)의 기존 방법을 기반으로 한다. XP-EHH 및 XP-CLR에서 식별된 중요 영역에 UMD 3.1을 기반으로 어노테이션(annotation)하였다. 중요 윈도우 영역의 일부 또는 전부와 겹치는 유전자를 후보 유전자로 정의하였다.
1-4. 후보 유전자의 선택
taurine 및 indicine 품종 사이의 소 결핵 감수성 불일치에 대한 인사이트를 얻기 위해, 두 가지 상이한 접근법을 사용하여 잠재적 후보 유전자에 대한 첫 번째 대략적인 스크리닝을 수행하였다. 먼저, 후보 유전자를 선택 시그니처 통계의 결과로부터 추론하였다. 이러한 목적으로, 면역과 연관된 가능성 있는 후보 유전자를 Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) (Huang et al., 2009a, 2009b)를 사용하여 유전자 온톨로지 (gene ontology) 및 유전자 풍부도 분석(gene enrichment analysis)을 구현함으로써 필터링하였다 (Huang et al., 2009a, 2009b). 과대 표시된(Overrepresented) Gene Ontology Biological Process (Gene Ontology Biological Process: GO-BP) 용어 및 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) 경로를 조사하였으며, 조사된 유전자의 수를 최대화하기 위해 통계적 유의성에 대한 임계값으로서 0.1의 P 값을 사용하였다. 또한, GeneCard를 탐색 (Stelzer et al., 2016)하여 XP-EHH 및 XP-EHH 방법에 공통적인 것으로 밝혀진 모든 유전자를 조사하였고, 면역과 연관될 수 있는 유전자를 추가 단계까지 유지하였다. 문헌 검토는 두 번째 접근법으로 수행되었다. 결과적으로, bTB(bovin tuberculosis)에 대한 민감도 조절에 대해 보고된 총 25 개의 유전자를 개별적으로 후보 유전자로 간주하고 선택 시그너처 유전자와 함께 마지막 선택 단계로 진행하였다. 마지막으로, 육안 검사를 통해 2 개의 집단 사이의 미스센스 변형 대립 유전자 조성의 분리를 나타내는 유전자를 유지함으로써 후보 유전자 선택을 개선하였으며, 이는 Ensembl Bos taurus UMD 3.1 변이체 표(Zimin et al., 2009)를 사용하여 수행되었다. Ensembl 변이체 표에 의해 제공된 SIFT 스코어를 사용하여 단백질에 대한 미스센스 변이체의 결과를 결정하였다.
도 1은 소 결핵 저항성 예측을 위한 단일 염기 다형성 유전자를 선별하는 과정을 전체적으로 플로우차트 형태로 나타낸 것이다.
최종적으로 소 결핵 저항성과 관련이 있는 44 개의 SNP를 결정하였다. 구체적인 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 하기 표 1의 rs number는 Ensembl 사이트(https://asia.ensembl.org/)에서 확인할 수 있다. 또한, 하기 표 1의 "위치"는 Ensembl Bos taurus UMD3.1에서 찾은 유전체 상의 위치를 bp 단위로 나타낸 것이다. 하기 표1 의 "저항성 변이"는 소 결핵에 저항성 높은 SNP의 변이를 나타내며, "민감성 변이"는 소 결핵 저항성이 낮은 SNP의 변이를 나타낸다.
rs number chr 위치 유전자 저항성 변이 민감성 변이
rs444640705 1 69,676,909 KALRN T A
rs210272832 2 71,099,168 MARCO C T
rs210127948 2 71,115,743 MARCO A G
rs210518866 2 71,115,767 MARCO G C
rs208660713 2 71,115,795 MARCO C T
rs209557929 2 71,115,816 MARCO T A
rs469606353 2 71,128,544 MARCO G A
rs210536056 2 71,130,080 MARCO T C
rs109551090 2 107,122,083 SLC11A1 A G
rs434272906 3 20,034,300 CTSS A T
rs55617297 6 56,670,964 TLR10 G T
rs55617311 6 59,672,186 TLR10 C T
rs55617324 6 59,672,264 TLR10 C T
rs55617437 6 59,673,169 TLR10 T C
rs55617310 6 59,673,215 TLR10 G A
rs210580164 6 59,704,709 TLR6 C T
rs207882984 6 59,704,949 TLR6 C T
rs68268279 6 59,705,084 TLR6 T C
rs68343176 6 59,705,097 TLR6 C G
rs68268275 6 59,705,531 TLR6 C T
rs68268272 6 59,706,455 TLR6 C T
rs208209126 7 48,921,837 IL9 T C
rs208893447 7 48,921,895 IL9 T C
rs109038488 11 7,198,007 IL18RAP G T
rs209439695 11 7,198,656 IL18RAP T C
rs208796762 11 7,214,002 IL18RAP T C
rs457663910 11 46,358,348 IL1A G C
rs208850822 13 57,894,808 CTSZ G A
rs208211019 13 57,898,652 CTSZ T C
rs522980029 14 1,811,030 HSF1 A G
rs516025239 14 1,928,675 SHARPIN T G
rs109032207 14 74,757,655 RUNX1T1 C T
rs520313532 18 56,520,223 IRF3 G C
rs382772154 19 43,232,715 ATP6V0A1 G A
rs207697469 22 58,479,475 SLC6A6 T C
rs380363097 23 10,042,753 MAPK13 T G
rs381290416 23 10,044,293 MAPK13 C A
rs716464475 29 44,663,787 CTSW G C
rs444785629 29 44,664,116 CTSW G A
rs519867726 29 44,664,168 CTSW T C
rs432398016 29 44,664,475 CTSW A C
rs209906905 29 44,664,623 CTSW T A
rs210598311 29 44,664,668 CTSW C T
rs437576913 29 44,664,743 CTSW C T

Claims (12)

  1. 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP) rs444640705, rs210272832, rs210127948, rs210518866, rs208660713, rs209557929, rs469606353, rs210536056, rs109551090, rs434272906, rs55617297, rs55617311, rs55617324, rs55617437, rs55617310, rs210580164, rs207882984, rs68268279, rs68343176, rs68268275, rs68268272, rs208209126, rs208893447, rs109038488, rs209439695, rs208796762, rs457663910, rs208850822, rs208211019, rs522980029, rs516025239, rs109032207, rs520313532, rs382772154, rs207697469, rs380363097, rs381290416, rs716464475, rs444785629, rs519867726, rs432398016, rs209906905, rs210598311, 및 rs437576913로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP 유전형을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 마이코박테리움(Mycobacterium) 속(genus) 미생물 감염에 대한 개체의 저항성 예측용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 마이코박테리움 속 미생물은 마이코박테리움 보비스(M. bovis), 마이코박테리움 보비스 BCG(M. bovis BCG), 마이코박테리움 투베르큘로시스(M. tuberculosis), 마이코박테리움 아프리카눔(M. africanum) 및 마이코박테리움 마이크로티(M. microti)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 개체는 소(Bos) 속(genus)의 개체인 것인 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 소 속은 보스 타우루스(Bos taurus), 보스 인디쿠스(Bos indicus), 보스 아쿠티프론스(Bos acutifrons), 보스 애깁티아쿠스(Bos aegyptiacus), 보스 프론탈리스(Bos frontalis), 보스 가우루스(Bos gaurus), 보스 그룬니엔스(Bos grunniens), 보스 자바니쿠스(Bos javanicus), 보스 플라니프론스(Bos planifrons), 보스 프리미제니우스(Bos primigenius), 및 보스 사우벨리(Bos sauveli)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 rs444640705의 염기가 티민(T), rs210272832의 염기가 시토신(C), rs210127948의 염기가 아데닌(A), rs210518866의 염기가 구아닌(G), rs208660713의 염기가 시토신, rs209557929의 염기가 티민, rs469606353의 염기가 구아닌, rs210536056의 염기가 티민, rs109551090의 염기가 아데닌, rs434272906의 염기가 아데닌, rs55617297의 염기가 구아닌, rs55617311의 염기가 시토신, rs55617324의 염기가 시토신, rs55617437의 염기가 티민, rs55617310의 염기가 구아닌, rs210580164의 염기가 시토신, rs207882984의 염기가 시토신, rs68268279의 염기가 티민, rs68343176의 염기가 시토신, rs68268275의 염기가 시토신, rs68268272의 염기가 시토신, rs208209126의 염기가 티민, rs208893447의 염기가 티민, rs109038488의 염기가 구아닌, rs209439695의 염기가 티민, rs208796762의 염기가 티민, rs457663910의 염기가 구아닌, rs208850822의 염기가 구아닌, rs208211019의 염기가 티민, rs522980029의 염기가 아데닌, rs516025239의 염기가 티민, rs109032207의 염기가 시토신, rs520313532의 염기가 구아닌, rs382772154의 염기가 구아닌, rs207697469의 염기가 티민, rs380363097의 염기가 티민, rs381290416의 염기가 시토신, rs716464475의 염기가 구아닌, rs444785629의 염기가 구아닌, rs519867726의 염기가 티민, rs432398016의 염기가 아데닌, rs209906905의 염기가 티민, rs210598311의 염기가 시토신, rs437576913의 염기가 시토신 또는 이들의 조합인 경우, 다른 뉴클레오티드인 경우보다 마이코박테리움 속 미생물 감염에 대한 저항성이 증가된 것인 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 rs444640705의 염기가 아데닌, rs210272832의 염기가 티민, rs210127948의 염기가 구아닌, rs210518866의 염기가 시토신, rs208660713의 염기가 티민, rs209557929의 염기가 아데닌, rs469606353의 염기가 아데닌, rs210536056의 염기가 시토신, rs109551090의 염기가 구아닌, rs434272906의 염기가 티민, rs55617297의 염기가 티민, rs55617311의 염기가 티민, rs55617324의 염기가 티민, rs55617437의 염기가 시토신, rs55617310의 염기가 아데닌, rs210580164의 염기가 티민, rs207882984의 염기가 티민, rs68268279의 염기가 시토신, rs68343176의 염기가 구아닌, rs68268275의 염기가 티민, rs68268272의 염기가 티민, rs208209126의 염기가 시토신, rs208893447의 염기가 시토신, rs109038488의 염기가 티민, rs209439695의 염기가 시토신, rs208796762의 염기가 시토신, rs457663910의 염기가 시토신, rs208850822의 염기가 아데닌, rs208211019의 염기가 시토신, rs522980029의 염기가 구아닌, rs516025239의 염기가 구아닌, rs109032207의 염기가 티민, rs520313532의 염기가 시토신, rs382772154의 염기가 아데닌, rs207697469의 염기가 시토신, rs380363097의 염기가 구아닌, rs381290416의 염기가 아데닌, rs716464475의 염기가 시토신, rs444785629의 염기가 아데닌, rs519867726의 염기가 시토신, rs432398016의 염기가 시토신, rs209906905의 염기가 아데닌, rs210598311의 염기가 티민, rs437576913의 염기가 티민 또는 이들의 조합인 경우, 다른 뉴클레오티드인 경우보다 마이코박테리움 속 미생물 감염에 대한 저항성이 감소된 것인 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 상기 SNP를 포함하는 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산인 것인 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 핵산은 프라이머, 프로브, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 조성물.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 마이코박테리움 속 미생물 감염에 대한 개체의 저항성 예측용 키트.
  10. 개체에서 분리된 생물학적 시료로부터 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP) rs444640705, rs210272832, rs210127948, rs210518866, rs208660713, rs209557929, rs469606353, rs210536056, rs109551090, rs434272906, rs55617297, rs55617311, rs55617324, rs55617437, rs55617310, rs210580164, rs207882984, rs68268279, rs68343176, rs68268275, rs68268272, rs208209126, rs208893447, rs109038488, rs209439695, rs208796762, rs457663910, rs208850822, rs208211019, rs522980029, rs516025239, rs109032207, rs520313532, rs382772154, rs207697469, rs380363097, rs381290416, rs716464475, rs444785629, rs519867726, rs432398016, rs209906905, rs210598311, 및 rs437576913로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 SNP를 검출하는 단계를 포함하는, 마이코박테리움 속 미생물 감염에 대한 개체의 저항성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 rs444640705의 염기가 티민(T), rs210272832의 염기가 시토신(C), rs210127948의 염기가 아데닌(A), rs210518866의 염기가 구아닌(G), rs208660713의 염기가 시토신, rs209557929의 염기가 티민, rs469606353의 염기가 구아닌, rs210536056의 염기가 티민, rs109551090의 염기가 아데닌, rs434272906의 염기가 아데닌, rs55617297의 염기가 구아닌, rs55617311의 염기가 시토신, rs55617324의 염기가 시토신, rs55617437의 염기가 티민, rs55617310의 염기가 구아닌, rs210580164의 염기가 시토신, rs207882984의 염기가 시토신, rs68268279의 염기가 티민, rs68343176의 염기가 시토신, rs68268275의 염기가 시토신, rs68268272의 염기가 시토신, rs208209126의 염기가 티민, rs208893447의 염기가 티민, rs109038488의 염기가 구아닌, rs209439695의 염기가 티민, rs208796762의 염기가 티민, rs457663910의 염기가 구아닌, rs208850822의 염기가 구아닌, rs208211019의 염기가 티민, rs522980029의 염기가 아데닌, rs516025239의 염기가 티민, rs109032207의 염기가 시토신, rs520313532의 염기가 구아닌, rs382772154의 염기가 구아닌, rs207697469의 염기가 티민, rs380363097의 염기가 티민, rs381290416의 염기가 시토신, rs716464475의 염기가 구아닌, rs444785629의 염기가 구아닌, rs519867726의 염기가 티민, rs432398016의 염기가 아데닌, rs209906905의 염기가 티민, rs210598311의 염기가 시토신, rs437576913의 염기가 시토신 또는 이들의 조합인 경우, 다른 뉴클레오티드인 경우보다 마이코박테리움 속 미생물 감염에 대한 저항성이 증가되었다고 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 rs444640705의 염기가 아데닌, rs210272832의 염기가 티민, rs210127948의 염기가 구아닌, rs210518866의 염기가 시토신, rs208660713의 염기가 티민, rs209557929의 염기가 아데닌, rs469606353의 염기가 아데닌, rs210536056의 염기가 시토신, rs109551090의 염기가 구아닌, rs434272906의 염기가 티민, rs55617297의 염기가 티민, rs55617311의 염기가 티민, rs55617324의 염기가 티민, rs55617437의 염기가 시토신, rs55617310의 염기가 아데닌, rs210580164의 염기가 티민, rs207882984의 염기가 티민, rs68268279의 염기가 시토신, rs68343176의 염기가 구아닌, rs68268275의 염기가 티민, rs68268272의 염기가 티민, rs208209126의 염기가 시토신, rs208893447의 염기가 시토신, rs109038488의 염기가 티민, rs209439695의 염기가 시토신, rs208796762의 염기가 시토신, rs457663910의 염기가 시토신, rs208850822의 염기가 아데닌, rs208211019의 염기가 시토신, rs522980029의 염기가 구아닌, rs516025239의 염기가 구아닌, rs109032207의 염기가 티민, rs520313532의 염기가 시토신, rs382772154의 염기가 아데닌, rs207697469의 염기가 시토신, rs380363097의 염기가 구아닌, rs381290416의 염기가 아데닌, rs716464475의 염기가 시토신, rs444785629의 염기가 아데닌, rs519867726의 염기가 시토신, rs432398016의 염기가 시토신, rs209906905의 염기가 아데닌, rs210598311의 염기가 티민, rs437576913의 염기가 티민 또는 이들의 조합인 경우, 다른 뉴클레오티드인 경우보다 마이코박테리움 속 미생물 감염에 대한 저항성이 감소되었다고 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.

KR1020190147727A 2019-11-18 2019-11-18 마이코박테리움 속 미생물의 감염 저항성을 예측하기 위한 조성물, 키트 및 방법 KR20210060105A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190147727A KR20210060105A (ko) 2019-11-18 2019-11-18 마이코박테리움 속 미생물의 감염 저항성을 예측하기 위한 조성물, 키트 및 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190147727A KR20210060105A (ko) 2019-11-18 2019-11-18 마이코박테리움 속 미생물의 감염 저항성을 예측하기 위한 조성물, 키트 및 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210060105A true KR20210060105A (ko) 2021-05-26

Family

ID=76137607

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190147727A KR20210060105A (ko) 2019-11-18 2019-11-18 마이코박테리움 속 미생물의 감염 저항성을 예측하기 위한 조성물, 키트 및 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20210060105A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101823368B1 (ko) 돈육내 다가 불포화지방산 함량 조절용 snp 마커 및 그의 용도
US20190002979A1 (en) Haplotyping of hla loci with ultra-deep shotgun sequencing
KR101929391B1 (ko) 돼지의 유두수 증대 예측용 유전자 마커 및 이의 용도
US20100092959A1 (en) Single nucleotide polymorphisms as genetic markers for childhood leukemia
JP6346557B2 (ja) Ｈｌａ−ａ＊３１：０１アレルの検出方法
Razali et al. A quantitative and qualitative comparison of illumina MiSeq and 454 amplicon sequencing for genotyping the highly polymorphic major histocompatibility complex (MHC) in a non-model species
KR101741252B1 (ko) 한우의 친자 감별을 위한 유전자 조성물
Gand et al. Development of a real-time PCR method for the genoserotyping of Salmonella Paratyphi B variant Java
CN117051131A (zh) 与绵羊抗布鲁氏菌病性状相关的snp分子标记及其检测引物和应用
CN117248030A (zh) 一种基于单细胞全基因组扩增的pkd1变异分子检测方法和应用
CN106929570B (zh) 一种利用普通牛y染色体单核苷酸遗传标记鉴定公牛品种的方法
KR20210060105A (ko) 마이코박테리움 속 미생물의 감염 저항성을 예측하기 위한 조성물, 키트 및 방법
KR101985659B1 (ko) 단일염기다형성 마커를 이용한 백우 품종 식별 방법
US10770183B2 (en) Methods of assessing a risk of developing necrotizing meningoencephalitis
JP2019024455A (ja) 結核菌遺伝系統特異的に結核症発症のリスクを判定する方法
CN117070643B (zh) 与绵羊布鲁氏菌病抗性相关的snp分子标记及其应用
CN117051134B (zh) 与绵羊抗布鲁氏菌病性状相关的snp分子标记及其检测引物、试剂盒和应用
CN117051132B (zh) 绵羊snp分子标记及其在绵羊抗布鲁氏菌病性状检测中的应用
RU2772938C1 (ru) Способ преимплантационного генетического тестирования семейной гипертрофической кардиомиопатии
RU2777091C1 (ru) Способ преимплатационного генетического тестирования рака молочной железы и яичников
RU2795796C1 (ru) Способ преимплантационного генетического тестирования Гемофилии А
KR102083675B1 (ko) 단일염기다형성 마커를 이용한 칡소 품종 식별 방법
KR101823376B1 (ko) 돈육내 스테아릭산 함량 조절용 snp 마커 및 그의 용도
KR101821541B1 (ko) 돈육내 팔미톨레인산 함량 조절용 snp 마커 및 그의 용도
KR101821542B1 (ko) 돈육내 팔미트산 함량 조절용 snp 마커 및 그의 용도